CN102329723B - 检测特定dna序列的方法和装置 - Google Patents
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Abstract
检测样品中微生物的存在的装置包括壳体,所述壳体包括与第一DNA引物固定的基底,所述第一DNA引物具有与感兴趣的微生物的特定DNA序列互补的核苷酸序列;与第二DNA引物结合的纤维蛋白原分裂剂,所述第二DNA引物具有同样与目的微生物的DNA序列互补的核苷酸序列;用于清洗所述壳体的清洗单元;用于向所述壳体添加纤维蛋白原的纤维蛋白原添加单元以便纤维蛋白原与纤维蛋白原分裂剂发生化学反应产生粘性物质;用于向所述壳体发射超声信号的超声发射器;以及用于接收来自于所述壳体的超声信号并将接收的超声信号传输至超声分析器的超声接收器,其中所述超声分析器基于接收的超声信号确定是否存在感兴趣的微生物。
Description
技术领域
本发明涉及基于生物-化学-物理转换方法和超声微生物检测装置,通过采用互补DNA序列和与纤维蛋白原裂解酶连接的特定DNA序列的结合检测微生物的特定DNA序列的存在,从而检测样品中微生物的存在。
背景技术
生物分析物的存在的检测存在很多方法,例如,酶免疫分析法(EIA)、放射免疫检定法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)、实时PCR(RT-PCR)等。这些方法已经用于测量激素水平、抗原、抗体、酶、蛋白质、药物、DNA的特定片段和污染物等。
在这些方法中,最常用的方法是PCR和RT-PCR,在这两种方法中,提取含有感兴趣的微生物的样品的DNA。然后,将基因组的双链DNA加热至94-96℃并保持1-9分钟,以便DNA链的互补碱基对之间的氢键断裂,生成单链DNA。为了检测样品中感兴趣的微生物的存在,添加互补的DNA寡聚核苷酸引物(例如F#1与R#1分别代表正向序列与反向序列),与DNA序列的相邻片段相结合,该DNA序列的相邻片段位于感兴趣的DNA(单链DNA)的这一特定片段(序列#1)的上游或下游。当引物序列与模板序列密切匹配时,稳定的DNA-DNA氢键将形成,这一过程被称为退火。然后,在保持20-40s前,将反应温度降至50-65℃。添加脱氧三磷酸核苷,通过DNA聚合酶的作用(例如Taq聚合酶),将生成与感兴趣的DNA这一特定片段(序列#1)互补的、表明感兴趣的微生物存在的DNA片段(称为序列#2)。序列#1称为被转录,序列#2形成。这称为延伸/延长步骤。随着升温(90℃)与降温(50-60℃)的重复循环,在最终的延长步骤(70-75℃持续15分钟)前,序列#1将多次被转录(通常30-35次)。这确保任一剩余的单链DNA充分延伸。采用PCR方法,使用1%琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶电泳将溶解含有特定DNA的转录片段的混合物。这些DNA片段和引物将根据他们的分子量溶解(resolve)。在紫外光(UV)下通过添加溴化乙锭实现DNA片段的可视化。如果感兴趣的微生物存在于样品中,在PCR步骤后,与互补DNA(序列#2)分子大小相同(right)的吸收紫外线的DNA带将出现。随后,在宿主细菌(例如大肠杆菌)中表达前,将这一PCR产物(假设序列#2)插入噬菌体载体系统(例如Pgem-T)中。然后可以使用传统的双脱氧法研究这一DNA带的DNA序列(例如序列#2)。如果以及当获得的这一PCR产物(实验性获得的序列#2)的测序结果与序列#1的测序结果互补时,该试验被认为是肯定的。另一方面,采用RT-PCR方法,在起始的加热步骤,将DNA结合染料(比如花青绿色染料)加入到反应混合物中(与所有其他试剂)。采用与PCR方法类似的实验条件,如果DNA(序列#1)的特定片段存在于样品中,它将被存在的DNA聚合酶转录。重复转录将产生多个序列#2。随着DNA序列的增加和DNA结合染料的存在,与DNA结合的染料的数量将增加。这一染料具有唯一的荧光特性,当其与DNA结合时将发荧光。因此,增加的荧光不仅表明这一互补DNA序列(序列#2)的存在,而且表明感兴趣的微生物中DNA的这一片段的复制数目,所述互补DNA序列表明这一感兴趣的微生物的序列(序列#1)的存在因此表明感兴趣的微生物的存在。
但是,虽然这些PCR与RT-PCR方法能够现场用于室外操作,但是由于他们依靠荧光检测和定量存在的分析物的水平,他们需要相对较重的仪器。因此,这些使用相对较重的仪器的方法不适合现场室外操作。
本发明不需要荧光源以检测感兴趣的微生物的存在。另外,图1中所示的每一部件可以仅仅为几厘米大。就这一点而言,微生物检测装置的体积相对地可以是小的(例如在我们的样机中为18cm长、8cm宽和5cm高)。另外,微生物检测装置可以全部是电池驱动。因此,该装置可以在没有常规的电源供给的远端位置操作。由于它的轻重量、可携带性和操作的简单性,该装置适合于手持现场室外操作。通过本发明,克服了现有检测方法和装置的缺点,可认识到其在生物分析物的分析领域中的优点。
发明内容
根据本发明的一个方面,本发明提供嵌入装置中检测样品中微生物的存在的方法,所述装置包括壳体,其包括与第一DNA引物固定的基底,所述第一DNA引物具有与感兴趣的微生物的特定DNA序列互补的核苷酸序列;与第二DNA引物结合的纤维蛋白原分裂剂,所述第二DNA引物具有同样与感兴趣的微生物的DNA序列互补的核苷酸序列;用于用于清洗所述壳体的清洗单元;用于向所述壳体添加纤维蛋白原的纤维蛋白原添加单元以便纤维蛋白原与纤维蛋白原分裂剂发生化学反应产生粘性物质;用于向所述壳体发射超声信号的超声发射器;以及用于接收来自于所述壳体的超声信号并将接收的超声信号传送给超声分析器的超声接收器,其中所述超声分析器基于接收的超声信号确定样品中是否存在感兴趣的微生物。
根据本发明的另一方面,提供检测样品中微生物的存在的方法,所述方法包括固定第一DNA引物与壳体中的基底,所述第一DNA引物具有与感兴趣的微生物的DNA序列互补的核苷酸序列;结合纤维蛋白原分裂剂与第二DNA引物,所述第二DNA引物具有与感兴趣的微生物的DNA序列互补的核苷酸序列;通过缓冲液清洗所述壳体;向所述壳体添加纤维蛋白原以便纤维蛋白原与纤维蛋白原分裂剂发生化学反应产生粘性物质;影响从超声发射器向超声分析器的超声信号的传输,其中,所述超声分析器内的算法基于接收的超声信号确定样品中是否存在微生物。
从以下将参照附图介绍的示例性实施例,本发明的进一步的特点和方面是显而易见的。
附图说明
说明书中包含的且作为说明书一部分的附图示出本发明的实施例,并与具体实施例一起解释本发明的原理。
图1是依据本发明的实施例的超声微生物检测装置的结构示意图;
图2是DNA引物一端与壳体206固定、另一端从201至205与感兴趣的微生物的互补DNA固定的实例的示意图;感兴趣的微生物上互补DNA的另一段与第二组DNA引物连接,在所述第二套DNA引物中,其自身通过双功能的化学键与纤维蛋白原分裂剂连接;
图3A是具有多个孔的塑料(包括聚苯乙烯)微孔板的实例的示意图,在所述孔中,所述第一组DNA引物与所述壳体结合;所述微孔板的孔不限于圆形;
图3B是微孔板的孔的实例的示意图;所述孔包含DNA引物的(第一)链与感兴趣的微生物的互补DNA的一段,这一微生物的DNA的另一段与互补的DNA引物的(第二)链结合,所述DNA引物与纤维蛋白原分裂剂连接;
图4是采用时间对信号绘制的图形的实例的示意图,所述信号是超声接收器中接收的以接收的电压或振幅量化的信号;
图5是根据本发明的实施例的示例性流程图。
具体实施方式
本发明的各个实施例将在以下参照附图描述。
图1是根据本发明的实施例的超声微生物检测装置100的示意图。检测装置包括壳体110、超声发射器105、超声接收器106、加热/冷却板103、一或多个温度传感器108、试剂传递管101与试剂移除管102和磁力搅拌机构104。
壳体110用于确定其中的样品中是否存在微生物。壳体110包含聚合物基底,比如塑料(包括聚苯乙烯)(例如用于制造酶标板)。所述壳体的形状不限于矩形、圆柱形或圆形。所述壳体可以是任意适合于容纳液体并允许DNA引物固定的封闭结构。另外,壳体110适合于经过其中的超声传播。
“样品”指用于测试感兴趣的微生物的存在的物质。例如,样品可以是取白水库、湖泊、河流、水潭、海洋、食物表面、任意容器表面、生物流体、组织匀浆或空气样品的物质(例如,来自感兴趣的病原菌的DNA)。合适的过滤器将用于容纳(trap)及浓缩样品中的微生物,以通过本发明作进一步分析。可以使用从合适的营养琼脂或细胞生长的细胞培养板直接获得的微生物的菌落并将其直接加入壳体110中。通过加热/冷却板103加热至大约95℃,微生物的DNA成分将释放。
图2是DNA引物和样品中感兴趣的目标微生物的结合的例子的示意图。在这一例子中,塑料聚合物207(例如聚苯乙烯)用于构成所述壳体110的基底,并且它也与DNA引物201结合。DNA引物201与基底207化学结合(206)。DNA引物201的链可能通过共价结合或非共价结合与塑料基底(比如聚苯乙烯)固定,结合方式取决于塑料(例如聚苯乙烯底部)和DNA引物间的反应。DNA引物201可能是具有6-30碱基长的核酸链,比如化学合成的寡聚核苷酸。它包含与感兴趣的目标微生物的部分DNA序列205互补的特定核苷酸序列。虽然仅仅阐述了DNA引物的单链,但是DNA引物的多个链可能以相似的方式固定在塑料基底上(例如聚苯乙烯)。
所述壳体还包括与第二DNA引物202通过双功能化学键203结合的纤维蛋白原分裂剂204(例如,各种类型的毒液包括拉塞尔蝰蛇的毒液中的凝血酶或活性组分,或其他天然的或合成的纤维蛋白原分裂化学制剂或酶)。DNA引物202也包含与样品中感兴趣的目标微生物的另一部分DNA序列(205)互补的特定核苷酸序列。虽然仅仅阐述了DNA引物202的单链,但是DNA引物的多个链可能以相似的方式与纤维蛋白原分裂剂结合。
塑料基底207可能是例如,图3A所示的微孔板孔300的形式或矩形或其他形状。微孔板包含唯一的或多个孔310。微孔板的每一个孔包含至少如图3B中所所示的DNA引物的单链。以示意性为目的,具有与DNA引物互补的DNA序列的微生物如图3B中所示。因此,样品中感兴趣的微生物的DNA的链与两个DNA引物结合。
本发明还包括搅拌机构104,比如通过磁力搅拌器搅拌。所述磁搅拌器能够轻轻地混合壳体110中的混合物。就这一点而言,该移动使得DNA样品的链与DNA引物的链杂交与退火。
加热/冷却板103能够加热或冷却壳体以便壳体内部的混合物在期望的适合于化学反应的温度范围内(例如96℃至室温)运行。加热/冷却板103可进一步包括监控壳体温度的温度传感器108,以便壳体在期望的温度运行。
如果DNA样品205与DNA引物201互补,(样品中)微生物的DNA205链将如图2中所示与DNA引物201杂交(结合)。同样,DNA205链的另一部分将与DNA引物202杂交(结合)。换言之,形成了由DNA引物201、加上感兴趣的目标微生物的互补DNA、加上另一互补的DNA引物、加上双功能化学键203、加上纤维蛋白原分裂剂204组成的复合体。整个复合体与塑料基底207(例如,聚苯乙烯)共价或非共价连接206。但是,如果DNA样品的链与DNA引物不互补,杂交将不会发生并且将不会形成复合体。
其后,混合物经历水浴处理,该水浴处理清洗掉没有与DNA引物附着的过多的微生物。水浴可包含通过试剂管开口101进入的pH常数水溶性缓冲液。如前所述,与DNA引物不互补的DNA链将不会与DNA引物结合。在这一水浴处理过程中,没有结合的DNA链、纤维蛋白原分裂剂和其他松散物质被清洗掉并通过试剂管开口102从壳体离开。就这一点而言,只有成功杂交的DNA链(例如,以复合体的形式)将保留在壳体中。
在水浴处理后,纯化的纤维蛋白原溶液或包含天然纤维蛋白原或合成的类纤维蛋白原物质的混合物通过试剂管开口101添加至壳体110中。继水浴处理之后,如果纤维蛋白原分裂剂仍然保留在壳体110中(由于与复合体连接,目标微生物是所述复合体中的部分),纤维蛋白原分裂剂将将天然的或合成的纤维蛋白原化学转换为粘性类型的混合物的纤维蛋白凝块(或胶体)。一般而言,化学反应处理取决于样品量的数量,需要几分钟来完成。
然后,超声发射器发出超声信号(或波)穿过壳体110。虽然超声发射器/接收器可能在纤维蛋白原的添加之前或之后的任一时间被激活,但是超声发射器/接收器必须在壳体的混合物成为粘性的之前被激活。超声发射器包含一或多个产生超声信号的超声换能器。发射的超声信号由如图1中所示的在壳体110另一端的超声接收器接收。接收的超声信号传输至超声分析器(未示出)用于分析。
图4是在示波器上显示的典型的接收的超声信号的示意图。如图中所示,接收的电压形式的超声信号在10分钟后显著减少至大约0.25V。因此,在短的一段时间内,可以确定存在复合体的粘度的改变。当超声信号穿过凝块时,超声信号幅度将显著降低。基于粘度的变化,可以确定感兴趣的目标微生物是否存在于混合物中。
超声中的衰减根据穿过介质的距离测量超声信号的幅度的下降。接收的超声信号的衰减可以通过以下方程计算:衰减=20(1og(V接收的/V传输的)/d(dB/cm)(1),其中,V接收的是接收的超声电压,V传输的是传输的超声电压,以及d是超声发射器和接收器之间的距离。基于衰减值,可以确定壳体110内部的内容物是否具有增强的粘度。当衰减值显著减少时,例如低于10dB,可以确定壳体110内部的内容物具有增强的粘度。本发明不限制衰减范围。
图5中阐述了检测感兴趣的目标微生物的DNA序列的示范性处理流程图。在步骤S501中,设置壳体110的温度条件。壳体110包括与DNA引物的链结合的塑料聚合物基底(包括聚苯乙烯)207,所述DNA引物与特定类型的微生物的DNA序列互补。通过激活加热/冷却板103,将壳体110调整至合适的温度(例如,在大约90℃)。其后,在步骤502中添加样品至壳体110。可通过试剂管101的开口添加样品。然后,样品在壳体中被混合,例如,通过磁搅拌机构104搅拌。一般而言,整个混合物允许混合10分钟。随后,在添加DNA引物的链至壳体110前,将壳体110冷却至大约56℃或更低,所述DNA引物与与纤维蛋白原分裂剂结合的特定类型的微生物的DNA序列互补。整个混合物允许再混合10分钟。
其后,在步骤503中,壳体用pH常数的水溶性缓冲液清洗以清洗掉未与DNA引物杂交的任意材料。在清洗后,再次激活加热/冷却板(培养箱)103以将壳体110带至合适的温度,所述合适的温度用于纤维蛋白原裂解酶运转和阻止纤维蛋白原的快速降解(例如,在大约37℃)。随后,添加纤维蛋白原溶液至壳体110(步骤S505)。另外,激活超声发射器105以发射超声信号穿过壳体110(步骤S504)。请注意,可能在纤维蛋白原的添加之前或之后激活超声发射器/接收器。
所述系统允许混合物与添加的纤维蛋白原(天然的或合成的类纤维蛋白原物质)化学反应一段预定的时间。然后,超声接收器接收传输的超声信号并将接收的超声信号传输至超声分析器109,用于分析。超声分析器可能安装在超声微生物检测装置中或通过有线或无线连接与超声微生物检测装置外部连接。
其后,在步骤S506中,超声分析器基于接收的来自于超声接收器的超声信号幅度,确定壳体110中是否有粘度变化。如果有粘度变化(步骤S506中的YES),超声分析器确定微生物存在于样品中(S508)。另一方面,在一段预定的时间后,如果复合体的粘度未改变(步骤S507中的N0),超声分析器确定微生物不存在于样品中(S507)。然后,处理结束。
本发明可能还包括基于接收的超声信号、表明微生物是否存在于样品中的显示器(例如,LCD显示器)。例如,如果有粘度变化,超声分析器109确定微生物存在并且显示器将表明微生物存在。另一方面,在一段预定的时间后,如果壳体110内部的内容物的粘度未改变,超声分析器109确定微生物不存在并且显示器将表明微生物不存在。
超声分析器109的操作可能通过确定是否有粘度变化的计算机可执行程序代码实现。计算机可执行程序代码可能存储在超声分析器109的计算机可读存储媒介中。例如,可以以系统、装置、方法、程序、记录媒介等的形式实现体积可以很小的本发明。
通过使用本检测方法和装置,通过使用相应组的DNA引物可以检测各种微生物,所述DNA引物具有与感兴趣的目标微生物的DNA序列互补的DNA序列。另外,本超声微生物检测装置的用户不需要具有生物化学和分子生物学的广博知识,其对于执行基于荧光的检测方法(例如,PCR和RT-PCR)是必须的。
虽然本发明参照示范性实施例描述,应该明白的是本发明并不受限于公开的示范性实施例。以下的权利要求的范围被认为是对本发明的最宽广的解释,以包括所有的改变和等同的结合和功能。
Claims (7)
1.一种检测样品中微生物的存在的装置,其特征在于,包括:
壳体,所述壳体包括:
与第一DNA引物固定的基底,所述第一DNA引物具有与感兴趣的微生物的DNA序列互补的核苷酸序列;
与第二DNA引物结合的纤维蛋白原分裂剂,所述第二DNA引物具有与感兴趣的微生物的DNA序列互补的核苷酸序列;
用于清洗所述壳体的清洗单元;
用于向所述壳体添加纤维蛋白原的纤维蛋白原添加单元,以便添加的纤维蛋白原与纤维蛋白原分裂剂发生化学反应产生粘性物质;
用于向所述壳体发射超声信号的超声发射器;以及
用于接收来自于所述壳体的超声信号并将接收的超声信号传输至超声分析器的超声接收器,
其中所述超声分析器基于接收的超声信号确定样品中是否存在感兴趣的微生物;
其中,所述基底是由聚苯乙烯或其他聚合物制成的塑料基底;所述装置还包括控制所述壳体的温度的加热/冷却板和一或多个温度传感器。
2.根据权利要求1所述的检测样品中微生物的存在的装置,其特征在于,所述基底是具有一或多个孔的微孔板。
3.根据权利要求1所述的检测样品中微生物的存在的装置,其特征在于,所述超声分析器基于接收的来自于超声接收器的超声信号幅度确定粘度改变是否发生。
4.根据权利要求1所述的检测样品中微生物的存在的装置,其特征在于,所述装置还包括用于混合所述壳体内部的物质的磁力搅拌机构。
5.根据权利要求1所述的检测样品中微生物的存在的装置,其特征在于,所述装置是便携式的且可用于现场操作。
6.一种以非诊断性目的检测样品中微生物的存在的方法,其特征在于,包括:
固定第一DNA引物与壳体中的基底,所述第一DNA引物具有与感兴趣的微生物的DNA序列互补的核苷酸序列;
结合纤维蛋白原分裂剂与第二DNA引物,所述第二DNA引物具有与目的微生物的DNA序列互补的核苷酸序列;
添加包含感兴趣的微生物的样品以形成混合物;
在预定的持续时间内,培养所述混合物;
通过缓冲液清洗所述壳体;
向所述壳体添加天然的或合成的纤维蛋白原,以便纤维蛋白原与纤维蛋白原分裂剂发生化学反应产生粘性物质;
向所述壳体发射超声信号;
接收来自于所述壳体的超声信号并将接收的超声信号传输至超声分析器,
其中所述超声分析器基于接收的超声信号确定样品中是否存在微生物;
其中,所述基底是由聚苯乙烯或其他聚合物制成的塑料基底。
7.根据权利要求6所述的以非诊断性目的检测样品中微生物的存在的方法,其特征在于,所述超声分析器基于接收的来自于接收的超声信号的超声信号幅度确定粘度改变是否已发生。
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