CN102331459B - 一种检测钟花报春花质量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测钟花报春花质量的方法，采用HPLC指纹图谱技术，色谱图中特征峰分离度良好，且相似度高，能够有效用于对钟花报春花药材的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测钟花报春花质量的方法，具体地，是采用HPLC指纹图谱进行检测的方法。
背景技术
钟花报春(Primula sikkmensis Hook)属于报春花科报春花属植物，是一种常见的藏药材，以花入药，是藏药“相相直吾”其中的一种原植物。花黄色，钟状，聚生于花葶顶端，主产于西藏东部及南部、青海东南部、四川西部、云南西北部；生于海拔3750-4500米的林缘湿草地、水沟边；分布于尼泊尔、锡金、不丹、缅甸。
藏族民间用全草作止泻药，其疗效独特显著。主要用于清热，小儿热痢、小儿肺炎等疾病，疗效确切，经几个藏医院的临床医生实践证明，在治疗小儿热痢方面，有效率达到80％，在甘孜藏族地区，藏民们也广泛使用，且资源十分丰富。
虽然我国的报春花资源极其丰富，但已进行研究的种类很少，王凤英等应用简单序列重复区间(ISSR，Inter-simple sequence repeat)分子标记对喜马拉雅-横断山区钟花报春居群遗传多样性及遗传分化进行了研究，研究结果表明喜马拉雅-横断山区钟花报春的13个居群具有很高的遗传多样性，并且居群间的分化也很大；朱惠芬等应用ITS序列分析探讨了偏花报春是属于灯台报春组还是钟花报春组。
在对钟花报春花的研究中，彭腾等从钟花报春花中分离鉴定了7个化合物(彭腾，等，钟花报春花的化学成分研究，中药材，2008年31卷1期.)，邱建平等利用正交试验研究了从钟花报春花中提取总黄酮的优选工艺(邱建平，等，正交设计优化钟花报春花总黄酮提取工艺，成都医学院学报，2009年4卷4期)。
目前，尚未见对钟花报春花的质量检测的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效、灵敏的检测钟花报春花质量的方法。
本发明提供了一种检测钟花报春花质量的方法，方法如下：
(1)钟花报春花样品的测试溶液制备：
精密称取钟花报春药材粗粉，加入15-30倍w/v的甲醇，静置10-50min，超声提取20-60min，过滤，滤液定容至0.8-1.2g生药/25ml，再取定容液，稀释至原浓度的1/6，微滤，滤液作为样品溶液；
(2)对照品溶液制备：
用甲醇或流动相溶液溶解2-苯基色原酮对照品，微滤，滤液作为对照品溶液；
(3)色谱条件：
色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂；紫外检测器，检测波长为292±10nm；流动相为乙腈-水系统，梯度洗脱，梯度条件如下：
(4)高效液相色谱检测：取步骤(1)制备得到的样品溶液和步骤(2)制备得到的对照品溶液，注入高效液相色谱仪，进行检测，得到钟花报春花样品的指纹图谱；
(5)比对：将钟花报春花样品的指纹图谱与标准指纹图谱进行比对；其中，标准指纹图谱特征如下：有8个共有特征峰；以2-苯基色原酮的色谱峰的保留时间和峰面积为1计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，1号峰的相对保留时间为0.18±0.02，相对峰面积为0.023±0.004；2号峰的相对保留时间为0.34±0.03，相对峰面积为0.086±0.017；3号峰的相对保留时间为0.41±0.004，相对峰面积为0.018±0.0036；4号峰的相对保留时间为0.83±0.08，相对峰面积为0.14±0.028；5号峰的相对保留时间为0.89±0.09，相对峰面积为0.18±0.036；6号峰的相对保留时间为1.03±0.1，相对峰面积为0.033±0.007；7号峰的相对保留时间为1.21±0.1，相对峰面积为0.039±0.008；S峰的相对保留时间为1，相对峰面积为1；比对时，以相似度在0.9以上为合格标准。
其中，步骤(1)中，甲醇用量为20倍w/v；静置30min，超声提取40min；滤液定容至1g生药/25ml。
其中，步骤(1)的具体操作如下：精密称取钟花报春花药材粗粉1g，加入甲醇20ml，静置30min，超声提取40min，过滤，滤液冷却至室温后加甲醇定容至25ml，取定容液，稀释至原浓度的1/6，微滤，滤液作为样品溶液。
其中，所述微滤是采用0.45μm微孔滤膜滤过。
其中，步骤(3)中，色谱柱为Diamonsil C18柱，250mm×4.6mm，5μm。
其中，步骤(3)中，检测波长为292nm。
其中，步骤(3)中，柱温为25℃。
其中，步骤(4)中，精密吸取样品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，检测时间为45min。
其中，步骤(5)中，标准指纹图谱特征如下：有8个共有特征峰；以2-苯基色原酮的色谱峰的保留时间和峰面积为1计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，1号峰的相对保留时间为0.1848±0.0104，相对峰面积为0.0228±0.00412；2号峰的相对保留时间为0.3353±0.00291，相对峰面积为0.0859±0.0173；3号峰的相对保留时间为0.4062±0.00583，相对峰面积为0.0182±0.0073；4号峰的相对保留时间为0.8345±0.0020，相对峰面积为0.1412±0.0205；5号峰的相对保留时间为0.8940±0.00114，相对峰面积为0.1831±0.0261；6号峰的相对保留时间为1.0341±0.00122，相对峰面积为0.0325±0.0078；7号峰的相对保留时间为1.2094±0.00310，相对峰面积为0.0389±0.0105；S峰的相对保留时间为1，相对峰面积为1。
进一步地，所述标准指纹图谱如图2所示。
本发明对钟花报春花药材的检测方法，采用HPLC指纹图谱技术，色谱图中特征峰分离度良好，且相似度高，能够有效用于对钟花报春花药材的质量控制。
附图说明
图1钟花报春花指纹图谱S峰的确定(292nm)
图2钟花报春花指纹图谱(292nm)
图37批钟花报春花样品的指纹图谱(292nm)
具体实施方式
实施例1
(1)钟花报春花样品的测试溶液制备：
精密称取钟花报春花药材粗粉1g，加入甲醇20ml，静置30min，超声提取40min，过滤，滤液冷却至室温后加甲醇定容至25ml，取定容液，稀释至原浓度的1/6，微滤，滤液作为样品溶液；
(2)对照品溶液制备：
精密称取2-苯基色原酮对照品0.00982g，置于100ml容量品中，加甲醇定容；使用时，可适当稀释，0.45μm微孔滤膜滤过，滤液作为对照品溶液；
(3)色谱条件：
色谱柱：Diamonsil C18柱，250mm×4.6mm，5μm。；紫外检测器，检测波长为292nm；流动相为乙腈-水系统，梯度洗脱，梯度条件如下：
(4)高效液相色谱检测：取步骤(1)制备得到的样品溶液注入高效液相色谱仪，精密吸取样品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，进行检测，检测时间为45min，得到钟花报春花样品的指纹图谱；
(5)比对：将钟花报春花样品的指纹图谱与标准指纹图谱进行比对；其中，标准指纹图谱特征如下：有8个共有特征峰；以2-苯基色原酮的色谱峰的保留时间和峰面积为1计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，1号峰的相对保留时间为0.1848±0.0104，相对峰面积为0.0228±0.00412；2号峰的相对保留时间为0.3353±0.00291，相对峰面积为0.0859±0.0173；3号峰的相对保留时间为0.4062±0.00583，相对峰面积为0.0182±0.0073；4号峰的相对保留时间为0.8345±0.0020，相对峰面积为0.1412±0.0205；5号峰的相对保留时间为0.8940±0.00114，相对峰面积为0.1831±0.0261；6号峰的相对保留时间为1.0341±0.00122，相对峰面积为0.0325±0.0078；7号峰的相对保留时间为1.2094±0.00310，相对峰面积为0.0389±0.0105；S峰的相对保留时间为1，相对峰面积为1。
在比对时，以相似度为指标，样品的相似度在0.9以上者，为合格品。
实施例2钟花报春花药材HPLC指纹图谱研究
1.1仪器与试药
SSI Series 1500高效液相色谱仪(美国科学系统公司)
AT-550色谱柱恒温箱(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)
BP211D型电子天平(德国Sartorius公司)
BP121S型电子天平(德国Sartorius公司)
DSY-1-2孔型电热恒温水浴锅(北京国华医疗器械厂)
BUG25-12型超声波清洗器(必能信超声(上海)有限公司)
RE-2000B型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)
试剂色谱乙腈和色谱甲醇(Fisher Scientific)，超纯水
材料 自制2-苯基色原酮对照品，纯度为99.83％；购自或采自各地的钟花报春花药材，见表1。
表1钟花报春花药材的来源情况
1.2试药
试剂 乙腈和甲醇(色谱纯)，超纯水
材料 自制2-苯基色原酮对照品，纯度为99.83％；购自或采自各地的钟花报春花药材(同含量测定用药材)
2试验方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱为Diamonsil 250×4.6mm 5μm；柱温为25℃；检测波长为292nm；流速为1ml/min；进样量为20μl；流动相为乙腈-水系统，梯度条件见表2。
表2乙腈-水的梯度条件
2.2对照品及供试品溶液的制备
2.2.1钟花报春花样品溶液的制备
精密称取钟花报春花药材粗粉约1g，置于100ml具塞三角瓶中，加入甲醇20ml，盖上塞子，静置30min，超声提取40min，补足重量。过滤，滤液冷却至室温后加甲醇定容至25ml。取定容液适量，稀释至原浓度的1/6，取稀释液适量，微滤，取续滤液适量，作为钟花报春花样品溶液，备用。
2.2.2对照品溶液的制备
精密称取对照品0.00982g，置于100ml容量品中，加甲醇定容。分别精密量取对照品溶液5ml、10ml、15ml、20ml于四支25ml容量瓶中，加甲醇定容，依次记作对照品1#、2#、3#、4#，原对照品溶液记作对照品5#，备用。
2.3参照峰的选择
在钟花报春花药材中2-苯基色原酮的含量最高；药理实验表明其具有一定生物活性；色谱图中其与相邻峰分离良好，分离度为7.8，因此，选择2-苯基色原酮的峰作为参照峰，并标记为S，见图1。
2.4方法学考察
2.4.1精密度试验 取2#钟花报春花药材粗粉约1g，按供试品溶液的制备方法(2.2.1)制得供试品溶液。在上述色谱条件下，连续进样5次，记录指纹图谱，结果表明各色谱峰相对峰面积和相对保留时间比值基本一致，RSD分别小于2.08％和0.30％(表3-表4)，说明精密度良好。
表3精密度试验结果(相对峰面积)
表4精密度试验结果(相对保留时间)
2.4.2稳定性试验 取2#钟花报春花药材粗粉约1g，按供试品溶液的制备方法(2.2.1)制得供试品溶液。在上述色谱条件下，分别在0、2、4、8、16h进样，记录指纹图谱，结果表明各色谱峰相对峰面积和相对保留时间比值基本一致，RSD分别小于1.64％和0.19％(表5-表6)，说明稳定性良好。
表5稳定性试验结果(相对峰面积)
表6稳定性试验结果(相对保留时间)
2.4.3重复性试验 取2#钟花报春花药材粗粉约1g，共6份，按供试品溶液的制备方法(2.2.1)制得供试品溶液。在上述色谱条件下，记录指纹图谱，结果表明各色谱峰相对峰面积和相对保留时间比值基本一致，RSD分别小于1.92％和0.20％(表7-表8)说明重复性良好。
表7重复性试验结果(相对峰面积)
表8重复性试验结果(相对保留时间)
2.5钟花报春药材指纹图谱的测定
各供试品溶液按上述的色谱条件分别进样，记录其指纹图谱，并对共有色谱峰进行标记，结果见图3。
3钟花报春花药材模式图谱的建立
以收集到的10批钟花报春花药材作为研究对象，以2-苯基色原酮的峰(S)作为基准峰，计算其它共有峰的相对峰面积和相对保留时间，结果见表9、10。
表9各批药材共有峰的相对峰面积
表10各批药材共有峰的相对保留时间
用国家药典委员会颁发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)对以上10批钟花报春花药材进行指纹图谱分析，结果见表11，相似度值均在0.986～1之间(以4号药材为参照)或0.992～0.999之间(以对照谱图为参照)，且最终确定指纹图谱，见图2。
表11各批药材相似度计算分析结果
根据以上试验结果，并结合“中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)”的规定，暂定钟花报春花药材指纹图谱的相似度值不得低于0.992(以对照谱图为参照)。
本发明对钟花报春花药材的检测方法，采用HPLC指纹图谱技术，色谱图中特征峰分离度良好，且相似度高，能够有效用于对钟花报春花药材的质量控制。
Claims (2)
1.一种检测钟花报春花质量的方法，其特征在于：方法如下：
（1）钟花报春花的样品溶液制备：
精密称取钟花报春药材粗粉，加入15-30倍w/v的甲醇，静置10-50min，超声提取20-60min，过滤，滤液定容至0.8-1.2g生药/25ml，再取定容液，稀释至原浓度的1/6，微滤，滤液作为样品溶液；
（2）对照品溶液制备：
用甲醇或流动相溶液溶解2-苯基色原酮对照品，微滤，滤液作为对照品溶液；
（3）色谱条件：
色谱柱以十八烷基键合硅胶为填充剂；紫外检测器，检测波长为292±10nm；流动相为乙腈-水系统，梯度洗脱，梯度条件如下：
；
（4）高效液相色谱检测：取步骤（1）制备得到的样品溶液和步骤（2）制备得到的对照品溶液，注入高效液相色谱仪，进行检测，得到钟花报春花样品的指纹图谱；
（5）比对：将钟花报春花样品的指纹图谱与标准指纹图谱进行比对；其中，标准指纹图谱特征如下：有8个共有特征峰；以2-苯基色原酮的色谱峰的保留时间和峰面积为1计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，1号峰的相对保留时间为0.18±0.02，相对峰面积为0.023±0.004；2号峰的相对保留时间为0.34±0.03，相对峰面积为0.086±0.017；3号峰的相对保留时间为0.41±0.004，相对峰面积为0.018±0.0036；4号峰的相对保留时间为0.83±0.08，相对峰面积为0.14±0.028；5号峰的相对保留时间为0.89±0.09，相对峰面积为0.18±0.036；6号峰的相对保留时间为1.03±0.1，相对峰面积为0.033±0.007；7号峰的相对保留时间为1.21±0.1，相对峰面积为0.039±0.008；S峰的相对保留时间为1，相对峰面积为1。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，甲醇用量为20倍w/v；静置30min，超声提取40min；滤液定容至1g生药/25ml。
3、根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）的具体操作如下：精密称取钟花报春花药材粗粉1g，加入甲醇20ml，静置30min，超声提取40min，过滤，滤液冷却至室温后加甲醇定容至25ml，取定容液，稀释至原浓度的1/6，微滤，滤液作为样品溶液。
4、根据权利要求1-3任意一项所述的检测方法，其特征在于：所述微滤是采用0.45μm微孔滤膜滤过。
5、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（3）中，色谱柱为Diamonsil C18柱，250mm×4.6mm,5μm。
6、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（3）中，检测波长为292nm。
7、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（3）中，柱温为25℃。
8、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（4）中，精密吸取样品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，检测时间为45min。
9、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（5）中，标准指纹图谱特征如下：有8个共有特征峰；以2-苯基色原酮的色谱峰的保留时间和峰面积为1计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，1号峰的相对保留时间为0.1848±0.0104，相对峰面积为0.0228±0.00412；2号峰的相对保留时间为0.3353±0.00291，相对峰面积为0.0859±0.0173；3号峰的相对保留时间为0.4062±0.00583，相对峰面积为0.0182±0.0073；4号峰的相对保留时间为0.8345±0.0020，相对峰面积为0.1412±0.0205；5号峰的相对保留时间为0.8940±0.00114，相对峰面积为0.1831±0.0261；6号峰的相对保留时间为1.0341±0.00122，相对峰面积为0.0325±0.0078；7号峰的相对保留时间为1.2094±0.00310，相对峰面积为0.0389±0.0105；S峰的相对保留时间为1，相对峰面积为1。
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