CN102321095B - 手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物及其制备和应用 - Google Patents

手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种螺环吲哚-吡喃嘧啶碱化合物及其手性合成方法，属于生化技术领域。本发明以4-羟基香豆素化合物或1-萘酚化合物，二氰基氧化吲哚烯化合物为反应底物，以松香衍生的手性硫脲为催化剂，立体选择性的合成了新型螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物。生物活性实验证明，本发明手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱化合物能够选择性地杀死肿瘤细胞，且对于不同类型的肿瘤都有较强的作用，说明其具有很好的选择性广谱抗肿瘤活性。因此，可作为抗癌活性物质，在制备抗癌药物中具有很好的应用前景。

Description

手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物及其制备和应用
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，涉及一种手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物及其制备方法；本发明同时还涉及该手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物在制备广谱抗癌药物中的应用。 
背景技术
在发展和开发药物方面，具有相关生物活性结构的手性分子的合成，一直以来都扮有很重要的角色，从而导致的药物革新无论对提高相关疾病的治疗，还是对人类健康维护方面都是十分重要的。在有机合成领域，尽管以药物为导向的手性合成是非常具有市场应用潜力的，但是手性合成方法的发展及其作为新型药物的应用还是非常有限。癌症是当今世界危害人类健康最严重的疾病之一，全世界每年约有700万人死于癌症及其并发症。其病理特征为发病细胞的生长和分裂速度明显高于正常细胞，但不具备正常细胞的生理功能和分化能力。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。癌细胞的生长特征包括：（1）自身产生生长信号或者感应被正常细胞忽略的较弱的生长信号；（2）对自体抗增殖信号不敏感；（3）抗细胞的自杀机制即抗细胞的自然凋亡；（4）无限增殖的能力；（5）一种起初侵入局部组织的，后来扩散或者转移到遍及身体的所有部位的能力。尽管目前药物治疗模式有很大的进步，但是癌症仍是全球范围内发病率和死亡率都很高的一种的疾病。并且，许多包括皮肤癌，前列腺癌，乳腺癌，肾癌在内的癌症的发病率都在持续上升。然而，迄今为止仍没有十分理想地癌症治疗方案，寻找攻克癌症的药物及治疗方法已经成为当今医学研究领域的热点之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物。
本发明的另一目的是提供一种手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物的制备方法。
本发明还有一个目的，就是提供一种手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物的应用——作为抗癌活性物质，应用在制备抗癌药物中。
（一）手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物
本发明手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物的结构式如下：
   或   
其中，R 1 为 –Me,、–Et、–H、–Allyl 或–Bn； 
R 2 为 –H、–Cl、–Br、–F、–Me、–MeO、–NO 2 或–CF 3  ；
R 3  为 –H、–Me、–Et或 –CF 3 ；
R 4 为 –H、–-Cl、–Br、–F、–Me、–MeO、–NO 2 或 –CF 3  ；
R 5 为 –H、–MeO、–OH或–SH；
X为 –O或 –NH；
Y为 –H或 –Ac。
（二）手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物的制备
本发明手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物的制备方法，是以4-羟基香豆素化合物或1-萘酚化合物与二氰基氧化吲哚烯化合物为原料，以松香衍生的手性硫脲化合物为催化剂，立体选择性的合成了新型螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物。其具体方法如下：
将底物4-羟基香豆素化合物或1-萘酚化合物与底物摩尔量0.01~0.2倍的松香衍生的手性硫脲化合物溶于二氯甲烷中，加入底物摩尔量1.0~2.0倍的二氰基氧化吲哚烯化合物，在室温下反应2~15h；反应完全后，柱层析分离，得到产物中间体；然后将产物中间体溶解到无水酸酐与吡啶的混合溶液中，在60~100℃条件下反应3~8小时，反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析分离得到目标产物；或将产物中间体溶解到无水原甲酸三乙酯与醋酸的混合溶液中，在60~100℃条件下反应2~8小时，应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，常温旋干，得到的固体溶解到无水甲苯中，加入产物中间体摩尔量1.0~5.0倍的水合肼，在常温下反应2~24小时，柱层析分离，得到目标产物。
所述底物4-羟基香豆素化合物其结构式如下：
其中，R 2 为 –H、–Cl、–Br、–F、–Me、–MeO、–NO 2 或–CF 3  。
所述底物1-萘酚化合物其结构式如下： 
其中，R 2 为 –H、–Cl、 -Br、–F、–Me、–MeO、–NO 2 或–CF 3  ；
R 5 为 –H、–MeO、–OH或–SH。
所述二氰基氧化吲哚烯化合物其结构式如下：
其中，R 1 为 –Me、–Et、–H、–Allyl 或 –Bn； 
R 4 为 –H、–Cl、–Br、–F、–Me、–MeO、–NO 2 或 –CF 3  。
所述松香衍生的手性硫脲化合物的结构式如下：
其制备方法祥见中国专利201010552078.6。
所述无水酸酐与吡啶的混合溶液中，无水酸酐与吡啶的体积比为1:1~5:1，优选2:1。
所述无水原甲酸三乙酯与醋酸的混合溶液中，无水原甲酸三乙酯和醋酸的体积比为2:1~5:1，优选3:1。
本发明经核磁、红外光谱、质谱等检测，成功合成了目标产物螺环吲哚-吡喃嘧啶碱。
本发明制备的手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱，通过检测其生物活性发现其具有抗癌活性，因此，可作为抗癌活性物质，应用在制备抗癌药物中。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱化合物的制备做详细的说明。
实施例 1、 (R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-7a的制备  
将32.4mg（0.2mmol）底物4-羟基香豆素化合物1b和13.0mg（0.02mmol）松香衍生的手性硫脲催化剂溶于1.5ml二氯甲烷中；在室温下加入另一个反应底物46.0mg（0.22mmol）二氰基氧化吲哚烯化合物1c，在室温下反应6小时。反应完全后，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:10）分离得到产物中间体73.4mg（产率：99%）。然后将产物中间体溶解到2.0ml无水酸酐和1.0ml吡啶的混合溶液中，在60℃条件下反应3小时。反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:5）分离，得到白色固体为最终产物——(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-7a：62.8mg（产率：76%）。 
其中，底物4-羟基香豆素化合物1b和二氰基氧化吲哚烯化合物1c的结构分别如下式所示：
上述制备的目标产物的结构式如下：
核磁分析： 1 H NMR (300 MHz, [D6]DMSO): δ 11.13(s, 1 H), 7.88-7.90(d, J = 7.5 Hz, 1 H), 7.78-7.83(t, J = 7.5 Hz, 1 H), 7.52-7.58(m, 2 H), 7.38-7.44(m, 2 H), 7.06-7.17(m, 2 H), 3.25(s, 3 H), 2.14(s, 3 H );  13 C NMR (75 MHz, [D6]DMSO): δ 174.2, 168.1, 158.1, 155.5, 152.0, 151.1, 143.4, 134.0, 130.6, 130.0, 125.2, 124.5, 123.1, 122.8, 116.8, 113.4, 112.1, 108.8, 100.7, 82.6, 48.4, 26.7, 23.2。
红外光谱分析：IR: 3432.20, 3114.55, 2936.82, 2225.34, 1734.13, 1695.53, 1609.58, 1491.32, 1378.75, 1293.62, 1244.57, 965.96, 754.84, 469.18 cm-1。
高分辨质谱分析：HRMS-ESI (m/z): calcd for C23H15N3O5+NH4 +: 431.1350; found: 431.1345, 1.2ppm。
实施例 2：(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8a的制备
将32.4mg（0.2mmol）底物4-羟基香豆素化合物1b和13.0mg（0.02mmol）松香衍生的手性硫脲催化剂溶于1.5ml二氯甲烷中；在室温下加入另一个反应底物51.7 mg（0.22mmol）二氰基氧化吲哚烯化合物2c，在室温下反应8小时。反应完全后，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:10）分离得到产物中间体。然后将产物中间体溶解到2.0ml无水酸酐和1.0ml吡啶的混合溶液中，在60℃条件下反应3小时。反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:5）得到白色固体为最终产物——(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8a：86.4mg（产率82％）。
其中，底物4-羟基香豆素化合物1b和二氰基氧化吲哚烯化合物2c的结构分别如下式所示：
上述制备的目标产物的结构式如下：
。
核磁分析： 1 H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.81-7.84(dd, J = 1.5 Hz, J = 8.1 Hz, 1 H), 7.64-7.70(t, J = 7.5 Hz, 1 H), 7.30-7.44(m, 4 H), 7.10-7.15(m, 1 H), 6.94-6.98(d, J = 7.8 Hz, 1 H), 5.86-5.99(m, 1 H), 5.45-5.51(d, J = 17.1 Hz, 1 H), 5.28-5.32(d, J = 10.5 Hz, 1 H), 4.47-4.49(d, J = 4.8 Hz, 2 H), 2.65(s, 3 H), 2.50(s, 3 H);  13 C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 173.5, 158.2, 156.0, 152.8, 152.6, 143.0, 134.0, 130.7, 130.4, 129.6, 125.0, 124.5, 123.9, 122.8, 118.2, 117.2, 112.2, 111.6, 110.1, 101.5, 95.8, 49.7, 43.3。
红外光谱分析：IR (KBr): 3427.07, 3083.00, 2922.77, 2223.74, 1722.96, 1679.14, 1609.05, 1489.26, 1362.19, 1292.76, 1208.10, 1074.65, 939.86, 757.02, 574.35 cm-1。
高分辨质谱分析：HRMS-ESI (m/z): calcd for C27H19N3O6+NH4 +: 499.1612; found: 499.1601, 2.2ppm。
实施例 3：(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8b的制备
将32.4mg（0.2mmol）底物4-羟基香豆素化合物1b和13.0mg（0.02mmol）松香衍生的手性硫脲催化剂溶于1.5ml二氯甲烷中；在室温下加入另一个反应底物58.3 mg（0.22mmol）二氰基氧化吲哚烯化合物3c，在室温下反应8小时。反应完全后，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:10）分离得到产物中间体。然后将产物中间体溶解到2.0ml无水酸酐和1.0ml吡啶的混合溶液中，在60℃条件下反应3小时。反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:5）得到白色固体为最终产物——(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8b：86.4mg（产率：61%）。
其中，底物4-羟基香豆素化合物1b的结构同实施例1，二氰基氧化吲哚烯化合物3c的结构分别如下式所示：
。
目标产物(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8b的结构式如下：
。
核磁分析： 1 H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.81-7.84(d, J = 7.8 Hz, 1 H), 7.65-7.72(t, J = 7.5 Hz, 1 H), 7.37-7.44(m, 2 H), 6.84-6.91(m, 3 H), 5.85-5.98(m, 1 H), 5.44-5.50(d, J = 17.4 Hz, 1 H), 5.28-5.31(d, J = 10.2 Hz, 1 H), 4.44-4.46(d, J = 5.1 Hz, 2 H), 3.76(s, 3 H), 2.66(s, 3 H), 2.50(s, 3 H);  13 C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 173.1, 158.2, 156.8, 156.1, 152.8, 152.5, 136.2, 134.0, 130.7, 130.6, 125.0, 122.8, 118.1, 117.2, 115.3, 112.2, 111.6, 111.4, 110.7, 101.4, 95.9, 55.8, 50.1, 43.4。
红外光谱分析：IR (KBr): 3426.82, 2932.24, 2228.53, 1725.95, 1680.34, 1608.38, 1372.60, 1289.94, 1200.78, 1072.40, 965.39, 761.79 cm-1。
高分辨质谱分析：HRMS-ESI (m/z): calcd for C28H21N3O7+Na+: 534.1272; found: 534.1287, 2.9ppm。
实施例 4：(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8c的制备
将32.4mg（0.2mmol）底物4-羟基香豆素化合物1b和13.0mg（0.02mmol）松香衍生的手性硫脲催化剂溶于1.5ml二氯甲烷中；在室温下加入另一个反应底物59.2 mg（0.22mmol）二氰基氧化吲哚烯化合物4c，在室温下反应8小时。反应完全后，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:10）分离得到产物中间体。然后将产物中间体溶解到2.0ml无水酸酐和1.0ml吡啶的混合溶液中，在60℃条件下反应3小时。反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:5）得到白色固体为最终产物——(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8c，产率：81%。
其中，底物4-羟基香豆素化合物1b的结构同实施例1，二氰基氧化吲哚烯化合物4c的结构分别如下式所示：
 。
最终产物(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8c的结构式如下：
。
核磁分析： 1 H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.81-7.84(dd, J = 1.5 Hz, J = 8.1 Hz, 1 H), 7.67-7.72(t, J = 7.5 Hz, 1 H), 7.29-7.45(m, 4 H), 6.88-6.90(d, J = 8.4 Hz, 1 H), 5.83-5.96(m, 1 H), 5.43-5.49(d, J = 17.1 Hz, 1 H), 5.29-5.33(d, J = 10.5 Hz, 1 H), 4.45-4.47(d, J = 5.1 Hz, 2 H), 2.66(s, 3 H), 2.49(s, 3 H);  13 C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 173.1, 158.2, 156.3, 152.9, 152.8, 141.6, 134.2, 130.9, 130.8, 130.0, 129.3, 125.1, 124.9, 122.8, 118.4, 117.2, 112.0, 111.4, 111.1, 100.8, 95.2, 49.7, 43.4。
红外光谱分析：IR (KBr): 3439.09, 2923.98, 2223.75, 1729.97, 1679.42, 1610.62, 1483.34, 1370.10, 1290.89, 1190.24, 1071.79, 762.56 cm-1。
高分辨质谱分析：HRMS-ESI (m/z): calcd for C27H18Cl N3O6+NH4 +: 533.1222; found: 534.1212, 1.9ppm。
实施例 5：(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8d的制备
将32.4mg（0.2mmol）底物4-羟基香豆素化合物1b和13.0mg（0.02mmol）松香衍生的手性硫脲催化剂溶于1.5ml二氯甲烷中；在室温下加入另一个反应底物55.7 mg（0.22mmol）二氰基氧化吲哚烯化合物5c，在室温下反应8小时。反应完全后，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:10）分离得到产物中间体。然后将产物中间体溶解到2.0ml无水酸酐和1.0ml吡啶的混合溶液中，在60℃条件下反应3小时。反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:5）得到白色固体为最终产物——(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8d，产率：57%。
其中，底物4-羟基香豆素化合物1b的结构同实施例1，二氰基氧化吲哚烯化合物5c的结构分别如下式所示：
最终产物(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8d的其结构式如下：
核磁分析： 1 H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.82-7.84(d, J = 7.8 Hz, 1 H), 7.67-7.72(t, J = 7.5 Hz, 1 H), 7.37-7.45(m, 2 H), 7.07-7.13(m, 2 H), 6.88-6.92(m, 1 H), 5.84-5.97(m, 1 H), 5.44-5.50(d, J = 17.4 Hz, 1 H), 5.30-5.33(d, J = 10.5 Hz, 1 H), 4.46-4.47(d, J = 4.8 Hz, 2 H), 2.67(s, 3 H), 2.50(s, 3 H);  13 C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 173.3, 161.3, 158.2, 158.1, 156.3, 152.8, 139.0, 134.2, 130.8, 130.7, 130.2, 125.1, 122.8, 118.4, 117.4, 117.2, 117.1, 112.8, 112.5, 112.0, 111.4, 111.0, 110.9, 100.9, 95.4, 49.9, 43.5。
红外光谱分析：IR (KBr): 3422.94, 2923.95, 2226.47, 1723.49, 1610.31, 1490.11, 1367.30, 1291.23, 1201.52, 1073.21, 768.10 cm-1。
高分辨质谱分析：HRMS-ESI (m/z): calcd for C27H18FN3O6+Na+: 522.1072; found: 522.1052, 3.8ppm。
实施例 6：(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8e的制备
将32.4mg（0.2mmol）底物4-羟基香豆素化合物1b和13.0mg（0.02mmol）松香衍生的手性硫脲催化剂溶于1.5ml二氯甲烷中；在室温下加入另一个反应底物55.7 mg（0.22mmol）二氰基氧化吲哚烯化合物6c，在室温下反应8小时。反应完全后，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:10）分离得到产物中间体。然后将产物中间体溶解到2.0ml无水酸酐和1.0ml吡啶的混合溶液中，在60℃条件下反应3小时。反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:5）得到白色固体为最终产物——(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8e，产率：73%。
其中，底物4-羟基香豆素化合物1b的结构同实施例1，二氰基氧化吲哚烯化合物6c的结构分别如下式所示：
。
最终产物(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8e的结构式如下：
。
核磁分析： 1 H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.81-7.84(dd, J = 1.2 Hz, J = 7.8 Hz, 1 H), 7.66-7.72(t, J = 7.5 Hz, 1 H), 7.37-7.45(m, 2 H), 7.05-7.18(m, 3 H), 5.94-6.06(m, 1 H), 5.45-5.51(d, J = 17.4 Hz, 1 H), 5.26-5.29(d, J = 10.2 Hz, 1 H), 4.58-4.60(d, J = 5.4 Hz, 2 H), 2.66(s, 3 H), 2.49(s, 3 H);  13 C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 173.1, 158.2, 156.1, 152.8, 152.7, 145.8, 134.1, 132.1, 131.3, 125.1, 124.7, 124.6, 122.8, 120.5, 119.1, 118.8, 117.8, 117.2, 112.0, 111.4, 101.1, 95.5, 49.9, 45.2, 45.1。
红外光谱分析：IR (KBr): 3426.83, 2926.29, 2228.78, 1728.13, 1631.30, 1484.66, 1369.82, 1291.72, 1197.08, 1072.54, 943.62, 763.15 cm-1。
高分辨质谱分析：HRMS-ESI (m/z): calcd for C27H18FN3O6+Na+: 522.1072; found: 522.1055, 3.1ppm。
实施例 7：(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8f的制备
将36.0 mg（0.2mmol）底物4-羟基香豆素化合物2b和13.0mg（0.02mmol）松香衍生的手性硫脲催化剂溶于1.5ml二氯甲烷中；在室温下加入另一个反应底物59.2 mg（0.22mmol）二氰基氧化吲哚烯化合物2b，在室温下反应8小时。反应完全后，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:10）分离得到产物中间体。然后将产物中间体溶解到2.0ml无水酸酐和1.0ml吡啶的混合溶液中，在60℃条件下反应3小时。反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:5）得到白色固体为最终产物——(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8f，产率：80%。
其中，底物4-羟基香豆素化合物2b和二氰基氧化吲哚烯化合物2c的结构分别如下式所示： 
 最终产物(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8f的结构式如下：
。
核磁分析： 1 H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.48-7.51(dd, J = 1.8 Hz, J = 8.1 Hz, 1 H), 7.27-7.43(m, 4 H), 7.11-7.16(m, 1 H), 6.95-6.98(d, J = 7.8 Hz, 1 H), 5.86-5.98(m, 1 H), 5.44-5.50(d, J = 17.1 Hz, 1 H), 5.29-5.32(d, J = 10.5 Hz, 1 H), 4.47-4.48(d, J = 4.8 Hz, 2 H), 2.66(s, 3 H), 2.50(s, 3 H);  13 C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 173.2, 160.6, 157.8, 157.3, 155.3, 152.4, 148.9, 143.0, 130.8, 130.3, 129.4, 124.5, 124.0, 121.8, 121.5, 119.1, 119.0, 118.2, 113.1, 113.0, 111.4, 110.1, 108.9, 108.5, 102.3, 96.0, 49.7, 43.3。
红外光谱分析：IR (KBr): 3389.21, 2921.61, 2224.05, 1721.81, 1677.94, 1585.78, 1443.17, 1363.02, 1276.47, 1187.38, 1065.92, 981.08, 831.96, 747.32, 661.00 cm-1。
高分辨质谱分析：HRMS-ESI (m/z): calcd for C27H18FN3O6+Na+: 522.1072; found: 522.1074, 0.4ppm。
实施例 8：(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8g的制备
将36.0 mg（0.2mmol）底物4-羟基香豆素化合物2b和13.0mg（0.02mmol）松香衍生的手性硫脲催化剂溶于1.5ml二氯甲烷中；在室温下加入另一个反应底物55.7 mg（0.22mmol）二氰基氧化吲哚烯化合物6c，在室温下反应8小时。反应完全后，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:10）分离得到产物中间体。然后将产物中间体溶解到2.0ml无水酸酐和1.0ml吡啶的混合溶液中，在60℃条件下反应3小时。反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:5）得到白色固体为最终产物——(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8g，产率：79%。
其中，底物4-羟基香豆素化合物2b、二氰基氧化吲哚烯化合物6c的结构分别如下式所示：
  最终产物(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8g的结构式如下：
。
核磁分析： 1 H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.48-7.51(dd, J = 2.4 Hz, J = 7.5 Hz, 1 H), 7.35-7.44(m, 2 H), 7.05-7.20(m, 3 H), 5.93-6.06(m, 1 H), 5.44-5.50(d, J = 17.1 Hz, 1 H), 5.26-5.29(d, J = 10.5 Hz, 1 H), 4.58-4.60(d, J = 5.1 Hz, 2 H), 2.66(s, 3 H), 2.49(s, 3 H);  13 C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 172.9, 160.7, 157.8, 157.4, 155.4, 155.3, 152.6, 149.1, 149.0, 145.8, 131.9, 131.2, 130.0, 129.8, 124.8, 124.7, 122.0, 121.7, 120.5, 119.2, 119.0, 117.9, 113.0, 112.9, 111.3, 108.9, 108.6, 102.1, 95.6, 49.9, 45.2, 45.1, 26.7, 24.2。
红外光谱分析：IR (KBr): 3366.93, 2925.29, 1729.55, 1680.45, 1628.83, 1491.40, 1448.75, 1368.55, 1300.27, 1194.83, 1068.32, 829.10, 663.15 cm-1。
高分辨质谱分析：HRMS-ESI (m/z): calcd for C27H17F2N3O6+Na+: 540.0978; found: 540.0954, 4.3ppm。
实施例 9：(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8h的制备
将28.8 mg（0.2mmol）底物1-萘酚化合物1d和13.0mg（0.02mmol）松香衍生的手性硫脲催化剂溶于1.5ml二氯甲烷中，在室温下加入51.7 mg（0.22mmol）二氰基氧化吲哚烯化合物1c，在室温下进行反应12小时。反应完全后，柱层析（H60硅胶， 乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:10）分离得到产物中间体73.4mg（产率：99%）。然后将产物中间体溶解到2.0ml无水酸酐和1.0ml吡啶的混合溶液中，在60℃条件下反应3小时。反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:5）得到白色固体为最终产物——(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8h，产率：61%。
其中，底物4-羟基香豆素化合物1d、二氰基氧化吲哚烯化合物1c的结构分别如下式所示：
最终产物(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-8h的结构式如下：
。
核磁分析： 1 H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.16-8.18(d, J = 7.5 Hz, 1 H), 7.78-7.81(d, J = 7.8 Hz, 1 H), 7.43-7.64(m, 4 H), 7.31-7.34(d, J = 7.5 Hz, 1 H), 7.16-7.21(t, J = 7.5 Hz, 1 H), 7.01-7.04(d, J = 7.8 Hz, 1 H), 6.56-6.58(d, J = 8.4 Hz, 1 H), 3.35(s, 1 H), 2.68(s, 3 H), 2.59(s, 3 H);  13 C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 175.3, 154.9, 145.0, 143.3, 134.0, 131.8, 130.6, 127.8, 127.7, 127.5, 126.6, 125.8, 124.5, 123.5, 122.7, 121.1, 113.3, 113.2, 109.0, 90.9, 65.9, 52.6, 27.1, 26.8, 24.4, 15.3。
红外光谱分析：IR (KBr): 3416.55, 2925.74, 2224.03, 1722.74, 1669.08, 1608.78, 1470.47, 1367.37, 1310.50, 1210.13, 814.31, 754.84, 663.80 cm-1。
高分辨质谱分析：HRMS-ESI (m/z): calcd for C26H19N3O4+Na+: 460.1268; found: 460.1252, 3.3ppm。
实施例 10、(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-9a的制备
将32.4mg（0.2mmol）底物4-羟基香豆素化合物1b和13.0mg（0.02mmol）松香衍生的手性硫脲催化剂溶于1.5ml二氯甲烷中，在室温条件下加入46.0mg（0.22mmol）二氰基氧化吲哚烯化合物1c，在室温下进行反应10小时。反应完全后，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:10），得到产物中间体73.4mg（产率99%）。然后将上述产物中间体溶解到3.0ml无水原甲酸三乙酯和1.0ml醋酸的混合溶液中，在90℃条件下反应5小时。反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，常温旋干。进一步将旋干得到的固体溶解到3.0ml无水甲苯中，在常温下加入0.2mmol水合肼，在室温下反应12小时。反应完全后，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:5）得到白色固体(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-9a：59.4mg（产率：72%）。 
其中，底物4-羟基香豆素化合物1b、二氰基氧化吲哚烯化合物1c的结构分别如下式所示：
最终产物(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-9a的结构式如下：
。
核磁分析： 1 H NMR (300 MHz, [D6]DMSO): δ 8.17(s, 1 H), 7.98-8.00(d, J = 6.6 Hz, 1 H), 7.73-7.79(m, 1 H), 7.46-7.55(m, 2 H), 7.14-7.23(m, 2 H), 6.79-6.95(m, 3 H), 5.67(s, 2 H), 3.17(s, 3 H );  13 C NMR (75 MHz, [D6]DMSO): δ 174.6, 157.1, 154.5, 153.9, 151.6, 151.0, 132.6, 127.7, 124.2, 122.4, 122.0, 120.8, 115.6, 111.7, 106.5, 101.8, 46.7, 25.7。
红外光谱分析：IR (KBr): 3336.07, 3204.11, 2921.26, 2851.71, 1713.29, 1662.40, 1609.03, 1490.18, 1362.95, 1242.31, 1170.97, 1069.67, 755.07, 496.92 cm-1。
高分辨质谱分析：HRMS-ESI (m/z): calcd for C22H15N5O4+H+: 414.1197; found: 414.1199, 0.5ppm。
实施例 11：(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-9b的制备
将32.4mg（0.2mmol）底物4-羟基香豆素化合物1b和13.0mg（0.02mmol）松香衍生的手性硫脲催化剂溶于1.5ml二氯甲烷中，在室温条件下加入51.7 mg（0.22mmol）二氰基氧化吲哚烯化合物2c，在室温下进行反应10小时。反应完全后，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:10），得到产物中间体73.4mg（产率99%）。然后将上述产物中间体溶解到3.0ml无水原甲酸三乙酯和1.0ml醋酸的混合溶液中，在90℃条件下反应5小时。反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，常温旋干。进一步将旋干得到的固体溶解到3.0ml无水甲苯中，在常温下加入0.2mmol水合肼，在室温下反应12小时。反应完全后，柱层析（H60硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:5）得到白色固体(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-9b，产率：78%。 
其中，底物4-羟基香豆素化合物1b的结构式同实施例10，二氰基氧化吲哚烯化合物2c的结构分别如下式所示：
。
  最终产物(R)-螺环吲哚-吡喃嘧啶碱-9b的结构式如下：
。
核磁分析： 1 H NMR (300 MHz, [D6]DMSO): δ 8.16(s, 1 H), 7.98-8.01(d, J = 7.8 Hz, 1 H), 7.74-7.79(t, J = 6.9 Hz, 1 H), 7.45-7.55(m, 2 H), 7.17(s, 2 H), 6.81(s, 3 H), 5.90-5.95(m, 1 H), 5.59-5.67(m, 3 H ), 5.18-5.22(d, J = 9.3 Hz, 1 H), 4.33(s, 2 H);  13 C NMR (75 MHz, [D6]DMSO): δ 175.2, 171.4, 158.0, 155.3, 154.8, 152.5, 151.8, 133.5, 132.3, 128.4, 125.0, 123.2, 122.9, 121.6, 117.0, 116.4, 112.6, 107.9, 102.6, 79.1, 47.7, 42.8, 22.5。
红外光谱分析：IR (KBr): 3336.19, 3204.27, 2921.33, 1713.33, 1662.41, 1609.06, 1490.22, 1362.98, 1242.24, 1170.99, 1069.63, 755.11, 496.91 cm-1。
高分辨质谱分析：HRMS-ESI (m/z): calcd for C24H17N5O4+H+: 440.1353; found: 440.1343, 2.3ppm。
下面通过一些典型的实验对本发明制备的手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物的抗肿瘤活性进行研究和分析。以喜树碱作为参照药物，评价这些新型化合物对五种肿瘤细胞株Jurkat，U937，EJ，Hela，及MDA的增殖和凋亡等生理活动的影响。
实验方法：实验中使用到的新型手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱均由本实验室合成，溶于5% DMSO中，去离子水梯度稀释使用，对照组加入同等浓度DMSO的去离子水。MTT购于Sigma (St. Louis, Mo.)公司。培养液RPMI 1640, Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 和胎牛血清(FBS)均购自Gibco公司。Annexin V/PI双染试剂盒购自Invitrogen公司。人胸腺癌细胞株(MDA-MB-231)，人子宫颈癌细胞株（Hela），人膀胱癌细胞株（EJ），人T淋巴细胞白血病细胞株（Jurkat），人单核细胞白血病细胞株（U937）购自ATCC。HeLa，EJ，U937，和 Jurkat细胞培养于添加10% FBS的1640培养基中，MDA-MB-231细胞培养于添加10% FBS的DMEM培养基中，培养基中添加50U/ml的青霉素及链霉素，置于37 oC ，5% CO2培养箱中。正常人外周血淋巴细胞从健康无肿瘤病史的志愿者（男性，年龄22-28岁）外周血中分离得到。无菌收集外周血于抗凝血袋中，使用Ficoll-Isopaque（密度1.077g/ml）梯度离心，分离淋巴细胞培养于15% FBS 1640培养基中，置于37 oC ，5% CO2培养箱中。通过MTT法检测细胞活力。将细胞悬液（5000/孔，体积90μL）接种于96孔板中培养，24小时后加入各浓度药物（1×10-7 to 2×10-4 M），10μL/孔。继续培养72小时后，加入MTT(5mg/mL) 10μL/孔, 37 oC孵育4小时，弃上清加入150 μL/孔DMSO溶解甲臜结晶，酶标仪检测吸光值。结果以IC50（半数抑制浓度）表示。
实验结果：表1为手型螺环吲哚-吡喃嘧啶碱7a~ 9b的离体抗肿瘤活性，数据结果表示为平均值加减标准误差(mean±s.e.m.)。从表1可以看出，化合物7a~9b的离体抗肿瘤活性以8a最好。以8a为母体进行结构修饰之后，产生了一系列化合物8b~8h，其抗肿瘤活性见表2。由表2的结果显示，以类似物8g效果最好。表3显示手型螺环吲哚-吡喃嘧啶碱8a 和8g 对肿瘤细胞和正常细胞毒性比较，数据结果表示为平均值加减标准误差(mean±s.e.m.)。表3的结果显示，8a具有中度的选择性，而类似物8g则具有很好的选择性。与经典抗肿瘤药物喜树碱对比发现，手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱对于肿瘤细胞的细胞毒性具有广谱性，即能够杀伤不同系别的肿瘤细胞。选择性和广谱性正是这类新型化合物未来作为抗肿瘤药物的优势。其高度的选择性和广谱性为其成为新型的抗癌药物开创了良好的前景。
表 1  手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱7a 至 9b的离体抗肿瘤活性
a  IC50 :50% 抑制浓度。  b  ‘--’: IC50 > 200 μM
表 2  化合物JP-8b 至 JP-8h 的离体抗肿瘤活性
a  IC50 : 50% 抑制浓度。  b ‘--’: IC50 > 200 μM.   c 喜树碱。 
表 3   化合物JP-8a和JP-8g 对肿瘤细胞和正常细胞毒性比较
  a  IC50 : 50% 抑制浓度。  b 正常人外周血淋巴细胞(hPBLs)。
上述实验表明，本发明合成的新型螺环吲哚-吡喃嘧啶碱能够有效地诱导肿瘤细胞的凋亡，并且同一药物对于正常细胞时，其凋亡程度明显较轻，说明此类药物具有很好的选择性；另一方面，与喜树碱相比，此类药物的作用特点具有明显地广谱性，对五种不同系别肿瘤细胞都有较强地杀伤能力。因此，可作为抗癌活性物质，在制备抗癌药物中具有很好的应用前景。

Claims (1)

1.一种手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物，其结构式如下：
其中，R 1 为 –Me,、–Et、–H、–Allyl 或–Bn； 
R 2 为 –H、–Cl、–Br、–F、–Me、–MeO、–NO 2 或–CF 3  ；
R 3  为 –H、–Me、–Et或 –CF 3 ；
R 4 为 –H、–-Cl、–Br、–F、–Me、–MeO、–NO 2 或 –CF 3  ；
R 5 为 –H、–MeO、–OH或–SH；
X为 –O或 –NH；
Y为 –H或 –Ac。
2. 如权利要求1所述手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物的制备方法，其特征在于：将底物4-羟基香豆素化合物或1-萘酚化合物与底物摩尔量0.01~0.2倍的松香衍生的手性硫脲化合物溶于二氯甲烷中，加入底物摩尔量1.0~2.0倍的二氰基氧化吲哚烯化合物，在室温下反应2~15h；反应完全后，柱层析分离，得到产物中间体；然后将产物中间体溶解到无水酸酐与吡啶的混合溶液中，在60~100℃条件下反应3~8小时，反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析分离得到目标产物；或将产物中间体溶解到无水原甲酸三乙酯与醋酸的混合溶液中，在60~100℃条件下反应2~8小时，反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，常温旋干，得到的固体溶解到无水甲苯中，加入产物中间体摩尔量1.0~5.0倍的水合肼，在常温下反应2~24小时，柱层析分离，得到目标产物；
所述底物4-羟基香豆素化合物的结构式如下： 
其中，R 2 为 –H、–Cl、–Br、–F、–Me、–MeO、–NO 2 或–CF 3  ；
所述底物1-萘酚化合物的结构式如下：
 其中，R 2 为 –H、–Cl、–Br、–F、–Me、–MeO、–NO 2 或–CF 3  ；
R 5 为 –H、–MeO、–OH或 –SH；
所述二氰基氧化吲哚烯化合物的结构式如下： 
 
其中，R 1 为 –Me、–Et、–H、–Allyl 或 –Bn； 
R 4 为 –H、–Cl、–Br、–F、–Me、–MeO、–NO 2 或 –CF 3  ；
所述松香衍生的手性硫脲化合物的结构式如下：
。
3. 如权利要求2所述手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物的制备方法，其特征在于：所述无水酸酐与吡啶的混合溶液中，无水酸酐与吡啶的体积比为1:1~5:1。
4. 如权利要求2所述手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物的制备方法，其特征在于：所述无水原甲酸三乙酯与醋酸的混合溶液中，无水原甲酸三乙酯和醋酸的体积比为2:1~5:1。
5. 如权利要求1所述手性螺环吲哚-吡喃嘧啶碱类化合物在制备广谱抗癌药物中的应用。
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