CN102346186B - 用于检测生物标本中的过氧化物还原酶ⅳ抗体的elisa试剂盒及其方法与运用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学领域,特别涉及用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒及其方法与运用,所述ELISA试剂盒包括抗体捕获剂、酶标二抗、底物;本试剂盒能特异性的检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量,其成本低,敏感性佳;运用本试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量,并与正常人的过氧化物还原酶Ⅳ的抗体水平进行比较,判断过氧化物还原酶Ⅳ抗体是否为阳性。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验领域,特别涉及用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的间接ELISA试剂盒及其方法与运用。
背景技术
类风湿关节炎(RA) 是一种以滑膜炎为基本病理改变, 以慢性破坏性关节病变为特征的全身性自身免疫病,大多病情呈进行性,最终导致关节纤维性或骨性强直而严重致残,严重影响患者生活质量。未经正确治疗的类风湿关节炎可迁延不愈, 甚至导致关节畸形。作为自身免疫性疾病,致病抗原驱动的自身反应性CD4+T细胞活化是类风湿关节炎发病的核心途径。
对于类风湿关节炎的诊断,现在主流仍然沿用1987 年美国风湿病学学会RA 的分类标准,其主要靠临床表现并排除其他关节炎从而对RA进行判断。另外,X线改变和类风湿因子也是判断RA的常用标准。但上述方法操作繁琐且特异性不高,且不适用于早期诊断。
众所周知,RA的病理改变从滑膜组织开始逐渐向软骨到骨发展。RA在早期若未得到有效治疗,将会引起关节功能障碍甚至劳动力丧失,并导致全身多脏器受累进而危及生命。如果能尽早对RA病情做出诊断,及早治疗,从而阻止或延缓其发展,将能有效的提高RA的治疗效果并减少其并发症的发生。而针对RA早期有高度敏感性和特异性的检测指标是实现RA早期诊断和治疗的前提。
早期诊断指标中,IL-8、IL-6水平在巨细胞病毒DNA阳性的类风湿关节炎患者中升高和CMV基因组出现之间存在联系,但特异性和敏感性低。在RA自身抗体作为检测指标方面:类风湿因子(RF)存在灵敏度低的缺点;在早期RF阴性的类风湿关节炎病人中可53.3% 的病人抗核周因子(APF)呈阳性,但APF抗原片的保存时间较短(仅为1~2周),检测稳定性低;Sa抗体在类风湿关节炎中阳性率为40%,特异性为98.9%,但类风湿关节炎早期仅约23%;过氧化物还原酶Ⅳ和类风湿关节炎的相关性研究尚未有人报道。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的之一在于提供一种试剂盒,该试剂盒能快速检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量,操作简单,成本低廉。
为实现上述目的,本发明的技术方案为:
1、用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒,所述ELISA试剂盒包括抗体捕获剂、酶标二抗和底物。
2、根据1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒,所述抗体捕获剂为过氧化物还原酶Ⅳ作不小于5μg/mL的稀释。
3、根据1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒,抗体捕获剂附于固相支持物上。
4、根据3所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒,所述固相支持物为酶标板或生物芯片。
5、根据1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒,所述生物标本为血清、尿液、细胞、组织物或血浆。
6、根据5所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒,所述生物标本为血清,所述血清为不大于200倍体积稀释的血清稀释液。
7、根据1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒,所述酶标二抗为辣根酶标记山羊抗人IgM作不大于4000倍稀释的稀释液。
8、根据1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒,所述抗体捕获剂与酶标二抗的用量体积比为1:1。
本发明的目的之二在于提供上述试剂盒的用途,该用途能弥补过氧化物还原酶Ⅳ抗体检测领域的技术空白,并为类风湿关节炎及其它免疫性疾病提供了诊断思路,特别适用于生物标本的检测。
为实现上述目的,本发明的技术方案为:
9、1-8所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒在检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的应用。
10、根据9所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒的应用,所述ELISA试剂盒在制备检测类风湿关节炎试剂盒中的应用。
11、根据9所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒的应用,所述ELISA试剂盒检测待测血清与正常人血清的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量,当待测血清的OD450nm值大于0.257为过氧化物还原酶Ⅳ抗体阳性,小于或等于0.257为过氧化物还原酶Ⅳ抗体阴性。
本发明的目的之三在于提供过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的方法,该方法敏感性高,操作简单。
为实现上述目的,本发明的技术方案为:
12、运用1-8任一项所述ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的方法,a、将生物标本与ELISA试剂盒中的抗体捕获剂接触并保温;b、将未结合的生物标本分离,得抗原-抗体复合物;c、在步骤b所得的抗原-抗体复合物加入ELISA试剂盒中的酶标二抗,得双抗复合物;d、检测结合于抗体捕获剂的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量。
13、根据12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的方法,所述方法还包括将步骤d所得的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量与正常人过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量进行比较判断。
14、根据12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的方法,步骤a中,将抗体捕获剂包被酶标板,将待测生物标本与抗体捕获剂接触,保温并用封闭液封闭;所述生物标本为不大于200倍体积稀释的血清稀释液,所述抗体捕获剂为过氧化物还原酶Ⅳ作小于5μg/ml的稀释液。
15、根据12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的方法,步骤b中,将步骤a中保温并用封闭液封闭的酶标板洗涤将未结合的生物标本分离,得抗原-抗体复合物。
16、根据12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的方法,步骤c中,在步骤b所得的抗原-抗体复合物加入ELISA试剂盒中的酶标二抗进行保温反应,得双抗夹心复合物;所述酶标二抗为辣根酶标记山羊抗人IgM作不大于4000倍稀释的稀释液。
17、根据12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的方法,步骤d中,在步骤c所得的双抗复合物中加入底物避光显色后,加入终止液终止反应得显色样品液,通过测显色样品液的OD450nm值检测结合于抗体捕获剂的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量。
18、根据12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的方法,所述方法还包括阴性对照组和空白对照组,所述阴性对照组为源自于正常人的生物标本。
19、根据18所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的方法,所述待测生物标本的OD450nm值大于阴性对照组样本的OD450nm值平均值与其2倍标准方差之和时,判定为过氧化物还原酶Ⅳ抗体阳性,述待测生物标本的OD450nm值小于或等于阴性对照组样本的OD450nm值平均值与其2倍标准方差之和时为阴性。
本发明的有益效果在于:本试剂盒能特异性的检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量,其成本低,敏感性佳;运用本试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量,并与正常人的过氧化物还原酶Ⅳ的抗体水平进行比较,可特异性教高的诊断类风湿关节炎,所以该试剂盒可以制备成类风湿关节炎诊断试剂盒,尤其适用于早期诊断。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述,其中:
图1为间接ELISA法检测初诊RA、复诊RA及正常人血清中过氧化物还原酶Ⅳ抗体的分析图。
图2为过氧化物还原酶Ⅳ间接法ELISA标准曲线,横坐标为小鼠抗人单克隆抗体稀释倍数,纵坐标为不同稀释倍数抗体所对应的OD450值。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。本实施例中所述抗原包被物人过氧化物还原酶Ⅳ的获得是通过构建原核表达质粒、转化表达菌并发酵培养,收集到大量的含有过氧化物还原酶Ⅳ的菌体沉淀,辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗人IgM,作为间接法ELISA的二抗;进一步确定了人过氧化物还原酶Ⅳ包被浓度和检测血清的最佳浓度范围及阴阳性临界值的确定,制定了一种特异性和敏感性高的类风湿关节炎过氧化物还原酶Ⅳ抗体检测方法,其能捕获7.8ng/mL过氧化物还原酶Ⅳ抗体。
实施例 过氧化物还原酶Ⅳ抗体间接法ELISA试剂盒及其方法与运用
一 包被物人过氧化物还原酶Ⅳ的制备
构建人过氧化物还原酶Ⅳ表达质粒,用pET原核表达系统制备重组抗原TRX-过氧化物还原酶Ⅳ融合蛋白。
1根据GenBank中检索到的人过氧化物还原酶Ⅳ成熟蛋白序列编码,设计合成编码过氧化物还原酶Ⅳ蛋白的DNA;
2分别在DNA5′端和3′端设计EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,经聚合酶链反应(PCR)、构建重组质粒pET过氧化物还原酶Ⅳ;
3在BL21(DE3)经IPTG诱导表达;
4 Ni-NTA亲和层析制备TRX-过氧化物还原酶Ⅳ;
5通过DNA测序、融合蛋白的相对分子质量分析及Western印迹来鉴定TRX-过氧化物还原酶Ⅳ质粒及表达的过氧化物还原酶Ⅳ抗原的正确性。
二、过氧化物还原酶Ⅳ抗体的间接法ELISA试剂盒及其方法与运用
1、实验材料
1.1、试剂
辣根酶标记山羊抗人IgM购自Lifescience公司;辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)购自北京中山生物技术公司;小鼠抗人过氧化物还原酶Ⅳ单克隆抗体购自Abcam公司;
1.2、仪器
紫外分光光度仪Backmen 公司。
1.3、主要试剂配制
1%封闭液:加入10mL封闭液贮液到90mlTBS中,在-15~-25℃稳定保存。 0.5%封闭液:加入5mL封闭液贮液到95mLTBS中,在-15~-25℃稳定保存。血清稀释液:用0.5%的封闭液稀释一抗。 HRP标记的抗小鼠或人IgG用0.5%的封闭液稀释为1:10000倍,得到二抗工作液。包被液: 0.85M(PH 9.6)碳酸盐缓冲液:1.59g Na2CO3加2.93g NaHCO3,三蒸水定容1000mL。洗涤液:0.01M pH7.4 PBS+吐温-20(T)使最终质量分数为0.05%。 底物溶液:磷酸盐-柠檬酸缓冲液(pH5.0~5.5):0.1M柠檬酸24.3mL加入25.7ml 0.2M Na2HPO4·12H2O 加入邻苯二胺40.0mg,定容至50mL,临用前加0.15mL体积分数为 30%的H2O2。终止剂:22.2mL硫酸加入蒸馏水177.8mL。
1.4、待测样品5例RA滑膜组织由北京大学附属人民医院风湿免疫科栗占国教授提供;534例 RA(其中初诊67例、复诊467例)、65例OA、120例SLE、10例硬皮病(scleroderma)、15例皮肌炎(dermatomyositis)及120例正常对照(NC)血液标本源自西南医院。
将收集的促凝血液标本4℃过夜后经3,000rpm离心30分钟,取上清,100ul分装,-70℃保存。
2、过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒及其方法与运用
2.1、最佳过氧化物还原酶Ⅳ包被浓度和检测血清稀释倍数的确定
采用方阵滴定法,具体步骤如下:(1)将含10μg/ul重组表达的人过氧化物还原酶Ⅳ按照如下浓度稀释(5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml),100μL/孔加于酶标板中,置4℃湿盒孵育12小时,洗板机洗涤3次,5min/次,拍干;(2)加入100μl/孔封闭液,4℃湿盒封闭过夜,洗板机洗涤3次,5min/次,拍干;(3)待测血清按照1:20、1:50、1:100、1:200倍稀释,100μl/孔,37℃湿盒作用1h,洗板机洗涤10次,3min/次,拍干;(4)将HRP标记的山羊抗人IgG按照1:4000稀释,100μl/L,加入酶标板中, 37℃湿盒孵育30分钟,洗板机洗涤10次,3min/次,拍干;酶标二抗按照已确定比例1:4 000使用;(5)加入TMB底物100μl/孔,37℃避光显色5min后,加入100μl/孔2mol/L硫酸终止反应;(6)检测:用酶标仪测OD450nm值。同时以1%的BSA/PBS溶液作空白对照,以P/N值最大的人过氧化物还原酶Ⅳ包被物浓度和待测血清稀释度为最佳工作浓度。
分别将人过氧化物还原酶Ⅳ包被物和待测血清作系列稀释,进行方阵试验,结果见表1。方阵滴定结果显示,人过氧化物还原酶Ⅳ包被浓度为50μg/ml,待测血清1:200倍稀释时, 类风湿关节炎血清OD450nm值大于1.0,阴阳性血清OD450nm比值(P/N)最大为10.45;人过氧化物还原酶Ⅳ包被浓度为20μg/ml,待测血清1:200倍稀释时, 类风湿关节炎血清OD450nm值大于1.0,阴阳性血清OD450nm比值(P/N)为10.08,仅比最大阴阳性血清OD450nm比值小0.37,考虑抗原包被成本,因此选择人过氧化物还原酶Ⅳ包被浓度为20μg/ml为最佳包被浓度;待测血清1:200倍稀释为最佳稀释浓度。
2.2、
取30份正常人血清,用上述建立的过氧化物还原酶Ⅳ抗体间接ELISA的方法检测。将30份正常人血清OD450nm值的平均值(X)和2标准方差(SD)之和作为阴性样品值的上限,即待测血清样品的OD值>X+2SD时,判断为阳性;否则为阴性。
通过对30份正常人血清样品进行检测(表2),求得其X值为0.1667,SD值为0.0417,确定阴阳性临界值为 X+2SD=0.1667+2×0.0417= 0.2501。即待测样品的OD450nm值大于0.2501为过氧化物还原酶Ⅳ阳性,小于或等于则为阴性。
2.3
取骨性关节炎(OA)、系统性红斑狼疮(SLE)、其他自身免疫性疾病(AD),包括多形性硬化、硬皮病、皮肌炎、类风湿关节炎(RA)和正常人对照(NC)血清,按照本实施例中的方法进行检测,观察结果。
2.4、
将含2μg/ul小鼠抗人过氧化物还原酶Ⅳ单克隆抗体按照如下浓度梯度倍比稀释(2000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125 ng/ml、62.5ng/ml、31.25 ng/ml、15.625 ng/ml、7.8125 ng/ml),100μL/孔加于酶标板中,每个稀释度重复3次,按建立的过氧化物还原酶Ⅳ抗体间接ELISA方法检测,结果见表3和图2。将小鼠抗人过氧化物还原酶Ⅳ单克隆抗体稀释至7.8125ng/ml时,OD450nm值为1.082,稍大于空白对照值0.895,由于在每一酶标孔中加100μL,因此,血清中检测含过氧化物还原酶Ⅳ抗体最低含量为0.78ng。
重复性试验结果
(1)批内重复性测定试验:取3份不同时间收集到的类风湿关节炎血清,按最佳稀释度稀释,加到抗原包被孔中,每份样品做3次重复ELISA测定。由每份样品的OD450nm值计算出平均OD450nm值(X)与标准方差(SD),进而计算出每份样品批内变异系数[CV=(SD/X)×100%];(2)批间重复性测定试验:在其它条件相同的情况下,用3份不同批次制备的纯化的小鼠抗人过氧化物还原酶Ⅳ抗体包被酶标板,对3份不同时间收集到的类风湿关节炎血清进行检测。由每份样品的OD450nm值计算出平均OD450nm值(X)与SD,进而计算出每份样品的批间变异系数。
经统计学分析,3份不同时间收集到的类风湿关节炎血清之间批内重复试验OD450nm值的变异系数(CV)为2.34%~4.87%,小于5%;3份不同时间收集到的类风湿关节炎血清3次批间重复试验OD450nm值的CV为1.27%~3.79%,小于5%(表4)。表明建立的过氧化物还原酶Ⅳ抗体间接ELISA方法具有很好的批内及批间重复性。
2.6、检测方法的确定
结论:在RA患者血清中过氧化物还原酶Ⅳ抗体滴度明显高于正常人血清(P<0.01)。尤其在初诊RA血清中过氧化物还原酶Ⅳ抗体滴度与正常人血清比较增高更为明显(P<0.001);通过cutoff值(0.2501)判断阳性率,在复诊RA患者血清中过氧化物还原酶Ⅳ抗体特异性为97%,敏感性为79%;过氧化物还原酶Ⅳ抗体在初诊RA患者血清中的特异性为98%,敏感性为82%。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (5)
1.用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒在制备检测类风湿关节炎的试剂中的应用,其特征在于:所述ELISA试剂盒包括抗体捕获剂、酶标二抗和底物;
所述抗体捕获剂为重组过氧化物还原酶Ⅳ,所述酶标二抗为被HRP标记的山羊抗人IgG;
所述重组过氧化物还原酶Ⅳ的终浓度不小于5μg/mL;
所述生物标本为待测血清作不大于200倍体积的稀释;
所述酶标二抗为被HRP标记的山羊抗人IgG作不大于4000倍稀释。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述抗体捕获剂附于固相支持物上。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述固相支持物为酶标板或生物芯片。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述抗体捕获剂与酶标二抗用量体积比为1:1。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述ELISA试剂盒检测待测血清与正常人血清的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量,比对待测血清OD450nm值和正常人血清OD450nm值的平均值X和2标准方差SD之和,待测血清样品的OD450nm值>X+2SD时,判断为阳性;否则为阴性。
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CN1706866A (zh) * | 2005-05-26 | 2005-12-14 | 江苏省农业科学院 | 水稻条纹病毒单克隆抗体及水稻条纹病毒的免疫学检测方法 |
CN1743847A (zh) * | 2005-05-09 | 2006-03-08 | 浙江大学 | H7亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接elisa检测试剂盒 |
WO2010146064A1 (en) * | 2009-06-16 | 2010-12-23 | B.R.A.H.M.S Gmbh | Diagnostical use of peroxiredoxin 4 |
-
2011
- 2011-01-24 CN CN201110025635.3A patent/CN102346186B/zh active Active
- 2011-12-07 WO PCT/CN2011/083637 patent/WO2012100599A1/zh active Application Filing
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN1743847A (zh) * | 2005-05-09 | 2006-03-08 | 浙江大学 | H7亚型水禽流感病毒血凝素抗体间接elisa检测试剂盒 |
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WO2010146064A1 (en) * | 2009-06-16 | 2010-12-23 | B.R.A.H.M.S Gmbh | Diagnostical use of peroxiredoxin 4 |
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