CN102336768A - N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2,3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙类化合物、制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙类化合物、制备方法及其用途，其结构通式如式(I)所示。实验结果表明此类化合物可以诱导人宫颈癌细胞、人肺癌细胞、人乳腺癌细胞中半胱天冬酶-3(Caspase-3)依赖的细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞的增殖，同时对正常细胞的毒性低，可以用于制备治疗宫颈癌、肺癌或乳腺癌的抗肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙类化合物、制备方法和用途。
背景技术
细胞凋亡(apoptosis)是细胞发生的一种受调控的程序性死亡过程，是细胞死亡的基本方式之一。细胞凋亡是多细胞生物去除冗余细胞或异常细胞的一种机制，在生物体的进化、维持内环境的稳定以及多种系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡过程的紊乱与多种疾病的发生有直接的关系。自上世纪90年代末以来，细胞凋亡与肿瘤的发生之间的关系逐渐受到了研究人员的重视。以往人们认为肿瘤是异常细胞过度增生的疾病，因此抑制肿瘤细胞生长一直是传统抗肿瘤药物设计的出发点。但是基于这种机制的化疗药物在临床上却存在着选择性差、毒副作用大和易产生耐药性等缺点。
近年来随着细胞凋亡研究的深入，人们逐渐认识到肿瘤的发生实际是细胞的增殖与凋亡失衡所致。研究表明在多种肿瘤细胞中凋亡机制被抑制，肿瘤细胞因而得以过度增生。另外，凋亡机制被抑制也使得肿瘤细胞对化疗药物的耐受性增强。因此，设法恢复肿瘤细胞中的凋亡机制成为当今抗肿瘤药物设计的一条新思路，在国际上得到了广泛重视。采用该思路发展靶向抗肿瘤药物的优点在于：第一，凋亡机制被抑制是多种肿瘤细胞中存在的一个普遍现象。因此基于促凋亡机制的药物有希望成为广谱的抗肿瘤药物。第二，凋亡过程是生物体的一种固有机制。诱发肿瘤细胞的凋亡过程，从而由生物体自行清除肿瘤细胞，这种方式对正常细胞的副作用较小，有望克服传统抗肿瘤药物选择性差的缺点。
细胞凋亡是一个多基因严格控制的过程。近年来随着细胞生物学和分子生物学的发展，人们对细胞凋亡过程有了进一步的认识。但是严格说来细胞凋亡的确切机制迄今为止尚不完全清楚。目前人们认为细胞凋亡过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化→进入连续反应过程。不同来源的信号启动凋亡的方式不同，所引起的信号转导过程也不尽相同。关于细胞凋亡过程研究比较多的途径主要有两种。一种为外源性途径，也称为FAS途径。FAS又称CD95，是由325个氨基酸组成的跨膜受体分子，属于肿瘤坏死因子受体家族成员。FAS如果与其配体FASL结合，则可以启动凋亡信号的转导。该蛋白以N端DED结构域连接另一个带有DED的后续成分，随后与无活性的半胱天冬酶-8(caspase-8)的酶原发生同嗜性交联，聚合多个caspase-8的分子。caspase-8分子则逐渐由单链酶原转成有活性的双链蛋白，进而导致caspase-3酶的激活。细胞凋亡的另一种主要途径为内源性途径，也称为线粒体途径。线粒体是细胞生命活动的控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡的调控中心。实验表明细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡中的关键步骤。释放到胞浆中的细胞色素C在dATP存在的条件下与Apaf-1蛋白结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，使得caspase-9被激活。激活的caspase-9能激活下游的caspase-3。不论是外源性途径还是内源性途径都归结于caspase-3的激活，激活的caspase-3诱发级联反应，使细胞最终发生不可逆的凋亡所示。
综上所述，特异性诱导细胞凋亡作用的活性化合物可能具有较低的毒副作用和广谱的抗肿瘤效果，作为抗肿瘤候选药物具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的为提供一种N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙类化合物。
本发明的目的之一为提供具有诱导肿瘤细胞凋亡活性的、新型的N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙类化合物，其结构通式如图(I)所示。
本发明的目的之二为提供一种上述N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙类化合物的制备方法，系以取代乙酮、氰乙酸乙酯和单质硫为原料的简便合成方法。
本发明的目的之三为提供上述N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙类化合物的用途，可以用于制备抗肿瘤药物或含N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙类化合物的抗肿瘤药物的组合物。
本发明的化合物采用肿瘤细胞株以及正常细胞株实验测试其抗肿瘤效果，在多个肿瘤细胞株上证明其具有较强的抑制肿瘤细胞活性，并且采用流式细胞实验和免疫印迹实验，证明其诱导细胞凋亡是通过Caspase-3依赖途径，同时发现这类化合物对正常细胞的毒性很小。
本发明的N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙具有如下通式(I)结构：
其中：
R1和R2共同选自-(CH2)m-，即噻吩环并合一个脂肪环，其中m为3-5的整数；
或者R1选自芳香基Ar，R2为氢原子；其中，Ar取代基选自5-7元芳香基、Z取代的5-7元芳香基、5-7元杂芳基、Z取代的5-7元杂芳基、并合5-7元杂芳基的5-7元芳香基、Z取代的并合5-7元杂芳基的5-7元芳香基，所述的杂环基中的杂原子为N、O或S，所含杂原子的数目为1-3；所述的Z取代基选自：卤素、C1-C4烷氧基、硝基、C1-C6直链或支链烃基、羟基取代的C1-C6直链或支链烃基、C3-C7饱和或不饱和环烷基；Z取代基的数目为1-4；
R8选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、羟基、C1-C4烷氧基、羧基、C1-C4酯基、氰基、硝基、氨基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、巯基或C1-C4酰基；n为1-4的整数。
所述的N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙类化合物代表性的化合物为N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(4-三氟甲基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7-二氢-环戊烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7-二氢-环戊烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7-二氢-环戊烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7-二氢-环戊烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7-二氢-环戊烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(4-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7-二氢-环戊烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7，8，9-四氢-环庚烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7，8，9-四氢-环庚烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7，8，9-四氢-环庚烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7，8，9-四氢-环庚烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7，8，9-四氢-环庚烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(4-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7，8，9-四氢-环庚烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-苯基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(4-氯-苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(4-氯-苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-苯基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(4-氯-苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(4-氯-苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-苯基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-苯基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-甲基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(3-甲基-4-氯-苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-甲基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-甲基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-甲基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(3-甲基-4-氯-苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(萘-2-基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(萘-2-基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(萘-2-基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(萘-2-基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(3-硝基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(4-氯苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(3，4-二羟基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(4-氯苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(3-硝基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(萘-2-基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(3，4-二羟基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(萘-2-基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙
本发明的N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙类化合物的制备方法，其合成策略如下：
其中R1、R2和R3的定义如前所述。将反应式中的原料和产物R3先给我(R3)n(回答：R3取代基有下面一些：
2-OH；3-F，4-Cl；4-CN；3-NO2，4-Cl；4-CF3；3-OH；4-OH；3-OH，4-OH
尽管在我们实施列中R3取代基变化的并不多，但考虑到尽可能大的获得专利保护范围，我们建议按照目前的写法递交)
具体包括如下步骤：
1)将R1，R2-取代乙酮、氰乙酸乙酯、单质硫、碱性氧化铝和吗啉按1∶1.5∶1.5∶0.5～1∶1.5的摩尔当量混合，混匀后，放入微波炉中，140W辐射10-30分钟。冷却后，柱层析分离得到4，5-二取代-2-氨基-噻吩-3-甲酸乙酯(II)；
2)按每克II需10～15毫升甲酰胺，将化合物II和甲酰胺混合，200～210℃搅拌反应1-5小时。冷去后，将反应液倾入水中，抽滤，水洗，干燥，得到5-R1取代-6-R2取代噻吩[2，3-d]嘧啶-4-酮(III)；
3)40℃-60℃条件下，将化合物III、溴乙酸乙酯和碳酸钾按1∶1∶1～1.5的的摩尔当量混合，投入到惰性溶剂中(按每毫摩尔III需4～8毫升)，搅拌24-72小时。将反应液倾入水中，有机溶剂萃取，得到的有机层经干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离得(4-氧代-5-R1取代-6-R2-取代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酸乙酯(IV)；
4)按每克IV需1～1.5毫升85％的水合肼和50～80毫升乙醇，将化合物IV和85％的水合肼投入到乙醇中，70～85℃搅拌10-20小时，减压蒸除60～80％的溶剂，将析出的固体抽滤，乙醇洗得(4-氧代-5-R1取代-6-R2-取代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰肼(V)；
5)将化合物V和R3-取代芳醛按1∶1～1.5(是否需要扩大1∶1～5，与n取代范围一致性，否则删除n)(回答：此处不需要修改，理由同权利说明书中的相关说明)的摩尔当量混合，投入到正丁醇中(按每毫摩尔V需40～50毫升)，于100℃-130℃搅拌10-20小时后，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离得目标物N’-(R3-取代苯亚甲基)-2-(4-氧代-5-R1取代-6-R2-取代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(I)。
以上说明中所述惰性溶剂包括四氢呋喃，二氯甲烷，氯仿，二氧六环，甲苯，优选四氢呋喃；所述有机溶剂包括乙酸乙酯，二氯甲烷，氯仿，乙醚，甲苯，优选乙酸乙酯。
本发明的化合物不仅合成方法简便，而且可促进肿瘤细胞中Caspase-3依赖的细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞的增殖，同时对于正常细胞的毒性低，可以用于制备抗肿瘤药物，尤其是适用于制备治疗宫颈癌、肺癌或乳腺癌的抗肿瘤药物。
附图说明
图1.化合物I-15、I-23、I-25、I-27和I-35对宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响(流式细胞术检测，采用DMSO为阴性对照)。
Apop：apoptosis的缩写，在此指流式细胞术所测出的细胞凋亡峰。
FL2-Area：FL2橙色荧光吸收峰面积，在此代表DNA分子含量。
图2.化合物I-23、I-27和I-35对PARP蛋白及Caspase-3的激活作用(Western Blot方法检测)。
DMSO：二甲亚砜
PARP：poly ADP-ribose polymerase，聚ADP核糖聚合酶
Caspase-3：半胱天冬酶-3
Tubulin：微管蛋白
具体实施方式
在以下的实施例中将进一步举例说明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例中的所有参数以及其余的说明，除另有说明外，都是以质量(克)为单位，实施例中所说的室温是指20℃-30℃。
实施例1
2-氨基-4，5，6，7-四氢-苯并[b]噻吩-3-甲酸乙酯(化合物II的一种(II-1))
将环己酮(2.4克，20mmol)、氰乙酸乙酯(3.4克，30mmol)、单质硫(0.96克，30mmol)、碱性氧化铝(1.8克)和吗啉(2.6克，30mmol)投入到50mL的圆底烧瓶中，放置到家用微波炉中，在140W微波辐射下，反应15分钟。冷去后，反应混合物直接用柱层析法(乙酸乙酯/石油醚＝1/10)分离纯化，得到2.0克类白色固体(II-1)，产率44％。Mp 112-115℃；1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.37(t，3H)，1.80(m，4H)，2.53(m，2H)，2.73(m，2H)，4.30(q，2H)，6.00(br，2H)。
实施例2
5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-4-酮(化合物III的一种(III-1))
将2-氨基-4，5，6，7-四氢-苯并[b]噻吩-3-甲酸乙酯(0.90克，4.0mmol，II-1)投入到甲酰胺(10mL)中，回流搅拌1.5小时。冷去后，将反应液倾入水中，抽滤，水洗，干燥，得到0.74克白色固体(III-1)，产率90％。Mp 256-259℃；1HNMR(400MHz，DMSO)：δ1.74-1.80(m，4H)，2.74(m，2H)，2.87(m，2H)，8.00(s，1H)，12.33(s，1H)。
实施例3
4-氧代-5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-乙酸乙酯(化合物IV的一种(IV-1))
将5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-4-酮(206毫克，1mmol，III-1)、溴乙酸乙酯(167毫克，1mmol)、碳酸钾(0.2克，1.45mmol)投入到丙酮(5mL)中，于55℃搅拌反应48小时。将反应液倾入水中，乙酸乙酯萃取(20mL×3)，得到的有机层经干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物用柱层析法(乙酸乙酯/石油醚＝1/4)分离纯化，得到200毫克白色固体(IV-1)，产率68％。Mp 99-102℃；1H NMR(DMSO，400MHz)δ1.23(t，3H)，1.75-1.82(m，4H)，2.77(m，2H)，2.87(m，2H)，4.19(q，2H)，4.80(s，2H)，8.36(s，1H)。
实施例4
4-氧代-5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-乙酰肼(化合物V的一种(V-1))
将4-氧代-5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-乙酸乙酯(1.5克，5.1mmol，IV-1)、85％水合肼(2mL)投入到乙醇(100mL)中。回流搅拌12小时，减压蒸除大部分溶剂，将析出的固体抽滤，少量乙醇洗得1.28克浅黄色固体(V-1)，产率89％。Mp 247-250℃；1H NMR(DMSO，400MHz)δ1.23(t，3H)，1.75-1.83(m，4H)，2.78(m，2H)，2.85(m，2H)，4.30(s，2H)，4.58(s，2H)，8.34(s，1H)，9.40(s，1H)。
实施例5
N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-1))
将4-氧代-5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-乙酰肼(55毫克，0.2mmol，V-1)和2-羟基苯甲醛(13.5毫克，0.22mmol)投入到正丁醇(10mL)中。于110℃搅拌12小时后，减压蒸除溶剂，残余物用柱层析法(乙酸乙酯/石油醚＝3/1)分离纯化，得到53毫克白色固体(I-1)，产率70％。Mp 267-271℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：1.75-1.83(m，4H)，2.78(m，2H)，2.85(m，2H)，5.16(s，2H)，6.87(t，1H)，6.90(d，1H)，7.26(t，1H)，7.74(d，1H)，8.30(s，1H)，8.36(s，1H)，10.09(s，1H)，11.72(s，1H)；EI-MS m/z 382.1(M+)，247.1(100％)；HRMS(ESI)m/z计算值(calcd)C19H18N4NaO3S[M+Na]+405.0997，实测值(found)405.0992。
实施例6
N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-2))
将2-羟基苯甲醛替换成3-氟-4-氯苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5。Mp 310-311℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：1.75-1.83(m，4H)，2.78(m，2H)，2.85(m，2H)，5.20(s，2H)，7.58-7.70(m，2H)，7.81(d，1H)，8.04(s，1H)，8.30(s，1H)，11.94(s，1H)；EI-MS m/z 418.1(M+)，247.1(100％)；HRMS(ESI)m/z calcd C19H16ClFN4NaO2S[M+Na]+441.0564，found441.0559。
实施例7
N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-3))
将2-羟基苯甲醛替换成4-氰基苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5。Mp 282-284℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：1.75-1.83(m，4H)，2.78(m，2H)，2.85(m，2H)，5.21(s，2H)，7.90(d，4H)，8.11(s，1H)，8.31(s，1H)，12.02(s，1H)；EI-MS m/z 391.1(M+)，247.1(100％)；HRMS(ESI)m/z calcd C20H17N5NaO2S[M+Na]+414.1001，found 414.0995。
实施例8
N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-4))
将2-羟基苯甲醛替换成3-硝基-4-氯苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5。Mp 253-265℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：1.70-1.86(d，2H)，2.77(m，2H)，2.86(m，2H)，5.22(s，2H)，7.85(d，1H)，8.05(d，1H)，8.11(s，1H)，8.30(s，1H)，8.44(s，1H)，12.04(s，1H)；EI-MS m/z 445.1(M+)，247.1(100％)；HRMS(ESI)m/z calcd C19H16ClN5NaO4S[M+Na]+468.0509，found 468.0504。
实施例9
N’-[(4-三氟甲基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-5))
将2-羟基苯甲醛替换成4-三氟甲基苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例5。Mp 300-301℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：1.72-1.85(m，4H)，2.77(m，2H)，2.86(m，2H)，5.22(s，2H)，7.81(d，2H)，7.96(d，2H)，8.13(s，1H)，8.31(s，1H)，11.97(s，1H)；EI-MS m/z 434.1(M+)，247.1(100％)；HRMS(ESI)m/z calcd C20H17F3N4NaO2S[M+Na]+457.0922，found457.0917。
实施例10
N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7-二氢-环戊烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-6))
将环己酮替换成环戊酮，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp280-282℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：2.40(m，2H)，2.93(m，4H)，5.18(s，2H)，6.87(t，1H)，6.91(d，1H)，7.26(t，1H)，7.75(d，1H)，8.30(s，1H)，8.37(s，1H)，10.06(s，1H)，11.71(s，1H)；EI-MS m/z 368.1(M+)，233.1(100％)；HRMS(ESI)m/z calcd C18H16N4NaO3S[M+Na]+391.0841，found391.0835。
实施例11
N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7-二氢-环戊烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-7))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成环戊酮和4-氰基苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 296-298℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：2.40(m，2H)，2.93(m，4H)，5.23(s，2H)，7.91(d，4H)，8.11(s，1H)，8.31(s，1H)，12.03(s，1H)；EI-MS m/z 377.1(M+)，233.1(100％)；HRMS(ESI)m/z calcd C19H15N5NaO2S[M+Na]+400.0844，found 400.0839。
实施例12
N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7-二氢-环戊烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-8))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成环戊酮和3-氟-4-氯苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 304-305℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：2.40(m，2H)，2.93(m，4H)，5.22(s，2H)，7.55-7.75(m，2H)，7.79(s，1H)，8.04(s，1H)，8.30(s，1H)，11.95(s，1H)；EI-MS m/z 404.1(M+)，233.1(100％)；HRMS(ESI)m/z calcd C18H14ClFN4NaO2S[M+Na]+427.0408，found427.0402。
实施例13
N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7-二氢-环戊烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-9))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成环戊酮和3-硝基-4-氯苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 285-287℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：2.40(m，2H)，2.93(m，4H)，5.24(s，2H)，7.86(d，1H)，8.06(d，1H)，8.12(s，1H)，8.31(s，1H)，8.45(s，1H)，12.06(s，1H)；EI-MS m/z 431.1(M+)，233.1(100％)；HRMS(ESI)m/z calcd C18H14ClN5NaO4S[M+Na]+454.0353，found 454.0347。
实施例14
N’-[(3-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7-二氢-环戊烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-10))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成环戊酮和3-羟基苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 294-296℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：2.37(m，2H)，2.90(m，4H)，5.16(s，2H)，6.83(d，1H)，7.11(d，1H)，7.12(s，1H)，7.25(t，1H)，7.95(s，1H)，8.26(s，1H)，10.11(s，1H)，11.78(s，1H)；EI-MS m/z 368.1(M+)，233.1(100％)；HRMS(ESI)m/z calcdC18H17N4O3S[M+H]+369.1021，found 369.1016。
实施例15
N’-[(4-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7-二氢-环戊烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-11))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成环戊酮和4-羟基苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 308-320℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：2.39(m，2H)，2.93(m，4H)，5.16(s，2H)，6.83(d，2H)，7.55(d，2H)，7.94(s，1H)，8.30(s，1H)，9.93(s，1H)，11.59(s，2H)；ESI-MS m/z 369.0[M+H]+；HRMS(ESI)m/z calcd C18H17N4O3S[M+H]+369.1021，found 369.1016。
实施例16
N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7，8，9-四氢-环庚烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-12))
将环己酮替换成环庚酮，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp244-249℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：1.61(m，4H)，1.85(m，2H)，2.85(m，2H)，3.25(m，2H)，5.16(s，2H)，6.87(t，1H)，6.91(d，1H)，7.26(t，1H)，7.74(d，1H)，8.29(s，1H)，8.36(s，1H)，10.06(s，1H)，11.69(s，1H)；EI-MS m/z 396.2(M+)，261.1(100％)；HRMS(ESI)m/z calcd C20H21N4O3S[M+H]+397.1334，found 397.1329。
实施例17
N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7，8，9-四氢-环庚烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-13))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成环庚酮和4-氰基苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 292-294℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：1.61(m，4H)，1.85(m，2H)，2.85(m，2H)，3.25(m，2H)，5.21(s，2H)，7.91(d，4H)，8.11(s，1H)，8.31(s，2H)，12.01(s，1H)；EI-MS m/z 405.2(M+)，261.1(100％)；HRMS(ESI)m/z calcd C21H20N5O2S[M+H]+406.1338，found406.1332。
实施例18
N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7，8，9-四氢-环庚烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-14))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成环庚酮和3-氟-4-氯苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 272-274℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：1.61(m，4H)，1.85(m，2H)，2.85(m，2H)，3.25(m，2H)，5.20(s，2H)，7.59-7.73(m，2H)，7.82(s，1H)，8.04(s，1H)，8.30(s，1H)，11.93(s，1H)；EI-MS m/z 432.1(M+)，261.1(100％)；HRMS(ESI)m/z calcd C20H19ClFN4O2S[M+H]+433.0901，found 433.0896。
实施例19
N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7，8，9-四氢-环庚烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-15))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成环庚酮和3-硝基-4-氯苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 243-248℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：1.61(m，4H)，1.85(m，2H)，2.85(m，2H)，3.25(m，2H)，5.22(s，2H)，7.86(d，1H)，8.06(d，1H)，8.12(s，1H)，8.30(s，1H)，8.45(s，1H)，12.04(s，1H)；EI-MS m/z 459.1(M+)，261.1(100％)；HRMS(ESI)m/z calcdC20H19ClN5O4S[M+H]+460.0846，found 460.0841。
实施例20
N’-[(3-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7，8，9-四氢-环庚烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-16))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成环庚酮和3-羟基苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 280-282℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：1.61(m，4H)，1.85(m，2H)，2.85(m，2H)，3.25(m，2H)，5.17(s，2H)，6.84(d，1H)，7.11(d，1H)，7.14(s，1H)，7.25(t，1H)，7.97(s，1H)，8.30(s，1H)，9.63(t，1H)，11.73(s，1H)；ESI-MS m/z 397.1[M+H]+；HRMS(ESI)m/z calcd C20H21N4O3S[M+H]+397.1334，found 397.1330。
实施例21
N’-[(4-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7，8，9-四氢-环庚烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-17))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成环庚酮和4-羟基苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 288-290℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：1.61(m，4H)，1.85(m，2H)，2.85(m，2H)，3.25(m，2H)，5.14(s，2H)，6.83(d，2H)，7.55(d，2H)，7.94(s，1H)，8.29(s，1H)，9.93(s，1H)，11.57(s，1H)；ESI-MS m/z 397.1[M+H]+；HRMS(ESI)m/z calcd C20H21N4O3S[M+H]+397.1334，found 397.1332。
实施例22
N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-苯基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-18))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成苯乙酮和3-氟-4-氯苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 229-231℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：5.24(s，2H)，7.44(d，2H)，7.53(d，2H)，7.64(m，4H)，7.80(d，1H)，8.04(s，1H)，8.48(s，1H)，11.92(s，1H)；ESI-MS m/z 441.0[M+H]+；HRMS(ESI)m/z calcd C21H15ClFN4O2S[M+H]+441.0588，found 441.0583。
实施例23
N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(4-氯-苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙(化合物I的一种(I-19))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成4-氯苯乙酮和3-氟-4-氯苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 235-238℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：5.24(s，2H)，7.37(d，2H)，7.51(d，2H)，7.58(s，1H)，7.60(d，1H)，7.67(d，1H)，7.80(d，1H)，8.04(s，1H)，8.47(s，1H)，11.92(s，1H)；ESI-MS m/z 475.0[M+H]+；HRMS(ESI)m/z calcd C21H14Cl2FN4O2S[M+H]+475.0199，found 475.0193。
实施例24
N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(4-氯-苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙(化合物I的一种(I-20))
将环己酮替换成4-氯苯乙酮，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 256-258℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：5.20(s，2H)，6.89(m，2H)，7.26(t，1H)，7.44(d，2H)，7.53(d，2H)，7.64(s，1H)，7.74(d，1H)，8.36(s，1H)，8.48(s，1H)，10.05(s，1H)，11.68(s，1H)；ESI-MS m/z 439.0[M+H]+；HRMS(EI)m/z calcd C21H16ClN4O3S[M+H]+439.0632，found 439.0626。
实施例25
N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-苯基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-21))
将环己酮替换成苯乙酮，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp226-229℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：5.20(s，2H)，6.90(m，3H)，7.26(t，1H)，7.37(d，2H)，7.51(d，2H)，7.57(s，1H)，7.74(d，1H)，8.36(s，1H)，8.47(s，1H)，10.05(s，1H)，11.68(s，1H)；ESI-MS m/z 405.1[M+H]+；HRMS(EI)m/z calcd C21H17N4O3S[M+H]+405.1021，found 405.1016。
实施例26
N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(4-氯-苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙(化合物I的一种(I-22))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成4-氯苯乙酮和4-氰基苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 299-305℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：5.25(s，2H)，7.44(d，2H)，7.53(d，2H)，7.64(s，1H)，7.91(d，4H)，8.11(s，1H)，8.48(s，1H)，12.00(s，1H)；EI-MS m/z 448.0[M+H]+；HRMS(ESI)m/z calcd C22H15ClN5O2S[M+H]+448.0635，found 448.0630。
实施例27
N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(4-氯-苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙(化合物I的一种(I-23))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成4-氯苯乙酮和3-硝基-4-氯苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 265-267℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：5.26(s，2H)，7.44(d，2H)，7.53(d，2H)，7.64(s，1H)，7.85(d，1H)，8.05(d，1H)，8.11(s，1H)，8.44(s，1H)，8.48(s，1H)，12.03(s，1H)；ESI-MS m/z 501.9[M+H]+；HRMS(ESI)m/z calcd C21H14Cl2N5O4S[M+H]+502.0144，found 502.0138。
实施例28
N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-苯基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-24))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成苯乙酮和4-氰基苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 244-246℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：5.25(s，2H)，7.37(m，3H)，7.51(d，2H)，7.57(s，1H)，7.90(d，4H)，8.10(s，1H)，8.47(s，1H)，11.99(s，1H)；ESI-MS m/z 414.1[M+H]+；HRMS(EI)m/z calcd C22H16N5O2S[M+H]+414.1026，found 414.1019。
实施例29
N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-苯基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-25))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成苯乙酮和3-硝基-4-氯苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 225-228℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：5.25(s，2H)，7.37(m，3H)，7.50(dd，2H)，7.58(s，1H)，7.85(d，1H)，8.04(dd，1H)，8.10(s，1H)，8.44(d，1H)，8.48(s，1H)，12.06(s，1H)；ESI-MS m/z 468.1[M+H]+；HRMS(ESI)m/z calcd C21H15ClN5O4S[M+H]+468.0533，found 468.0528。
实施例30
N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-甲基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-26))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成丙酮和3-氟-4-氯苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 296-298℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：2.47(s，3H)，5.22(s，2H)，7.22(s，1H)，7.62(dd，1H)，7.69(t，1H)，7.81(dd，1H)，8.05(s，1H)，8.37(s，1H)，11.97(s，1H)；EI-MS m/z 379.0[M+H]+；HRMS(ESI)m/z calcd C16H13ClFN4O2S[M+H]+379.0432，found 379.0426。
实施例31
N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(3-甲基-4-氯-苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙(化合物I的一种(I-27))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成3-甲基-4-氯苯乙酮和3-氟-4-氯苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 158-166℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：2.35(s，3H)，5.25(s，2H)，7.32(d，1H)，7.41(d，1H)，7.48(s，1H)，7.61(s，1H)，7.85(d，1H)，8.05(d，1H)，8.10(s，1H)，8.44(s，1H)，8.47(s，1H)，12.06(s，1H)；ESI-MS m/z 489.0[M+H]+；HRMS(ESI)m/z calcd C22H16Cl2FN4O2S[M+H]+489.0355，found 489.0350。
实施例32
N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-甲基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-28))
将环己酮替换成丙酮，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp275-280℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：2.47(s，3H)，5.18(s，2H)，6.88(m，2H)，7.21(s，1H)，7.25(d，1H)，7.75(d，1H)，8.36(s，1H)，8.37(s，1H)，10.09(s，1H)，11.74(s，1H)；ESI-MS m/z 343.0[M+H]+；HRMS(ESI)m/z calcd C16H15N4O3S[M+H]+343.0865，found 343.0859。
实施例33
N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-甲基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-29))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成丙酮和4-氰基苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 299-303℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：2.46(s，3H)，5.24(s，2H)，7.22(s，1H)，7.92(d，4H)，8.12(s，1H)，8.37(s，1H)，12.05(s，1H)；ESI-MS m/z 352.1[M+H]+；HRMS (ESI)m/z calcdC17H14N5O2S[M+H]+352.0868，found 352.0863。
实施例34
N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-甲基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(化合物I的一种(I-30))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成丙酮和3-硝基-4-氯苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 282-284℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：2.46(s，3H)，5.24(s，2H)，7.22(s，1H)，7.86(d，1H)，8.06(d，1H)，8.12(s，1H)，8.37(s，1H)，8.45(s，1H)，12.08(s，1H)；ESI-MS m/z 406.0[M+H]+；HRMS(ESI)m/z calcd C16H13ClN5O4S[M+H]+406.0377，found 406.0371。
实施例35
N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(3-甲基-4-氯-苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙(化合物I的一种(I-31))
将环己酮替换成3-甲基-4-氯苯乙酮，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 233-236℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：2.35(s，3H)，5.19(s，2H)，6.89(m，2H)，7.25(t，1H)，7.33(d，1H)，7.41(d，1H)，7.48(s，1H)，7.60(s，1H)，7.74(d，1H)，8.35(s，1H)，8.47(s，1H)，10.08(s，1H)，11.71(s，1H)；ESI-MS m/z 453.0[M+H]+；HRMS(ESI)m/z calcdC22H18ClN4O3S[M+H]+453.0788，found 453.0783。
实施例36
N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(萘-2-基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙(化合物I的一种(I-32))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成2-萘乙酮和3-氟-4-氯苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 184-192℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：5.24(s，2H)，7.54(m，3H)，7.63(d，1H)，7.67(s，1H)，7.70(s，1H)，7.90(d，1H)，7.93(m，3H)，8.03(s，1H)，8.32(s，1H)，8.43(s，1H)，11.95(s，1H)；ESI-MS m/z 491.1[M+H]+；HRMS(ESI)m/z calcd C25H17ClFN4O2S[M+H]+491.0745，found 491.0739。
实施例37
N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(萘-2-基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙(化合物I的一种(I-33))
将环己酮替换成2-萘乙酮，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 229-231℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：5.20(s，2H)，6.87(d，1H)，6.90(t，1H)，7.25(t，1H)，7.53(q，2H)，7.63(dd，1H)，7.70(s，1H)，7.73(d，1H)，7.89(d，1H)，7.93(m，2H)，8.04(s，1H)，8.34(s，1H)，8.50(s，1H)，10.07(s，1H)，11.70(s，1H)；ESI-MS m/z 455.1[M+H]+；HRMS(EI)m/z calcd C25H19N4O3S[M+H]+455.1178，found 455.1172。
实施例38
N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(萘-2-基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙(化合物I的一种(I-34))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成2-萘乙酮和4-氰基苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 228-237℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：5.26(s，2H)，7.53(q，2H)，7.63(d，1H)，7.70(s，1H)，7.91(m，7H)，8.04(s，1H)，8.08(s，1H)，8.50(s，1H)，12.03(s，1H)；ESI-MS m/z 464.0[M+H]+；HRMS(ESI)m/z calcd C26H18N5O2S[M+H]+464.1181，found 464.1176。
实施例39
N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(萘-2-基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙(化合物I的一种(I-35))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成2-萘乙酮和3-硝基-4-氯苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 233-237℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：5.26(s，2H)，7.53(q，2H)，7.63(d，1H)，7.71(s，1H)，7.84(d，1H)，7.89(d，1H)，7.93(q，2H)，8.03(s，1H)，8.04(d，1H)，8.09(s，1H)，8.44(s，1H)，8.50(s，1H)，12.05(s，1H)；ESI-MS m/z 518.1[M+H]+；HRMS(ESI)m/z calcd C25H16ClN5NaO4S[M+Na]+540.0509，found 540.0504。
实施例40
N’-[(3-硝基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(4-氯苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙(化合物I的一种(I-36))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成4-氯苯乙酮和3-硝基苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 195-197℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：5.26(s，2H)，7.44(d，2H)，7.53(d，2H)，7.64(s，1H)，7.75(t，1H)，8.18(s，1H)，8.19(d，1H)，8.27(d，1H)，8.49(s，1H)，8.55(s，1H)，12.03(s，1H)；ESI-MS m/z 468.0[M+H]+；HRMS(ESI)m/z calcd C21H15ClN5O4S[M+H]+468.0533，found 468.0528。
实施例41
N’-[(3，4-二羟基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(4-氯苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙(化合物I的一种(I-37))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成4-氯苯乙酮和3，4-二羟基苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 296-298℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：5.17(s，2H)，6.78(d，1H)，6.93(d，1H)，7.18(s，1H)，7.44(d，2H)，7.53(d，2H)，7.64(s，1H)，7.86(s，1H)，8.48(s，1H)，9.23(s，1H)，9.45(s，1H)，11.54(s，1H)；ESI-MS m/z 455.0[M+H]+；HRMS(EI)m/zcalcd C21H16ClN4O4S[M+H]+455.0581，found 455.0575。
实施例42
N’-[(3-硝基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(萘-2-基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙(化合物I的一种(I-38))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成2-萘乙酮和3-硝基苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 161-165℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：5.27(s，2H)，7.52(q，2H)，7.63(d，1H)，7.71(s，1H)，7.75(t，1H)，7.89(d，1H)，7.93(q，2H)，8.04(s，1H)，8.17(s，1H)，8.18(d，1H)，8.26(d，1H)，8.50(s，1H)，8.54(s，1H)，12.03(s，1H)；ESI-MS m/z 484.1[M+H]+；HRMS(EI)m/z calcd C25H18N5O4S[M+H]+484.1079，found 484.1074。
实施例43
N’-[(3，4-二羟基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(萘-2-基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙(化合物I的一种(I-39))
将环己酮和2-羟基苯甲醛分别替换成2-萘乙酮和3，4-二羟基苯甲醛，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-5。Mp 267-271℃；1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：5.24(s，2H)，6.00(d，1H)，6.43(d，2H)，7.25(t，1H)，7.38(t，2H)，7.47(t，2H)，7.64(d，2H)，7.89(d，2H)，8.68(d，1H)，10.83(s，1H)，11.55(s，2H)；ESI-MS m/z 471.0[M+H]+；HRMS(ESI)m/z calcdC25H19N4O4S[M+H]+471.1127，found 471.1122。
实施例44
本发明化合物对三种肿瘤细胞株增殖的百分抑制活性测定
选取本发明化合物I-1～I-39，采用MTT比色法测定其对肿瘤细胞抑制活性。受试肿瘤细胞株为肺癌A549细胞、宫颈癌HeLa细胞和乳腺癌MDA-MB-231细胞。具体步骤为：
●取处于指数生长期、状态良好的肿瘤细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数3～5×104个/mL，制成细胞悬液；
●取细胞悬液接种于96孔板上，100μl/孔，置恒温CO2培养箱中培养24h；
●换含本发明化合物(浓度为20μM)的培养液，100μl/孔，处理细胞48h；
●将MTT(5μg/mL)加入96孔板中，15μl/孔，培养箱中反应4h；
●加入三联剂溶解晶体，50μl/孔，放置过夜(自封袋封闭防止盐酸挥发)；
●用多功能酶标仪在波长为550nm处测定每孔吸光值，按下列公式计算细胞抑制率。
本发明所描述的化合物在该项测试中获得的完全结果见表1。
表1.N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙类化合物对三种肿瘤细胞增殖百分抑制率数据
实施例45
本发明部分化合物对三种肿瘤细胞株抑制增殖活性的半数有效抑制浓度(IC50)的测定
选取I-1、I-15、I-23、I-25、I-27和I-35这6个显示出较强抑制活性的化合测IC50，分别配制6种不同浓度的待测化合物溶液(1.563μM，3.125μM，6.25μM，12.5μM，25μM，50μM)进行测试，实验方法和体系如实施例44。使用Graphpad软件对不同浓度下细胞存活率进行拟合分析从而得到化合物的IC50值，结果见表2。同时，我们平行测试了I-1、I-15、I-23、I-25、I-27和I-35这6个化合物对正常人胚肾细胞HEK-293T的增殖抑制活性，发现本发明化合物对正常细胞增殖的影响很小(IC50＞50μM，表2)，这说明本发明化合物的毒性较小。
以上化合物在在该项测试中获得的完全结果见表2。
表2.部分活性突出的N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙类化合物对三种肿瘤细胞增殖抑制IC50数值
实施例46
本发明部分化合物诱导细胞凋亡机制的测定
选择抗肿瘤作用明显的化合物I-15、I-23、I-25、I-27和I-35，进行初步的作用机制研究。应用流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡及细胞周期变化；通过利用Western Blot方法检测PARP蛋白的降解以判断小分子抑制剂能否引起Caspase依赖的细胞凋亡。
选取本化合物I-15、I-23、I-25、I-27和I-35各20μM处理HeLa细胞12小时后，用胰酶消化制成单细胞细胞悬液，用于流式细胞仪检测。具体步骤如下：
(1)制备的单细胞悬液可用70％乙醇固定，4摄氏度保存。
(2)染色前用PBS洗一次，进行离心沉淀去除固定液。
(3)加20ulRNase A 37摄氏度水浴30分钟.再加入800ul PI染色液混匀，至4摄氏度避光30分钟。
(4)用流式细胞仪进行测试.记录激发波长488nm处的红色荧光。
(5)结果使用WinMDI 2.9软件进行分析。
流式细胞检测结果表明：化合物I-23、I-27和I-35能够有效诱导HeLa细胞的凋亡(参见附图1)。
为了进一步印证该结果，我们选取了细胞凋亡过程中关键的蛋白Caspase3及PARP，使用Western Blot方法来观察其激活情况。具体步骤如下：
(1)选取化合物I-23、I-27、I-35处理HeLa细胞12小时后收取裂解细胞，制成全细胞裂解液，煮沸后以备聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
(2)配置10％-15％的分离胶及5％的基层胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。基层胶分离电压为60V，分离胶分离电压为120V，溴酚蓝指示剂跑至底部停止。
(3)蛋白质经SDS-PAGE胶分离后，将其从凝胶上转移到PVDF膜上。采用湿转法，转膜电压为110-120V，至电流达到350mA停止(或根据蛋白大小调整转移时间)。
(4)将转好的PVDF膜用含5％脱脂牛奶的TBST置于脱色摇床室温震荡1小时。
(5)用1×TBST配置的3％BSA稀释一抗至1∶1000-1∶10000的比例，4℃置于脱色摇床振荡结合过夜。
(6)1×TBST洗5分钟，洗三次。
(7)用1×TBST配置的3％BSA稀释二抗至1∶5000-1∶10000的比例，室温置脱色摇床振荡结合1小时，1×TBST洗5分钟，洗三次，水洗5分钟，洗2次。
(8)将膜使用ECL试剂盒底物作用1-5分钟，化学发光检测，曝光于X胶片。
Western Blot方法检测表明：化合物I-23、I-27和I-35可以诱导HeLa细胞中Caspase-3蛋白的活化，引起PARP蛋白降解，体现出Caspase-3蛋白依赖的细胞凋亡的典型特征(参见附图2)。
结果表明所述的N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙类化合物(I-23、I-25、I-27和I-35，结构式如下所示)对人肺癌A549细胞、人宫颈癌HeLa细胞和人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖均显示出明显的抑制作用，并且对正常细胞具有较低的毒副作用。进一步的生物实验结果表明这些化合物可以诱导Caspase-3依赖的细胞凋亡，印证了其抗肿瘤效果的分子作用机制。这些化合物具有开发成新型抗肿瘤药物的潜力，推荐用于制备治疗宫颈癌、肺癌、乳腺癌的抗肿瘤药物。
Claims (10)
1.一种N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙类化合物，其具有式I所示结构：
式(I)中：
R1和R2共同选自-(CH2)m-，即噻吩环并合一个脂肪环，其中m为3-5的整数；
或者R1选自芳香基Ar，R2为氢原子；其中，Ar取代基选自5-7元芳香基、Z取代的5-7元芳香基、5-7元杂芳基、Z取代的5-7元杂芳基、并合5-7元杂芳基的5-7元芳香基、Z取代的并合5-7元杂芳基的5-7元芳香基，所述的杂环基中的杂原子为N、O或S，所含杂原子的数目为1-3；所述的Z取代基选自：卤素、C1-C4烷氧基、硝基、C1-C6直链或支链烃基、羟基取代的C1-C6直链或支链烃基、C3-C7饱和或不饱和环烷基；Z取代基的数目为1-4；
R3选自卤素、C1-C6直链或支链烃基、羟基、C1-C4烷氧基、羧基、C1-C4酯基、氰基、硝基、氨基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、巯基或C1-C4酰基；n为1-4的整数。
2.如权利要求1所述的N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙类化合物，其特征在于，所述的Ar取代基为苯基、Z取代的苯基、萘基或Z取代的苯基；所述的Z取代基如权利要求1所述。
3.如权利要求1所述的N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙类化合物，其特征在于，所述的N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙类化合物为N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(4-三氟甲基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5，6，7，8-四氢-苯并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7-二氢-环戊烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7-二氢-环戊烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7-二氢-环戊烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7-二氢-环戊烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7-二氢-环戊烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(4-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7-二氢-环戊烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7，8，9-四氢-环庚烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7，8，9-四氢-环庚烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7，8，9-四氢-环庚烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7，8，9-四氢-环庚烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7，8，9-四氢-环庚烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(4-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-6，7，8，9-四氢-环庚烷并[4，5]噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-苯基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(4-氯-苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(4-氯-苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-苯基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(4-氯-苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(4-氯-苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-苯基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-苯基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-甲基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(3-甲基-4-氯-苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-甲基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-甲基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-(4-氧代-5-甲基-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙、N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(3-甲基-4-氯-苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(3-氟-4-氯苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(萘-2-基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(2-羟基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(萘-2-基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(4-氰基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(萘-2-基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(3-硝基-4-氯苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(萘-2-基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(3-硝基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(4-氯苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(3，4-二羟基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(4-氯苯基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(3-硝基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(萘-2-基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙、N’-[(3，4-二羟基苯基)亚甲基]-[4-氧代-5-(萘-2-基)-噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基]乙酰腙。
4.一种制备如权利要求1所述化合物的方法，包括以下步骤：
1)将R1，R2-取代乙酮、氰乙酸乙酯、单质硫、碱性氧化铝和吗啉按1∶1.5∶1.5∶0.5～1∶1.5的摩尔当量混合，放入微波炉中，140W辐射10-30分钟；冷却后，柱层析分离得到4-R1取代-5-R2取代-2-氨基-噻吩-3-甲酸乙酯(II)；
2)按每克II需10～15毫升甲酰胺，将化合物II和甲酰胺混合，200～210℃搅拌反应1-5小时；冷去后，将反应液倾入水中，抽滤，水洗，干燥，得到5-R1取代-6-R2取代噻吩[2，3-d]嘧啶-4-酮(III)；
3)在惰性溶剂中和40℃-60℃条件下，化合物III、溴乙酸乙酯和碳酸钾按1∶1∶1～1.5的摩尔当量混合，反应24-72小时；得到(4-氧代-5-R1取代-6-R2-取代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酸乙酯(IV)；
4)按每克IV需1～1.5毫升85％的水合肼和50～80毫升乙醇，将化合物IV和85％的水合肼投入到乙醇中，70～85℃反应10-20小时得到(4-氧代-5-R1取代-6-R2-取代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰肼(V)；
5)在正丁醇中和100℃-130℃，化合物V和R3-取代芳醛按1∶1～1.5(是否需要扩大1∶1～5，与n取代范围一致性，否则删除n)(回答：R3取代基无论是几个，都是由反应原料直接带入，故不存在取代基多，就投料量大的问题。所以此处不需要修改)的摩尔当量混合，反应10-20小时得到N’-(R3-取代苯亚甲基)-2-(4-氧代-5-R1取代-6-R2-取代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙(I)。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征是步骤2)中所述产物，经过冷却后，将反应液倾入水中，抽滤，水洗和干燥的后处理；步骤3)中所述反应产物倾入水中，有机溶剂萃取，有机层经干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离的后处理；步骤4)中所述反应产物经减压蒸除60～80％的溶剂，将析出的固体抽滤和乙醇洗涤的后处理；步骤5)中所述反应产物经减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离的后处理。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征是步骤3)中所述惰性溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、二氧六环或甲苯。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征是所述的步骤3)中有机溶剂为乙酸乙酯，二氯甲烷，氯仿，乙醚或甲苯。
8.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物包含治疗有效量的一种或多种如权利要求1～2中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
9.如权利要求1～2中任意一项所述的N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.如权利要求8所述的N’-芳亚甲基-2-(4-氧代噻吩[2，3-d]嘧啶-3-基)乙酰腙类化合物或其药学上可接受的盐的应用，其特征是所述的抗肿瘤药物为治疗宫颈癌、肺癌或乳腺癌的药物。
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