CN102359961A - 一种用于雌酚类或β-肾上腺素受体激动剂类化合物检测的试剂盒及其方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学分析检测技术领域,特别是涉及一种食品、饲料、临床及环境中雌酚类及β-肾上腺素受体激动剂类化合物的检测技术领域。为了提供一种可以在现场,快速、高灵敏度、低成本检测,同时还要具有操作简便、易于观察等特点,更为重要的是可以作为初检工具,避免大量的阴性样品重复检测的试剂盒,本发明公开了一种用于雌酚类或β-肾上腺素受体激动剂类化合物检测的试剂盒,包括:染料溶液、氧化剂、稀释剂、酸溶液,从而可以快速的定性检测样品中的雌酚类及β-肾上腺素受体激动剂类化合物。
Description
技术领域
本发明属于化学分析检测技术领域,特别是涉及一种食品、饲料、临床及环境中雌酚类及β-肾上腺素受体激动剂类化合物的检测技术领域。
背景技术
动物源性食品中“瘦肉精”等β-激动剂和雌酚类兽药是检出率最高、危害最严重、在国际上检测最为严格的的化学性残留危害物。常见的β-肾上腺素受体激动剂类化合物包括克仑特罗(clenbuterol)、沙丁胺醇(salbutamol)、莱克多巴胺(ractopamine)、特布它林(terbutaline)、西马特罗(cimaterol)、雷托巴胺(ractopamine)、沙美特罗(salmeterol)、非诺特罗(fenoterol)等及其盐,能使动物体内的营养成分由脂肪向肌肉转移,表现出营养再分配效应,进而调控动物体的物质代谢,增强脂肪分解,促进蛋白质合成,显著提高胴体瘦肉率和饲料报酬。但是,人类食用了残留有该类物质的动物食品后,能使人体产生低敏感现象,哮喘发生率和发病程度升高,还可导致内分泌紊乱,糖尿病人可并发酸中毒,以及导致染色体畸变的可能,同时可以诱发恶性肿瘤,严重的甚至可以致人死亡。
己烯雌酚( diethylstilbestrol,DES),双烯雌酚(dienestrol),己烷雌酚(hexestrol)和双酚A(bisphenol A),均属于人工合成的非甾体雌激素。能促使女性器官及副性征正常发育,对垂体前叶促性腺激素及催乳素的分泌有小剂量刺激而、大剂量抑制的作用。由于这些非甾体雌激素有促进蛋白质的合成代谢,提高动物日增重和饲料效率,所以受到利益的驱动,目前在动物生产中被滥用于饲料添加剂作为动物的促生长素,这一违规操作屡禁不止。但是上述雌酚类化合物能引发动物和人的癌症,影响生殖能力,甚至动物妊娠期间用药还会殃及后代,属于环境荷尔蒙,干扰人及动物的内分泌。
不管β-肾上腺素受体激动剂类化合物还是非甾体雌激素,它们的滥用及其在动物性食品中的残留严重危害着人们的健康和生命安全,并严重影响了我国畜禽产品的进出口贸易。我国和世界上大多数国家都明文禁止β-肾上腺素受体激动剂和雌酚类化合物在食品领域的使用。除此之外,在环境和临床领域,这两类化合物也是重要的检测物质。
目前,国内外这两类化合物主要的检测方法是色谱法,该方法存在有明显的缺点:一方面成本高、操作复杂、不能现场、只有专业的检测机构能够配备;另一方面,大量的阴性样品重复检测,费时费力,单靠有限的专业检测机构已经远远不能满足庞大的市场检测需求,两者形成明显的矛盾。目前现有技术中的快速检测方法主要是酶联免疫法,但由于其特异性强,不能同时检出一类毒害物的残留,会导致漏检,作为初筛方法酶联免疫法在大批量样品的快速检测中的应用有很大的局限性。目前尚无一种可以同时检测一类毒害物的快速检测方法和产品,因此找到一种灵敏、快速、低成本、可同时检出一类毒害物的检测试剂盒具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种食品、饲料、临床及环境中雌酚类及β-肾上腺素受体激动剂类化合物的检测试剂盒,其可以在现场,快速、高灵敏度、低成本检测,同时还要具有操作简便、易于观察等特点,更为重要的是可以作为初检工具,避免大量的阴性样品重复检测。
为了实现发明目的,本发明公开了一种用于雌酚类或β-肾上腺素受体激动剂类化合物检测的试剂盒,包括:
氧化剂:所述氧化剂为过氧化氢、氯酸钾、溴酸钾、次氯酸钾、次氯酸钙、重铬酸钾、重铬酸钠中的一种或几种,所述氧化剂浓度为1×10-5~5mol/L;
稀释剂:所述稀释剂为甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、水溶液中的一种或几种;
酸溶液:所述酸溶液的H+浓度为1×10-6~15mol/L。
为了进一步提高本发明公开的试剂盒的检测灵敏度,本发明进一步公开了还包括有表面活性剂:所述表明活性剂为十二烷基二甲基苄基氯化铵、十二烷基二甲基苄基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基吡啶氯化铵、十六烷基吡啶溴化铵中的一种或几种,所述表面活性剂溶液浓度为1×10-6 ~5mol/L。
为了进一步提高试剂盒的检测准确度,避免干扰,本发明又进一步公开了还包括有金属络合剂。
当然,作为上述各种溶液的进一步优选浓度,本发明公开了所述染料溶液的最佳浓度为1×10-5 ~ 1mol/L;所述氧化剂的最佳浓度为1×10-4~1mol/L;所述酸溶液的最佳H+浓度为1×10-3 ~ 5mol/L;所述表面活性剂溶液的最佳浓度为1×10-5 ~ 1mol/L。
同时,本发明还在公开试剂盒的基础上,进一步公开了应用这种试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
制备检测溶液:分别在两个色谱瓶或试管中加入染料溶液、酸溶液、表面活性剂溶液,并用稀释剂稀释至检测浓度 ,其中染料溶液的检测浓度为1×10-7 ~ 0.5mol/L,最佳浓度范围1×10-5 ~ 1×10-2mol/L;氧化剂溶液的检测浓度为1×10-5~1mol/L,最佳浓度在1×10-4~1×10-1mol/L;表面活性剂溶液的检测浓度为1×10-6 ~0.1mol/L,最佳浓度在1×10-5 ~ 1×10-2mol/L;
加入样品:在其中一份检测溶液中加入待测样品,另一份加入等量的水作为空白对照;
除去金属离子干扰:分别在两个色谱瓶或试管中加入络合剂;
进行检测:在两个色谱瓶或试管中平行加入氧化剂溶液,摇匀、静置观察颜色变化;
得到检测结果:如加入样品的溶液变色明显较空白溶液慢,则含有雌酚类和β-肾上腺素受体激动剂类化合物;如变色时间几乎相同则不含有雌酚类和β-肾上腺素受体激动剂类化合物,如加入样品的溶液变色较空白溶液快,则重新检测。
最后,本发明进一步明确了试剂盒在检测含有雌酚类或β-肾上腺素受体激动剂类化合物的溶液中的应用,所述雌酚类化合物包括己烯雌酚(diethylstilbestrol)、己烷雌酚(hexestrol)、己二烯雌酚(dienestrol)、双酚A(bisphenol A);所述β-肾上腺素受体激动剂类化合物包括克仑特罗(clenbuterol)、沙丁胺醇(salbutamol)、莱克多巴胺(ractopamine)、特布它林(terbutaline)、西马特罗(cimaterol)、雷托巴胺(ractopamine)、沙美特罗(salmeterol)、非诺特罗(fenoterol)及其盐。
由于雌酚类或β-肾上腺素受体激动剂类化合物可以在一定程度上阻碍氧化剂对染料的褪色效应,也就是说由于存在这类物质,会使得氧化剂对染料的褪色作用延迟,当雌酚类或β-肾上腺素受体激动剂类化合物消耗完全后,褪色作用继续完成,只是与不含有此类物质的空白对照相比,其褪色时间较长,褪色过程较为缓慢,所以本发明基于此原理,通过样品溶液与空白对照溶液的变色时间比较,可以定性的得到样品溶液中是否含有雌酚类或β-肾上腺素受体激动剂类化合物。
综上所述,采用本发明所公开的试剂盒以后,对雌酚类或β-肾上腺素受体激动剂类化合物的定性检测达到了可现场操作、快速、高灵敏度、低成本、操作简便、易于观察等检测要求。
具体实施方式
实施例1 鸡肉中己烯雌酚的检测
(1)样品的前处理:
用2支15毫升的离心管分别准确称取鸡肉1.5-1.6g,各加入5毫升的甲醇,然后均放入超声机里超声30分钟,离心5分钟。采用标准加入法分别配置空白样品、标准样品溶液,再用甲醇加至5毫升。然后同上超声30分钟,离心5分钟。取出上清液备用,残渣扔掉。将上清液均在80℃左右水浴蒸干,然后分别加8ml 1molL-1的NaOH溶解,用3ml的氯仿洗两次,PH调至9.0~10.5,再用4ml的氯仿萃取3次于50℃左右浓缩蒸干。最后用1ml的乙醇溶液和24ml的纯净水配成样品溶液备用。
(2)试剂盒检测步骤:
将试剂盒中提供的染料溶液、酸溶液、表面活性剂溶液、络合剂溶液和稀释剂依次加入到两个完全相同的色谱瓶中。向一个色谱瓶中加入处理好的样品,向另一个色谱瓶中加入等体积的空白溶剂作为对照,最后向两个色谱瓶中平行加入氧化剂溶液。微微振荡使溶液迅速混合均匀,比对两个色谱瓶中溶液颜色褪色的时间。
(3)检测结果判定:
如待测样品与空白试样几乎同时变色,则不含有己烯雌酚;如待测样品的变色明显比空白样品慢,则含有己烯雌酚;如待测样品先变色,说明操作有误或试剂失效,需要重新进行实验。
实施例2 饲料中己烷雌酚的检测
(1)样品的前处理:
准确称取粉碎饲料样品1+0.05g到50ml离心管中,加入4ml乙腈,1ml丙酮;用标准加入法分别配置空白样品、标准样品溶液;涡漩1min后于4000r/min以上离心3min;将上清液在50℃氮气留下吹干,最后用5ml乙醇溶解成样品溶液备用。
(2)试剂盒检测步骤:
检测步骤同实施例1。
(3)检测结果判定:
如待测样品与空白试样几乎同时变色,则不含有己烷雌酚;如待测样品的变色明显比空白样品慢,则含有己烷雌酚;如待测样品先变色,说明操作有误或试剂失效,请重新进行实验。
实施例3 尿液中沙丁胺醇和莱克多巴胺的同时检测
(1)样品的前处理:
取1ml尿液样品到10ml离心管中,用标准加入法分别配置空白样品、同时含沙丁胺醇和莱克多巴胺的标准样品溶液,加入4ml乙醇混和均匀后直接用于分析。
(2)试剂盒检测步骤:
检测步骤同实施例1。
(3)检测结果判定:
如待测样品与空白试样几乎同时变色,则不含有本实施例所述被检物;如待测样品的变色明显比空白样品慢,则含有本实施例所述被检物;如待测样品先变色,说明操作有误或试剂失效,请重新进行实验。
实施例4 水中雌酚及β-肾上腺素受体激动剂的检测
(1)样品的前处理:
取1ml水样品到10ml离心管中,加入4ml乙醇混和均匀后直接用于分析。
(2)试剂盒检测步骤:
检测步骤同实施例1。
(3)检测结果判定:
如待测样品与空白试样几乎同时变色,则不含有本发明所述化合物;如待测样品的变色明显比空白样品慢,则含有本发明所述化合物;如待测样品先变色,说明操作有误或试剂失效,请重新进行实验。
Claims (9)
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征是还包括有:
表面活性剂:所述表明活性剂为十二烷基二甲基苄基氯化铵、十二烷基二甲基苄基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基吡啶氯化铵、十六烷基吡啶溴化铵中的一种或几种,所述表面活性剂溶液浓度为1×10-6 ~5mol/L。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒,其特征是还包括有金属络合剂。
4.如权利要求1所述的试剂盒,其特征是所述染料溶液的最佳浓度为1×10-5 ~ 1mol/L。
5.如权利要求1所述的试剂盒,其特征是所述氧化剂的最佳浓度为1×10-4~1mol/L。
6.如权利要求1所述的试剂盒,其特征是所述酸溶液的最佳H+浓度为1×10-3 ~ 5mol/L。
7.如权利要求2所述的试剂盒,其特征是所述表面活性剂溶液的最佳浓度为1×10-5 ~ 1mol/L。
8.应用如权利要求3所述试剂盒的检测方法,其特征是包括以下步骤:
制备检测溶液:分别在两个色谱瓶或试管中加入染料溶液、酸溶液、表面活性剂溶液,并用稀释剂稀释至检测浓度 ,其中染料溶液的检测浓度为1×10-7 ~ 0.5mol/L,最佳浓度范围1×10-5 ~ 1×10-2mol/L;氧化剂溶液的检测浓度为1×10-5~1mol/L,最佳浓度在1×10-4~1×10-1mol/L;表面活性剂溶液的检测浓度为1×10-6 ~0.1mol/L,最佳浓度在1×10-5 ~ 1×10-2mol/L,检测溶液pH值保持在7.0以下;
加入样品:在其中一份检测溶液中加入待测样品,另一份加入等量的水作为空白对照;
除去金属离子干扰:分别在两个色谱瓶或试管中加入络合剂;
进行检测:在两个色谱瓶或试管中平行加入氧化剂溶液,摇匀、静置观察颜色变化;
得到检测结果:如加入样品的溶液变色明显较空白溶液慢,则含有雌酚类和β-肾上腺素受体激动剂类化合物;如变色时间几乎相同则不含有雌酚类和β-肾上腺素受体激动剂类化合物,如加入样品的溶液变色较空白溶液快,则重新检测。
9.如权利要求1所述试剂盒在检测含有雌酚类或β-肾上腺素受体激动剂类化合物的溶液中的应用,所述雌酚类化合物包括己烯雌酚(diethylstilbestrol)、己烷雌酚(hexestrol)、己二烯雌酚(dienestrol)、双酚A(bisphenol A);所述β-肾上腺素受体激动剂类化合物包括克仑特罗(clenbuterol)、沙丁胺醇(salbutamol)、莱克多巴胺(ractopamine)、特布它林(terbutaline)、西马特罗(cimaterol)、雷托巴胺(ractopamine)、沙美特罗(salmeterol)、非诺特罗(fenoterol)及其盐。
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