CN102325899A

CN102325899A - 为所需的奶和/或组织特征选择动物

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Publication number: CN102325899A
Application number: CN2009801570442A
Authority: CN
Inventors: K·莱纳特; S·D·拜里; R·G·施奈尔; A·K·H·麦基本; R·斯派尔曼; A·安科斯密特-乌迪
Original assignee: Fonterra Cooperative Group Ltd
Current assignee: Fonterra Cooperative Group Ltd
Priority date: 2008-12-24
Filing date: 2009-12-24
Publication date: 2012-01-18
Also published as: ECSP11011223A; EP2379750A2; CO6410245A2; UY32368A; EA201170890A1; IL213749A0; BRPI0923636A2; CL2011001573A1; AP2011005803A0; WO2010087725A2; AU2009338835A1; ZA201105179B; WO2010087725A3; JP2012513754A; CA2748228A1; EP2379750A4; US20110321182A1; AR074927A1

Abstract

本发明涉及携带突变动物中产生有利的奶、组织和/或生长速率特征的DGAT1基因中的突变。更特别地，本发明还涉及DGAT1基因外显子(16)的突变的鉴定，以及突变与奶和组织脂肪成分和/或奶体积的相关性。

Description

为所需的奶和/或组织特征选择动物

该国际专利申请要求享有2008年12月24日提交的新西兰临时专利申请573950的优先权，在此将其内容引入作为参考。

技术领域

本发明涉及与产奶(如，体积)和奶中的脂肪和蛋白组成相关的新遗传变异。该新的遗传变异还与包含该变异的动物的组织组成相关。本发明还涉及通过测定遗传变异的存在或不存在的动物选择，特别是牛。

背景技术

动物脂肪和奶组成(特别是牛奶生产)的遗传基础对于乳品工业是非常重要的。调节动物脂肪和奶组成和体积的能力具有改变农业实践和制造定制的以满足各种需求的产品的潜能。特别地，在遗传上评价动物(特别是牛)以选择表达所需性状(如所需的奶和肉组成)的那些的方法将是有用的。

奶组成变化(例如，主要奶蛋白的相对含量)的遗传基础和这些变化对产奶特征和奶加工特性的影响已经是很多研究、争论和评论的主题。例如，国际专利申请PCT/NZ01/00245(作为WO02/36824公开)报道了牛二酰甘油O-酰基转移酶同源物1(鼠)(DGAT1)基因中的多态性与提高的奶产量和改变的奶组成相关，并且特别是DGAT1多肽中相对频繁的K232A多态性的存在，其中DGAT1多肽232位的丙氨酸氨基酸的存在导致乳脂百分比、乳脂产量和乳蛋白百分比的降低，同时提高了奶体积和乳蛋白产量。K232A多态性已经显出对DGAT1酶功能具有作用(Grisart，B.等，2002，Genome Res.12：222-231；Grisart B.等，2004，PNAS101：2398-2403)。WO02/36824的表1中鉴定了牛DGAT1基因中的十三个多态性，其中只有两个出现在外显子中。鉴定出K232A多态性在外显子8中，还鉴定出同义多态性在外显子4中，在碱基5997处。DGAT1涉及甘油三酯合成，并且催化脂肪酸通过共价结合脂肪酰基-CoA和二酰甘油而连接至甘油主链的第三个位置上。Yen等，2008，Journal of Lipid Research，49：2283-2301中提供了DGAT酶、DGAT1和DGAT2的概述。

在另一个实例中，国际专利申请PCT/NZ02/00157(作为WO2003/104492公开)报道了牛生长激素受体(GHR)基因中的多态性与提高的奶体积和改变的奶组成相关，特别是F279Y氨基酸多态性的存在导致提高的奶产量、降低的乳脂和奶蛋白百分比，以及体重的降低。对于奶组成的其他特征，对于变异的基础不太清楚。

有助于选择的标记(其提供了追踪特定的偏好遗传等位基因的能力)涉及被与性状相关或部分限定性状的一个基因或一组基因分离的一个或多个DNA分子标记的鉴定。DNA标记有一些优点。它们相对易于测量并且是明确的，并且因为DNA标记是共显性的，可以区分地鉴定出杂合和纯合动物。一旦建立标记系统，能够非常容易地形成选择决定，因为从单个动物(不管是胚胎、幼年或成年)收集到含有DNA的样品后，可以在任何时间测定DNA标记。

本发明提供了与动物中有利的奶、组织、初乳和生长特征相关的新突变。本发明还提供了通过直接检测突变或通过标记辅助检测来选择具有所需组织组成和/或所需奶和/或初乳生产品质(如，体积以及脂肪和蛋白的组成)的动物(特别是牛)的方法。本发明还提供了使用本发明方法选择的动物。此外，本发明提供了源自所选动物的组织产品，如但不限于，肉、器官、毛皮、流体(例如，血液和血清)等，其中所述组织通常具有降低的脂肪含量和/或降低的脂肪饱和度。更进一步，本发明提供了由所选动物产生的奶，从其产生的乳制品，使得给公众提供了目前在市场上销售的奶、乳和组织产品的替代品。

发明内容

本发明涉及DGAT1基因中的突变的鉴定。特别地，本发明涉及相当于牛DGAT1基因的外显子16的DGAT1基因区域中的突变的鉴定，与该突变相关的几个标记的鉴定和突变与含有该突变的动物产生的奶和组织的品质(特别是奶和组织的脂肪组成和/或奶体积)的关联。

因此，在第一个方面中，本发明提供了分离的核酸分子，该核酸分子包含编码DGAT1蛋白或其片段的DGAT1核苷酸序列，其中核酸分子在相当于牛DGAT1基因的外显子16的DGAT1核苷酸序列区域中具有突变。

关于“一个突变”或“该突变”指的是相当于牛DGAT1的外显子16的DGAT1核苷酸序列区域中的任何突变。此后，将这样的突变称为“本发明的一个突变”或“本发明的该突变”。

在一个实施方案中，突变破坏DGAT1蛋白的功能。

在进一步的实施方案中，突变破坏全长DGAT1蛋白的表达。

在更进一步的实施方案中，突变破坏DGAT1蛋白的酶活性。

在一些实施方案中，突变破坏DGAT1核苷酸序列中的外显子剪接基序。

在一些实施方案中，DGAT1核苷酸序列编码牛DGAT1蛋白。牛DGAT1蛋白可以错漏一个或多个由牛DGAT1基因的外显子16编码的氨基酸。或者，牛DGAT1蛋白可以错漏由牛DGAT1基因的外显子16编码的所有氨基酸。

在一些实施方案中，突变是GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的核苷酸置换。例如，突变可以是GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的A至C核苷酸置换。

本发明还提供了根据本发明第一个方面的核酸分子，其包含SEQ ID NO：2或44中所列的核苷酸序列。

在第二个方面中，本发明提供了分离的核酸分子，其由SEQ ID NO：2或44所列的核苷酸序列组成。

在第三个方面中，本发明提供了分离的多肽，该多肽包含DGTA1氨基酸序列，其中多肽在相当于牛DGTA1基因的外显子16编码的氨基酸的DGTA1氨基酸序列区域中具有突变。

在本发明该方面的内容中涉及的“一个突变”或“该突变”指的是相当于牛DGAT1基因的外显子16编码的氨基酸的DGAT1氨基酸序列区域中的任何突变。如上所示，在此将这样的突变称为“本发明的一个突变”或“本发明的该突变”。

在一个实施方案中，突变破坏多肽的功能。

在一些实施方案中，突变破坏多肽的酶活性。

在进一步的实施方案中，突变破坏全长DGAT1多肽的表达。

在一些实施方案中，多肽是牛DGTA1蛋白。例如，在一个实施方案中，分离的多肽包含SEQ ID NO：4或46中所列的氨基酸序列。

在一些实施方案中，牛DGAT1蛋白可以错漏一个或多个由牛DGAT1基因的外显子16编码的氨基酸。或者，牛DGAT1蛋白可以错漏由牛DGAT1基因的外显子16编码的所有氨基酸。例如，在一个实施方案中，分离的多肽包含SEQ ID NO：47或48所列的氨基酸序列。

在第四个方面中，本发明提供了分离的多肽，其由SEQ ID NO：47或48中所列的氨基酸序列组成。

携带本发明突变的动物产生具有有利的奶特征的奶，或能够产生产生具有有利的奶特征的奶的后代，其中有利的奶特征选自作为全奶百分比的总乳脂的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中饱和脂肪酸百分比的降低、蛋白产量的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、如通过提取的乳脂降低的固体脂肪含量所示的降低的脂肪硬度(例如，在10℃下)、乳脂∶蛋白比例的降低、所产生的奶体积的增加和乳糖产量的增加中的一种或多种。这些特征中的每一种是相对于未携带突变的相同品种动物的增加或降低。如在此所用的，“有利的奶特征”意思是具有至少一种上述特征的奶。

如“乳脂”内容中所用的术语“脂肪”具有本领域的常用意思。例如，脂肪指的是甘油三酯(或三酰甘油)，其含有三个连接甘油主链的脂肪酸。在乳脂的情况中，甘油三酯占高达约98％的总脂肪含量，剩余的为磷脂、胆固醇、胆固醇酯、甘油二酯、甘油一酯、游离脂肪酸和脂溶性维生素。

术语“脂肪酸”也是本领域公知的，并且指的是具有不同长度的直链或支链烃链的羧酸，链的一端为甲基，另一端为羧酸。在碳链中只具有单键的脂肪酸称为饱和脂肪酸。相反，碳链中具有单个双键的脂肪酸称为单不饱和脂肪酸，碳链中具有两个或多个双键的脂肪酸称为多不饱和脂肪酸。

在一些实施方案中，携带本发明突变的牛产奶，或能够产生产奶的后代，其中奶具有低于约3％的总乳脂。在其他实施方案中，携带本发明突变的牛产奶，或能够产生产奶的后代，其中奶在其奶的总脂肪酸含量中具有至少约27％的不饱和脂肪酸。在其他实施方案中，携带本发明突变的牛产奶，或能够产生产奶的后代，其中奶在其奶的总乳脂肪酸含量中具有低于约57％的饱和脂肪酸。在其他实施方案中，携带本发明突变的牛产奶，或能够产生产奶的后代，其中奶在其奶的总乳脂肪酸含量中具有至少约1.2％的ω-3脂肪酸。在其他实施方案中，携带本发明突变的牛产奶，或能够产生产奶的后代，在标准新西兰农场条件(即乳牛放牧黑麦草/白三叶草牧场)下，其产奶体积每季产奶至少6000升。

如说明书中所用的，“约”意思是大约或接近，并且在在此所列的数值或范围的内容中，意思是所述或所要求的数值或范围±10％。

在进一步的方面中，本发明还涉及从携带本发明突变的动物的奶产生的产品，包括乳制品，如奶油、冰淇淋、酸奶和干酪、乳基饮料(如，乳饮料，包括奶昔和酸奶饮料)、奶粉和乳基运动补充剂，以及其他产品，包括食品添加剂，如蛋白粉和膳食补充产品，包括日补充片剂。

携带本发明突变的动物通常还具有有利的组织特征，其中它们产生具有一种或多种选自以下品质的组织或能够产生产生具有一种或多种选自以下品质的组织的后代，所述品质为：作为总质量百分比的总脂肪的降低、总脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总脂肪酸含量的饱和脂肪酸百分比的降低、蛋白产量的增加、总脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、通过提取的脂肪降低的固体脂肪含量所示的降低的脂肪硬度(例如，在10℃下)、脂肪∶蛋白比例的降低和由于动物生长速率的一般提高所产生的肉体积的增加。如上所述，这些特征中的每一种是相对于未携带突变的相同品种动物的增加或降低。如在此所用的，“有利的组织特征”指的是具有至少一种上述特征的动物的组织。有效地，这样的动物降低了脂肪合成，导致组织(如，肌肉)中的脂肪降低，由此使得动物产生更瘦的肉。这样的动物通常还具有提高的生长速率。

在进一步的方面中，本发明还涉及源自携带本发明突变的动物的组织或组织产品。在一个实施方案中，组织或组织产品可以包括，但不限于，肉、器官、毛皮、流体(例如，血液和血清)等。这些组织通常具有降低的脂肪含量和/或降低的脂肪饱和度。

携带本发明突变的动物还通常具有有利的初乳特征，因为它们产生具有一种或多种选自以下品质的初乳，或能够产生产生具有一种或多种选自以下品质的初乳的后代，所述品质为：作为全部初乳百分比的总初乳脂肪的降低、总初乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总初乳脂肪酸含量中饱和脂肪酸百分比的降低、蛋白产量的增加、总初乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、初乳脂肪∶蛋白比例的降低和所产初乳体积的增加。这些特征中的每一种是相对于未携带突变的相同品种动物的增加或降低。如在此所用的，“有利的初乳特征”意思是具有至少一种上述特征的初乳。

在一些实施方案中，携带本发明突变的动物可以包括哺乳动物、鸟类和水产物种。哺乳动物可以包括，但不限于，饲养哺乳动物，如牛、绵羊和山羊。鸟类物种包括，但不限于，家禽，如鸡、鸭、火鸡和鹅。水产物种包括，但不限于，鱼，如鲑鱼、鳟鱼、无鳔石首鱼、澳洲肺鱼和贝类。在一个实施方案中，动物是牛。这样的动物与不携带突变的相同物种和品种的动物相比，通常将产生具有较低脂肪含量的肉和奶。

存在本发明进一步的许多且分开的方面。

在一个进一步的方面中，本发明提供了测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含具有编码DGAT1蛋白或其片段的DGAT1核苷酸序列且在DGAT1核苷酸序列的外显子16中具有突变的核酸分子。

在更进一步的方面中，本发明提供了根据有利的奶特征而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含具有编码DGAT1蛋白或其片段的DGAT1核苷酸序列且在DGAT1核苷酸序列的外显子16中具有突变的核酸分子。在一个实施方案中，有利的奶特征选自总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

在进一步的方面中，本发明提供了根据有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含具有编码DGAT1蛋白或其片段的DGAT1核苷酸序列且在DGAT1核苷酸序列的外显子16中具有突变的核酸分子。在一个实施方案中，有利的组织特征涉及脂肪含量，更优选不饱和脂肪酸含量，特别是ω-3脂肪酸含量。在优选的实施方案中，组织是肉。

在一些实施方案中，通过测定牛是否包含根据本发明第一个方面的核酸分子来鉴定牛的遗传价值。

在一个方面中，本发明提供了测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含具有DGAT1氨基酸序列的多肽，该DGAT1氨基酸序列在由DGAT1的外显子16编码的一个或多个氨基酸中具有突变。

在进一步的方面中，本发明提供了根据有利的奶特征而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含具有DGAT1氨基酸序列的多肽，该DGAT1氨基酸序列在由DGAT1的外显子16编码的一个或多个氨基酸中具有突变。在一个实施当案中，有利的奶特征选自总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

在进一步的方面中，本发明提供了根据有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含具有DGAT1氨基酸序列的多肽，该DGAT1氨基酸序列在由DGAT1的外显子16编码的一个或多个氨基酸中具有突变。

在一些实施方案中，该方法包括测定牛是否包含根据本发明第三个方面的多肽。

在一些实施方案中，该方法包括测定多肽的表达和/或活性。

在更进一步的实施方案中，该方法进一步包括以鉴定的遗传价值为基础来选择牛。

在一些实施方案中，测定牛遗传价值的方法是体外方法。

在一个方面中，本发明提供了选择产生有利奶特征的牛或能够产生产生有利奶特征的后代的牛的方法，该方法包括：(i)测定牛是否包含具有编码DGAT1蛋白或其片段的DGAT1核苷酸序列且在DGAT1核苷酸序列的外显子16中具有突变的核酸分子；(ii)以该测定为基础来选择牛。在一个实施方案中，有利的奶特征选自总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

在进一步的方面中，本发明提供了选择产生有利组织特征、有利初乳特征和/或提高的生长速率的牛或能够产生产生有利组织特征、有利初乳特征和/或提高的生长速率的后代的牛的方法，该方法包括：(i)测定牛是否包含具有编码DGAT1蛋白或其片段的DGAT1核苷酸序列且在DGAT1核苷酸序列的外显子16中具有突变的核酸分子；(ii)以该测定为基础来选择牛。优选，组织是肉。

在一些实施方案中，选择方法包括测定牛是否包含根据本发明第一个方面的核酸分子。

在一个方面中，本发明提供了选择产生有利奶特征的牛或能够产生产生有利奶特征的后代的牛的方法，该方法包括：(i)测定牛是否包含具有DGAT1氨基酸序列的多肽，该DGAT1氨基酸序列在由DGAT1的外显子16编码的一个或多个氨基酸中具有突变；(ii)以该测定为基础来选择牛。在一个实施方案中，有利的奶特征选自总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

在进一步的方面中，本发明提供了选择产生有利组织特征、有利初乳特征和/或提高的生长速率的牛或能够产生产生有利组织特征、有利初乳特征和/或提高的生长速率的后代的牛的方法，该方法包括：(i)测定牛是否包含具有DGAT1氨基酸序列的多肽，该DGAT1氨基酸序列在由DGAT1的外显子16编码的一个或多个氨基酸中具有突变；(ii)以该测定为基础来选择牛。

在一些实施方案中，选择方法包括测定牛是否包含根据本发明第三个方面的多肽。

在一些实施方案中，选择方法包括测定多肽的表达和/或活性。在一个实施方案中，从编码多肽的RNA测定多肽的表达。RNA可以从根据本发明第一个方面的核酸分子转录得到。

在一个实施方案中，通过测量多肽的含量、多肽的不存在和/或与牛表达的野生型DGAT1多肽的含量相比的多肽含量来测定多肽的表达和/或活性。

在一些实施方案中，选择牛的方法是体外方法。

在一个方面中，本发明提供了根据有利的奶特征而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定所述牛的DGAT1外显子16等位基因特征。

在一个实施方案中，有利的奶特征选自总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

在进一步的方面中，本发明提供了根据有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定所述牛的DGAT1外显子16等位基因特征。

在一个实施方案中，从获自所述牛的核酸分子测定DGAT1外显子16等位基因特征。在一个实施方案中，核酸分子是DNA。在另一个实施方案中，核酸分子是RNA，如mRNA，或hnRNA。在一些实施方案中，该方法包括测定根据本发明第一个方面的核酸分子的存在或不存在。

在一个实施方案中，从获自所述牛的多肽测定DGAT1外显子16等位基因特征。在一个实施方案中，该方法包括测定根据本发明第三个方面的DGAT1多肽的存在或不存在。

在一个实施方案中，使用DGAT1外显子16等位基因的连锁或连锁不平衡中的多态性来测定DGAT1外显子16等位基因特征。在一个实施方案中，DGAT1外显子16等位基因的连锁或连锁不平衡中的多态性在染色体14上，并且选自ARS-BFGL-NGS-4939、Hapmap52798-ss46526455、Hapmap29758-BTC-003619、BFGL-NGS-18858、Hapmap24717-BTC-002824和Hapmap24718-BTC-002945。

在进一步的实施方案中，该方法进一步包括在与有利的奶特征相关的一个或多个其他基因座测定所述牛的等位基因特征。例如，在一个实施方案中，基因座是与奶体积和/或含量相关的一个或多个基因中的一个或多个多态性。在一个实施方案中，一个或多个基因中的一个或多个多态性与脂肪代谢相关。在进一步的实施方案中，DGAT1外显子16等位基因特征和一个或多个其他基因座的等位基因特征协同作用来产生有利的奶特征。在更进一步的实施方案中，一个或多个其他基因座在与DGAT1的相同染色体上。例如，多态性可以编码牛DGAT1蛋白的氨基酸位置232的赖氨酸至丙氨酸。或者，一个或多个其他基因座位于与DGAT1不同染色体上。

在另一个方面中，本发明提供了根据有利的奶特征而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含编码以下多肽的核酸分子：(i)具有野生型DGAT1生物活性的多肽(A)；或(ii)具有DGAT1氨基酸序列的多肽(B)，该DGAT1氨基酸序列在由DGAT1的外显子16编码的一个或多个氨基酸中具有突变；或(iii)多肽A和多肽B，其中编码多肽A的核酸分子不存在且编码多肽B的核酸分子存在，或编码多肽A的核酸分子和编码多肽B的核酸分子的同时存在，表示有利的奶特征。

如在此所用的，术语“野生型DGAT1”指的是不包含本发明突变的DGAT1核酸分子或DGAT1多肽。例如，在一个实施方案中，编码具有野生型DGAT1的生物活性的多肽的核酸分子将在由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的核苷酸位置8078具有腺嘌呤。这样的核酸分子可以具有SEQ IDNO：1或43所列的核苷酸序列。因此，所编码的具有野生型DGAT1生物活性的多肽将在由GenBank登录号AAL49962/GI：18642598表示的牛DGAT1蛋白的氨基酸位置435具有甲硫氨酸。这样的多肽可以具有SEQ ID NO：3或45所列的氨基酸序列。

在另一个方面中，本发明提供了根据有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含编码以下多肽的核酸分子：(i)具有野生型DGAT1生物活性的多肽(A)；或(ii)具有DGAT1氨基酸序列的多肽(B)，该DGAT1氨基酸序列在由DGAT1的外显子16编码的一个或多个氨基酸中具有突变；或(iii)多肽A和多肽B，其中编码多肽A的核酸分子不存在且编码多肽B的核酸分子存在，或编码多肽A的核酸分子和编码多肽B的核酸分子同时存在，表示有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率。

在一个实施方案中，核酸分子是DNA或RNA。DNA可以是根据本发明第一个方面的核酸分子，或RNA可以从根据本发明第一个方面的核酸分子转录得到。在一个实施方案中，测定遗传价值的方法进一步包括确定编码多肽B的RNA的含量。

在一个实施方案中，多肽A可以包含SEQ ID NO：3或45中所列的氨基酸序列。

在一个实施方案中，多肽B是根据本发明第三个方面的多肽。

在另一个方面中，本发明提供了根据有利的奶特征而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含：(i)具有野生型DGAT1生物活性的多肽(A)；或(ii)具有DGAT1氨基酸序列的多肽(B)，该DGAT1氨基酸序列在由DGAT1的外显子16编码的一个或多个氨基酸中具有突变；或(iii)多肽A和多肽B，其中多肽A不存在且多肽B存在，或多肽A和多肽B同时存在，表示有利的奶特征。

在另一个方面中，本发明提供了根据有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含：(i)具有野生型DGAT1生物活性的多肽(A)；或(ii)具有DGAT1氨基酸序列的多肽(B)，该DGAT1氨基酸序列在由DGAT1的外显子16编码的一个或多个氨基酸中具有突变；或(iii)多肽A和多肽B，其中多肽A不存在和多肽B存在，或多肽A和多肽B同时存在，表示有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率。

在一个实施方案中，该方法进一步包括确定多肽B的含量和/或活性。

在一个实施方案中，多肽A可以包含SEQ ID NO：3或45中所列的氨基酸序列。在一个实施方案中，多肽B是根据本发明第三个方面的多肽。在另一个方面中，本发明提供了测定牛的DGAT1基因型的方法，该方法包括测定获自牛的核酸分子是否是：(i)编码具有野生型DGAT1的生物活性的多肽的核酸分子(A)；或(ii)具有编码DGAT1蛋白的DGAT1核苷酸序列和在DGAT1核苷酸序列的外显子16中具有突变的核酸分子(B)，其中获自牛的核酸分子未受异源核酸污染。

在一个实施方案中，核酸分子B编码根据本发明第三个方面的多肽。

在一个实施方案中，核酸分子A可以包含SEQ ID NO：1或43中所列的核苷酸序列。

在一个实施方案中，核酸分子B是根据本发明第一个方面的核酸分子。

在另一个方面中，本发明提供测定牛的DGAT1基因型的方法，该方法包括测定获自牛的多肽是否是：(i)具有野生型DGAT1生物活性的多肽(A)；或(ii)具有DGAT1氨基酸序列的多肽(B)，该DGAT1氨基酸序列在由DGAT1的外显子16编码的一个或多个氨基酸中具有突变；其中获自牛的多肽未受异源多肽污染。

在一个实施方案中，该方法包括测定多肽的表达和/或活性。

在另一个实施方案中，该方法包括多肽或源自多肽的肽的质谱分析。

在一个实施方案中，多肽B是根据本发明第三个方面的多肽。

尽管以上所述的一些方法涉及牛的内容，但清楚同样适用于其他动物，如，但不限于，以上所述的那些。

在进一步的方面中，本发明包括包含核酸分子的探针，其中所述探针在严谨条件下与根据本发明第一个方面的核酸分子杂交。本发明还涉及含有该探针的诊断试剂盒。

本发明还包括用于检测根据本发明第一个方面的核酸分子的引物组合物。在一个实施方案中，该引物组合物包括一个或多个与根据本发明第一个方面的核酸分子的一部分或其互补体基本上互补的核酸分子。例如，引物组合物可以包括具有SEQ ID NO：5、6和7所列的核苷酸序列的核酸分子。还设想了包括这样的引物组合物的诊断试剂盒。

本发明进一步包括用于检测根据本发明第三个方面的多肽的抗体组合物。还设想了包括该抗体组合物和使用说明书的诊断试剂盒。

本发明进一步提供了用于检测根据本发明第一个方面的核酸分子的诊断试剂盒，该试剂盒包括用于扩增核酸分子或其片段的第一个和第二个引物，引物分别与突变上游和下游的核酸分子的核苷酸互补。

在一个实施方案中，诊断试剂盒的至少一个引物包括与核酸分子的非编码区互补的核苷酸。诊断试剂盒还可以包括与突变互补的第三个引物。

在一个实施方案中，引物结合的核酸分子编码根据本发明第三个方面的多肽。

在进一步的方面中，本发明提供了根据有利的奶特征而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的A核苷酸存在或不存在。

在进一步的方面中，本发明提供了根据有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的A核苷酸存在或不存在。

在进一步的方面中，本发明提供了根据有利的奶特征而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的C核苷酸存在或不存在。

在进一步的方面中，本发明提供了根据有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的C核苷酸存在或不存在。

在进一步的方面中，本发明提供了根据有利的奶特征而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的CC基因型存在或不存在。

在进一步的方面中，本发明提供了根据有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的CC基因型存在或不存在。

在进一步的方面中，本发明提供了根据有利的奶特征而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的AC基因型存在或不存在。

在进一步的方面中，本发明提供了根据有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的AC基因型存在或不存在。

在另一个方面中，本发明提供了选择具有表示有利的奶特征的基因型的牛的方法，该方法包括：(i)测定上述方面中涉及的所述牛的DGAT1外显子16等位基因特征；和(ii)以该测定为基础来选择牛。例如，有利的奶特征可以包括总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

在进一步的方面中，本发明提供了选择具有表示有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率的基因型的牛的方法，该方法包括：(i)测定上述方面中涉及的所述牛的DGAT1外显子16等位基因特征；和(ii)以该测定为基础来选择牛。

在进一步的方面中，本发明提供了选择具有表示有利的奶特征的DGAT1外显子16等位基因特征的牛的方法，该方法包括：(i)测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的CC基因型不存在；和以该测定为基础来选择牛。

在进一步的方面中，本发明提供了选择具有表示有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率的DGAT1外显子16等位基因特征的牛的方法，该方法包括：(i)测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的CC基因型不存在；和以该测定为基础来选择牛。

在进一步的方面中，本发明提供了选择具有表示有利的奶特征的DGAT1外显子16等位基因特征的牛的方法，该方法包括：(i)测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的A核苷酸不存在；和(ii)以该测定为基础来选择牛。

在进一步的方面中，本发明提供了选择具有表示有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率的DGAT1外显子16等位基因特征的牛的方法，该方法包括：(i)测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的A核苷酸不存在；和(ii)以该测定为基础来选择牛。

在进一步的方面中，本发明提供了选择具有表示有利的奶特征的DGAT1外显子16等位基因特征的牛的方法，该方法包括：(i)测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的C核苷酸存在；和(ii)以该测定为基础来选择牛。

在进一步的方面中，本发明提供了选择具有表示有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率的DGAT1外显子16等位基因特征的牛的方法，该方法包括：(i)测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的C核苷酸存在；和(ii)以该测定为基础来选择牛。

在进一步的方面中，本发明提供了选择具有表示有利的奶特征的DGAT1外显子16等位基因特征的牛的方法，该方法包括：(i)测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的CC基因型存在；和(ii)以该测定为基础来选择牛。

进一步的方面中，本发明提供了选择具有表示有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率的DGAT1外显子16等位基因特征的牛的方法，该方法包括：(i)测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的CC基因型存在；和(ii)以该测定为基础来选择牛。

在进一步的方面中，本发明提供了选择具有表示有利的奶特征的DGAT1外显子16等位基因特征的牛的方法，该方法包括：(i)测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的AC基因型存在；和(ii)以该测定为基础来选择牛。

进一步的方面中，本发明提供了选择具有表示有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率的DGAT1外显子16等位基因特征的牛的方法，该方法包括：(i)测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的AC基因型存在；和(ii)以该测定为基础来选择牛。

在一些实施方案中，有利的奶特征选自总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

在一些实施方案中，从获自牛的基因组DNA或RNA，或从产自RNA的cDNA，确定C核苷酸、CC基因型或AC基因型的存在。

在一些实施方案中，通过测定编码由GenBank登录号AAL49962/GI：18642598表示的牛DGAT1蛋白的氨基酸位置435的亮氨酸的密码子的存在来确定C核苷酸、CC基因型或AC基因型的存在。

在一些实施方案中，通过测定编码由GenBank登录号AAL49962/GI：18642598表示的牛DGAT1蛋白的氨基酸位置435的甲硫氨酸的密码子的存在来确定AC基因型的存在。

在一些实施方案中，通过将获自牛的DGAT1核酸分子测序来确定C核苷酸、CC基因型或AC基因型的存在。

在进一步的实施方案中，测定包括将获自牛的基因组DNA或RNA，或产自RNA的cDNA的DGAT1核酸分子扩增的步骤。

在一个实施方案中，通过PCR来进行扩增。

在一个实施方案中，通过使用引物来进行扩增，该引物包括具有SEQ ID NO：1、2、43和44之一中所列核苷酸序列的至少约10个连续核苷酸的核酸分子或具有与SEQ ID NO：1、2、43和44之一中所列核苷酸序列互补的至少约10个连续核苷酸的核酸分子，或天然产生的侧翼序列。

在一个实施方案中，至少一个引物包括具有SEQ ID NO：5、6和7之一中所列的核苷酸序列的核酸分子。

在一些实施方案中，测定包括限制酶消化源自牛的DGAT1核酸分子的步骤。还可以对以上所述的PCR扩增的产物进行这样的消化。

在一些实施方案中，通过源自牛的DGAT1核酸分子的质谱分析来确定C核苷酸、CC基因型或AC基因型的存在。

在一些实施方案中，通过一个或多个探针的杂交来确定C核苷酸、CC基因型或AC基因型的存在，该一个或多个探针包含具有SEQ ID NO：1、2、43和44之一中所列核苷酸序列的一部分的核苷酸序列的核酸分子或具有与SEQ ID NO：1、2、43和44之一中所列核苷酸序列的一部分互补的核苷酸序列的核酸分子。

在一个实施方案中，一个或多个探针包含具有SEQ ID NO：1、2、43和44之一中所列核苷酸序列的至少约10个或多个连续核苷酸的核酸分子或具有与SEQID NO：1、2、43和44之一中所列核苷酸序列互补的至少约10个或多个连续核苷酸的核酸分子。

在一些实施方案中，一个或多个探针包含具有对应于由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的A核苷酸或C核苷酸的核酸分子。

在一些实施方案中，通过获自牛的DGAT1多肽的分析来确定C核苷酸、CC基因型或AC基因型的存在。

在一个实施方案中，通过检测由GenBank登录号AAL49962/GI：18642598表示的牛DGAT1蛋白的氨基酸位置435的甲硫氨酸的存在来确定AC基因型的存在。

在进一步的实施方案中，通过检测由GenBank登录号AAL49962/GI：18642598表示的牛DGAT1蛋白的氨基酸位置435的亮氨酸的存在来确定AC基因型的存在。

在更进一步的方面中，本发明提供了选择牛群的方法，该方法包括：(i)使用根据本发明上述方面的方法来选择多头牛；和(ii)分离和集合选定的牛，以形成牛群。在一个实施方案中，本发明进一步提供了通过该方法选择的牛群。

在进一步的方面中，本发明提供了遗传改进的动物，其包括转基因非人动物，其包含含有编码DGAT1蛋白或其部分的DGAT1核苷酸序列的核酸分子，其中核酸分子在相当于牛DGAT1基因的外显子16的DGAT1核苷酸序列的区域中具有突变。

在一个实施方案中，转基因非人动物包含根据本发明第一个方面的核酸分子。本发明还提供了产自非人动物的克隆。形成转基因非人动物的技术和用于克隆和操纵转基因动物的技术是本领域已知的，并且在以下有进一步的详细描述。

在进一步的方面中，本发明提供了包含含有编码DGAT1蛋白或其部分的DGAT1核苷酸序列的核酸分子的转基因牛，其中核酸分子在相当于牛DGAT1基因的外显子16的DGAT1核苷酸序列的区域中具有突变。在一个实施方案中，转基因牛包含根据本发明第一个方面的核酸分子。

在一个实施方案中，本发明提供了产自以上所述的转基因动物或转基因牛的克隆。

在进一步的方面中，本发明提供了通过上述选择方法选择的牛或转基因牛。在一个实施方案中，本发明提供了产自这些牛的克隆。

在一些实施方案中，转基因非人动物、转基因牛或选定的牛产奶，或能够产生产奶的后代，所述奶具有一种或多种选自以下的品质：与不携带突变的相同品种的动物或牛相比时，作为全奶百分比的总乳脂的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中饱和脂肪酸百分比的降低、蛋白产量的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、如通过提取的乳脂降低的固体脂肪含量所示的降低的脂肪硬度(例如，在10℃下)、乳脂∶蛋白比例的降低、所产生的奶体积的增加和乳糖产量的增加。

在一个实施方案中，牛或转基因牛在标准新西兰农场条件(即乳牛放牧黑麦草/白三叶草牧场)下，每季产奶至少6000升。在一些实施方案中，牛或转基因牛产生具有低于约3％总乳脂的奶。在一些实施方案中，牛或转基因牛产生在总乳脂肪酸含量中具有至少27％不饱和脂肪酸的奶。在一些实施方案中，牛或转基因牛产生在总乳脂肪酸含量中具有低于约57％饱和脂肪酸的奶。在一些实施方案中，牛或转基因牛产生在总乳脂肪酸含量中具有至少约1.2％ω-3脂肪酸的奶。

在进一步的方面中，本发明提供了由上述转基因非人动物、转基因牛或牛产生的奶。

在更进一步的方面中，本发明提供了从上述奶产生的产品。例如，产品可以选自冰淇淋、酸奶、干酪、乳基饮料、乳饮料、奶昔、酸奶饮料、奶粉、乳基运动补充剂、食品添加剂、蛋白粉、膳食补充产品和日补充片剂。

在进一步的方面中，本发明提供了通过根据本发明的上述方面转基因非人动物、转基因牛或牛产生的精子或卵子。

在一些实施方案中，转基因非人动物、转基因牛或选定的牛产生组织，或能够产生产生组织的后代，所述组织具有一种或多种选自以下的品质：与未携带突变的相同品种的动物或牛相比时，作为总质量百分比的总脂肪的降低、总脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总脂肪酸含量的饱和脂肪酸百分比的降低、蛋白产量的增加、总脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、通过提取的乳脂降低的固体脂肪含量所示的降低的脂肪硬度(例如，在10℃下)、乳脂∶蛋白比例的降低和由于动物生长速率的一般提高所产生的肉体积的增加。

在进一步的方面中，本发明提供了源自上述转基因非人动物、转基因牛或牛的组织或组织产品。在一个实施方案中，组织或组织产品选自肉、器官、毛皮、血液和血清。

在一些实施方案中，转基因非人动物、转基因牛或选定的牛产生初乳，或能够产生产生初乳的后代，所述初乳具有一种或多种选自以下的品质：作为全部初乳百分比的总初乳脂肪的降低、总初乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总初乳脂肪酸含量中饱和脂肪酸百分比的降低、蛋白产量的增加、总初乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、初乳脂肪∶蛋白比例的降低和所产初乳体积的增加。

在进一步的方面中，本发明提供了包含编码DGAT1蛋白或其部分的DGAT1核苷酸序列的核酸分子的用途，其用于产生转基因非人动物，其中核酸分子在相当于牛DGAT1基因的外显子16的DGAT1核苷酸序列的区域中具有突变。在一个实施方案中，核酸分子是根据本发明第一个方面的核酸分子。

如本说明书中所用的术语“包含(comprising)”意思是“至少部分由……组成”。当解释本说明书中包括术语“包含”的每种情况时，术语前序部分那个或那些以外的特征也可以存在。相关的术语，如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”以相同的方式来解释。

在参考专利说明书、其他外部文献或其他信息来源的本说明书中，通常是为了提供讨论本发明特征的目的。除非另外明确指出，对这些外部文献的参考没有解释为以任何权限允许这些文献或这些信息来源为现有技术，或形成本领域公知常识的一部分。

发明详述

本发明是部分基于第一次鉴定了相当于牛DGAT1基因的外显子16的区域中二酰甘油O-酰基转移酶同源物1(鼠)(DGAT1)基因中的突变。因此，本发明提供了分离的核酸分子，该核酸分子包含编码DGAT1蛋白或其部分的DGAT1核苷酸序列，其中核酸分子在相当于牛DGAT1基因的外显子16的DGAT1核苷酸序列的区域中具有突变。

分离的核酸分子可以是包含全部或部分DGAT1核苷酸序列的基因组DNA。例如，核酸分子可以是包含DGAT1核苷酸序列的完整编码和非编码区的基因组DNA，具有或不具有相连的5’和3’未翻译区。或者，核酸分子可以是只包含含有外显子16或其等价物的DGAT1核苷酸序列部分的基因组DNA，具有或不具有侧翼内含子序列。

分离的核酸分子也可以是RNA，例如mRNA或hnRNA，其编码全部或一部分的DGAT1蛋白。如本领域技术人员所理解的，核酸分子还可以包括产自mRNA的cDNA。本领域已知的标准技术，并且通常描述于Sambrook J等，(2001)，Molecular cloning：a laboratory manual.(分子克隆：实验室手册)，第三版，(ColdSpring Harbour Laboratory Press，New York)中，可以用于从mRNA产生cDNA。这通常涉及从含有DGAT1 mRNA的核酸样品的逆转录，以及随后的逆转录产物的PCR扩增。

在一些实施方案中，本发明的突变破坏了DGAT1蛋白的功能和/或表达。关于功能，“破坏”意思是与野生型DGAT1蛋白的功能水平相比时，蛋白的功能水平降低或消除。关于表达，“破坏”意思是与野生型DGAT1蛋白的表达水平相比时，全长突变蛋白的表达水平降低或消除。在一个实施方案中，突变破坏了DGAT1蛋白的酶活性。

可以以本领域已知的各种方式来测量DGAT1蛋白的功能、表达和/或活性的破坏。例如，DGAT1编码催化其中二酰甘油共价结合脂肪酰基-CoA以形成作为主要脂肪成分的甘油三酯的反应的酶。因此，可以通过测量油酰-CoA(脂肪酰基-CoA)结合至甘油三酯中的程度的降低或消除来测定对DGAT1蛋白的酶活性的破坏。

本发明的突变包括外显子16中的核苷酸置换、核苷酸删除、核苷酸插入或任何其他突变，其改变了SEQ ID NO：1或43中所列的野生型DGAT1序列的核苷酸序列。在一个实施方案中，突变是破坏DGAT1外显子16中存在的外显子剪接基序的核苷酸置换。例如，发明人发现了由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的腺嘌呤(A)至胞嘧啶(C)核苷酸置换，在此引入作为参考。这相当于野生型DGAT1基因的编码序列的核苷酸位置1303。在此用关于GenBank登录号AY065621/GI：18642597的核苷酸序列来参照该突变位置。因此，在此将该突变称为“A8078C”或“8078C”

在限定推定外显子剪接基序(ATGATG)的DGAT1核苷酸序列的位置中发生了A8078C核苷酸置换，这预示着增强了转录过程中外显子16的剪接。位置8078的A核昔酸由C核苷酸置换将剪接基序的核苷酸组成改变为CTGATG，由此破坏预定的剪接增强子功能。实际上，在转录过程中剪接出外显子16，使其没有结合至DGAT1 mRNA核酸分子中。因此，翻译了DGAT1多肽，其缺失了21个由外显子16编码的氨基酸。

本领域技术人员将预期和理解本发明还包括外显子16中的其他突变(包括外显子剪接基序中的突变)，其破坏所编码的DGAT1多肽的功能、活性和/或表达。此外，本发明还包括外显子16外出现的其他突变，但其导致外显子16的一个或多个氨基酸删除，并且其破坏所编码的DGAT1多肽的功能、活性和/或表达。因此，本发明不限于在此举例说明的A8078C核苷酸突变。A8078C核苷酸突变仅证明了由外显子16编码的氨基酸对于DGAT1功能的重要性。

因此，本发明包括编码DGAT1多肽的分离的核酸分子，该多肽缺失一个或多个由DGAT1基因的外显子16编码的氨基酸。关于A8078C核苷酸突变，分离的核酸编码缺失所有21个由外显子16编码的氨基酸的DGAT1多肽。该核酸分子的核苷酸序列列于SEQ ID NO：2或44中。

在RNA加工过程中没有切除外显子16时，具有A8078C核苷酸突变的核酸分子编码在DGAT1的位置435具有甲硫氨酸至亮氨酸置换的DGAT1多肽。

最初在牛中检测到A8078C突变，而后在其家族中检测到，它们是霍斯坦-弗里斯(Holstein-Friesian)品种。本领域技术人员清楚本发明的这种突变，或任何其他突变，不是打算用来限于霍斯坦-弗里斯品种，或实际上一般的牛品种。可以通过杂交技术或其他方法，如转基因，如以下进一步描述的，将本发明的突变引入其他动物中，乃至不同品种的牛中。因此，本发明的突变例如在其他产奶品种(如，泽西种乳牛(Jersey)、格恩西奶牛(Guernsey)、瑞士褐牛(Brown Swiss)、乳用短角牛(Milking Shorthorn)等等)中是有用的。本发明的突变在双重目的(例如，瑞士褐牛)和肉用品种中也是有用的，肉用品种如作为黄牛(Bos taurus)物种的实例给出的昂古斯牛(Angus)和赫勒福德牛(Hereford)，作为Bos indicus种的实例的婆罗门牛(Brahman)和瘤牛(Zebu)，以及动物生产中所用的牛属的任何其他物种，这是本领域已知的。

本发明还提供了包含DGAT1氨基酸序列的分离的多肽，其中多肽在相当于DGAT1基因的外显子16编码的氨基酸的DGAT1氨基酸序列的区域中具有突变。DGAT1多肽中的突变破坏了多肽的功能、表达和/或酶活性。该内容中的术语“破坏”与以上所述的具有相同的意思。突变可以是外显子16编码的氨基酸中的氨基酸置换、删除、插入或任何其他突变，其改变了如SEQ ID NO：3或45中所列的来自野生型DGAT1序列的氨基酸序列。在一个实施方案中，突变是在编码由GenBank登录号AAL49962/GI：18642598表示的牛DGAT1蛋白的位置435的甲硫氨酸的密码子中，在此引入作为参考。将预期该密码子中的A8078C核苷酸突变将产生DGAT1多肽的位置435的甲硫氨酸(M)至亮氨酸(L)的氨基酸置换，由此产生包含SEQ ID NO：4或46中所列的氨基酸序列的多肽。在此将这样的突变称为M435L。然而，如上所述，因为A8078C核苷酸突变破坏了推定的外显子剪接基序，并且因此在大部分的情况中，在RNA加工过程中剪除了外显子16，在相应的DGAT1多肽中删除了由外显子16编码的所有21个氨基酸。因此，在本发明的一个实施方案中，分离的多肽包含SEQ ID NO：47或48中所列的氨基酸序列。在此将这样的突变称为Δ418-438或Δ16。

用于分离本发明的核酸分子和多肽的方法是公知的，并且通常描述于Sambrook等，2001(上文)。通常从取自动物的样品中分离出本发明的核酸分子和多肽。例如，这样的样品可以取自动物的奶、组织、血液、血清、血浆、脑脊髓液、尿液、精液、毛发或唾液。可以使用标准技术，如细胞刮擦或活体检查技术，来获得组织样品。

牛DGAT1基因的多态性之前已经与提高的奶产量和改变的奶组成相关，并且特别是来自DGAT1基因中的多态性的DGAT1中的K232A氨基酸置换的存在。多态性是DGAT1编码序列的核苷酸位置694和695的AA至GC的双核苷酸置换。含有该多态性的牛产生具有降低的乳脂百分比、乳脂产量和乳蛋白百分比以及提高的奶体积和奶蛋白产量的奶(参见WO02/36824)。

DGAT1涉及甘油三酯合成，并且预期牛中甘油三酯合成的变化改变了奶中的甘油三酯水平，以及组织的脂肪含量和/或组成(Wang JY等，2007，Lipids in Healthand Disease(健康和疾病中的脂质)，6：2-10；White SN等，2007，J.Anim.Sci.85：1-10)。

已经发现了本发明的突变与含有该突变的动物中有利的奶特征和/或有利的组织特征和/或提高的生长速率相关。如在此所用的，词语“动物”包括哺乳动物、鸟类物种和水产物种。哺乳动物可以包括，但不限于，农场哺乳动物，如牛、绵羊和山羊。鸟类物种包括，但不限于，家禽，如鸡、鸭、火鸡和鹅。水产物种包括，但不限于，鱼类，如鲑鱼、鳟鱼、无鳔石首鱼、澳洲肺鱼和贝类。在优选的实施方案中，动物是牛。

如在此所用的，“有利的奶特征”指的是获自动物的具有至少一种或多种选自以下的品质的奶：作为全奶百分比的总乳脂的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、蛋白产量的增加、总乳脂肪酸含量中饱和脂肪酸百分比的降低、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、如通过提取的乳脂降低的固体脂肪含量所示的降低的脂肪硬度(例如，在10℃下)、乳脂∶蛋白比例的降低、所产生的奶体积的增加、初乳产量的增加和乳糖产量的增加。这些品质中的每一种是相对于未携带本发明突变的相同品种的动物的增加或降低。

本发明的突变可以通过破坏野生型DGAT1的功能来催化脂肪酸连接甘油主链而影响游离脂肪酸的水平，例如，奶中的游离脂肪酸的水平。DGAT1催化脂肪酸连接至甘油主链的第三个位置上。C4:0通常连接甘油三酯的第三个位置，并且因此通常通过DGAT1来催化(冒号前的数字表示脂肪酸链中的碳原子的数目，而冒号后的数字表示链中的双键数目)。如果C4:0没有通过DGAT1连接第三个位置，细胞集合中的C4:0水平增加，并且导致置于甘油三酯位置1或2上的C4:0增加。

人奶甘油三酯主要包含甘油主链位置2中的C16:0，其对于1，3脂酶的脂解作用提供了更好的溶解性，因为含有C16:0的2-甘油一酯比从1和3位释放出来的C16:0游离脂肪酸溶解性更大。例如，在牛奶中，通常以约1∶1的比例在甘油主链的位置1/3和2上发现C16:0。可以发现从具有本发明突变的牛产生的奶粉比产自只携带野生型DGAT1的牛的奶粉在脂解作用中溶解性更大。这很可能是由于甘油主链位置2中的C16:0的甘油三酯增加引起的。还预期了位置2中C12:0和C14:0的甘油三酯的增加。含有在甘油主链的位置2具有C16:0和C14:0的甘油三酯的牛奶更像人奶，并因此对消费者是有益的，包括人类婴儿。

通过具有本发明突变的动物(包括牛)产生的奶维持了典型的乳蛋白组成。因此，对于加工蛋白流不需要其他的程序。

因为降低了通过携带本发明突变的牛产生的总乳脂含量，并且蛋白质含量保持正常，因此乳脂∶蛋白质的比例中存在了变化，即，携带本发明突变(包括举例说明的A8078C突变)的牛中乳脂∶蛋白质比例的实质性降低。

源自具有本发明突变的动物的乳脂可以具有提高的脂溶性化合物的浓度，如维生素和味道。这可能导致更强的味道，因为存在较低比例的脂肪∶脂溶性化合物。令人感兴趣地，源自牧场饲养的牛的奶的通常不受欢迎的味道在源自具有本发明包括的A8078C突变的牛的奶中得到稀释。

源自具有本发明突变的动物的乳脂还具有降低的脂肪硬度。这通过在10℃提取的乳脂降低的固体脂肪含量来表示。

本发明还涉及产自携带本发明突变的动物的奶的产品。这样的产品包括，但不限于，乳制品，如冰淇淋、酸奶和干酪，乳基饮料，如乳饮料，包括奶昔和酸奶饮料，奶粉，乳基运动补充剂以及食品添加剂，如蛋白粉，和膳食补充产品，包括日补充片剂。

可以从获自具有本发明突变的动物的奶产生与只携带野生型DGAT1的动物相比更软的乳脂产品。乳脂的稠度和质地比源自只携带野生型DGAT1的动物的乳脂更接近于植物油。

获自携带本发明突变的动物的乳脂比源自只携带野生型DGAT1的动物的乳脂具有较低的熔化温度。可以将获自携带本发明突变的动物的乳脂与较高熔化温度的脂肪混合，以抑制来自较高熔化温度的熔化温度，即，至中间熔化温度。可以提高来自单独脂肪的脂肪质地(更软)。

获自携带本发明突变的动物的较软乳脂产品保持和/或增强了“乳”味道和质地。以技术或合成方式制得的较软乳脂产品易于失去这种从乳脂直接制得的产品的“乳”味道和质地。较软的乳脂产品包括，例如，脱脂乳粉制干酪、奶油干酪、软干酪和鲜奶油。例如，其已经显示出从获自携带8078C突变的动物的奶制造的黄油比源自只携带野生型DGAT1的牛的黄油在更低温度下可涂抹。

由于由携带突变的动物产生的奶中脂肪百分比的降低，可以从产自具有本发明突变的动物的奶制得的产品通常比从只携带野生型DGAT1的动物的奶制得的产品具有更低的脂肪含量。因此，可以产生较低脂肪的奶，而在制造过程中不需要除去乳脂。相似地，还可以产生其他较低脂肪的乳制品和/或较低饱和脂肪的产品。人食用较低脂肪和/或较低饱和脂肪食品可以避免与高脂肪膳食相关的健康状况，如心血管疾病，包括冠心病(或缺血性)心脏病，脑血管疾病，高血压，心力衰竭和风湿性心脏病。

通过给动物饲喂包含含油饲料的膳食，如种子或牧场植物，可以进一步降低从具有本发明突变的动物产生的奶的脂肪含量。这还将导致提高的不饱和脂肪酸的水平。或者，或另外地，可以给予动物共轭亚油酸(CLA)，来进一步抑制乳脂合成和饱和。

在本发明的一个实施方案中，可以从获自携带本发明突变并且在DGAT1相同等位基因中携带K232A氨基酸置换的动物的奶制得产品(如上所述)。例如，已经显示了携带本发明A8078C突变的牛和该牛的低乳脂雌性后代的一个染色体携带编码缺乏21个由外显子16编码的氨基酸的DGAT1多肽并且含有232A置换的等位基因。

在一个实施方案中，携带A8078C核苷酸突变的牛产生奶，或能够产生产奶的后代，在其奶中具有低于约3％的总乳脂，其奶的总乳脂肪酸含量中至少约27％不饱和脂肪酸，其奶的总乳脂肪酸含量中低于约57％饱和脂肪酸和/或其奶的总乳脂肪酸含量中至少约1.2％的ω-3脂肪酸。再进一步，携带A8078C核苷酸突变的牛产生奶，或能够产生产奶的后代，与标准新西兰农场条件(即乳牛放牧黑麦草/白三叶草牧场)相似的管理条件下，每季产奶大约6000升体积。在不同畜牧系统下放牧的携带A8078C核苷酸突变的牛获得更高的体积是可能的。

如在此所用的，“有利的组织特征”指的是获自具有至少一种或多种选自以下的品质的动物的组织：作为总质量百分比的总脂肪的降低、总脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总脂肪酸含量的饱和脂肪酸百分比的降低、蛋白产量的增加、总脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、通过10℃下提取的乳脂降低的固体脂肪含量所示的脂肪硬度的降低、乳脂∶蛋白比例的降低和由于动物生长速率的一般提高所产生的肉体积的增加。

本发明还涉及源自携带本发明突变的动物的组织和组织产品，包括但不限于，肉、器官、毛皮、流体，例如，血液和血清等。这些组织通常具有降低的脂肪含量和/或降低的脂肪饱和度。

如在此所用的，术语“提高的生长速率”指的是随着时间重量或大小的增加速率，达到限定目标重量或大小需要的时间和/或达到性成熟的时间。

本发明还包括本发明的核酸分子和多肽的变体。如在此所用的术语“变体”指的是分别具有不同于特定被鉴定的序列的核苷酸或氨基酸序列但其保留那些序列等价功能的核酸分子或多肽。例如，变体核酸分子可以包括不同于本发明序列的核酸分子，但作为遗传密码简并的结果，编码具有与由本发明的核酸分子编码的突变多肽相似活性的多肽。没有改变多肽的氨基酸序列的核苷酸序列变化是“沉默变化”。除了ATG(甲硫氨酸)和TGG(色氨酸)，可以通过本领域已知的技术来改变用于相同氨基酸的其他密码子，例如，优化特定宿主生物体中的密码子表达。

本发明还包括导致所编码的多肽序列中一个或几个氨基酸的保守置换的核苷酸序列改变。本领域技术人员将了解制备表现型上沉默的氨基酸置换的方法(参见，例如，Bowie等，1990，Science 247：1306)。

将理解本发明突变的鉴定能够提供根据有利的奶特征(更特别地乳脂组成)、有利的组织特征和/或提高的生长速率而测定动物(例如，牛)遗传价值的方法。

如在此所用的，术语“遗传价值”指的是对于给定表现型性状的所有阳性和阴性遗传影响的总和。预计的遗传价值通常表示为对于给定的表现型性状预计的奶牛或公牛的育种价值。

本发明突变的鉴定还能够提供选择产生有利的奶特征、有利的组织特征和有利的初乳特征和/或提高的生长速率的动物(如，牛)的方法。例如，这随后使得可以选择具有所需乳脂组成的涉及合适奶制品生产的奶。例如，通过为产生具有较低总乳脂百分比和较高百分比的不饱和脂肪酸的奶而选择的牛产生的奶可能涉及低脂奶制品的生产，如低脂酸奶。通过为产生具有较低百分比的饱和脂肪酸和/或较高百分比的不饱和脂肪酸的奶而选择的牛产生的奶还涉及公知的传统上高脂肪的产品(如，冰淇淋)的生产，其为具有较高百分比饱和脂肪的产品提供了更健康的替代品。

本发明突变的鉴定还能够提供关于本发明的突变来测定动物的DGAT1基因型的方法。

上述方法包括测定牛是否包含如上所述的具有本发明突变的DGAT1核酸分子或多肽。或者，可以测定动物的DGAT1外显子16等位基因特征。进行这些方法的方式是本领域已知的。以下的段落将提供实施例，部分参考已经由发明人在牛中鉴定的A8078C DGAT1核苷酸突变。

1具有本发明突变的核酸分子和多肽的鉴定

对于测定动物是否包含具有本发明突变的DGAT1核酸分子或多肽，本领域中存在各种已知的标准方法。例如，这些方法可以包括将取自动物的核酸分子(例如，DNA)样品进行测序的步骤。因此，在本发明的一个实施方案中，测定动物是否包含具有本发明突变的核酸分子的步骤包括将获自动物的核酸分子进行测序的步骤。核苷酸测序的方法是本领域技术人员公知的。

测定特定的核酸分子是否存在于动物中的另一种标准方法的实例是聚合酶链式反应(PCR)(Mullis等，编辑，1994，The Polymerase Chain Reaction(聚合酶链式反应)，Birkhauser)。在本发明突变的两侧和/或结合本发明突变的寡核苷酸引物可以用于扩增获自检测动物的样品中的核酸分子。核酸分子可以选自基因组DNA、RNA(例如，mRNA或hnRNA)，或产自mRNA的cDNA(参见SambrookJ等，2001，上文，cDNA生产的一般方法)。

寡核苷酸引物将对DGAT1核苷酸序列具有足够的互补性，并且是足够长的，以选择性地与打算扩增的DGAT1核酸分子杂交，由此在PCR中常用的体外条件下引发DNA合成。在一个实例中，PCR扩增步骤中所用的引物之一可以只识别和结合DGAT1的突变序列。因此，PCR产物的存在将表示样品中存在核酸分子，并且因此动物具有突变。在另一个实例中，PCR扩增步骤可以使用在突变两侧的引物，例如，一个引物结合外显子15中的序列，而另一个引物结合DGAT1的外显子17中的序列。然后从cDNA(产自mRNA)的扩增将鉴定出产生外显子16的交替剪接的突变，如本发明包括的A8078C核苷酸突变。大小比预计的小的PCR产物将表示DGAT1编码序列的删除，而大小比预计的大的PCR产物表示插入突变。

适用于本发明的基于PCR方法的引物包含SEQ ID NO：1、2、43和44之一中所列核苷酸序列的至少约10个连续的核苷酸，或与SEQ ID NO：1、2、43和44之一中所列核苷酸序列互补的至少10个连续的核苷酸，或其天然产生的侧翼序列。可以用于上述方法的PCR引物的实例在此呈现为SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。

其他基于PCR的方法包括基于逆转录酶PCR的扩增，其可以用于检测本发明的破坏DGAT1的转录并因此破坏其表达的突变。例如，可以使用RT-PCR，其中mRNA形式的核酸分子获自待检测的动物，并且将其逆转录。然后使用相同样品中表达的DGAT1和其他(对照)基因特异性的寡核苷酸引物进行实时PCR，并且相对于对照基因将DGAT1特异性转录产物的水平标准化，以确定DGAT1的表达值。将所获得的值与获自表达野生型DGAT1的动物的表达值相比较。DGAT1表达的降低将表示本发明的破坏DGAT1转录的突变的存在。还可以使用本领域公知的其他定量扩增方法，并且包括例如微矩阵分析。

测定动物中是否存在特定核酸分子的其他方法可以包括取自动物的核酸分子样品的限制酶消化的步骤。例如，本发明的突变可以形成或破坏核酸内切酶限制位点。因此，通过本领域公知的方法分离和观察消化的限制片段可以形成用于特定核苷酸序列存在或不存在的诊断测试。消化的核苷酸序列可以是如上所述扩增的PCR产物。

例如，A8078C突变破坏了野生型序列中的NlaIII限制位点，并且同时在突变序列中形成了新的HaeIII位点。因此，与野生型DGAT1 DNA相比时，用NlaIII或HaeIII消化含有A8078C突变的DGAT1 DNA将形成不同大小的限制片段。可以通过本领域已知的标准技术，如琼脂糖凝胶电泳和/或Southern杂交，来检测这样的改变的限制片段大小。

测定动物中是否存在特定核酸分子的其他方法可以包括将探针与取自动物的核酸分子样品杂交的步骤。这样的探针应当包含足够长的并且与DGAT1核苷酸序列足够互补的核酸分子，以在高或低严谨条件下选择性地结合核酸分子样品中所含的DGAT1核酸分子，以促进本发明突变的存在或不存在的检测。关于超过约100个核苷酸长度的探针，典型的严谨杂交条件是比天然双链体的解链温度(Tm)低不超过25至30℃(例如，10℃)(通常参见，Sambrook J等，2001，上文；Ausubel等，1987，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学的通用实验方案)，John Wiley & Sons，Inc)。可以通过以下公式来计算超过约100个核苷酸长的核酸分子的Tm：Tm＝81.5+0.41％(G+C-log(Na⁺))。对于超过100个碱基长的多核苷酸的典型严谨条件是如下的杂交条件：在6×SSC，0.2％SDS的溶液中预洗涤；在65℃，6×SSC，0.2％SDS中杂交过夜；接着在65℃，1×SSC，0.1％SDS中洗涤两次，每次30分钟，在65℃，0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤两次，每次30分钟。对于具有低于约100个核苷酸长度的探针，示例性严谨杂交条件通常比Tm低5至10℃。平均而言，长度低于100个核苷酸的核酸分子的Tm降低大约(500/核酸分子长度)℃。对于已知作为肽核酸的DNA模拟物(PNA)(Nielsen等，1991，Science 254(5037)：1497-500)，Tm值高于DNA-DNA或DNA-RNA杂交体的那些，并可以使用Giesen等，1998，Nucleic Acids Res.26(21)：5004-5006中所述的公式来计算。对于具有低于100个碱基长度的DNA-RNA杂交体的示例性严谨杂交条件为比Tm低5至10℃。

取自动物的核酸分子样品可以是基因组DNA或RNA(包括mRNA或hnRNA)。还可以对产自mRNA的cDNA进行分析。

上述探针通常包含SEQ ID NO：1、2、43和44之一中所列核苷酸序列的至少约10个连续的核苷酸，或与SEQ ID NO：1、2、43和44之一中所列核苷酸序列互补的至少10个连续的核苷酸，或其天然产生的侧翼序列。因此，探针可以包含包括本发明突变的核苷酸序列。

这样的探针可以另外包含结合核酸分子样品时检测探针存在的手段。标记探针的方法，如放射性标记，是本领域公知的(参见，例如，Sambrook J等，2001，上文)。

基于探针的检测试验的一个实例是使用能够与目标DGAT1 mRNA杂交的探针的Northern分析。本领域技术人员清楚，Northern分析是需要相对于彼此将样品浓度标准化的定量方法。通常将样品相对于内部对照(如，每种样品中存在的rRNA含量)进行标准化来实现此。

本发明的上述方法依赖于遗传信息，如源自包括上述那些的适用于检测和鉴定与需要测定的性状相关的多态性的方法，特别是单核苷酸多态性(SNP)。为了方便，以下讨论特别涉及SNP，然而，本领域技术人员将认识到所讨论的方法适于检测和鉴定其他遗传多态性，如三联重复序列或微卫星。

SNP是导致个体间遗传变化的单碱基变化或点突变。认为SNP在哺乳动物基因组中大约每100至300个碱基出现一次，并且可以出现在编码或非编码区。由于遗传密码的冗余，编码区的SNP可以改变或未改变蛋白产品的氨基酸序列。例如，通过改变控制区，如启动子、转录因子结合位点、加工位点、核糖体结合位点，非编码区的SNP可以例如改变基因表达、mRNA稳定性，并影响基因转录、加工和翻译。

SNP可以促进大规模相关遗传研究，并且最近对SNP发现和检测存在很大的兴趣。作为用于多种表型性状(包括潜在性状)的标记，SNP显示了很大的前景，如例如，疾病倾向和严重性、健康倾向、药物响应性，包括，例如，对不利药物反应的敏感性，以及如在此所述的，与所需的表型性状相关。特定SNP与表型性状相关的知识，结合受试者是否具有所述特定SNP的知识，能够进行靶向诊断、预防和治疗应用，使得更好地控制疾病，以提高对病况的了解、研发选择性育种方案和鉴定所需遗传价值的对象。

实际上，已经构建了多个已知SNP的数据库，并且对于一些这样的SNP，构建了与SNP相关的生物作用的数据库。可理解地，对人基因组存在关注焦点。例如，NCBI SNP数据库“dbSNP”结合至NCBI’s Entrez系统中，并可以使用与其他Entrez数据库(如，PubMed和GenBank)相同的方法来搜寻。该数据库记录了超过1.5百万条在人基因组序列上绘出的SNP。每个dbSNP项目包括多态性的序列内容(即，周围的序列)、多态性的出现频率(通过群或个体)以及用于测试变化的实验方法、实验方案和条件，并可以包括SNP与特定表型性状相关的信息。对于多种商业和科学关注的物种，可以获得相似的数据库。

存在并且继续有许多努力来研发可靠且快速鉴定与表型性状相关的新SNP的方法。这不是一个普通的任务，至少部分是因为哺乳动物基因组DNA的复杂性(例如，3×10⁹碱基对的单倍体人基因组，而目前估计单倍体牛基因组的大小为2.7-2.9×10⁹碱基对)，以及相关的灵敏度和差别对待的需求。

为检测SNP的测定基因型的方法是本领域公知的，并且以上已经概括地进行了描述。这样的方法包括DNA测序，需要引物或探针的等位基因特异性杂交的方法，等位基因特异性的核苷酸引入接近或邻近多态性结合的引物(通常称为“单碱基延伸”或“迷你测序”)，等位基因特异性的寡核苷酸连接(结合)(连接链式反应或连接挂锁探针)，通过限制酶(限制片段长度多态性分析或RFLP)或化学或其他试剂的等位基因特异性的寡核苷酸或PCR产物的切断，通过结构特异性酶，包括入侵性结构特异性酶，或质谱进行的电泳或色谱迁移率中等位基因依赖性差异的分辨。在SNP位于编码区并导致氨基酸变化的情况中，氨基酸变化的分析也是可能的。

DNA测序使得可以直接测定和鉴定SNP。对于筛选目的，特异性和精确性中的益处通常超出完整基因组乃至靶向的亚基因组测序中内在的困难。

迷你测序涉及使引物与研究中的测试样品上的SNP位点附近的DNA序列杂交。使用所有四个不同标记的荧光双脱氧核苷酸(A、C、G或T)和DNA聚合酶，通过一个核苷酸来延伸引物。结合了四个核苷酸中的唯一一个(纯合情况)或四个核苷酸中的两个(杂合情况)。结合的碱基与SNP位置的核苷酸互补。

目前用于SNP检测的各种方法涉及位点特异性和/或等位基因特异性的杂交。这些方法很大程度上依赖于寡核苷酸与含有目标SNP的目标序列的差别结合。Affymetrix(Santa Clara，Calif.)和Nanogen Inc.(San Diego，CA)的技术是特别公知的，并且利用含有单碱基错配的DNA双链体没有完全碱基配对的双链体稳定的事实。通过荧光来检测配对双链体的存在。

通过位点特异性杂交检测或鉴定SNP的大部分方法需要通过如PCR的方法的目标扩增，以提高灵敏度和特异性(参见，例如，U.S.专利No.5,679,524，PCT公开WO98/59066，PCT公开WO95/12607)。US申请20050059030(在此全部引入)描述了检测总的人DNA中的单核苷酸多态性的方法，其不需要之前的扩增或复杂性降低，以选择性地富集目标序列，并且不需要借助任何酶反应。该方法利用涉及两个杂交事件的单步杂交：目标序列的第一部分与捕获探针的杂交，和所述目标序列的第二部分与检测探针的杂交。两个杂交事件在相同的反应中发生，并且其中发生杂交的顺序不是关键的。

US申请20050042608(在此全部引入)描述了Thorp等(U.S.专利No.5,871,918)的核酸杂交的电化学检测方法的改进。简而言之，设计了捕获探针，其中每个具有不同的SNP碱基，并且探针碱基的序列在SNP碱基的每一侧。探针碱基与邻近SNP位点的相应目标序列互补。每个捕获探针固定于不同的电极上，该电极在基质的传导工作表面上具有非传导的外层。利用过渡金属复合物通过检测每个电极的氧化-还原反应来检测每个捕获探针和核酸目标之间的杂交程度。将这些不同电极的氧化率的差异用于检测选定的核酸目标是否在选定的SNP位点具有单核苷酸多态性。

使用MEGATYPE^TM技术的Lynx Therapeutics(Hayward，CA)技术可以测定同时来自小的或大的基因组材料集合的非常大量的SNP的基因型。该技术使用荧光标记的探针并且比较收集的两个群的基因组，使得能够检测和收集横跨区分两个群的SNP的DNA片段，而不需要之前的SNP作图或知识。

存在多种检测和鉴定SNP的其他方法。这些包括使用质谱，例如，来测量与SNP杂交的探针。该技术在进行的多快上有所不同，从每天几个样品至每天40,000SNP的高通量，其使用大量密码标记物。优选的实例是使用包含本发明突变的核酸分子的质谱测定，本发明的突变包括例如A8078C突变。这样的质谱方法是本领域技术人员已知的，并且本发明的测定基因型的方法适用于本发明多态性的质谱检测。

还可以通过ligation-bit分析来测定特定SNP的存在。这种分析需要两个与目标杂交的引物，该目标在引物之间具有一个核苷酸缺口。将四种核苷酸的每一种加入分开的含有DNA聚合酶、连接酶、目标DNA和引物的反应混合物中。聚合酶将核苷酸添加至与SNP互补的第一个引物的3’端，然后连接酶将两个邻近的引物连接在一起。样品加热时，如果发生了连接，目前较大的引物将保持杂交的，并且可以检测信号，例如荧光。这些方法的更多讨论可以在U.S.专利No.5,919,626；5,945,283；5,242,794；和5,952,174中找到。

US专利6,821,733(在此全部引入)描述了检测两个核酸分子序列中的差异的方法，包括步骤：在允许形成四支复合物和分支移动的条件下将两个核酸接触；在其中检测分子能够结合示踪分子或四支复合物的条件下将四支复合物与示踪分子和检测分子接触；在暴露于四支复合物之前和之后，检测示踪分子与检测分子的结合。四支复合物与示踪分子竞争与检测分子的结合表明了两个核酸分子之间的差异。

此外，已经研发了大量依赖于核酸构象可变性的方法来检测SNP。例如，单链构象多态性(SSCP)(Orita等，1989，PNAS 86：2766-2770)是依赖于单链核酸在特定条件下在溶液中形成二级结构的能力的方法。该二级结构取决于碱基组成，并且可以通过单核苷酸置换来改变，引起非变性条件下电泳迁移率的差异。通常放射性标记时通过放射自显影方法，通过条带的银染，通过与可检测标记的探针片段的杂交或使用随后检测(例如，通过自动化DNA测序仪)的荧光PCR引物，来检测各种多态性。

SSCP的改进是本领域公知的，并且包括使用不同的凝胶运行条件，如例如不同的温度，或添加添加剂和不同的凝胶基质。SSCP的其他变化是本领域技术人员公知的，包括，RNA-SSCP、限制性核酸内切酶指印-SSCP、双脱氧指印(在双脱氧测序和SSCP之间的杂合体)，双方向双脱氧指印(其中使用两个相对的引物同时进行双脱氧终止反应)和荧光PCR-SSCP(其中用多种荧光染料内部标记PCR产物，可以用限制酶消化，接着SSCP，并且在能够检测荧光染料的自动化DNA测序仪分析)。

利用改变不同核酸结构的迁移率的其他方法包括变性梯度凝胶电泳(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)和杂双链体分析(HET)。在此，双链DNA的解离变化(例如，由于碱基对错配引起的)导致电泳迁移率的变化。将这些迁移率移动用于检测核苷酸变异。

变性高压液相色谱(HPLC)是再一种用于检测SNP的方法，使用本领域公知的HPLC方法作为上述分离方法(如，凝胶电泳)的替换方法来检测，例如，以不同速率从HPLC柱洗脱出来的同质双链和异质双链，由此能够检测错配核苷酸，并且因此能够检测SNP。

检测SNP的再一种方法依赖于单链和双链核酸对各种试剂分离的不同易感性，包括化学分裂剂和核酸分解酶。例如，通过RNase A分裂RNA:DNA杂合双链内的错配，例如通过噬菌体T4核酸内切酶YII和T7核酸内切酶I分裂杂合双链，通过分裂酶I在单链和双链DNA之间的连接处分裂发夹环的5’端，通过Maxam-Gilbert测序化学中常用的化学剂改变杂合双链内的错配核苷酸，都是本领域公知的。

更多的实例包括蛋白翻译测试(PTT)，用于解决变异产生的终止密码子，该变异导致翻译的过早终止和蛋白产物大小减小，并且使用错配结合蛋白。例如，通过MutS蛋白(大肠杆菌DNA错配修复系统的成分)或人hMSH2和GTBP蛋白与含有错配碱基的双链DNA杂合双链的结合来检测变异。然后用错配结合蛋白培养DNA双链，并且通过迁移率移动试验来检测变异。例如，简单试验基于错配结合蛋白与杂合双链的结合保护杂合双链免受核酸外切酶降解。

上述检测和鉴定SNP的方法适用于鉴定具有本发明突变的核酸分子，并且因此可用于本发明的方法中。

基于蛋白和蛋白质组的方法也适用于检测和分析含有本发明突变的多肽。通过分析所述多肽可以直接检测导致表达多肽中的变异的突变或与表达多肽中的变异相关的突变。这通常需要在获自待测试动物的样品内分离各种蛋白，例如，通过凝胶电泳或HPLC，并且鉴定源自其的所述蛋白或肽，例如通过NMR或蛋白测序，如化学测序或更普遍的质谱。蛋白质组方法是本领域公知的，并且对于自动化具有很大潜能。例如，综合系统，如来自Proteome Systems的ProteomIQ^TM系统，提供了高通量的平台，用于结合样品制备、蛋白分离、图像获取和分析、蛋白处理、质谱和生物信息学技术的蛋白组分析。

大部分蛋白质鉴定的蛋白质组方法利用质谱，包括离子阱质谱、液相色谱(LC)和LC/MS质谱、气相色谱(GC)质谱、傅立叶变换-离子回旋共振质谱(FT-MS)、MALDI-TOF质谱和ESI质谱，及其衍生物。质谱方法在蛋白的翻译后修饰的测定中也是有用的，例如磷酰化和糖基化，并且因此在测定导致蛋白翻译后修饰变化或与蛋白翻译后修饰变化相关的突变中具有作用。

相关技术也是公知的，并且包括，例如，蛋白处理装置，如“化学喷雾打印机”，其包括压电打印技术，这可以通过将酶或化学物质直接喷射至选定的蛋白质点上，在原位酶或化学消化从2-D PAGE凝胶电印迹至膜的蛋白样品。原位消化和培养蛋白质后，可以将膜直接置于质谱仪中，用于肽分析。

其他合适的基于多肽的分析包括，但不限于，天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、等电聚焦、2D PAGE、使用特异性抗体的蛋白质印迹、免疫沉淀和肽指印。

如上所述，本发明突变的鉴定能够提供测定动物遗传价值的方法或选择动物的方法，这些动物具有有利的奶、组织和/或生长速率特性。这些方法依赖于动物的DGAT1外显子16等位基因特征和/或基因型的测定。

可以通过于DGAT1基因的一个(单倍体型(haplotype))或两个(基因型)等位基因的核苷酸组成来测定DGAT1的外显子16的等位基因特征。例如，关于DGAT1中的A8078C突变，野生型等位基因包括位置8078的腺嘌呤，并且因此在此称为“A等位基因”。A等位基因优选包含SEQ ID NO：1或43中所列的核苷酸序列。突变的DGAT1等位基因包含位置8078的胞嘧啶，并且因此在此称为“C等位基因”。C等位基因优选包含SEQ ID NO：2或44中所列的核苷酸序列。因此，DGAT1的位置8078的特定核苷酸将决定DGAT1的等位基因特性，并且特别地，将决定DGAT1的外显子16的等位基因特性。

为了测定动物中外显子的等位基因特征，可以以如上所述的多种方式实现DGAT1的外显子16的特定核苷酸组成的存在的鉴定(即，本发明突变的存在的鉴定)。例如，可以通过如单链构象多态性分析(SSCP)等这样的技术来测定本发明特定突变的存在，包括A8078C突变。还可以通过将获自动物的核酸分子直接测序来测定本发明突变的存在。或者，可以使用限制酶消化。此外，PCR和逆转录酶PCR可以用于分别扩增获自动物的DNA或mRNA，以确定外显子16的等位基因特征。例如，PCR扩增步骤中所用的引物之一可以识别并且只结合野生型的DGAT1的外显子16或只结合DGAT1的外显子16的突变序列。因此，PCR产物的存在或不存在说明了等位基因特征。如果在扩增反应中使用结合外显子16任一侧的PCR引物，mRNA(或获自mRNA的cDNA)的PCR扩增可以鉴定删除或插入突变。例如，一个引物可以结合DGAT1的外显子15中的序列，而另一个引物可以结合DGAT1的外显子17中的序列。然后PCR扩增将鉴定出引起外显子16交替剪接的突变，如本发明包括的A8078C核苷酸突变。大小小于预期的PCR产物将表示DGAT1编码序列的删除，而大小大于预期的PCR产物表示插入突变。鉴定本发明突变存在的其他方法并因此测定DGAT1的外显子16等位基因特征的方法是本领域已知的，并且以上有所描述。这些包括获自动物的核酸分子(例如，DNA或mRNA)的质谱分析，或使用识别和结合外显子16中的特定等位基因的探针的DNA或mRNA的Southern分析。

还可以通过获自动物的多肽样品的分析，如以上所述的方法，来实现动物中外显子的等位基因特征的测定。例如，DGAT1的A等位基因是编码外显子16中的甲硫氨酸氨基酸的密码子的一部分。可以通过将获自动物的多肽直接测序来测定甲硫氨酸的存在。

与本发明的突变连锁或不平衡连锁的遗传基因座也可以用于(间接)测定突变的存在，由此也测定了DGAT1的外显子16等位基因特征。例如，发明人鉴定了与SEQ ID NO：2所列核酸分子连锁或不平衡连锁的几个标记，例如，ARS-BFGL-NGS-4939、Hapmap52798-ss46526455、Hapmap29758-BTC-003619、BFGL-NGS-18858、Hapmap24717-BTC-002824和Hapmap24718-BTC-002945。连锁是遗传学中的现象，由此两个或多个突变或多态性位于相同染色体上，并且足够近，使得通常可以共同遗传。遗传相关，或连锁不平衡，是遗传学中的现象，由此两个或多个突变或多态性以这样近的遗传接近，使得它们以高频率共同遗传。这表示在基因型测定中，一个多态性存在的检测暗示着另一个的存在(Reich DE等，2001，Nature 411：199-204)。

此外，可以根据本发明的突变和相同或不同基因中的其他多态性来筛选动物，包括DGAT1中的编码K232A氨基酸置换的多态性和GHR基因中的F279Y氨基酸突变。本发明的突变与一个或多个其他多态性的结合可以提供协同作用。本发明的突变可以存在于与一个或多个其他多态性相同或不同的染色体上。动物对于本发明的突变可以是纯合或杂合的，或对于一个或多个其他基因中的多态性是纯合或杂合的。

发明人鉴定的突变DGAT1等位基因具有SEQ ID NO：2或44中所列的核苷酸序列。SEQ ID NO：2中所列的序列编码DGAT1多肽的位置232的丙氨酸残基，而SEQ ID NO：44中所列的序列编码DGAT1多肽的位置232的赖氨酸残基。如上所示，K232A多态性是由于DGAT1中的双核苷酸置换引起的，其中DGAT1的编码区的位置694和695的AA核苷酸(即，GenBank登录号AY065621/GI：18642597的位置6829和6830)被GC取代。预期232A多态性和DGAT1的外显子16编码的21个氨基酸的删除的结合对于有利的奶特征将具有协同作用。因此，在具有包括一个突变等位基因的基因型的动物中，可以实现协同作用，即，具有SEQ ID NO：2或44中所列核苷酸序列的DGAT1等位基因的一个拷贝，和一个编码野生型DGAT1多肽的等位基因。在该实例中，具有至少一个突变DGAT1等位基因的动物具有以下的DGAT1基因型之一：6829G 6830C/6829G 6830C、8078A/8078C；6829G6830C/6829A 6830A、8078C/8078A；6829A 6830A/6829A 6830A、8078A/8078C；6829G 6830C/6829G 6830C、8078C/8078C；6829A 6830A/6829A 6830A、8078C/8078C。构成这些基因型的等位基因具有以下表1中所列的氨基酸序列。

表1

如上所述，本发明能够提供根据有利的奶、组织和生长速率特征而测定动物(例如，牛)的遗传价值或测定基因型的方法。在一个实施方案中，这些方法包括测定动物是否包含多肽，或包含编码多肽的核酸分子，所述多肽具有：(i)野生型DGAT1的生物活性(即，包含多肽(A)或核酸分子(A)的动物)；或(ii)具有DGAT1氨基酸序列，该序列在由DGAT1的外显子16编码的一个或多个氨基酸中具有突变(即，动物包含多肽(B)或核酸分子(B))；或(iii)(i)和(ii)的结合。在这种情况中，并且参照以上的表1，核酸分子(A)可以具有SEQ ID NO：1或43中所列的核苷酸序列，而核酸分子(B)可以具有SEQ ID NO：2或44中所列的核苷酸序列。此外，多肽(A)可以具有SEQ ID NO：3或45中所列的氨基酸序列，而多肽(B)可以具有SEQ ID NO：4、46、47和48之一中所列的氨基酸序列。以上描述了测定动物包含哪个DGAT1核酸和多肽的方法。

2诊断试剂盒

本发明进一步提供了用于检测本发明核酸分子的诊断试剂盒，如用于测定测试下的动物的外显子16 DGAT1等位基因特征和/或基因型，和用于如上所述的本发明的其他方法中。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了诊断试剂盒，其可以用于测定动物(包括牛)的DGAT1基因型。诊断试剂盒可以包括一套引物，其从获自动物的核酸分子的样品扩增DGAT1。引物通常包括扩增含有本发明突变的DGAT1基因区域的核苷酸序列。例如，可以使用靶向本发明突变并且在常规杂交、Taqman试验、OLE试验等中作为等位基因特异性寡核苷酸功能的引物来进行实际的基因型测定。或者，可以对引物进行设计，以通过微测序可以测定基因型。

因此，引物试剂盒可以包括第一、第二和第三引物，分别为(a)、(b)和(c)。引物(a)与含有本发明的DGAT1突变的区域互补，并因此与其结合。引物(b)与引物(a)待扩增的区域的上游或下游区域互补，并因此与其结合，使得例如在两个引物的存在下，通过PCR扩增含有突变的遗传材料。引物(c)与对应于引物(a)结合的区域互补，并因此与其结合，但引物(c)缺少突变，即，包括野生型核苷酸。因此，将在引物(b)和(c)的存在下扩增含有未突变区域的遗传材料。对于野生型基因纯合的遗传材料将因此在引物(b)和(c)的存在下提供扩增的产物。对于突变基因纯合的遗传材料将因此在引物(a)和(b)的存在下提供扩增的产物。杂合遗传材料将在两种情况中都提供扩增的产物。

在一个实施方案中，诊断试剂盒在检测包含DGAT1基因或编码含有本发明突变的DGAT1多肽的DNA中是有用的。试剂盒可以包括用于扩增DNA的第一和第二引物，该引物分别与突变的DNA上游和下游的核苷酸序列互补，该突变导致有利的奶、组织和/或生长速率特征。在一个实施方案中，选择至少一个核苷酸序列与DGAT1基因的非编码区互补，并因此与其杂交。例如，在一个实施方案中，试剂盒包括具有SEQ ID NO：5和6中所列序列的寡核苷酸引物。试剂盒还可以包括第三引物，其与突变互补，并因此与其结合。

优选，试剂盒包括使用说明书，例如，用于根据本发明的方法。

在一个实施方案中，诊断试剂盒包括核苷酸探针，其与SEQ ID NO：1、2、43和44之一中所列的核苷酸序列互补，并因此与其结合。探针可以例如与获自待测试动物的DNA或mRNA杂交。试剂盒可以包括用于检测结合样品中的mRNA的核苷酸探针的工具，如本领域已知的工具。在特定的方面中，本发明该方面的试剂盒包括与SEQ ID NO：1、2、43和44之一中所列的核苷酸序列具有足够互补性的核酸分子的探针，使得在严谨条件下与其结合。“严谨”杂交条件具有本领域技术人员公知的意思。促进核酸杂交的合适的严谨条件取决于探针的长度，并且例如为，约45℃下，6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)。合适的洗涤严谨性取决于同源性程度和探针的长度。如果探针和目标序列之间的同源性为100％，可以使用高温(65℃至75℃)。然而，如果探针非常短(＜100bp)，即使具有100％同源性，也必须使用较低的温度。通常，在低温下(37℃至40℃)开始洗涤，并以3-5℃的间隔升温，直至背景足够低，以致没有影响放射自显影。诊断试剂盒还可以含有使用试剂盒的说明手册。

在另一个实例中，诊断试剂盒包含如下所述的抗体，或抗体组合物，用于检测野生型DGAT1的存在或不存在和/或含有本发明突变的多肽的存在或不存在。

3抗体

本发明还提供了抗体及其组合物，其检测本发明的多肽。这样的抗体可以包括，但不限于，多克隆、单克隆、嵌合和单链抗体。对于抗体的产生，可以通过注射本发明的多肽或其具有致免疫特性的任何片段或寡肽来免疫各种宿主，包括兔子、大鼠、山羊、小鼠、人等。各种佐剂可以用于提高免疫应答，并且包括但不限于，Freund’s，矿物凝胶，如氢氧化铝，和表面活性物质，如溶血卵磷脂。用于人体的佐剂包括BCG(卡介苗)和小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。优选用于诱导抗体产生的多肽或其片段或寡肽具有由至少5个氨基酸组成的氨基酸序列，并且更优选，至少10个氨基酸。还优选多肽、或其片段或寡肽与天然蛋白的氨基酸序列的一部分相同，并且含有小的天然产生分子的完整氨基酸序列。DGAT1氨基酸的短链可以与另一个蛋白的那些融合，如KLH，并且可以产生嵌合分子的抗体。

可以使用通过培养物中的连续细胞系提供抗体分子产生的任何技术来制备本发明多肽的单克隆抗体。这些包括，但不限于，杂交瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术和EBV-杂交瘤技术(例如，参见，Kohler G和Milstein C，1975，Nature256：495-497；Kozbor D等，1985，J.Immunol.Methods 81：31-42；Cote RJ等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2026-2030；Cole SP等，1984，Mol.Cell Biol.62：109-120)。还可以通过诱导淋巴细胞群的体内产生或通过筛选高特异性结合试剂的免疫球蛋白文库或组来产生抗体，如文献中所公开的(例如，参见，Orlandi R等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3833-3837；Winter G等，1991，Nature349：293-299)。

还可以产生含有本发明多肽的特定特异性结合位点的抗体片段。例如，这样的片段包括，通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab’)2片段和通过还原F(ab’)2片段的二硫桥接产生的Fab片段。或者，可以构建Fab表达文库，使得可以快速且容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段(例如，参见Huse WD等，1989，Science 246：1275-1281)。

各种免疫试验可以用于筛选来鉴定具有所需特异性的抗体。使用具有确定的特异性的多克隆或单克隆抗体进行竞争性结合或免疫放射测量试验的各种实验方案是本领域公知的。这样的免疫试验通常涉及本发明的多肽与其特异性抗体之间的复合物形成的测量。优选利用对两个非干扰DGAT1表位反应性的单克隆抗体的双位点的基于单克隆的免疫试验，但也可以使用竞争性结合试验。用于本发明DGAT1多肽的诊断试验包括利用抗体和标记的方法，该标记用于检测体液或细胞或组织提取物中的多肽。可进行修饰或不修饰而使用抗体，并且可以通过共价或非共价连接报告分子来标记。

4样品制备

如本领域技术人员所清楚的，由于方便，适用于本发明方法的样品可以获自组织或流体，并且使得样品含有待测试的一个或多个部分。例如，在待分析核酸的情况中，将使用含有核酸的组织或流体。

便利地，样品可以取自奶、组织、血液、血清、血浆、脑脊髓液、尿液、精液、毛发或唾液。可以使用标准技术，如细胞刮擦或活体检查技术，来获得组织样品。例如，可以通过使用耳打孔机从动物收集耳组织来获得细胞或组织样品。相似地，通常进行采取血样，例如，用于病原体测试，并且采取血样的方法是本领域公知的。同样，储存和处理生物样品的方法也是本领域公知的。例如，如果需要，可以将组织样品冷冻直至测试。此外，本领域技术人员将认识到分级或纯化程序后将更容易分析一些测试样品，例如，将全血分离成血清或血浆成分。

如上所述，上述用于检测本发明突变的方法可以用于选择单独的牛，或实际上牛群。例如，选择含有本发明突变的牛，并且与那些不含突变的牛分离出来。然后集合选择的牛，形成牛群。

此外，本发明涉及通过本发明的方法选择的动物产生的精子、卵子和核。将精子、卵子和核用于进一步的育种程序中。

本发明还涉及通过本发明的方法选择的动物产生的奶，以及从所述奶产生的产品。

本发明还提供遗传改变的动物的生产，其可以包括包含本发明突变的转基因动物。用于产生遗传改变的动物的方法是本领域已知的。这样的方法包括，但不限于，在动物的DGAT1基因中产生本发明的特定突变，使用锌指核酶技术(Geurts等，2009，Science 325(5939)：433)，或通过同源重组将突变DGAT1基因的插入(作为基因组或cDNA构建体)动物中。在这点上，构建体可以包括重组元件(loxp位点)，其可以通过如Cre重组酶这样的酶来识别，并且其增强重组过程。

“转基因动物”意思是工程化的以在动物的细胞内(一些或全部细胞)含有本发明突变的动物。可以通过各种不同方法来产生转基因动物，包括转染、电穿孔、微注射、胚胎干细胞中的基因靶向以及重组病毒和逆转录病毒转染(参见，例如，U.S.Pat.Nos.4,736,866；5,602,307；Mullins等，1993 Hypertension 22(4)：630-633；Brenin等，1997 Surg.Oncol.6(2)：99-110；Tuan(编辑)，Recombinant Gene ExpressionProtocols(重组基因表达实验方案)，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)，No.62，Humana Press(1997))。例如，首先制得核酸构建体，或“转基因构建体”，其包括适用于制备转基因动物的转基因(即，含有本发明突变的核酸分子)。构建体可以包括编码本发明突变DGAT1多肽的cDNA序列或基因组序列。在一个实施方案中，将牛基因组DGAT1编码序列用于制备转基因构建体，其中构建体包括野生型牛DGAT1基因中发现的相关内含子和外显子序列。为了产生编码本发明的突变DGAT1多肽的基因组序列构建体，可以使用含有DGAT1基因的细菌人造染色体(BAC)、酵母人造染色体(YAC)、P1人造染色体(PAC)或其他染色体DNA片段。通过以下本领域记载的实验方案(参见例如，Gong S等，2002，Genome Research 12：1992-1998)，将所需的DGAT1突变引入DGAT1基因中。

然后将携带突变DGAT1编码序列(基因组序列或cDNA序列)的转基因构建体与指导DGAT1表达的启动子可操作地连接。转基因构建体还可以包括其他转录和翻译调控元件或核苷酸序列(例如，顺式-作用激活子/增强子或抑制子)，并且将这些序列可操作地连接编码突变DGAT1多肽的多核苷酸。启动子和其他转录和翻译调控元件或核苷酸序列可以包括是天然动物序列的那些，其天然地负责表达DGAT1，或可以包括不同来源的序列。例如，携带DGAT1的基因组编码区的基因组克隆可以包括天然DGAT1 5’序列(包括天然启动子区域)和3’序列。或者，适用于本发明实践中的序列可以是真核生物或病毒基因的序列，或其衍生物，其以特异性或非特异性方式和/或以可诱导(例如，四环素诱导型启动子或MMTV类固醇诱导型启动子)或不可诱导的方式刺激或抑制基因转录。可以用于本发明实践中的启动子的实例包括，但不限于，朊病毒启动子、Thy-1启动子、PDGF启动子、酪氨酸羟化酶启动子、多巴胺转运子启动子、钙-钙调蛋白激酶II启动子、ELA启动子、MLP启动子、CMV启动子、MMLV启动子、MMTV启动子、SV40启动子、逆转录病毒LTR、金属硫蛋白启动子、RSV启动子等。启动子可以是指导普遍表达或以组织特异性方式表达的启动子，例如，只在乳腺中表达。

然后将所需的转基因核酸构建体用于产生转基因动物，例如，转基因牛。这可以以各种方式来实现。在一种方法中，从雌性收集前核(pronuclear)阶段的胚胎，并且将转基因构建体微注射至胚胎中，在该情况中，转基因核酸在染色体上整合至胚胎的基因组中。将改变的胚胎植入假怀孕的雌性动物中，这使得改变的胚胎发育至足月。所得到的成熟动物将在生殖细胞(产精子或卵子的细胞)和体细胞中都含有基因改变。在另一种方法中，从动物中分离出胚胎干细胞(ES)，并通过电穿孔、转染或微注射将转基因构建体引入细胞中。转基因核酸通过非同源重组整合至基因组中。然后将改变的ES细胞植入胚泡(早期胚胎)中，然后将其植入雌性动物的子宫中。从该胚泡出生的后代是嵌合动物，即，含有源自改变的ES细胞以及源自胚泡的未改变细胞的细胞的动物。通过选择具有发育自改变细胞的生殖细胞的后代，并杂种繁殖，可以获得在所有细胞中含有遗传改变的后代。前核微注射方法尤其适于引入大尺寸的基因组型转基因构建体，如携带基因组多核苷酸的BAC，其编码本发明的突变DGAT1多肽。

可以使用转基因特异性探针通过分析组织样品来测试后代的转基因整合。在这点上，Southern印迹分析和PCR特别有用。还可以使用合适的试验，例如，其中Northern印迹分析和Western印迹分析，通过分析组织样品中mRNA的水平或突变DGAT1多肽的水平来测定转基因的表达。用于这些分析的组织样品可以包括获自乳腺的样品。

如上所示，还可以使用锌指核酶来产生携带本发明突变的转基因动物。该技术描述于Geurts等，2009，上文中，并且不需要使用胚胎干细胞。相反，通过将DNA和RNA分子标准微注射至胚胎中来引入靶向的突变。DNA或RNA分子编码特异性的锌指核酶，并且通过种系如实且有效地遗传突变。

本发明还提供了产自本发明转基因动物的克隆，或产自携带本发明突变的任何动物(不管是转基因的或不是)的克隆。可以通过如体细胞核转移这样的方法来产生这些克隆的动物。该技术能够从单个体细胞形成新的动物(克隆)，而不需要进行在有性过程中卵母细胞被精子受精后发生的过程。将使用该技术产生的克隆胚胎转移至发情同步的代孕母体中，以形成新的动物。简而言之，在体细胞核转移方法中，当未成熟的卵母细胞在补充了各种激素和生长因子的培养基中培养并生长24-72小时时，其成熟至减数分裂的中期II，并将其称为体外成熟的卵母细胞。将通过用激素超数排卵收集的卵母细胞称为体内成熟的卵母细胞。通过微操作器除去使用该方法产生的成熟卵母细胞的单倍体，并将待克隆的动物的体细胞注入该去核卵母细胞的卵周隙或细胞质中。此后，将注入卵周隙或细胞质中的体细胞通过电刺激与去核卵母细胞在物理上融合。通过电刺激或化学物质来激活融合的卵母细胞。将由此产生的克隆胚胎通过外科或非外科程序转移至代孕母体的输卵管或子宫中，使得可以生出活的后代。

将认识到没有打算将本发明仅限于以上的实例。本领域技术人员显而易见的许多变化是可能的，并且没有脱离所附权利要求中限定的范围。

还可以宽泛地说本发明在于涉及申请说明书或申请说明书中所示的部分、元素和特征，单独地或总合地，以及任何两个或多个所述部分、元素或特征的任意或全部的组合，并且在在此提及具有本发明所属领域已知等价物的特定整体的情况中，认为在此引入这样的已知等价物，如同其单独列出一样。

通过参照以下实验实施例来进一步详细地描述本发明。提供该实施例只是用于说明目的，并且不是用于限制，除非另外指出。因此，本发明包括作为在此所提供教导的结果而明显的任何和所有变化。

附图说明

图1显示了母牛363的家谱。在家谱图中，所有产生具有有利的奶特征的奶的动物，或产生具有有利的奶特征的奶的siring母牛，是阴影表示的。雄性用方块表示，雌性用圆形表示。

图2显示了图表，其描绘了对于图1的家谱图中的低乳脂含量的标记相关图谱。每个标记与母牛363的家谱图中乳脂百分比相关的F-值呈现为在相对小的片段上的标记位置的函数，该片段从染色体14pter横跨至核苷酸位置2百万碱基对。高F-值表示标记周围的染色体区域与引起有利奶特征表现型的突变的位置的高相关程度。通过长方形来表示来自核苷酸位置444kb-446kb的DGAT1基因的位置。只描绘了具有所有3个基因型类别并具有5或更多计数的标记。通过虚线表示对应于假发现率的20.188的F-值。

图3显示了母牛363中突变的图示，作为接近外显子16的3’-端的腺嘌呤(A)至胞嘧啶(C)核苷酸置换(GenBank登录号AY065621/GI：18642597中的位置8078)。突变编码：(i)其中位置435中的甲硫氨酸残基由亮氨酸替代的DGAT1蛋白(M435L)，和(ii)缺少21个由外显子16编码的氨基酸的DGAT1蛋白(Δ418-438)。A：DGAT1基因结构的图示。外显子表示为长方形，内含子和基因间区域通过粗线表示。B：获自8078位置杂合的母牛363的外显子16的序列色谱。C和D：母牛363中突变周围的部分核苷酸和氨基酸序列。C：野生型DGAT1基因(上序列)和DGAT1蛋白(下序列)的部分序列。用大写字母表示外显子序列，部分内含子序列是小写字母。接近外显子16的3’-端的外显子剪接基序(ATGATA)是下划线的。通过蛋白序列内的水平线来表示RNA加工过程中对应于内含子15和内含子16的序列的去除。D：母牛363中突变DGAT1基因的部分序列(上序列)，突变DGAT1蛋白的部分序列，其中位置435的甲硫氨酸残基由亮氨酸取代(中序列；水平线表示RNA加工过程中对应于内含子15和内含子16的序列的去除)，和缺乏21个由外显子16编码的氨基酸的突变DGAT1蛋白的部分序列(下序列；水平线表示对应于内含子15、外显子16和内含子16的序列的去除)。DGAT1基因的外显子16中的突变外显子剪接基序(CTGATG)是下划线的。E：外显子剪接基序的突变导致mRNA加工过程中外显子16的切除。获自野生型DGAT1基因的纯合携带者(母牛351和352)的肝总RNA的逆转录酶PCR显示出预期的含有外显子16的200个碱基对产物。该200个碱基对产物在来自位置8078突变杂合的母牛(母牛346和353)的样品中量不太大。来自位置8078突变杂合的母牛的样品还产生了另外的137个碱基对的PCR产物，其缺乏对应于外显子16的核苷酸。显示出在346和353泳道中以大约240个碱基对移动的条带是137和200个碱基对产物的异质双链。

图4显示了对应于母牛363中的突变的区域中的DGAT1蛋白的进化保守。比对了来自牛(Bos taurus)(Bta，登录号NP_777118.2)、大额牛(Bos indicus)(Bin，ABR27822.1)、水牛(Bubalus bubalis)(Bbu，ABB53651.2)、人(Homo sapiens)(Has，NP_036211.2)、黑猩猩(Pan troglodytes)(Ptr，XP_520014.2)、猕猴(Macacamulatta)(Mmu，XP_001090134.1)、家犬(Canis familiaris)(Cfa，XP_539214.2)、家马(Equus caballus)(Eca，XP_001917097.1)、家山羊(Capra hircus)(Chi，ABD59375.1)、绵羊(Ovis aries)(Oar，NP_001103634.1)、野猪(Sus scrofa)(Ssc，NP_999216.1)、短尾负鼠(Monodelphis domestica)(Mdo，XP_001371565.1)、斑马鱼(Danio rerio(Dre，NP_956024.1)、小鼠(Mus musculus)(Mus，NP_034176.1)和大鼠(Rattus norvegicus)(Rno，NP_445889.1)的部分氨基酸序列，并且显示出与母牛363的突变等位基因(M435L或Δ418-438)编码的部分序列相反。破折号表示作为遗漏外显子16结果的Δ418-438突变蛋白中的21个氨基酸缺失。底端行中的星号表示所比较物种中的完全保守。

图5显示了母牛363中的A8078C突变对DGAT1蛋白的酶活性的影响。通过在缺乏内源性二酰甘油转移酶的活性的baker’s酵母株H1246中以相当的水平(即，在±10％内)表达相应cDNA而获得野生型和突变形式的DGAT1蛋白，测试其将[¹⁴C]油酰-CoA转化成二酰甘油的能力。通过母牛363的突变DGAT1基因来编码DGAT1-232A-Δ418-438(SEQ ID NO：47)，即，在位置232含有丙氨酸残基，并且缺乏由外显子16编码的21个氨基酸(即，Δ16)。全长，野生型蛋白DGAT1-232A(SEQ ID NO：3)和DGAT1-232K(SEQ ID NO：45)在位置232分别含有丙氨酸和赖氨酸。A：获自二酰甘油转移酶反应的产物的薄层色谱，该反应来自每个cDNA表达质粒的两个独立酵母转化体，和来自用不含插入片段的表达质粒(空载体)转化的相同宿主菌株。通过箭头来表示[¹⁴C]油酰-CoA(反应底物)和甘油三酯(反应产物)的位置。B：通过图A中所示的TLC平板的密度计成像来定量重组DGAT1蛋白和对照合成的甘油三酯产量，并且表示为来自每个质粒的两个独立转化体的每个面积的平均数(+标准误差)。在所有反应中，使用了等量的总细胞提取物。

图6显示了A8078C突变对突变杂合母牛肝中的二酰甘油转移酶活性的影响。从野生型(n＝11，AA)和携带者母牛(n＝13，CA)获取从肝活体组织制备的微粒体蛋白样品，并通过薄层色谱和闪烁计数来测试它们将[¹⁴C]油酰-CoA转化成二酰甘油的能力。将[¹⁴C]油酰-CoA至甘油三酯的平均结合描述为每分钟的计数(CPM)，并且在野生型和杂合携带者母牛之间显著不同(AA vs.CA，p＜0.05)，如通过星号所示的。

具体实施方式

实施例-有利奶特征表型的遗传基础的分析

该实施例描述了鉴定具有提高的奶体积、降低的乳脂含量、降低的饱和脂肪酸含量、提高的不饱和和ω-3脂肪酸含量和降低的脂肪硬度的母牛，并使用为发现控制经济上重要的奶性状的新突变而进行的程序来研究这些特征的遗传基础。

材料和方法

1.具有极端奶性状的母牛的鉴定

为了在标准新西兰乳牛业实践下产生高体积的具有降低脂肪百分比的奶的母牛，筛选了新西兰国家乳畜群中的几百万只动物。

2.固体脂肪含量和脂肪酸组成的分析

在峰值哺乳期期间从上午和下午挤奶收集奶样，并合并形成每只动物的单独复合样品。

使用MacGibbon AKH和McLennan WD，1987，NZ J.Dairy Science andTechnology，22：143-156中所述的程序，使用Bruker Minispec NMS 120NMR仪器(Bruker Analytische Messtechnik GmbH，Rheinstetten，德国)，通过脉冲核磁共振(NMR)，测定了提取的乳脂的固体脂肪含量(SFC)。将SFC结果表示为固体脂肪百分比。使用MacGibbon AKH和McLennan WD，1987，上文中所述的顺序逼近法(sequential method)来调节乳脂样品，这需要在60℃熔化脂肪30min，将熔化的样品在0℃过夜结晶，接着以5℃(45min平衡后)的间隔测定至40℃的SFC。比较中使用的最明显的是10℃下的SFC。

通过脂肪酸甲酯(FAME)分析(参见MacGibbon AKH，1988，NZ J.Dairy Scienceand Technology，23：399-403)来测定乳脂的脂肪酸含量。

按照所述的(Mackle TT等，1999，NZ J.Dairy Sci.，82：172-80)，通过HPLC和SDS-PAGE测定奶样的酪蛋白和乳清蛋白含量。

3.罕见奶特征的遗传性的分析

使用标准体外受精技术和胚胎植入代孕母体中，从母牛363产生七只雌性和五只雄性后代。按照标准新西兰乳牛业实践来饲养小牛，并且在15个月大时，使小母牛受精。

通过傅立叶变换红外线光谱(http://www.foss.dk)(FTIR)测量乳脂和蛋白含量、固体脂肪含量、乳脂肪酸组成和乳蛋白组成来测定有利奶特征表型的世代内遗传。

4.用于突变图谱作图的家谱的产生，和乳脂表型的测定。

从母牛363的五头小公牛收集精子，并用于使商业产奶畜群中的不相关霍斯坦种乳牛(Holstein-Friesian)的母牛受精。按照标准新西兰乳牛业实践来饲养小母牛，并且在15个月大时使其受精。

在早期和峰值哺乳期阶段中，通过FTIR测定母牛363的五头雄小牛的101头哺乳期母小牛的乳脂百分比，并用作引起有利奶特征表型的突变的图谱作图的表型。

在早期和峰值哺乳期阶段中，通过FTIR测定传递有利奶特征表型的开始者母牛363、其七头小母牛(母牛273、351、346、352、353、354和357)、母牛107(346的小母牛)、母牛108和307(母牛354的小母牛)和母牛363的三头小公牛的50头哺乳小母牛的乳脂百分比，并用作表型来作出带有负责有利奶特征表型的突变的基因组区的图谱。

5.测定基因型

从母牛363家谱内的199头动物的全血分离基因组DNA：母牛363、其公畜和祖公畜、五头小公牛、七头小母牛和母牛107、108和307，其五头小公牛做公畜的101头孙母牛，补充79头孙母牛的母畜。使用Illumina BovineSNP50Genotyping BeadChip(Illumina Inc.，San Diego，CA，U.S.A.)测定样品的基因型。总共45,261个提供信息的SNP标记用于相关的图谱作图。

从全血或精子分离基因组DNA，全血或精子来自185头经常用于新西兰乳牛群人工受孕的公畜，和来自代表BoviQuest Friesian-Jersey杂交畜群的80头公畜和1595头母牛(Spelman RJ等，2001，Proc.Assoc.Advmt.Anim.Breed.Genet.14：393-396)。使用SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6给出的PCR引物，和SEQ ID NO：7中给出的延伸引物，在定制的iPLEX^TMGold试验(SEQUENOM，San Diego，CA，USA)中，为A8078C突变，测定样品的基因型。将来自突变杂合的母牛363家谱的八头动物的DNA用作阳性对照。

6.相关性图谱

使用SAS版本9.1来分析Illumina基因型。使用Illumina提供的染色体位置数据，通过SNP名称来合并数据。对于每个染色体，形成分开的数据库。通过进入数据库的Illumina样品ID来合并乳脂百分比测量。合并SNP等位基因来形成基因型变量。为了分析目的，按字母顺序排列这些基因型，即，A、AC、C等。然后将这些变成SAS中所用的数值(即，A、AC、C等于0、0.25和0.5等)。在每个基因型配对中，将最低按字母顺序的基因型水平用作GLM模型中的参照/基线组。根据以下的表2编码基因型。

对于每个染色体，分开进行分析。对于每个SNP，进行了分开的广义线性模型，即，对于每个染色体，表型＝基因型。将以下模型用于广义线性建模：

y＝基因型+e

(其中y＝乳脂含量(定量变量)，基因型＝对于特定染色体的SNP标记，e＝误差或残数)。

通过线性回归(ANOVA建模)计算每个SNP标记的F-值和p-值。对于所有的SNP标记，通过采用0、1、2基因型编码惯例，获得了相同的结果。对于每个标记的参照组是最低次序的纯合组，由0来表示。杂合组由1来表示，最高次序的纯合组由2来表示。

表2

基因型	基因型编码
		A，AC，C	0，0.25，0.5
A，AG，G	0，1，2
		A，TA/AT，T	0，1，2.5
G，TG，T	2，2.25，2.5
		C，GC/CG，G	0.5，1，2
C，TC，T	0.5，1，2.5

采用Benjamin和Hochberg程序来测定假发现率(FDR)。计算中只包括具有所有3个基因型类别和具有5或更高计数的那些标记。从相关性图谱返回的每个标记的p-值以最低p-值开始的幅度(即，最显著的标记)排序。通过采用极限来鉴定最大的p-值，使得：

P(i)≤α/(m-(i)+1)

(其中将α设定为0.05；m是标记的总数，i是来自相关性图谱的p-值的幅度的升序)。

总共10,096个标记符合标准(具有所有3个基因型类别和5或更高计数的标记)并且包括在计算中。计算的极限为4.9549103x10^-6。丢弃P_(j)≤4.9549103x10^-6的标记(其中j是单独的标记)。鉴定出6个标记具有低于极限的p-值。通过采用与最大p-值相关的F-值形成了F-值极限/FDR，使得P(i)≤α/(m-(i)+1)。在这种情况下，返回的最大p-值来自ARS-BFGL-NGS-18858，具有1.1817496x10^-6的p-值；从ANOVA建模返回的相关F-值是20.187953515。

7.候选基因序列分析

将DGAT1鉴定为用于有利奶特征表型的候选基因。通过与人基因序列的同源性和来自牛DGAT1基因的GenBank注释(登录号AY065621.1；GI：18642597)来测定内含子/外显子边界。使用SEQ ID NO：8-11呈现的引物从基因组DNA扩增了外显子1，使用SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13呈现的引物扩增了外显子2，使用SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15呈现的引物扩增了外显子3，并且使用SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17呈现的引物扩增了横跨外显子4至17的染色体片段。使用SEQ ID NO：18-35呈现的引物测定了两个方向的外显子和内含子/外显子边界序列。

8.活组织取样

通过峰值和中间哺乳期过程中不同时间点的穿刺活检来收集肝组织。AgResearch Ruakura Animal Ethics Committee(Hamilton，新西兰)综述和批准了活体检查程序和相关的动物处理实验方案。将组织样品在液氮中立即速冻并在-85℃下存储，直至进一步处理。

9.DGAT1 cDNA克隆和酵母表达载体的构建

从获自野生型母牛352和突变母牛354的总肝RNA扩增DGAT1 cDNA。将SEQID NO：36和37呈现的引物用于头10个扩增循环；用SEQ ID NO：38呈现的引物用于接下来的20个扩增循环，与以下引物配对：(i)SEQ ID NO：39呈现的引物(编码DGAT1-232K的cDNA)；(ii)SEQ ID NO：37呈现的引物(编码DGAT1-232A的cDNA)；或(iii)SEQ ID NO：40呈现的引物(编码DGAT1-232A-Δ418-438的cDNA)。Advantage GC Genomic LA Polymerase Mix(Clontech)用于所有30个循环。

使用TOPO TA Cloning试剂盒(Invitrogen)，将PCR产物克隆至pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中，并转化至大肠杆菌TOP10(Invitrogen)中。从重组克隆制备质粒DNA，并且使用标准程序测定插入片段的序列。

用HindIII/NotI(DGAT1-232K和DGAT1-232A-Δ418-438)和HindIII/EcoRI(DGAT1-232A)从pCR2.1-TOPO切除DGAT1插入片段，并使用Rapid DNALigation试剂盒(Roche)克隆至酵母表达载体pYES2(Invitrogen)的HindIII和NotI或EcoRI位点中。所有DNA修饰酶获自Roche。使用标准程序证实了质粒插入片段及其邻接片段的核苷酸序列。

按照所述的(Ausubel等，1987，上文)，通过电穿孔，将DGAT1表达质粒和非重组载体pYES2引入菌株H1246中(Sandager L等，2002，J.Biol.Chem.277：6478-6482)。通过在30℃下培养三天，在含有葡萄糖作为唯一可发酵碳源(SCD-ura)的无尿嘧啶最小培养基上选择了转化体。通过有限稀释的两轮克隆后，对于DGAT1-232A、DGAT1-232K和DGAT1-232A-Δ418-438等位基因，分别使用SEQ ID NO：37和38、SEQ ID NO：38和39以及SEQ ID NO：38和40呈现的引物对，通过PCR筛选了带有DGAT1表达质粒的转化体。通过标准方法测定了PCR产物的序列。将重组酵母菌株常规地维持在SCD-ura平板上。

10.DGAT1蛋白在baker’s酵母中的异源表达

将重组酵母菌株在100mL SCD-ura中生长至OD600nm 0.4-0.6。将细胞在100mL无菌水中洗涤一次，并且重悬浮于100mL含有2％半乳糖作为唯一碳源的无尿嘧啶合成的完全培养基中，并在30℃下在旋转振荡器上培养12-16小时。将二十个OD600nm的培养物收集至15mL玻璃离心管中，并且保留1 OD600nm，用于mRNA定量。将细胞在4000g下沉淀5min，在1体积水中洗涤，并重悬浮于50μL玻璃珠破坏缓冲液中(20mM Tris-HCl(pH7.9)，10mM MgCl₂，1mM EDTA，5％甘油，1mM DTT，0.3M磷酸铵，完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)，0.8mMPefabloc SC PLUS(Roche))。将600mg玻璃珠(直径450-550μm，Sigma)加入每个管中，并且通过在4℃下强烈涡旋5min来破坏细胞。将500μL玻璃珠破坏缓冲液加入每个管中，并且通过吸移来收集裂解液。将裂解液在12000g^-1下离心10min，并且保留上清液。使用DC蛋白试验(Bio-Rad)测定了澄清裂解液的蛋白浓度。立即使用裂解液来测定二酰甘油转移酶活性，或存储在-80℃。

对于酵母转化体中DGAT1表达的定量，将1 OD600nm的半乳糖诱导的酵母培养物收集至1.5mL eppendrof管中，并且在4000g下沉淀5分钟。使用Yeast ProteinExtraction Buffer试剂盒(GE Healthcare)制备了原生质球。使用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取了原生质球RNA。使用Superscript III First Strand Systhesis试剂盒(Invitrogen)将400ng的总RNA转录成cDNA。使用cDNA模板、2×Probes MasterMastermix(Roche)和SEQ ID NO：49和50中呈现的引物对，通过定量PCR反应，测定了重组DGAT1 mRNA的水平。用于检测扩增的荧光探针是Universal ProbeLibrary#98(Roche)(5’-CTGTGCCT-3’)。热循环条件如下：95℃预培养5分钟，接着95℃(10秒钟)、60℃(15秒钟)和72℃(1秒钟)的45个循环。在LightCycler480仪器(Roche)上进行了热循环和荧光检测。使用稀释系列的集合cDNA样品来测定扩增效率，产生了标准曲线。所有样品和标准品测量重复三次。使用SEQ IDNO：51和52呈现的引物和荧光检测探针Universal Probe Library#82(Roche)(5’-CTCCTCTG-3’)，进行了相同的试验来测定酵母GAPDH的mRNA水平。循环条件与DGAT1试验相同。通过计算牛DGAT1 mRNA的平均交点值(Cp)与酵母GAPDH mRNA的平均Cp的比例，测定了DGAT1表达水平。

11.重组DGAT1蛋白的二酰甘油转移酶试验

在200μL的由250mM蔗糖、1mM EDTA、20mM MgCl₂、100mM Tris-HCl(pH7.5)、25μg无脂肪酸血清白蛋白(Sigma)、40nmol 1，2-二油酰-sn-甘油(Sigma)和5nmol[1-¹⁴C]油酰-CoA(特异的活性50-62mCi/mmol；GE Healthcare)组成的溶液中，定量了油酰-CoA至二酰甘油的转化。在每个反应中使用了含有50μg蛋白的澄清酵母细胞裂解液。将反应在37℃下预培养两分钟。加入二酰甘油和油酰CoA，将反应混合物在37℃再培养8min。通过加入800μl含有15μg/ml三油精的氯仿∶甲醇(1∶1)并混合来停止反应。将600μL氯仿加入每个反应中，混合，并在-20℃下培养过夜。加入300μL酸化H₂O(17mM NaCl，1mM H₂SO₄)后，收集有机相并且在氮流下干燥。将收集的材料溶解于20μL丙酮中，并且使用己烷/乙酸乙酯(9∶1vol/vol)在硅胶60薄层色谱平板(Merck)上分离。将TLC平板干燥，并且暴露于PhosphorImager屏幕(Kodak)48小时。通过用Pharos FX plus扫描仪(Bio-Rad)扫描获得了TLC图像。通过保持系数(Rf；溶剂的移动距离除以TAG的移动距离)来鉴定三酰甘油(TAG)，之前用TAG标准品(Sigma)来测定。

12.来自组织活检的微粒体的制备

将300mg肝在4ml冰冷均质介质(0.25M蔗糖、1mM EDTA，在pH7.4用5mMTris缓冲)中均质。使用速度设定为5的Polytron均质机PT1200，在冰上进行了均质，三次，持续大约10秒。将匀浆在4℃和15,000g下离心30分钟。收集上清液，并在4℃和100,000g下离心1小时。丢弃上清液，并将沉淀物(微粒体部分)重悬浮于150μL均质介质中，并储存在-80℃。使用Bio-Rad蛋白试验测定了蛋白浓度。

13.组织微粒体的二酰甘油转移酶试验

在100μL的由0.1M K-磷酸盐缓冲液(pH7.4)、10mM MgCl₂、1mM 1，2-二油酰-sn-甘油(Sigma)和0.2μCi[1-¹⁴C]油酰-CoA(American Radiolabeled Chemicals，Inc.)组成的溶液中定量了油酰-CoA至二酰甘油的转化。每个反应中使用了含有40μg蛋白的微粒体样品。将反应混合物在37℃下培养30min。通过加入750μL的氯仿∶甲醇(1∶1)并混合来停止反应。加入375μL酸化H₂O(17mM NaCl，1mMH₂SO₄)后，收集有机相并且在氮流下干燥。将收集的材料溶解于20μL己烷中，并且使用己烷∶乙醚∶乙酸(80∶20∶1vol∶vol∶vol)在硅胶60薄层色谱平板(Merck)上分离。通过与TAG标准品(Sigma)比较来鉴定对应于TAG部分的区域，从TLC平板上刮下来，并转移至1.5ml离心管中。将500μL Optifase Hisafe 3(Perkin Elmer)混合物加入管中，并在Wallac 1409液体闪烁计数器(Perkin Elmer)中作为每分钟的计数来测定[¹⁴C]β发射。

14.外显子16剪接的分析

为了测定外显子16的存在或不存在，根据制造商的说明，使用Qiagen RNeasy试剂盒(Qiagen)，从母牛363谱系的四头突变和四头野生型母牛获得的乳房和肝脏活检提取RNA。简而言之，使用Fastprep仪器(Qbiogene)中的Fastprep Lysing基质D柱，通过在Qiagen缓冲液RLT中研磨来将组织活检样品均质。在无RNAse的水中洗脱RNA，并通过在260nm处的吸光值来定量。通过在RNA 6000纳米实验室芯片和BioAnalyzer仪器(Agilent Technologies)上的电泳来证实RNA完整性。根据制造商的说明，使用寡dT引物和First Strand cDNA试剂盒(Invitrogen)来制备cDNA。

使用1μl组织cDNA、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液和Q溶液(所有来自Qiagen)，将SEQ ID NO：41和42呈现的引物用于扩增DGAT1(通过GenBank登录号NM_174693.2；GI：110350684来表示)编码区的位置1178至位置1377的区域。30个扩增循环后[30秒，94℃，30秒，60℃，30秒，72℃]，根据标准实验方案，将PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中分离。通过与1kb+阶梯(ladder)(Invitrogen)比较来测定PCR产物的大小。对于含有或缺乏外显子16的mRNA，预期的扩增子大小分别为200和137个碱基对。

15.剪接调控基序的鉴定

为了鉴定具有剪接调控活性的序列，将牛DGAT1基因序列提交至RESCUE-ESE网络服务器(http://genes.mit.edu/burgelab/rescue-ese/)。RESCUE-ESE通过将询问序列与具有实验证实的外显子调控活性的六聚物序列比较来鉴定剪接增强子基序(Fairbrother WG等，2002，Science 297：1007-13)。将牛DGAT1序列与人、小鼠和斑马鱼(Danio rerio)基序进行比较(Yeo G等，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：15700-5)。

16.饲料摄入测量

将第二次哺乳期的15头A8078C突变杂合的母牛和15头非突变母牛(纯合AA)在中间哺乳期(11月)圈养在室内14天并且通过使用calan门喂养新鲜牧草(在使用牛的饲料摄入试验中使用calan门由Ferrie等描述，2006，Irish Journal ofAgricultural Research 45：149-156)。每头母牛每日挤奶后接受新鲜切割的牧草膳食两次(每天大约0900和1600点)。通过将三份150g样品在95℃干燥48小时，每日两次(上午和下午.)测定新鲜饲料的干物质含量，每次测定重复三份。估算的饲料定量为25kg DM/母牛/天的新鲜牧草。

每日记录每头母牛的上午和下午定量的残余物重量，并且重复三次测定干物质含量，对于以上所述的每头母牛和限量供给。

结果

1.母牛363产生高体积的具有罕见脂肪组成的奶

母牛363鉴定为在标准新西兰乳牛业实践下产生高体积的具有降低脂肪百分比的奶。图1中显示母牛363的谱系。所有产生具有有利的奶特征的奶的动物或产生具有有利的奶特征的奶的siring母牛用阴影表示。雄性用方块表示，雌性用圆形表示。如从图1中可看到的，三头母牛363的小母牛(346、353和354)产生具有有利的奶特征的奶，而五头小公牛中的三头产出了产生具有有利的奶特征的奶的母牛。

母牛363的奶的平均脂肪含量为2.81％(标准偏差0.1％)，认为这低于Holstein-Fresian母牛的4.34％的国家平均值。

母牛363的平均脂肪产量为175kg/季(标准偏差26kg；季平均长度为253天)，与新西兰Holstein-Fresian平均的162kg相比(季长为270天)。

母牛363的平均奶产量为6224升/季(标准偏差924升；季平均长度为253天)，认为这高于新西兰Holstein-Fresian母牛的平均值(4064升；季长270天)。

2.母牛363的奶特征是可遗传的

进行了进一步的交配来延伸图1所示的谱系。将来自母牛363的五头小公牛的精子用于产生101头哺乳雌性后代。它们的奶的分析证明了母牛363的五头小公牛中的三头产出了产生低脂奶的母牛，表示这些公牛已经遗传了引起有利的奶特征表型的基因座。其他雌性后代获自具有母牛363的有利奶特征的小母牛。那些母牛的乳脂百分比概括于以下的表3中。

表3

图谱群中的动物的乳脂百分比

如表3中所看到的，显示了开始者母牛363、其七头小母牛(母牛273、351、352、353、354、346和357)、母牛107(346的小母牛)、母牛108和307(354的小母牛)和363的传递有利奶特征表型的三头小公牛的50头哺乳小母牛在早期和峰值哺乳季中通过傅立叶转化红外线光谱(http://www.foss.dk)(FTIR)测定的平均乳脂百分比。应当注意到乳脂百分比在一些动物中降低，特别是在哺乳早期。上表中呈现的数据是在早期哺乳过程中获自多个测试日的单个动物的平均值。因此，预期一些动物中的乳脂百分比随着哺乳进展进一步降低。这是用于性状基因座遗传图谱作图的数据。

如在表3中看到的，母牛363的小母牛346、353和354产生了与其母畜相似极端特征的奶，而小母牛351、352和357产生了与相同畜群中的不相关对照母牛相似的奶，并且与Holstein-Friesian母牛的新西兰平均相似。来自小母牛346、353和354的奶的平均脂肪百分比为2.62％(标准偏差0.09％)，而小母牛351、352和357的平均乳脂为4.20％(标准偏差0.43％)。

以下表4中显示了获自母牛363的奶的脂肪酸组成(表示为总脂肪酸的重量比)，并且是非常不寻常的。

表4

来自母牛363的乳脂的脂肪酸含量

如表4中所看到的，获自母牛363的奶中的饱和脂肪酸百分比明显降低至总脂肪酸含量的55-60％，而与新西兰喂草控制系统下的Holstein-Friesian母牛相比，单不饱和和多不饱和脂肪酸的百分比明显增加13-33％(MacGibbon AKH和TaylorMW，2006，Composition and Structure of Milk Lipids(乳脂的组成和结构)，AdvancedDairy Chemistry，Vol.2.Lipids，第3版，1-42。Fox，P.F.，和McSweeney，P.L.H.编辑，Springer，New York)。此外，在获自母牛363的奶中的ω-3脂肪酸也明显较高，ω-3脂肪酸的特征在于n-3位置的碳-碳双键。

以下的表5显示了获自母牛363谱系的母牛的奶的固体脂肪含量(SFC)。对于谱系的开始者(母牛363)，其小母牛346、353和354的平均值和标准偏差(产生具有有利奶特征的奶的小母牛)和相同畜群中没有产生具有有利的奶特征的奶的三头不相关对照母牛(对照母牛)，显示了表示为总固体脂肪百分比的10℃下提取的乳脂的SFC。

表5

获自母牛363谱系的母牛的奶在10℃下的固体脂肪含量(SFC)

如表5中所示的，来自母牛363的奶在10℃下含有43.9％固体脂肪，明显低于基于草料膳食的母牛的平均值(57.7％，标准偏差3.3％)。此外，来自小母牛346、353和354的奶在10℃下的平均固体脂肪为42.2％(标准偏差2.8％)，而相同畜群中的不相关对照母牛的平均值为56.9％(标准偏差4.2％)。

以下的表6显示了获自母牛363谱系的母牛的奶的脂肪酸组成。将通过脂肪酸甲酯分析测定的单独脂肪酸分组，并表示为总脂肪酸的重量百分比。表示谱系的开始者(母牛363)，其小母牛346、353和354，小母牛351、352和357的平均值和标准偏差以及相同畜群中的三头不相关对照母牛(对照母牛)的结果。脂肪酸组由以下组成：饱和脂肪酸：C4:0、C6:0、C8:0、C10:0、C12:0、C13:0、C14:0、C15:0、C16:0、C17:0、C18:0、C20:0、C22:0和C24:0；单不饱和脂肪酸(MUFA)：C10:1、C12:1、C14:1、C16:1、C17:1、C18:1n-9、C20:1n-11、C20:1n-9、C22:1n-9和C24:1；多不饱和脂肪酸(PUFA)：C18:2n-6、C18:3n-6、C20:2n-6、C20:3n-6、C20:4n-6、C20:3n-3、C20:4n-3、C20:5n-3、C22:4n-6、C22:5n-6、C22:5n-3和C22:6n-3；不饱和脂肪酸：MUFA+PUFA；ω-3脂肪酸：C18:3n-3、C20:5n-3和C22:6n-3。

表6

获自母牛363谱系的母牛的奶的脂肪酸组成

如表6中所示的，来自小母牛346、353和354的奶平均含有54.25％的饱和脂肪酸(标准偏差2.08％)、30.09％的单不饱和脂肪酸(标准偏差1.43％)和3.22％多不饱和脂肪酸(标准偏差0.14％)。ω-3脂肪酸含量是1.33％(标准偏差0.11％)。在来自小母牛351、352和357的奶中，发现了百分比与相同畜群中的不相关对照母牛相似的这些脂肪酸组，以及品种平均产量。

母牛363及其六头小母牛的酪蛋白和乳清蛋白的百分比和组成在新西兰基于牧草控制系统下的Holstein-Friesian母牛的正常变化内。

母牛363的五头小公牛中的三头产出了产生具有与母牛363相似的有利奶特征表型的奶的小母牛。

3.DGAT1作为候选基因的鉴定和新突变的检测

图2中显示了基因型测定的结果和相关性图谱。相关性图谱鉴定出染色体14上的区域300-1,400kb碱基中与有利的奶特征表型强烈相关的SNP标记ARS-BFGL-NGS-4939、Hapmap52798-ss46526455和Hapmap29758-BTC-003619。通过相关性图谱鉴定的具有强烈相关的其他标记是BFGL-NGS-18858、Hapmap24717-BTC-002824和Hapmap24718-BTC-002945。将这些标记绘制于没有分配给牛基因组装配中的染色体的contig(Chr.Un.004.115)(ftp://ftp.hgsc.bcm.tmc.edu/pub/data/Btaurus/fasta/Btau20070913-freeze/)。

通过BLASTN分析(Altschul SF等，1990，J.Mol.Biol.215：403-10)，将横跨牛染色体14上的1-1,400kb的区域鉴定为与横跨人染色体8的核苷酸位置142,200-146,200kb的区域同源。然而，牛染色体14序列缺乏与人核苷酸143,960-144,144kb相似的序列。通过BLASTN比较测试时，物种间比对中的这种缺口通过牛邻接片段(contigs)Chr.Un.004.209和Chr.Un.004.115中的序列来闭合。因此，这些邻接片段以及因此标记BFGL-NGS-18858、Hapmap24717-BTC-002824和Hapmap24718-BTC-002945，被绘制于有利奶特征表型的候选区域。

候选区中存在的基因的分析鉴定了横跨染色体14上的区域444-447kb的牛DGAT1基因。DGAT1编码二酰甘油O-酰基转移酶1(EC 2.3.1.20)，其催化甘油三酯合成中的终止步骤(Cases S等，1998，PNAS 95：13018-23)，即脂肪酸与甘油主链的连接。

为了确定DGAT1基因是否含有解释观察到的有利奶特征表型的新突变，在母牛363和346中测定了编码序列和内含子/外显子边界区域(有利的奶特征，包括低脂肪百分比)，并与GenBank中记载的DGAT1序列(登录号AY065621.1；GI：18642597)以及获自母牛351和357(正常脂肪百分比)的序列相比较。

母牛363和346中的DGAT1基因的外显子16中的腺嘌呤(A)至胞嘧啶(C)核苷酸置换(GenBank登录号AY065621.1；GI：18642597的位置8078)是杂合的(AC)，而母牛351和357中是纯合的AA(对于野生型和突变体编码序列，各自参见SEQ ID NO：1和43，以及SEQ ID NO：2和44)。图3A显示了牛DGAT1基因的内含子/外显子结构，而图3B、3C和3D显示了A至C核苷酸置换周围的序列。

为了测定突变是否与母牛363谱系中的有利的奶特征表型分离，测定了母牛363的公畜和祖公畜、其五头小公牛、四头剩余的小母牛、母牛107、108和307以及传递表型的小公牛产出的所有孙母牛的外显子16的序列。在所有呈现出有利奶特征表征的母牛，以及母牛363的产出了产生与母牛363相似的奶的小母牛的三头小公牛中发现了A8078C突变。在母牛363的公畜和祖公畜中不存在A8078C突变。

在185头常常用于新西兰乳牛群人工授精的公畜，和来自表示BoviQuestFriesian-Jersey杂交群的80头公畜和1595头母牛中不存在A8078C突变(Spelman等，2001，上文)。

没有具有A8078C突变的哺乳动物DGAT1核苷酸序列保藏于GenBank，证明了来自母牛363的序列的新颖性。

A8078C突变的存在限于母牛363的谱系，在其公畜和祖母畜中不存在，并且在母牛363的母畜中不存在有利的奶特征表型，这表明A8078C置换是母牛363中的新生突变。

来自A8078C突变杂合的母牛的乳腺和肝的mRNA的分析揭示了新的较短的DGAT1转录产物的额外存在，其缺乏由外显子16编码的63个核苷酸(图3E)。在杂合母牛中，大约一半的乳腺和肝DGAT1转录产物缺乏外显子16，表明A8078C突变有效地破坏了外显子16的剪接(图3D)。在杂合母牛中没有检测到来自野生型DGAT1等位基因的转录的补偿性提高(图3E)。只在携带A8078C突变的动物中观察到缺乏外显子16的转录产物，并且在其他母牛中未发现。

在突变前-mRNA分子的小子集中正确剪接外显子16是可能的。所得到的全长、成熟mRNA编码突变DGAT1蛋白，其中位置435中的高保守甲硫氨酸被亮氨酸残基取代(图3和4)。该非同义突变很可能影响酶的催化特性。

在GenBank中没有缺乏与牛外显子16同源的区域或缺乏由外显子16编码的高保守的21个氨基酸的脊椎动物DGAT1 cDNA、EST或蛋白序列被保藏(参见图4)。

野生型牛DGAT1基因的分析鉴定出接近外显子16的3’-端的推定外显子剪接增强子基序(ESE)。推定的ESE在高等脊椎动物中是保守的(8078-ATGATG-8083)(参见图3和图4)。

ESE基序是比邻内含子-外线边界的短的、功能性的顺调控序列元件。剪接调控因子至ESE的序列特异性募集有助于从前-mRNA转录产物中除去内含子的过程中通过剪接体来鉴定外显子(Cartegni L等，2002，Nat.Rev.Genet.3：285-298；BlackDL，2003，Annu.Rev.Biochem.72：291-336)。破坏ESE基序的突变可以调节外显子鉴定和降低剪接效率，导致整个外显子从成熟mRNA转录产物中排除出来(PfarrN等，2005，J.Immunol.174：4172-4177；Steiner B等，2004，Hum.Mutat.24：120-129)。

母牛363中的A8078C突变(8078-CTGATG-8083)破坏了牛DGAT1基因的3’-端附近鉴定的推定ESE(图3)。

在表达相等水平的DGAT1 mRNA的重组酵母菌株中，在缺乏21个由外显子16编码的氨基酸的重组突变牛DGAT1蛋白中没有检测到二酰甘油转移酶活性。相反，在相同条件下表达全长野生型蛋白时，容易地检测到二酰甘油转移酶活性(图5)。

与来自纯合野生型母牛(n＝11)的等价微粒体制剂相比，来自杂合突变母牛(n＝13)的肝活检样品的微粒体蛋白制剂显示出实质性的(20％±4.5％平均±SEM)和统计学显著的(p＜0.05)[¹⁴C]油酰-CoA结合至三酰甘油中的降低(图6)。这证明了A8078C突变降低了突变母牛肝脏中的二酰甘油转移酶活性。

母牛中乳脂合成的抑制已经显示出导致乳体积和乳蛋白产量的增加。例如，通过给牧草膳食补充反-10、顺-12共轭亚油酸诱导的乳脂抑制伴随着乳体积和乳蛋白产量的增加(Griinari JM和Bauman DE，2003：Update on theories of diet-induced milkfat depression and potential applications(膳食诱导的乳脂抑制理论和潜在应用的更新)。动物营养最近进展的115-156页，P.C.Garnsworthy和J.Wiseman编辑。Nottingham University Press，Nottingham，UK；Back PJ和Lopez-Villalobos N，2004，Proc.NZ Society of Animal Production 64：150-153)。认为CLA对乳脂合成的作用是通过对DGAT1活性的作用，因为牛乳腺细胞的CLA处理没有改变体外DGAT1表达(Sorensen等，2008，Lipids 43：903-912)，尽管DGAT活性和合成得到了抑制。相似地，来自DGAT1 232A多态性携带者的奶的脂肪百分比的降低伴随奶体积和奶蛋白产量的增加(Grisart B等，2004，PNAS 101：2398-2403)。

这些观察证明了母牛363中突变的发现是出乎意料的并且是令人惊讶的。突变导致来自大部分成熟DGAT1 mRNA转录产物分子的外显子16的错误排除。通过突变mRNA编码的DGAT1蛋白缺乏在整个脊椎动物演变中高度保守的21个氨基酸，并且不具有可检测的脂肪酸酰基-CoA:二酰甘油转移酶活性。所得到的甘油三酯合成的降低容易地解释了携带该突变的奶牛中观察到的乳脂和蛋白质表型。

4.突变奶牛的饲料需求与野生型奶牛相似

在14-天的阶段中，野生型奶牛(位置8078纯合AA)的主动干物质摄入为每天16.3±0.3kg的干物质(平均±SEM)。对于相同的时间段，A8078C突变杂合的母牛消耗16.1±0.3kg DM/天(平均±SEM)。

讨论

本发明认识到如上所述的DGAT1基因中的突变，单独或与连锁或连锁不平衡的多态性一起，用作具有有利的奶特征、有利的组织特征和/或提高的生长速率的动物，或能够产生具有有利的奶特征、有利的组织特征和/或提高的生长速率的后代的动物的选择工具。这样的策略将能够产生上等的组织产品，特别是肉，和来自优化奶组成的上等乳制品。

Claims

1.一种分离的核酸分子，该核酸分子包含编码DGAT1蛋白或其一部分的DGAT1核苷酸序列，其中核酸分子在相当于牛DGAT1基因的外显子16的DGAT1核苷酸序列的区域中具有突变。

2.根据权利要求1的分离的核酸分子，其中突变破坏DGAT1蛋白的功能。

3.根据权利要求1或权利要求2的分离的核酸分子，其中突变破坏全长DGAT1蛋白的表达。

4.根据权利要求1至3任一项的分离的核酸分子，其中突变破坏DGAT1蛋白的酶活性。

5.根据权利要求1至4任一项的分离的核酸分子，其中突变破坏DGAT1核苷酸序列中的外显子剪接基序。

6.根据权利要求1至5任一项的分离的核酸分子，其中DGAT1核苷酸序列编码牛DGAT1蛋白。

7.根据权利要求6的分离的核酸分子，其中牛DGAT1蛋白缺失一个或多个由牛DGAT1基因的外显子16编码的氨基酸。

8.根据权利要求6或权利要求7的分离的核酸分子，其中牛DGAT1蛋白缺失所有由牛DGAT1基因的外显子16编码的氨基酸。

9.根据权利要求1至8任一项的分离的核酸分子，其中突变是由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的核苷酸置换。

10.根据权利要求1至9任一项的分离的核酸分子，其中突变是由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的A至C核苷酸置换。

11.根据权利要求1至10任一项的分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO：2或44中所列的核苷酸序列。

12.一种分离的核酸分子，其由SEQ ID NO：2或44中所列的核苷酸序列组成。

13.一种分离的多肽，该多肽包含DGAT1氨基酸序列，其中多肽在相当于由牛DGAT1基因的外显子16编码的氨基酸的DGAT1氨基酸序列的区域中具有突变。

14.根据权利要求13的分离的多肽，其中突变破坏多肽的功能。

15.根据权利要求13或权利要求14的分离的多肽，其中突变破坏多肽的酶活性。

16.根据权利要求13至15任一项的分离的多肽，其中突变破坏全长DGAT1多肽的表达。

17.根据权利要求13至16任一项的分离的多肽，其中多肽是牛DGAT1蛋白。

18.根据权利要求17的分离的多肽，其包含SEQ ID NO：4或46中所列的氨基酸序列。

19.根据权利要求17的分离的多肽，其中牛DGAT1蛋白缺失一个或多个由牛DGAT1基因的外显子16编码的氨基酸。

20.根据权利要求17或权利要求19的分离的多肽，其中牛DGAT1蛋白缺失所有由牛DGAT1基因的外显子16编码的氨基酸。

21.根据权利要求17、19和20中任一项的分离的多肽，其包含SEQ ID NO：47或48中所列的氨基酸序列。

22.一种由SEQ ID NO：47或48中所列的氨基酸序列组成的分离的多肽。

23.一种测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含具有编码DGAT1蛋白或其一部分的DGAT1核苷酸序列并且在DGAT1核苷酸序列的外显子16中具有突变的核酸分子。

24.一种根据有利的奶特征而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含具有编码DGAT1蛋白或其一部分的DGAT1核苷酸序列并且在DGAT1核苷酸序列的外显子16中具有突变的核酸分子。

25.根据权利要求24的方法，其中有利的奶特征选自总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

26.一种根据有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含具有编码DGAT1蛋白或其一部分的DGAT1核苷酸序列并且在DGAT1核苷酸序列的外显子16中具有突变的核酸分子。

27.根据权利要求23至26任一项的方法，其包括测定牛是否包含根据权利要求2至12任一项的核酸分子。

28.一种测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含具有DGAT1氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列在由DGAT1的外显子16编码的一个或多个氨基酸中具有突变。

29.一种根据有利的奶特征而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含具有DGAT1氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列在由DGAT1的外显子16编码的一个或多个氨基酸中具有突变。

30.根据权利要求29的方法，其中有利的奶特征选自总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

31.一种根据有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含具有DGAT1氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列在由DGAT1的外显子16编码的一个或多个氨基酸中具有突变。

32.根据权利要求28至31任一项的方法，其包括测定牛是否包含根据权利要求14至22任一项的多肽。

33.根据权利要求28至32任一项的方法，其中该方法包括测定多肽的表达和/或活性。

34.根据权利要求23至33任一项的方法，进一步包括基于测定来选择牛。

35.根据权利要求23至34任一项的方法，其是体外方法。

36.一种用于选择产生有利的奶特征的牛或能够产生产生有利的奶特征的后代的牛的方法，该方法包括：

(i)测定牛是否包含具有编码DGAT1蛋白或其一部分的DGAT1核苷酸序列并且在DGAT1核苷酸序列的外显子16中具有突变的核酸分子；和

(ii)基于测定来选择牛。

37.根据权利要求36的方法，其中有利的奶特征选自总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

38.一种用于选择产生有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率的牛或能够产生产生有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率的后代的牛的方法，该方法包括：

(ii)基于测定来选择牛。

39.根据权利要求36至38任一项的方法，其包括测定牛是否包含根据权利要求2至12任一项的核酸分子。

40.一种用于选择产生有利的奶特征的牛或能够产生产生有利的奶特征的后代的牛的方法，该方法包括：

(i)测定牛是否包含具有DGAT1氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列在由DGAT1的外显子16编码的一个或多个氨基酸中具有突变；和

(ii)基于测定选择牛。

41.根据权利要求40的方法，其中有利的奶特征选自总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

42.一种用于选择产生有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率的牛或能够产生产生有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率的后代的牛的方法，该方法包括：

(ii)基于测定选择牛。

43.根据权利要求40至42任一项的方法，包括测定牛是否包含根据权利要求14至22任一项的多肽。

44.根据权利要求440至43任一项的方法，其中该方法包括测定多肽的表达和/或活性。

45.根据权利要求44的方法，其中从编码多肽的RNA测定多肽的表达。

46.根据权利要求45的方法，其中从根据权利要求2至12任一项的核酸分子转录RNA。

47.根据权利要求44的方法，其中通过测量多肽的含量、多肽的不存在和/或与牛表达的野生型DGAT1多肽的含量相比的多肽含量来测定多肽的表达和/或活性。

48.根据权利要求36至47任一项的方法，其是体外方法。

49.一种根据有利的奶特征而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定所述牛的DGAT1外显子16等位基因特征。

50.根据权利要求49的方法，其中有利的奶特征选自总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

51.一种根据有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定所述牛的DGAT1外显子16等位基因特征。

52.根据权利要求49至51任一项的方法，其中从获自所述牛的核酸分子测定DGAT1外显子16等位基因特征。

53.根据权利要求52的方法，其中核酸分子是DNA或RNA。

54.根据权利要求49至53任一项的方法，其中测定根据权利要求1至12任一项的核酸分子的存在或不存在。

55.根据权利要求49至51任一项的方法，其中从获自所述牛的多肽测定DGAT1外显子16等位基因特征。

56.根据权利要求49至51和55任一项的方法，其中测定根据权利要求13至22任一项的DGAT1多肽的存在或不存在。

57.根据权利要求49至51任一项的方法，其中使用DGAT1外显子16等位基因的连锁或连锁不平衡中的多态性来测定DGAT1外显子16等位基因特征。

58.根据权利要求57的方法，其中DGAT1外显子16等位基因的连锁或连锁不平衡中的多态性是在牛染色体14上的，并且选自ARS-BFGL-NGS-4939、Hapmap52798-ss46526455、Hapmap29758-BTC-003619、BFGL-NGS-18858、Hapmap24717-BTC-002824和Hapmap24718-BTC-002945。

59.根据权利要求49、50和52至58任一项的方法，进一步包括测定所述牛在与有利的奶特征相关的一个或多个其他基因座的等位基因特征。

60.根据权利要求59的方法，其中所述基因座是在与奶体积和/或含量相关的一个或多个基因中的一个或多个多态性。

61.根据权利要求60的方法，其中一个或多个基因中的一个或多个多态性与脂肪代谢相关。

62.根据权利要求59至61任一项的方法，其中DGAT1外显子16等位基因特征和一个或多个其他基因座的等位基因特征协同作用来产生有利的奶特征。

63.根据权利要求59至62任一项的方法，其中一个或多个其他基因座在与DGAT1相同的染色体上。

64.根据权利要求60至63任一项的方法，其中多态性编码牛DGAT1蛋白的氨基酸位置232的赖氨酸至丙氨酸置换。

65.根据权利要求59至62任一项的方法，其中一个或多个其他基因座位于DGAT1不同的染色体上。

66.一种根据有利的奶特征而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含核酸分子，该核酸分子编码：

(i)具有野生型DGAT1生物活性的多肽(A)；或

(ii)具有在由DGAT1的外显子16编码的一个或多个氨基酸中具有突变的DGAT1氨基酸序列的多肽(B)；或

(iii)多肽A和多肽B，

其中编码多肽A的核酸分子不存在并且编码多肽B的核酸分子存在，或编码多肽A的核酸分子和编码多肽B的核酸分子都存在，表示有利的奶特征。

67.根据权利要求66的方法，其中有利的奶特征选自总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

68.一种根据有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含核酸分子，该核酸分子编码：

(i)具有野生型DGAT1生物活性的多肽(A)；或

(iii)多肽A和多肽B，

其中编码多肽A的核酸分子不存在并且编码多肽B的核酸分子存在，或编码多肽A的核酸分子和编码多肽B的核酸分子都存在，表示有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率。

69.根据权利要求66至68任一项的方法，其中核酸分子是DNA或RNA。

70.根据权利要求69的方法，其中DNA是根据权利要求2至12任一项的核酸分子，或RNA从根据权利要求2至12任一项的核酸分子转录。

71.根据权利要求70的方法，其进一步包括测定编码多肽B的RNA含量。

72.根据权利要求66至71任一项的方法，其中多肽A包含SEQ ID NO：3或45中所列的氨基酸序列。

73.根据权利要求66至72任一项的方法，其中多肽B是根据权利要求14至22任一项的多肽。

74.一种根据有利的奶特征而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含：

(i)具有野生型DGAT1生物活性的多肽(A)；或

(iii)多肽A和多肽B，

其中多肽A不存在并且多肽B存在，或多肽A和多肽B都存在，表示有利的奶特征。

75.根据权利要求74的方法，其中有利的奶特征选自总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

76.一种根据有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定牛是否包含：

(i)具有野生型DGAT1生物活性的多肽(A)；或

(iii)多肽A和多肽B，

其中多肽A不存在并且多肽B存在，或多肽A和多肽B都存在，表示有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率。

77.根据权利要求74至76任一项的方法，进一步包括测定多肽B的含量和/或活性。

78.根据权利要求74至77任一项的方法，其中多肽A包含SEQ ID NO：3或45中所列的氨基酸序列。

79.根据权利要求74至78任一项的方法，其中多肽B是根据权利要求14至22任一项的多肽。

80.根据权利要求66至79任一项的方法，其是体外方法。

81.一种用于测定牛的DGAT1基因型的方法，该方法包括测定获自牛的核酸分子是否是：

(i)编码具有野生型DGAT1的生物活性的多肽的核酸分子(A)；或

(ii)具有编码DGAT1蛋白的DGAT1核苷酸序列并且在DGAT1核苷酸序列的外显子16中具有突变的核酸分子(B)，

其中获自牛的核酸分子未受异源核酸污染。

82.根据权利要求81的方法，其中核酸分子B编码根据权利要求14至22任一项的多肽。

83.根据权利要求81或权利要求82的方法，其中核酸分子A包含SEQ ID NO：1或43中所列的核苷酸序列。

84.根据权利要求81至83任一项的方法，其中核酸分子B是根据权利要求2至12任一项的核酸分子。

85.一种用于测定牛DGAT1基因型的方法，该方法包括测定获自牛的多肽是否是：

(i)具有野生型DGAT1的生物活性的多肽(A)；或

(ii)具有在由DGAT1的外显子16编码的一个或多个氨基酸中具有突变的DGAT1氨基酸序列的多肽(B)，

其中获自牛的多肽未受异源多肽污染。

86.根据权利要求85的方法，其中该方法包括测定多肽的表达和/或活性。

87.根据权利要求85的方法，其中该方法包括多肽或源自多肽的肽的质谱分析。

88.根据权利要求85至87任一项的方法，其中多肽B是根据权利要求14至22任一项的多肽。

89.一种包含核酸分子的探针，其中所述探针在严谨条件下与根据权利要求1至12任一项的核酸分子或其互补体杂交。

90.一种包含根据权利要求89的探针的诊断试剂盒。

91.一种用于检测根据权利要求1至12任一项的核酸分子的引物组合物。

92.根据权利要求91的引物组合物，其包括一个或多个与根据权利要求1至12的核酸分子的一部分或其互补体基本上互补的核酸分子。

93.根据权利要求91或权利要求92的引物组合物，其包括具有SEQ ID NO：5、6和7中所示的核苷酸序列的核酸分子。

94.一种诊断试剂盒，其包括根据权利要求91至93任一项的引物组合物。

95.一种用于检测根据权利要求13至22任一项的多肽的抗体组合物。

96.一种包含根据权利要求95的抗体组合物和使用说明书的诊断试剂盒。

97.一种用于检测根据权利要求1至12任一项的核酸分子的诊断试剂盒，该试剂盒包括用于扩增核酸分子或其一部分的第一个和第二个引物，该引物分别与突变上游和下游的核酸分子的核苷酸互补。

98.根据权利要求97的诊断试剂盒，其中至少一个引物包括与核酸分子的非编码区互补的核苷酸。

99.根据权利要求97或权利要求98的诊断试剂盒，其进一步包括与突变互补的第三个引物。

100.根据权利要求97至99任一项的诊断试剂盒，其中核酸分子编码根据权利要求13至22任一项的多肽。

101.一种根据有利的奶特征而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的A核苷酸的存在或不存在。

102.根据权利要求101的方法，其中有利的奶特征选自总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

103.一种根据有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的A核苷酸的存在或不存在。

104.一种根据有利的奶特征而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的C核苷酸的存在或不存在。

105.根据权利要求104的方法，其中有利的奶特征选自总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

106.一种根据有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的C核苷酸的存在或不存在。

107.一种根据有利的奶特征而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的CC基因型的存在或不存在。

108.根据权利要求107的方法，其中有利的奶特征选自总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

109.一种根据有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的CC基因型的存在或不存在。

110.一种根据有利的奶特征而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的AC基因型的存在。

111.根据权利要求110的方法，其中有利的奶特征选自总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

112.一种根据有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率而测定牛遗传价值的方法，该方法包括测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的AC基因型的存在。

113.一种选择具有表示有利的奶特征的基因型的牛的方法，该方法包括：

(i)根据权利要求49、50和52至58任一项测定所述牛的DGAT1外显子16等位基因特征；和

(ii)基于该测定来选择牛。

114.根据权利要求113的方法，其中有利的奶特征选自总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

115.一种选择具有表示有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率的基因型的牛的方法，该方法包括：

(i)根据权利要求51至58任一项测定所述牛的DGAT1外显子16等位基因特征；和

(ii)基于该测定来选择牛。

116.一种用于选择具有表示有利的奶特征的DGAT1外显子16等位基因特征的牛的方法，该方法包括：

(i)测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的CC基因型的不存在；和

(ii)基于该测定来选择牛。

117.一种用于选择具有表示有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率的DGAT1外显子16等位基因特征的牛的方法，该方法包括：

(ii)基于该测定来选择牛。

118.一种用于选择具有表示有利的奶特征的DGAT1外显子16等位基因特征的牛的方法，该方法包括：

(i)测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的A核苷酸的不存在；和

(ii)基于该测定来选择牛。

119.一种用于选择具有表示有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率的基因型的牛的方法，该方法包括：

(ii)基于该测定来选择牛。

120.一种用于选择具有表示有利的奶特征的DGAT1外显子16等位基因特征的牛的方法，该方法包括：

(i)测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的C核苷酸的存在；和

(ii)基于该测定来选择牛。

121.一种用于选择具有表示有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率的基因型的牛的方法，该方法包括：

(ii)基于该测定来选择牛。

122.一种用于选择具有表示有利的奶特征的DGAT1外显子16等位基因特征的牛的方法，该方法包括：

(i)测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的CC基因型的存在；和

(ii)基于该测定来选择牛。

123.一种用于选择具有表示有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率的DGAT1外显子16等位基因特征的牛的方法，该方法包括：

(ii)基于该测定来选择牛。

124.一种用于选择具有表示有利的奶特征的DGAT1外显子16等位基因特征的牛的方法，该方法包括：

(i)测定由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的AC基因型的存在；和

(ii)基于该测定来选择牛。

125.一种用于选择具有表示有利的组织特征、有利的初乳特征和/或提高的生长速率的DGAT1外显子16等位基因特征的牛的方法，该方法包括：

(ii)基于该测定来选择牛。

126.根据权利要求116、118、120、122和124任一项的方法，其中有利的奶特征选自总乳脂含量的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、乳脂∶蛋白比例的降低和所产生的奶体积的增加中的一种或多种。

127.根据权利要求120至126任一项的方法，其中从获自牛的基因组DNA或RNA，或从产自RNA的cDNA确定C核苷酸、CC基因型或AC基因型的存在。

128.根据权利要求120至127任一项的方法，其中通过测定编码GenBank登录号AAL49962/GI：18642598表示的牛DGAT1蛋白的氨基酸位置435的亮氨酸的密码子的存在来确定C核苷酸、CC基因型或AC基因型的存在。

129.根据权利要求124至126任一项的方法，其中通过测定编码牛DGAT1基因的氨基酸位置435的甲硫氨酸的存在来确定AC基因型的存在。

130.根据权利要求120至129任一项的方法，其中通过将获自牛的DGAT1核酸分子测序来确定C核苷酸、CC基因型或AC基因型的存在。

131.根据权利要求120至130任一项的方法，其中测定包括从获自牛的基因组DNA或RNA或从产自RNA的cDNA扩增DGAT1核酸分子的步骤。

132.根据权利要求131的方法，其中通过PCR来进行所述扩增。

133.根据权利要求131或权利要求132的方法，其中通过使用引物来进行扩增，引物包括具有SEQ ID NO：1、2、43和44之一中所列核苷酸序列的至少约10个连续核苷酸的核酸分子或具有与SEQ ID NO：1、2、43和44之一中所列核苷酸序列互补的至少约10个连续核苷酸的核酸分子，或天然产生的侧翼序列。

134.根据权利要求133的方法，其中至少一个引物包括具有SEQ ID NO：5、6和7之一中所列核苷酸序列的核酸分子。

135.根据权利要求116至134任一项的方法，其中测定包括源自牛的DGAT1核酸分子的限制酶消化的步骤。

136.根据权利要求120至129任一项的方法，其中通过源自牛的DGAT1核酸分子的质谱分析来确定C核苷酸、CC基因型或AC基因型的存在。

137.根据权利要求120至129任一项的方法，其中通过一个或多个探针的杂交来确定C核苷酸、CC基因型或AC基因型的存在，这一个或多个探针包含具有SEQID NO：1、2、43和44之一中所列核苷酸序列一部分的核苷酸序列的核酸分子或具有与SEQ ID NO：1、2、43和44之一中所列核苷酸序列一部分互补的核苷酸序列的核酸分子。

138.根据权利要求137的方法，其中一个或多个探针包含具有SEQ ID NO：1、2、43和44之一中所列核苷酸序列的至少约10个或多个连续核苷酸的核酸分子或具有与SEQ ID NO：1、2、43和44之一中所列核苷酸序列互补的至少约10个或多个连续核苷酸的核酸分子。

139.根据权利要求137或权利要求138的方法，其中一个或多个探针包含具有对应于由GenBank登录号AY065621/GI：18642597表示的牛DGAT1基因的位置8078的A核苷酸或C核苷酸的核酸分子。

140.根据权利要求120至126任一项的方法，其中通过获自牛的DGAT1多肽的分析来确定C核苷酸、CC基因型或AC基因型的存在。

141.根据权利要求140的方法，其中通过检测由GenBank登录号AAL49962/GI：18642598表示的牛DGAT1蛋白的氨基酸位置435的甲硫氨酸的存在来确定AC基因型的存在。

142.根据权利要求140或权利要求141的方法，其中通过检测由GenBank登录号AAL49962/GI：18642598表示的牛DGAT1蛋白的氨基酸位置435的亮氨酸的存在来确定AC基因型的存在。

143.一种选择牛群的方法，该方法包括：

(i)使用根据权利要求34、36至48和113至142任一项的方法来选择多头牛；和

(ii)分离和收集选定的牛，以形成畜群。

144.一种通过根据权利要求143的方法选择的牛群。

145.一种转基因非人动物，其包括含有编码DGAT1蛋白或其一部分的DGAT1核苷酸序列的核酸分子，其中核酸分子在相当于牛DGAT1基因的外显子16的DGAT1核苷酸序列的区域中具有突变。

146.根据权利要求162的转基因非人动物，包含根据权利要求2至12任一项的核酸分子。

147.一种转基因牛，其包括含有编码DGAT1蛋白或其一部分的DGAT1核苷酸序列的核酸分子，其中核酸分子在相当于牛DGAT1基因的外显子16的DGAT1核苷酸序列的区域中具有突变。

148.根据权利要求147的转基因牛，其包含根据权利要求2至12任一项的核酸分子。

149.一种产自根据权利要求145至148任一项的转基因动物或转基因牛的克隆。

150.一种通过根据权利要求34、36至48和113至142任一项的方法选择的牛。

151.一种产自根据权利要求150的牛克隆。

152.一种根据权利要求145至148和150任一项的转基因非人动物或牛，其中动物或牛产奶，或能够产生产奶的后代，所述奶具有一种或多种选自以下的品质：与未携带突变的相同品种的动物或牛相比时，作为全奶百分比的总乳脂的降低、总乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总乳脂肪酸含量中饱和脂肪酸百分比的降低、蛋白产量的增加、总乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、通过10℃下提取的乳脂降低的固体脂肪含量所示的降低的脂肪硬度、乳脂∶蛋白比例的降低、所产生的奶体积的增加和乳糖产量的增加。

153.根据权利要求152的牛，其在一季中产生至少6000升奶。

154.根据权利要求152或权利要求153的牛，其产生具有低于约3％总乳脂的奶。

155.根据权利要求152至154任一项的牛，其产生在全奶脂肪酸含量中具有至少约27％不饱和脂肪酸的奶。

156.根据权利要求152至155任一项的牛，其产生在全奶脂肪酸含量中具有低于约57％饱和脂肪酸的奶。

157.根据权利要求152至156任一项的牛，其产生在全奶脂肪酸含量中具有至少约1.2％ω-3脂肪酸的奶。

158.一种通过根据权利要求145至148、150和152至157任一项的转基因非人动物或牛产生的奶。

159.一种产自根据权利要求158的奶的产品。

160.根据权利要求159的产品，其选自冰淇淋、酸奶、干酪、乳基饮料、乳饮料、奶昔、酸奶饮料、奶粉、乳基运动补充剂、食品添加剂、蛋白粉、膳食补充产品和日补充片剂。

161.一种通过根据权利要求145至148、150和152至157任一项的转基因非人动物或牛产生的精子或卵子。

162.根据权利要求145至148和150任一项的转基因非人动物或牛，其中动物或牛产生组织，或能够产生产生组织的后代，所述组织具有一种或多种选自以下的品质：与未携带突变的相同品种的动物或牛相比时，作为总质量百分比的总脂肪的降低、总脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总脂肪酸含量的饱和脂肪酸百分比的降低、蛋白产量的增加、总脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、通过10℃下提取的脂肪降低的固体脂肪含量所示的脂肪硬度的降低、脂肪∶蛋白比例的降低和由于动物生长速率的一般提高所产生的肉体积的增加。

163.一种源自根据权利要求162的转基因非人动物或牛的组织或组织产品。

164.根据权利要求163的组织或组织产品，其选自肉、器官、毛皮、血液和血清。

165.根据权利要求145至148和150任一项的转基因非人动物或牛，其中动物或牛产生初乳，或能够产生产生初乳的后代，所述初乳具有一种或多种选自以下的品质：作为全部初乳百分比的总初乳脂肪的降低、总初乳脂肪酸含量中不饱和脂肪酸百分比的增加、总初乳脂肪酸含量中饱和脂肪酸百分比的降低、蛋白产量的增加、总初乳脂肪酸含量中ω-3脂肪酸百分比的增加、初乳脂肪∶蛋白比例的降低和所产初乳体积的增加。

166.一种包含编码DGAT1蛋白或其一部分的DGAT1核苷酸序列的核酸分子的用途，其用于产生转基因非人动物，其中核酸分子在相当于牛DGAT1基因的外显子16的DGAT1核苷酸序列的区域中具有突变。

167.根据权利要求166的用途，其中核酸分子是根据权利要求2至12任一项的核酸分子。