CN102321731B - 一种阴道炎检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阴道炎检测试剂盒，包括以下组分：反应装置、加样试管、吸管、联检稀释液、联检显色液、联检终止液、说明书、联检比色卡，其中反应装置上设有过氧化氢反应孔、白细胞酯酶反应孔、唾液酸苷酶反应孔、β-葡萄糖醛酸酶反应孔、乙酰氨基葡萄糖苷酶反应孔和pH值孔，反应孔中有相应的反应基，反应基由相应的反应底物固化层、显色促进层和化学惰性载体层组成。本发明还提供了该检测试剂盒的制备方法以及新型化学载体的制备方法。本发明的检测试剂盒可用于区分细菌性阴道炎与其他阴道炎，并可进一步鉴定出阴道分泌物中的需氧菌/厌氧菌和兼性厌氧菌等菌群，该方法操作简单快速，准确性高，适用于临床常规特别是医院门诊的使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种阴道炎检测试剂盒及其制备方法，尤其涉及细菌性阴道炎(厌氧菌和兼性厌氧菌阴道炎)、需氧菌阴道炎、霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
微生态是一门新兴的学科，近年来随着科技的迅猛发展，医学微生态已成为一门独立的边缘学科，并日益受到人们的重视。女性阴道从生理学角度上讲是一个闭合的体腔，其内包含着多种成分，也寄生着许多细菌。
阴道微生态主要有三部分构成，首先是阴道上皮细胞，女性阴道壁是由分层的鳞状未角化的上皮细胞构成，它们能随着体内雌激素水平的上升而不断增殖、加厚。阴道内没有发现分泌性腺体，但分泌物来自前庭大腺、尿道旁腺、子宫内膜和输卵管等部位。阴道分泌物受雌激素水平的控制并在月经中期随雌激素水平降低而减少。分泌物中含有90％～95％的水、无机盐、有机盐、尿素、碳水化合物和其他大分子物质。构成阴道微生态的第二部分是微生物菌群。早在1892年，Dederlein首次发表了关于人类阴道微生态菌群的研究。Doderlein和当时的人们都认为阴道微生物仅由革兰氏染色阳性杆菌构成，即乳酸杆菌。随着对阴道菌群研究的不断深入，人们发现健康女性的阴道菌群是由多种厌氧菌和需氧菌构成。正常状态下，阴道内存在多种微生物。目前，阴道分泌物中已分离到29种微生物，其中最重要的是乳酸杆菌，它在健康女性的阴道排出物标本中分离率高达50％～80％.现已确定定植于正常阴道内的微生物群主要由细菌、真菌、原虫和病毒组成，它们主要栖居于阴道四周的侧壁粘膜皱褶中，其次是穹隆，部分在宫颈。健康女性阴道菌群中除乳酸杆菌外，还有表皮葡萄球菌、大肠杆菌、棒状杆菌、粪链球菌、支原体和白色念珠菌等。第三个必须强调的微生态部分是宿主和菌群间及菌群与菌群之间相互作用的复杂性。它们之间是相互制约、相互作用、相互依赖的对立统一，或是共生关系或是拮抗关系，共处于阴道的微生态环境中，保持着协调平衡的状态。
一般用定性和定量的方法测得健康妇女阴道排出物中活菌数为102-9/ml，厌氧菌和需氧菌的比供为5∶1。其中乳杆菌是阴道正常菌群中最重要、数量最多的常住菌，其数量占95％以上。可达8×107/ml。目前研究表明从健康妇女阴道内可分离出16种乳杆菌，分离率达50-80％，其中数量较多的是嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌和发酵乳杆菌，而糖原分解能力强的菌包括的嗜酸乳杆菌、莱氏乳杆菌及唾液乳杆菌。乳杆菌在维持阴道微生态平衡中起重要作用。其中能产生H2O2的乳杆菌在维持阴道自净及抗感染中起着关键作用。它可分解阴道粘膜上皮细胞内的糖元，产生一定量的乳酸，使阴道保持酸性环境。有利于阴道的自净作用。同时它可提高机体的免疫功能，激活巨噬细胞，维持阴道局部的抗感染能力。此外它亦具有防止宫颈阴道上皮化生的作用。
H2O2浓度的测定是分析阴道微生态是否正常的良好指标，阴道微生态的异常是病原体存在的强烈提示信号，会诱发其他致病微生物或阴道内条件致病菌成为事实病原体，是其他病原体(如滴虫，霉菌等)易复发，难以治愈的重要原因之一。
正常阴道内寄生着乳酸杆菌，链球菌，表皮葡萄球菌，阴道加德纳菌及大肠杆菌以及厌氧的消化链球菌属，消化球菌，厌氧乳酸杆菌，类杆菌等，这些菌保持一定的比例，维系着阴道内生态平衡，正常妇女阴道分泌物中每毫升有106个菌落形成单位。
正常育龄妇女，在内分泌激素的作用下，阴道上皮细胞增生，其表层细胞含有丰富的糖原，非常有利于兼氧乳酸杆菌的生长，这种细菌占阴道的90％以上，这种乳酸杆菌大量存在，就抑制了其他致病菌的生长，在阴道内形成了一个正常的生态平衡。乳酸杆菌是属于乳酸菌一类的细菌，这类菌可利用黄素蛋白将氧变成H2O2，这一作用结合亚铁血红素，过氧化氢酶的缺失，结果产生过量而不被细菌全部降解的H2O2。其浓度与乳酸杆菌的数量有关。由此可通过检测H2O2的浓度来反映乳酸杆菌的状况。正常人阴道分泌物中的H2O2浓度一般在2μmol/L以上，如检测H2O2浓度≤2μmol/L时，则意味着阴道生态菌群遭到了破坏，已经引起了厌氧菌的生长，导致了阴道菌群的失衡。如：当人体雌激素水平下降，导致阴道上皮萎缩，细胞糖原减少，不利于乳酸杆菌的生长；大量使用抗生素或用碱性液体过度冲洗阴道，抑制乳酸杆菌的生长；性乱，性交频繁(因精液pH为7.2-7.8)等导致致病性厌氧菌和加德纳菌大量繁殖，引起阴道微生物生态平衡的失调等等。
白细胞酯酶(leukocyte esterase，LET)专用于检测多行核白细胞释放的酯酶，在正常情况下难以检测。当人体发生炎症反应时，多形核白细胞的趋化性在炎症病灶聚集而大量释放酯酶，只有在这种炎症情况下(白细胞104/ml)，炎性白细胞酯酶才有可能检测到，建议在实际工作中参考清洁度指标权衡诊治。
阴道炎是妇女最常见的疾病，宫颈炎也存在较高的发病率.当炎性患者自我症状比较轻微时，容易造成误诊，常常延误了治疗，并有可能并发输卵管炎，子宫内膜炎而导致不孕及流产。三种最常见的阴道炎(细菌性阴道炎，滴虫性阴道炎，霉菌性阴道炎)均有明显的多形核白细胞浸润，其酯酶可在分泌物中检测，其LET检测的阳性率＞95％，特异性＞96％。
唾液酸苷酶是某些细菌的毒力因子，又因为它能除去组织中的亚端糖类，使细菌的粘附力增强，在与BV相关的细菌中，已知B群链球菌和加德纳菌可产生唾液酸苷酶，诸多的代谢产物中的唾液酸苷酶会改变粘膜通透性，从而利于细菌对粘膜组织的附着，侵入和损伤。此外，环氧化物酶和磷酸酯会诱导子宫细胞产生花生四烯酸，刺激产生参与分娩的前列腺素，导致早产的发生。唾液酸酶还会阻碍成纤维细胞中骨胶原蛋白的合成，导致低体重儿的发生。
但也应该注意，唾液酸是细胞膜糖蛋白与糖酯的主要成分，正常细胞中游离形式存在较低，但肿瘤细胞唾液酸酶活性增强，使细胞表面负电荷增加，肿瘤细胞易失去接触抑制，无限增殖，也使粘附力减低，易侵袭转移。现也把唾液酸酶作为肿瘤标志物之一，检测唾液酸酶阳性也可能是生殖道肿瘤或是其他炎症，风湿的结果。
β-葡萄糖醛酸酶是大肠杆菌产生的一种特异性酶。近年来的研究发现，在肠杆菌科中，除少数志贺氏菌、沙门氏菌等细菌外，94％～97％的大肠杆菌都可以产生β-葡萄糖醛酸酶。故检测此酶的存在可以定性或定量检测大肠杆菌的存在。
乙酰氨基葡萄糖苷酶为白色念珠菌、热带念珠菌的特异性酶，因此可以通过检测脯氨酸氨基肽酶活性和乙酰氨基葡萄糖苷酶来指示念珠菌感染。研究表明白色念珠菌和滴虫具有乙酰氨基葡萄糖苷酶特异性酶，通过大量研究念珠菌白带pH不大于4.6，而滴虫白带pH不小于4.8，通过结合pH值可将二者区分开。因此可以通过检测乙酰氨基葡萄糖苷酶和pH值来检测滴虫。
一般来说，正常白带pH为3.8-4.5，BV白带pH＞4.5，滴虫白带pH可大于5-6，霉菌白带pH在4.0-4.7。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是提供一种细菌性阴道炎(厌氧菌和兼性厌氧菌阴道炎)、需氧菌阴道炎、霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎快速检测试剂盒及其制备方法。
为了实现本发明目的，本发明公开了一种阴道炎检测试剂盒，包括反应装置，其中反应装置上设有反应孔，反应孔包括过氧化氢反应孔、白细胞酯酶反应孔、唾液酸苷酶反应孔、β-葡萄糖醛酸酶反应孔、乙酰氨基葡萄糖苷酶反应孔和pH值孔其中至少一个或几个或全部，反应孔中有相应的反应基，反应基包括相应的反应底物固化层、显色促进层和化学惰性载体层，其中，过氧化氢反应孔中还包括过氧化物酶固定层；
所述过氧化氢反应孔的底物固化层包被有N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺和3，5-二氯-2-羟基苯磺酸；显色促进层包被有4-氨基安替吡啉、PBS缓冲盐和海藻糖；化学惰性载体层由介孔分子筛及粘合剂组成；进一步还包括过氧化物酶固定层，由介孔分子筛吸附过氧化物酶而构成；及/或
所述白细胞酯酶反应孔的底物固化层包被有5-溴-4-氯-3-吲哚乙酸酯；显色促进层包被有乙酸钠盐和海藻糖；化学惰性载体层由介孔分子筛及粘合剂组成；及/或
所述唾液酸苷酶反应孔的底物固化层包被有5-溴-4-氯-3-吲哚神经氨酸盐；显色促进层包被有维生素C、海藻糖及乙酸-乙酸钠缓冲盐；化学惰性载体层由介孔分子筛及粘合剂组成；及/或
所述β-葡萄糖醛酸酶反应孔的底物固化层包被有对硝苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷；显色促进层包被有海藻糖和PBS缓冲盐；化学惰性载体层由介孔分子筛及粘合剂组成；及/或
所述乙酰氨基葡萄糖苷酶反应孔的底物固化层包被有对硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖苷；显色促进层包被有海藻糖和PBS缓冲盐；化学惰性载体层由介孔分子筛及粘合剂组成。
如前所述的试剂盒，其特征在于，所述反应装置按如下方法制备获得：
1)过氧化氢反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2∶1混匀，用质量分数为95％的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括300～625mg/m2 4-氨基安替吡啉、20mg/m2海藻糖和80mol/m2PBS缓冲盐；
过氧化物酶固定层：过氧化物酶300～625mg/m2，吸附于介孔分子筛；
底物固化层：N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺0.25～1.24g/m2、3，5-二氯-2-羟基苯磺酸2.50～12.40g/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、过氧化物酶固定层、底物固化层依次涂布于反应孔内；及或
2)白细胞酯酶反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2∶1混匀，用质量分数为95％的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括4.0mg/m2乙酸钠盐、20mg/m2海藻糖；
底物固化层：5-溴-4-氯-3-吲哚乙酸酯100～490mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；及或
3)唾液酸苷酶反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2∶1混匀，用质量分数为95％的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括0.4mg/m2维生素C、20mg/m2海藻糖及40mol/m2乙酸-乙酸钠缓冲盐；
底物固化层：5-溴-4-氯-3-吲哚神经氨酸盐250～450mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；及或
4)β-葡萄糖醛酸酶反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2∶1混匀，用质量分数为95％的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括20mg/m2海藻糖和80mol/m2PBS缓冲盐；
底物固化层：对硝苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷320～470mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；及或
5)乙酰氨基葡萄糖苷酶反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2∶1混匀，用质量分数为95％的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括20mg/m2海藻糖和80mol/m2PBS缓冲盐；
底物固化层：对硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖苷254～457mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；
6)将上述涂布完成的反应基，进行固化，在孔上粘贴铝箔保护膜，装入铝箔袋中，即得反应装置。
其中以上所述的反应装置中的介孔分子筛是按照以下方法制备得到的：在313K下，在80ml的2mol/L盐酸溶液中加入2g EO20 PO70 EO20(P123)作为模板剂，连续搅拌3h，再加入4.25g正硅酸乙酯，搅拌8h后，将白色胶体转移到水热釜中，在95℃下放置48h后取出，过滤，自然晾干，在空气气氛中773K下焙烧5h，即合成出所述的介孔分子筛；
优选的，以上所述反应装置中，过氧化物酶固定层中介孔分子筛为200目的硅胶。
其中，以上所述反应装置中的粘合剂选自三硅酸镁、无水硫酸钙、碳酸钙其中至少一种。
本发明所述的粘合剂其作用是将制备得到的介孔分子筛连接到一起，使其能够具有一定的形状，任何可达到该结果的粘合剂都可应用于本发明。
前述的试剂盒，其还进一步包括联检稀释液、联检显色液、联检终止液；
本发明所要解决的技术问题之二是提供所述试剂盒的的制备方法，具体可按照如下方法进行：
1)反应卡的制备
反应卡制成单片装，将过氧化氢反应孔、白细胞酯酶反应孔、唾液酸苷酶反应孔、β-葡萄糖醛酸酶反应孔、乙酰氨基葡萄糖苷酶反应孔和pH值孔其中一个或几个或全部排列在反应卡上，在每个反应孔中按下述方法涂布上相应的底物固化层、显色促进层、化学惰性载体层、过氧化氢反应孔中还包括过氧化物酶固定层；
2)过氧化氢反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2∶1混匀，用质量分数为95％的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括300～625mg/m24-氨基安替吡啉、20mg/m2海藻糖和80mol/m2PBS缓冲盐；
过氧化物酶固定层：过氧化物酶300～625mg/m2，吸附于介孔分子筛；
底物固化层：N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺0.25～1.24g/m2、3，5-二氯-2-羟基苯磺酸2.50～12.40g/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、过氧化物酶固定层、底物固化层依次涂布于反应孔内；及或
3)白细胞酯酶反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2∶1混匀，用质量分数为95％的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括4.0mg/m2乙酸钠盐、20mg/m2海藻糖；
底物固化层：5-溴-4-氯-3-吲哚乙酸酯100～490mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；及或
4)唾液酸苷酶反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2∶1混匀，用质量分数为95％的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括0.4mg/m2维生素C、20mg/m2海藻糖及40mol/m2乙酸-乙酸钠缓冲盐；
底物固化层：5-溴-4-氯-3-吲哚神经氨酸盐250～450mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；及或
5)β-葡萄糖醛酸酶反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2∶1混匀，用质量分数为95％的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括20mg/m2海藻糖和80mol/m2PBS缓冲盐；
底物固化层：对硝苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷320～470mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；及或
6)乙酰氨基葡萄糖苷酶反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2∶1混匀，用质量分数为95％的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括20mg/m2海藻糖和80mol/m2PBS缓冲盐；
底物固化层：对硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖苷254～457mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；
7)将上述涂布完成的反应基，进行固化，在孔上粘贴铝箔保护膜，装入铝箔袋中，即得反应装置；
8)联检稀释液的制备：制备成含有2.2g/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸以及10g/L明胶的溶液；
9)联检显色液的制备：制备成本含有0.05g/L的固紫B盐以及10g/L明胶的溶液；
10)联检终止液的制备：制备成含有80g/L氢氧化钠的溶液。
本发明的试剂盒进一步还可包括加样试管、吸管、说明书、联检比色卡等；
加样试管、吸管、联检比色卡等均采用现有方法制造。
本发明所要解决的技术问题之三是提供以上所述试剂盒在制备检测阴道炎试剂中的应用，所述的阴道炎包括细菌性阴道炎、需氧菌阴道炎、霉菌性阴道炎以及滴虫性阴道炎。
本发明的试剂盒的优点在于，阴道炎联合快速检测试剂盒通过对过氧化氢的检测以及对白细胞酯酶、唾液酸苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、脯氨酸氨基肽酶和乙酰氨基葡萄糖苷酶的活性的测定，从而直接区分细菌性阴道炎与其他阴道炎，并可进一步鉴定出阴道分泌物中的需氧菌/厌氧菌和兼性厌氧菌等菌群，该方法操作简单快速，准确性高，适用于临床常规特别是医院门诊的使用。
附图说明
图1为本发明实施例1所述的方法制备的试剂盒中的反应装置；
图2为原有装置与加样检测后的对比反应(过氧化氢为阴性；其它为阳性)。
具体实施方式
以下通过实施例进一步阐明本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
实施例1 阴道炎检测试剂盒的制备
1)反应卡的制备
反应卡由ABS工程塑料制成单片装，在正面靠右排布反应孔：过氧化氢反应孔、白细胞酯酶反应孔、唾液酸苷酶反应孔、β-葡萄糖醛酸酶反应孔、乙酰氨基葡萄糖苷酶反应孔和pH值孔，所述反应孔直径为4mm，圆形，在每个反应孔中按下述方法涂布上相应的底物固化层、显色促进层、化学惰性载体层等；
2)过氧化氢反应基的制备
化学惰性载体：介孔分子筛10g、三硅酸镁5g、95％(w/w)乙醇30ml充分搅拌的悬浊液，取20μl均匀涂布在反应孔中，40℃流动空气干燥1小时，介孔分子筛密度为531g/m2；
显色促进层：4-氨基安替吡啉为450mg/m2、含有5％(w/w)海藻糖和200mmol/LPBS缓冲盐混合溶液5μl，海藻糖为20mg/m2，PBS缓冲盐为80mol/m2；
过氧化物酶固定层：过氧化物酶450mg/m2，吸附于200目的硅胶；
底物固化层：N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺0.75g/m2、3，5-二氯-2-羟基苯磺酸7.5g/m2；
3)白细胞酯酶反应基的制备
化学惰性载体：介孔分子筛10g、三硅酸镁5g、95％乙醇30ml充分搅拌的悬浊液，取20μl均匀涂布在反应孔中，40℃流动空气干燥1小时，介孔分子筛密度为531g/m2；
显色促进层：含有1％(w/w)乙酸钠盐、5％(w/w)海藻糖的混合溶液5μl，加入反应基中，干燥，乙酸钠盐4.0mg/m2、海藻糖20mg/m2；
底物固化层：5-溴-4-氯-3-吲哚乙酸酯300mg/m2；
4)唾液酸苷酶反应基的制备
化学惰性载体：介孔分子筛10g、三硅酸镁5g、95％乙醇30ml充分搅拌的悬浊液，取20μl均匀涂布在反应孔中，40℃流动空气干燥1小时，介孔分子筛密度为531g/m2；
显色促进层：含有0.1％维生素C、5％海藻糖及100mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲盐的混合溶液5μl，加入反应基中，干燥，包括维生素C 0.4mg/m2、海藻糖20mg/m2及乙酸-乙酸钠缓冲盐40mol/m2；；
底物固化层：5-溴-4-氯-3-吲哚神经氨酸盐350mg/m2；
5)β-葡萄糖醛酸酶反应基的制备
化学惰性载体：介孔分子筛10g、三硅酸镁5g、95％乙醇30ml充分搅拌的悬浊液，取20μl均匀涂布在反应孔中，40℃流动空气干燥1小时，介孔分子筛密度为531g/m2；
显色促进层：含有5％(w/w)海藻糖和200mmol/L PBS缓冲盐的混合溶液5μl，加入反应基中，干燥，海藻糖为20mg/m2，PBS缓冲盐为80mol/m2；
底物固化层：对硝苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷400mg/m2；
6)乙酰氨基葡萄糖苷酶反应基的制备
化学惰性载体：乙酰氨基葡萄糖苷酶特异性孔分子筛10g、三硅酸镁5g、95％乙醇30ml充分搅拌的悬浊液，取20μl均匀涂布在反应孔中，40℃流动空气干燥1小时，介孔分子筛密度为531g/m2；
显色促进层：含有5％海藻糖和200mmol/L PBS缓冲盐的混合溶液5μl，加入反应基中，干燥，海藻糖为20mg/m2，PBS缓冲盐为80mol/m2；
底物固化层：对硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖苷355mg/m2；
将2)～6)涂布于相应反应孔中，固化，在孔上粘贴铝箔保护膜，装入铝箔袋中，即得反应装置；
7)将上述涂布完成的反应装置，进行固化，在孔上粘贴铝箔保护膜，装入铝箔袋中，即得反应装置；
8)联检稀释液的制备：
2-(N-吗啉代)乙磺酸 2.2g
明胶 10g
去离子水 1000ml
分装，共制成2000人份；
9)联检显色液的制备：
固紫B盐 0.05g
明胶 10g
去离子水 1000ml
分装，共制成8000人份；
10)联检终止液的制备：
氢氧化钠 80g
去离子水 1000ml
分装，共制成4000人份；
11)上述实施例1中2)～6)所用介孔分子筛的制备：
在313K下，在80ml的2mol/L盐酸溶液中加入2g O20 PO70 EO20(P123)模板剂(sigma)，连续搅拌3h；再加入4.25g正硅酸乙酯，搅拌8h后，将白色胶体转移到水热釜中，在95℃下放置48h后取出，过滤，自然晾干；在空气气氛中773K下焙烧5h，即合成出所需的介孔分子筛；
加样试管、吸管、联检比色卡等均采用现有方法制造。反应装置如图1所示。
实施例2本发明的阴道炎检测试剂盒的制备
1)反应卡的制备
反应卡由ABS工程塑料制成单片装，在正面靠右排布反应孔：过氧化氢反应孔、白细胞酯酶反应孔、唾液酸苷酶反应孔、β-葡萄糖醛酸酶反应孔、乙酰氨基葡萄糖苷酶反应孔和pH值孔，所述反应孔直径为4mm，圆形，在每个反应孔中按下述方法涂布上相应的底物固化层、显色促进层、化学惰性载体层等；
2)过氧化氢反应基的制备
化学惰性载体：介孔分子筛10g、无水硫酸钙5g、95％(w/w)乙醇30ml充分搅拌的悬浊液，取20μl均匀涂布在反应孔中，40℃流动空气干燥1小时；
显色促进层：4-氨基安替吡啉300mg/m2、含有5％海藻糖和200mmol/L PBS缓冲盐的混合溶液5μl，加入反应基中，干燥；
过氧化物酶固定层：过氧化物酶300mg/m2，吸附于介孔分子筛；
底物固化层：N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺0.25g/m2、3，5-二氯-2-羟基苯磺酸2.50g/m2。
将化学惰性载体层、显色促进层、过氧化物酶固定层、底物固化层依次涂布于反应孔内；
3)白细胞酯酶反应基的制备
化学惰性载体：介孔分子筛10g、无水硫酸钙5g、95％(w/w)乙醇30ml充分搅拌的悬浊液，取20μl均匀涂布在反应孔中，40℃流动空气干燥1小时；
显色促进层：含有1％(w/w)乙酸钠盐、5％(w/w)海藻糖的混合溶液5μl，加入反应基中，干燥；
底物固化层：5-溴-4-氯-3-吲哚乙酸酯100mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；
4)唾液酸苷酶反应基的制备
化学惰性载体：介孔分子筛10g、无水硫酸钙5g、95％乙醇30ml充分搅拌的悬浊液，取20μl均匀涂布在反应孔中，40℃流动空气干燥1小时；
显色促进层：含有0.1％(w/w)维生素C、5％(w/w)海藻糖及100mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲盐的混合溶液5μl，加入反应基中，干燥；；
底物固化层：5-溴-4-氯-3-吲哚神经氨酸盐250mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；
5)β-葡萄糖醛酸酶反应基的制备
化学惰性载体：介孔分子筛10g、无水硫酸钙5g、95％乙醇30ml充分搅拌的悬浊液，取20μl均匀涂布在反应孔中，40℃流动空气干燥1小时；
显色促进层：含有5％海藻糖和200mmol/L PBS缓冲盐的混合溶液5μl，加入反应基中，干燥；
底物固化层：对硝苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷320mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；
6)乙酰氨基葡萄糖苷酶反应基的制备
化学惰性载体：介孔分子筛10g、无水硫酸钙5g、95％乙醇30ml充分搅拌的悬浊液，取20μl均匀涂布在反应孔中，40℃流动空气干燥1小时；
显色促进层：含有5％(w/w)海藻糖和200mmol/L PBS缓冲盐的混合溶液5μl，加入反应基中，干燥；
底物固化层：对硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖苷254mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；
7)将上述涂布完成的反应装置，进行固化，在孔上粘贴铝箔保护膜，装入铝箔袋中，即得反应装置；
8)联检稀释液的制备：
2-(N-吗啉代)乙磺酸 2.2g
明胶 10g
去离子水 1000ml
共制成2000人份，分装；
9)联检显色液的制备：
固紫B盐 0.05g
明胶 10g
去离子水 1000ml
共制成8000人份，分装；
10)联检终止液的制备：
氢氧化钠 80g
去离子水 1000ml
共制成4000人份，分装；
介孔分子筛的制备与实施例1相同；
加样试管、吸管、联检比色卡等均采用现有方法制造。
实施例3本发明的阴道炎检测试剂盒的使用方法
【样本要求】
1.非经期取样，且取样前24小时应禁止性交、盆浴、阴道灌洗及局部上药等。雌性激素使用者，孕期、经期样品会对结果判读有影响，不宜做该项检测。雌性激素使用者及激素滥用者会对检测结果产生影响，也不适宜做该项检测。
2.阴道后穹窿处旋转10-20秒，尽可能多地采集患者阴道分泌物，以清晰见到棉签上有分泌物附着为准。
3.取样后的标本应及时检测，否则应保存在2-8℃，当天内完成检测。
【检验方法】
1.取出实施例1制备的试剂盒使其恢复至室温。
2.取一软试管滴加稀释液6～8滴，将常规方法采取的阴道分泌物棉签置于试管中，充分涮洗后用手指轻轻挤压棉签，使棉签吸附的液体流回试管，弃棉签，得到所需样本液。
3.从铝箔袋中取出联检卡，轻轻揭掉板贴，用吸管吸取样本液，在联检卡的七个孔中每孔滴加1滴样本液(每滴约为30μl)，之后在“唾液酸苷酶反应孔”中再加1滴“显色液”(每滴约为30μl)，在桌面轻轻震摇联检卡，1分钟内对照比色卡记录pH值。
4.将联检卡置于放在37℃温育5分钟，在“乙酰氨基葡萄糖苷酶反应孔”和“β-葡萄糖醛酸酶”再滴加1滴“终止液”(每滴约为30μl)，半分钟后，立刻判读结果。
【结果判读】
第1孔(过氧化氢)：不显色或淡黄色(标记为“+”)表示阳性，指示阴道菌群失调，阴道环境病态或处于亚健康状态；显淡红色(标记为“±”)，指示可能有中量乳酸杆菌存在，如图2所示，需结合临床再判，通常判阴性，阴道菌群开始呈现不正常趋势或处于恢复期。显红色或紫红色(标记为“-”)表示阴性，指示可能有大量乳酸杆菌存在，阴道菌群正常。
第2孔(白细胞酯酶)：不显色或浅淡色(标记为“-”)表示阴性，指示白细胞小于5/HP；显淡蓝色(标记为“±”)表示阴性，如图2所示，指示白细胞5～15/HP；显蓝色(标记为“+”、“++”、“+++”)表示阳性，指示白细胞大于15/HP。
第3孔(唾液酸苷酶)：不显色或桔黄色(标记为“-”)表示阴性；显淡红色(标记为“±”)表示弱阳性，显红色、紫红色、蓝色、褐色或黑色(标记为“+”)表示阳性，如图2所示，该孔阳性指示可能感染细菌性阴道病(BV)。
第4孔(β-葡萄糖醛酸酶)：不显色为阴性，显黄色为阳性，如图2所示，提示需氧性阴道炎感染。
第5孔(乙酰氨基葡萄糖苷酶)：不显色或浅淡色(标记为“-”)表示阴性；显淡黄色(标记为“±”)表示弱阳性，显黄色(标记为“+”)表示阳性，如图2所示，该孔阳性若同时pH值≥4.8指示滴虫性阴道炎感染，若同时pH值≤4.6指示念珠菌性阴道炎感染。
第6孔(pH)值：如图2所示，颜色从黄色—青色—绿色—蓝色，表示pH从3.8到5.4变化，对照妇科联检比色卡黄色、绿色pH为≤4.6，蓝色pH为≥4.8。
第7孔(空白对照)如图2所示。
本发明的试剂盒的优点在于，阴道炎联合快速检测试剂盒通过对过氧化氢的检测以及对白细胞酯酶、唾液酸苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、脯氨酸氨基肽酶和乙酰氨基葡萄糖苷酶的活性的测定，从而直接区分细菌性阴道炎与其他阴道炎，并可进一步鉴定出阴道分泌物中的需氧菌/厌氧菌和兼性厌氧菌等菌群，该方法操作简单快速，准确性高，适用于临床常规特别是医院门诊的使用。
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种阴道炎检测试剂盒，包括反应装置，其中反应装置上设有反应孔，反应孔包括过氧化氢反应孔、白细胞酯酶反应孔、唾液酸苷酶反应孔、β-葡萄糖醛酸酶反应孔、乙酰氨基葡萄糖苷酶反应孔和pH值孔其中至少一个或几个或全部，反应孔中有相应的反应基，反应基包括相应的反应底物固化层、显色促进层和化学惰性载体层，其中，过氧化氢反应孔中还包括过氧化物酶固定层；
所述过氧化氢反应孔的底物固化层包被有N-乙基-N-（2-羟基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺和3,5-二氯-2-羟基苯磺酸；显色促进层包被有4-氨基安替吡啉、PBS缓冲盐和海藻糖；化学惰性载体层由介孔分子筛及粘合剂组成；进一步还包括过氧化物酶固定层，由介孔分子筛吸附过氧化物酶构成；及/或
所述白细胞酯酶反应孔的底物固化层包被有5-溴-4-氯-3-吲哚乙酸酯；显色促进层包被有乙酸钠盐和海藻糖；化学惰性载体层由介孔分子筛及粘合剂组成；及/或
所述唾液酸苷酶反应孔的底物固化层包被有5-溴-4-氯-3-吲哚神经氨酸盐；显色促进层包被有维生素C、海藻糖及乙酸-乙酸钠缓冲盐；化学惰性载体层由介孔分子筛及粘合剂组成；及/或
所述β-葡萄糖醛酸酶反应孔的底物固化层包被有对硝苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷；显色促进层包被有海藻糖和PBS缓冲盐；化学惰性载体层由介孔分子筛及粘合剂组成；及/或
所述乙酰氨基葡萄糖苷酶反应孔的底物固化层包被有对硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖苷；显色促进层包被有海藻糖和PBS缓冲盐；化学惰性载体层由介孔分子筛及粘合剂组成；
所述反应装置按如下方法制备获得：
1）过氧化氢反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2:1混匀，用质量分数为95%的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括300～625mg/m24-氨基安替吡啉、20mg/m2海藻糖和80mol/m2PBS缓冲盐；
过氧化物酶固定层：过氧化物酶300～625mg/m2，吸附于介孔分子筛；
底物固化层：N-乙基-N-（2-羟基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺0.25～1.24g/m2、3,5-二氯-2-羟基苯磺酸2.50～12.40g/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、过氧化物酶固定层、底物固化层依次涂布于反应孔内；及或
2）白细胞酯酶反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2:1混匀，用质量分数为95%的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括4.0mg/m2乙酸钠盐、20mg/m2海藻糖；
底物固化层：5-溴-4-氯-3-吲哚乙酸酯100～490mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；及或
3）唾液酸苷酶反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2:1混匀，用质量分数为95%的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括0.4mg/m2维生素C、20mg/m2海藻糖及40mol/m2乙酸-乙酸钠缓冲盐；
底物固化层：5-溴-4-氯-3-吲哚神经氨酸盐250～450mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；及或
4）β-葡萄糖醛酸酶反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2:1混匀，用质量分数为95%的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括20mg/m2海藻糖和80mol/m2PBS缓冲盐；
底物固化层：对硝苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷320～470mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；及或
5）乙酰氨基葡萄糖苷酶反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2:1混匀，用质量分数为95%的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括20mg/m2海藻糖和80mol/m2PBS缓冲盐；
底物固化层：对硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖苷254～457mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；
6）将上述涂布完成的反应基，进行固化，在孔上粘贴铝箔保护膜，装入铝箔袋中，即得反应装置。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述反应装置中的介孔分子筛是按照以下方法制备得到的：在313K下，在80ml的2mol/L盐酸溶液中加入2gEO20PO70EO20(P123)作为模板剂，连续搅拌3h，再加入4.25g正硅酸乙酯，搅拌8h后，将白色胶体转移到水热釜中，在95℃下放置48h后取出，过滤，自然晾干，在空气气氛中773K下焙烧5h，即合成出所述的介孔分子筛。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述反应装置中，过氧化物酶固定层中介孔分子筛为200目的硅胶。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述反应装置中的粘合剂选自三硅酸镁、无水硫酸钙、碳酸钙其中至少一种。
5.如权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还进一步包括联检稀释液、联检显色液、联检终止液。
6.制备权利要求1-5任一项所述试剂盒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）反应卡的制备
反应卡制成单片装，将过氧化氢反应孔、白细胞酯酶反应孔、唾液酸苷酶反应孔、β-葡萄糖醛酸酶反应孔、乙酰氨基葡萄糖苷酶反应孔和pH值孔其中一个或几个或全部排列在反应卡上，在每个反应孔中按下述方法涂布上相应的底物固化层、显色促进层、化学惰性载体层、过氧化氢反应孔中还包括过氧化物酶固定层；
2）过氧化氢反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2:1混匀，用质量分数为95%的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括300～625mg/m24-氨基安替吡啉、20mg/m2海藻糖和80mol/m2PBS缓冲盐；
过氧化物酶固定层：过氧化物酶300～625mg/m2，吸附于介孔分子筛；
底物固化层：N-乙基-N-（2-羟基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺0.25～1.24g/m2、3,5-二氯-2-羟基苯磺酸2.50～12.40g/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、过氧化物酶固定层、底物固化层依次涂布于反应孔内；及或
3）白细胞酯酶反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2:1混匀，用质量分数为95%的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括4.0mg/m2乙酸钠盐、20mg/m2海藻糖；
底物固化层：5-溴-4-氯-3-吲哚乙酸酯100～490mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；及或
4）唾液酸苷酶反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2:1混匀，用质量分数为95%的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括0.4mg/m2维生素C、20mg/m2海藻糖及40mol/m2乙酸-乙酸钠缓冲盐；
底物固化层：5-溴-4-氯-3-吲哚神经氨酸盐250～450mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；及或
5）β-葡萄糖醛酸酶反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2:1混匀，用质量分数为95%的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括20mg/m2海藻糖和80mol/m2PBS缓冲盐；
底物固化层：对硝苯基-β-D-葡萄糖醛酸苷320～470mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；及或
6）乙酰氨基葡萄糖苷酶反应基的制备：
化学惰性载体层：介孔分子筛与粘合剂按重量比2:1混匀，用质量分数为95%的乙醇充分搅拌成悬浊液，均匀涂布在反应孔中，介孔分子筛为531g/m2，空气干燥；
显色促进层：包括20mg/m2海藻糖和80mol/m2PBS缓冲盐；
底物固化层：对硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖苷254～457mg/m2；
将化学惰性载体层、显色促进层、底物固化层依次涂布于反应孔内；
7）将上述涂布完成的反应基，进行固化，在孔上粘贴铝箔保护膜，装入铝箔袋中，即得反应装置；
8）联检稀释液的制备：制备成含有2.2g/L的2-（N-吗啉代）乙磺酸以及10g/L明胶的溶液；
9）联检显色液的制备：制备成含有0.05g/L的固紫B盐以及10g/L明胶的溶液；
10）联检终止液的制备：制备成含有80g/L氢氧化钠的溶液。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还进一步包括加样试管、吸管、说明书、联检比色卡。
8.权利要求1～5任一项所述试剂盒在制备检测阴道炎试剂中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，所述的阴道炎包括细菌性阴道炎、需氧菌阴道炎、霉菌性阴道炎以及滴虫性阴道炎。
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Address after: 225300, Jiangsu Taizhou Development Zone Temple Lane rich Nomura, Shuai village A (G19) third storey factory building and third, fourth floor research area Patentee after: Jiangsu world biological Polytron Technologies Inc Address before: 225300, Jiangsu Taizhou Development Zone Temple Lane rich Nomura Shuai village A (G19) third storey factory building and third, fourth floor research area Patentee before: Jiangsu Shuoshi Biological Technology Co., Ltd. |
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Address after: No. 837, Yaocheng Avenue, Taizhou, Jiangsu 225300 Patentee after: JIANGSU BIOPERFECTUS TECHNOLOGIES CO.,LTD. Address before: 225300 Workshop on the third floor of building a (G19), Fuye village and shuaiyu village, Sixiang Development Zone, Taizhou City, Jiangsu Province, and office and research area on the third and fourth floors Patentee before: JIANGSU BIOPERFECTUS TECHNOLOGIES CO.,LTD. |