CN102317784A - 作为癌症标记物的armet - Google Patents
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Abstract
本发明涉及辅助评估癌症的方法。其公开了早期肿瘤中转移的富含精氨酸的蛋白(＝ARMET)作为不同癌症类型的通用标记物的用途。ARMET帮助评估肺相关癌症或肺癌(LC)或者结肠癌，例如非小细胞肺癌(NSCLC)或结肠直肠癌(CRC)，可能还有助于评估其他特定癌症类型。该特定癌症类型是例如乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆管癌。此外，其尤其涉及用于根据源自个体的液体样品通过测量所述样品中的RMET来评估癌症的方法。ARMET的测量可例如用于癌症的早期检测或经历手术的患者的监测。
Description
说明
本发明涉及辅助评估癌症的方法。其公开了早期肿瘤中转移的富含精氨酸的蛋白(＝ARMET)作为不同癌症类型的通用标记物的用途。ARMET帮助评估肺相关癌症或肺癌(LC)或者结肠癌，例如非小细胞肺癌(NSCLC)或结肠直肠癌(CRC)，可能还有助于评估其他特定癌症类型。该特定癌症类型是例如乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆管癌。此外，其尤其涉及用于根据源自个体的液体样品通过测量所述样品中的ARMET来评估癌症的方法。ARMET的测量可例如用于癌症的早期检测或经历手术的患者的监测。
尽管检测和治疗在进步，癌症仍是主要的公共卫生挑战。癌细胞以癌相关标记物蛋白的产生为特征。癌相关蛋白存在于携带癌细胞的个体的组织和体液中。它们的水平通常在致癌过程的早期低，并在疾病进展过程中升高，并且只在极少数情况下观察到蛋白水平在疾病进展过程中下降。这些蛋白的灵敏检测是用于诊断癌症的有利的和有前景的方法，尤其在癌症的早期诊断中。最普遍的癌症类型是乳腺癌(BC)、肺癌(LC)和结肠直肠癌(CRC)。
最重要的实体瘤治疗方法是：
a)肿瘤的手术切除，
b)化学疗法，
c)放射疗法
d)利用生物制剂如抗肿瘤抗体或抗血管生成抗体的治疗和
d)上述方法的组合。
肿瘤的手术切除已被广泛接受为早期实体瘤的第一线治疗。然而，大多数癌症只有当它们显示症状，即当患者已处于疾病进展的相当晚期时才被检测到。
癌症的分期是根据程度、进展和严重性对该疾病的分类。其将癌症患者分组，以便可对治疗的预后和选择进行归纳。
CRC的不同期以前常常按照Duke期A-D分类。当前，TNM系统是最广泛使用的癌症解剖学程度分类法。其代表了国际上接受的统一的分期系统。存在三个基本变量：T(原发肿瘤程度)、N(区域淋巴结状态)和M(远端转移存在与否)。TNM标准由UICC(国际抗癌联盟(International Union Against Cancer))公布(Sobin，L.H.，Wittekind，Ch.(编者)，TNM Classification of Malignant Tumours(恶性肿瘤的TNM分类)，第6版(2002))。一旦确定了TNM状态，将患者分组为由I-IV(以IV表示最晚期的疾病期)的罗马数字表示的疾病期。TNM分期和UICC疾病期如取自上述Sobin和Wittekind(编者)的下表中所示彼此相应。
TNM分期与UICC疾病期的相互关系
| UICC疾病期 | T分期 | N分期 | M分期 |
| 0期 | Tis | N0 | M0 |
| I期 | T1、T2 | N0 | M0 |
| IIA期 | T3 | N0 | M0 |
| IIB期 | T4 | N0 | M0 |
| IIIA期 | T1、T2 | N1 | M0 |
| IIIB期 | T3、T4 | N1 | M0 |
| IIIC期 | 任何T | N2 | M0 |
| IV期 | 任何T | 任何N | M1 |
尤其重要的是，早期诊断癌(例如CRC的)转变为好得多的预后。在CRC中，结肠直肠的恶性肿瘤起因于良性肿瘤，即起因于腺瘤。因此，那些在腺瘤期被确诊的患者具有最佳预后。早在Tis、N0、M0或T1-3期；N0期；M0期被确诊的患者，如果经适当治疗，与已存在远端转移时被确诊的患者只有10％的5年存活率相比，在确诊后存活5年的可能性超过90％。
包括成像方法如X射线或核共振成像在内的当前检测方法理论上可能至少在某种程度上适合用作一般筛查方法。然而，它们极其昂贵，卫生保健系统难以承受在大量受试者(特别对于无任何肿瘤症状的受试者)的普查中普遍且广泛地使用它们。
因此，本发明之目的是提供简单且性价比高的肿瘤评估方法，例如用以鉴定疑似患有癌症的个体。为此目的，在体液例如血液、血清或血浆中可检测出的一般肿瘤标记物或一组此类标记物将是合乎需要的。
许多血清肿瘤标记物已处于临床应用中。例如，cytoceratin 19的可溶性30kDa片段(CYFRA 21-1)、癌胚抗原(carcinoembryogenicantigen，CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和鳞状细胞癌抗原(SCC)是最主要的LC标记物。然而，它们均不符合筛查方法所要求的灵敏度和特异性的标准(Thomas，L.，Labor und Diagnose，TH BooksVerlagsgesellschaft，Frankfurt/Main，Germany(2000))。
为了具有临床效用(clinical utility)，作为单一标记物的新诊断标记物应与本领域已知的其他标记物相当或更好。或者，若分别单独使用或与一种或多种其他标记物联合使用，则新诊断标记物应引起诊断灵敏度和/或特异性的提高。最好通过将在下面详述的其受试者工作特性(receiver-operating characteristics)评估测试的诊断灵敏度和/或特异性。
全血、血清或血浆是临床常规中最广泛使用的样品来源。鉴定有助于可靠的癌症检测或提供早期预后信息的早期肿瘤标记物可导致将极大促进该疾病的诊断和管理的方法。因此，存在提高癌症尤其LC的体外评估的迫切临床需要。提高癌症例如LC的早期确诊尤其重要，因为对于早期诊断的患者，存活可能性与在疾病进展期(progressed stage)确诊的患者相比要高得多。
最近已对生化标记物在肺癌中的临床效用进行了综述。(Duffy，M.J.，Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.38(2001)225-262)。
CYFRA 21-1目前被认为是当前已知最好的肺癌肿瘤标记物。虽然不具有器官特异性，但其主要存在于肺组织中。CYFRA 21-1对肺癌的灵敏度在相对其他良性肺病95％的特异性下被描述为在46-61％之间。升高的CYFRA 21-1血清水平还与明显的良性肝病、肾功能不全和浸润性膀胱癌相关。CYFRA 21-1测试被推荐用于术后治疗监测。
CEA属于胎儿癌性抗原类，通常在胚胎发生过程中产生。CEA不是器官特异性的，并主要用于结肠直肠癌的监测。除了恶性肿瘤外，还有数种良性疾病例如肝硬化、支气管炎、胰腺炎和自身免疫疾病与CEA血清水平升高相关。在对良性肺病95％的特异性下，其对肺癌的灵敏度据报导为29-44％。CEA的主要用途是监测结肠癌，尤其是在疾病已转移时。但是，许多癌症(包括乳腺癌)可产生升高水平的CEA。CEA的优选用途是肺癌的治疗监测。
NSE是SCLC的肿瘤标记物。通常，发现升高的NSE血清水平与神经外胚层肿瘤和神经内分泌瘤相关。在良性肺病和脑病(如脑膜炎或其他脑炎性疾病以及头外伤)患者中也发现升高的血清水平。虽然对于SCLC(在95％的特异性下)的灵敏度据报导为60-87％，但对NSCLC的NSE测试性能差(7-25％)。NSE被推荐用于SCLC的治疗监测。
CA 19-9(糖类抗原19-9)是糖脂上的唾液酰化Lewis(a)抗原，为胃肠癌肿瘤标记物。其存在于胎儿胃、肠和胰腺上皮细胞。在成人肝、肺和胰腺的组织中也可存在低浓度。在肿瘤量与CA 19-9测定值之间无关联。因此，CA 19-9的测定不能用于胰腺癌的早期检测。由于黏蛋白唯独由肝脏分泌，在某些情况下甚至微量胆汗於积可导致明显升高的CA 19-9血清水平。该标记物主要用于帮助监测那些患已证实的胰腺癌患者的疾病状态(灵敏度70-87％)。3-7％的群体具有Lewis a-阴性/b-阴性血型结构，且不能表达带活性决定子CA 19-9的黏蛋白。在解释结果时，必须考虑这点。
CA 125存在于高百分比的上皮起源的非黏蛋白卵巢肿瘤中，并可在血清中检测到。卵巢癌约占20％的妇科肿瘤。虽然最高的CA125值出现在罹患卵巢癌的患者中，但在子宫内膜、乳腺、胃肠道恶性肿瘤和多种其它恶性肿瘤中亦观察到明显升高的值。升高的值有时发现于多种良性妇科疾病，例如卵巢囊肿、卵巢化生、子宫内膜异位症、子宫肌瘤或宫颈炎。该标记物的轻微上升也可发生于早期妊娠和多种良性疾病(例如急性和慢性胰腺炎、良性胃肠疾病、肾功能不全、自身免疫疾病和其它良性疾病)。显著上升水平已发现于良性肝病如肝硬化和肝炎。极端上升可由于恶性和良性疾病而发生于任意种类的腹水。虽然CA 125是相对非特异的标记物，但它是当今最重要的用于监测严重卵巢癌(serous ovarian carcinoma)患者治疗和进展的肿瘤标记物。据报导对于82-93％的特异性有69-79％的灵敏度。
PSA(“前列腺相关抗原”)是用于血液检验的常见测试肿瘤标记物。PSA似乎具有高组织特异性；该糖蛋白发现于正常前列腺上皮细胞和分泌物，但未见于其他组织。PSA对前列腺癌的存在高度灵敏。上升水平与病期和肿瘤体积相关。其预示复发和对治疗的反应。最后，在术前具有非常高的值且可能复发的患者中，该抗原具有预后价值。
NNMT(烟酰胺N-甲基转移酶；Swiss-PROT：P40261)具有明显的29.6kDa的分子量和5.56的等电点。NNMT催化烟酰胺和其他吡啶的N-甲基化。该活性对许多药物和异生素化合物的生物转化是重要的。已报导该蛋白主要在肝中表达，并位于细胞质中。已从来自人肝脏的cDNA克隆了NNMT，其含有编码计算分子量为29.6kDa的264-氨基酸蛋白的792-核苷酸开放阅读框(Aksoy，S.，等，J.Bio.Chem.269(1994)14835-14840)。文献中关于该酶在人类癌症中的潜在作用的内容所知甚少。在一份论文中，报导了上升的肝NNMT酶活性是小鼠中癌症恶病质的标记物(Okamura，A.，等，Jpn.J.Cancer Res.89(1998)649-656)。在一份最近的报告中，证实了放射敏感细胞系中响应放射的NNMT基因下调(Kassem，H.，等，Int.J.Cancer 101(2002)454-460)。最近已发现(WO 2004/057336)NNMT将在CRC评估中令人关注。
ProGRP是肿瘤标记物，可用于SCLC的检测和监测。上升的血清水平亦存在于非恶性肺/胸膜疾病(例如自发性肺纤维化或结节病)患者。虽然据报导在SCLC领域中proGRP灵敏度(在95％的特异性下)为47-86％，但是在NSCLC领域中proGRP测试的性能差，因为据报导灵敏度低于10％。
SCC最初在子宫颈的鳞状细胞CA中被鉴定。SCC对LC的灵敏度一般低(18-27％)。因此，SCC测试被认为不适合筛查。然而，尽管CYFRA 21-1通常表现更好，由于对鳞状细胞CA更高的灵敏度，SCC的优选用途是治疗监测。
关于标记物特征和针对提高的肺癌诊断，公布了利用基于模糊逻辑学的分类算法来组合CYFRA 21-1、NSE和一般炎症标记物C-活性蛋白(CRP)的血清水平的方法(Schneider，J.等，Int.J.Clin.Oncol.7(2002)145-151)。作者报导了95％特异性下92％的灵敏度。然而，在该研究中，例如CYFRA 21-1作为单一肿瘤标记物的灵敏度据报导在95％的特异性下为72％，这显著高于在许多其他已报导研究中的灵敏度。Duffy，M.J.在Cri.Rev.Clin.Lab.Sci.38(2001)225-262中报导了46％-61％的灵敏度。由Schneider等获得的该异常高的性能引起了一些怀疑，其可能由于几个因素造成。第一，对照患者群体似乎比患者群体更年轻，即群体年龄不十分匹配，并且患者群体包括许多晚期。第二，更关键的是，对训练集(用于确定模糊逻辑限定词(fuzzylogic qualifier))的样品检查算法性能。因此，这些限定词严格来说是针对该集“特制的”，并不用于独立的验证集(validation set)。在正常情况下，期望用于更大的、独立的且充分平衡的验证集的相同算法将导致显著降低的总体性能。
本发明的任务是调查是否能够鉴定可用于评估癌症疾病的生化标记物。具体地，本发明的发明人调查了是否可在组织样品或体液中鉴定生化标记物以评估不同癌症类型，例如肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌和/或胆管癌。
意想不到的是，已发现利用ARMET蛋白作为生物标记物可至少部分地克服现有技术中目前已知标记物的一些问题。
本发明涉及用于体外评估癌症的方法，其包括测量样品中ARMET蛋白和/或其片段的浓度，并在癌症的评估中利用测量结果，尤其测定的浓度。
意想不到的是，发现试样中ARMET蛋白和/或其片段的浓度增加与癌症发生相关。可表明ARMET是这样的标记物：其不对单一癌症类型有特异性，而是不同癌症类型的标记物(即，一般肿瘤标记物)。因为ARMET似乎对肿瘤发生过程相当特异，所以新型肿瘤标记物ARMET对多种肿瘤类型具有巨大的临床效用潜能。
本发明的方法适合评估许多不同癌症类型。与正常对照相比，例如在特定癌症类型如肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌和/或胆管癌中已分别发现，样品中ARMET蛋白和/或其片段的浓度增加。
根据本发明的优选实施方案，测量样品中ARMET蛋白和/或其片段的浓度以便体外评估特定癌症类型，例如肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆管癌。
根据本发明另一优选实施方案，测量样品中ARMET蛋白和/或其片段的浓度以便体外评估癌症，例如肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、胰腺癌或前列腺癌。
根据本发明另一优选实施方案，测量样品中ARMET蛋白和/或其片段的浓度以便体外评估癌症，例如肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌或黑色素瘤癌。
根据本发明另一优选实施方案，测量样品中ARMET蛋白和/或其片段的浓度以便体外评估癌症，例如肺癌、结肠癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌或卵巢癌。
根据本发明另一优选实施方案，测量样品中ARMET蛋白和/或其片段的浓度以便体外评估癌症，例如肺癌、结肠癌、乳腺癌或卵巢癌。
根据本发明另一优选实施方案，测量样品中ARMET蛋白和/或其片段的浓度以便体外评估癌症，例如肺癌(LC)或结肠直肠癌(CRC)。
根据本发明另一优选实施方案，测量样品中ARMET蛋白和/或其片段的浓度以便体外评估癌症，例如肺癌(LC)。
根据本发明另一优选实施方案，测量样品中ARMET蛋白和/或其片段的浓度以便体外评估癌症，例如结肠直肠癌(CRC)。
本发明一个实施方案涉及区分可能不患癌症的个体和可能被分类为“疑似”病例的个体的人群普查。后一组个体可随后接受进一步的诊断方法，例如通过成像方法或其他合适方法。
本发明又一实施方案涉及适合诊断一般性癌症的肿瘤标记物组或适合诊断特定肿瘤类型如肺癌的肿瘤标记物组的改进。
本发明还涉及通过生化标记物体外评估癌症的方法，其包括测量ARMET蛋白和/或其片段以及一种或多种其他癌症特异性标记物的浓度，并在癌症的评估中利用测量结果，尤其测定的浓度。优选与ARMET联合使用的标记物，一方面是作为一般肿瘤标记物(即对单一肿瘤类型无特异性的标记物)的标记物，或者另一方面是特异性肿瘤标记物(对单一肿瘤类型特异的标记物)。例如用于评估癌症如肺癌或结肠癌的优选标记物为Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA125、PSA、proGRP、SCC和NNMT。这些标记物可各自单独使用或者与ARMET一起以任意组合使用。
如果根据本发明的该方法评估癌症，那么各种癌症的一种或多种其他标记物优选地选自Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA125、PSA、proGRP、SCC和NNMT。
因此，在优选实施方案中，本发明还涉及包括至少ARMET标记物和例如Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC和NNMT中的至少一种其他标记物的标记物组在评估癌症如肺癌和/或结肠癌中的用途。
优选地，本发明涉及通过生化标记物评估癌症如肺癌或结肠癌的方法，其包括测量样品中ARMET和/或其片段以及一种或多种其他癌症标记物(例如一种或多种肺癌或结肠癌的标记物)的浓度，并在癌症的评估中利用测量结果，尤其测定的浓度。优选地，一种或多种其他癌症标记物选自Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA125、PSA、proGRP、SCC和NNMT。
在优选实施方案中，本发明还涉及至少包括ARMET和CYFRA21-1的标记物组在癌症特别是LC或结肠癌，更特别是NSCLC或结肠直肠癌的评估中的用途。
本发明还涉及至少包括ARMET和CEA的标记物组在癌症特别是LC或结肠癌，更特别是NSCLC或结肠直肠癌的评估中的用途。
本发明还涉及至少包括ARMET和NSE的标记物组在癌症特别是LC或结肠癌，更特别是NSCLC或结肠直肠癌的评估中的用途。
本发明还涉及至少包括ARMET和CA 19-9的标记物组在癌症特别是LC或结肠癌，更特别是NSCLC或结肠直肠癌的评估中的用途。
本发明还涉及至少包括RMET和CA 125的标记物组在癌症特别是LC或结肠癌，更特别是NSCLC或结肠直肠癌的评估中的用途。
本发明还涉及至少包括ARMET和PSA的标记物组在癌症特别是LC或结肠癌，更特别是NSCLC或结肠直肠癌的评估中的用途。
本发明还涉及至少包括ARMET和proGRP的标记物组在癌症特别是LC或结肠癌，更特别是NSCLC或结肠直肠癌的评估中的用途。
本发明还涉及至少包括ARMET和SCC的标记物组在癌症特别是LC或结肠癌，更特别是NSCLC或结肠直肠癌的评估中的用途。
本发明还涉及至少包括ARMET和NNMT的标记物组在癌症特别是LC或结肠癌，更特别是NSCLC或结肠直肠癌的评估中的用途。本发明还涉及ARMET蛋白和/或其片段在癌症的评估中的用途，其中ARMET和/或其片段浓度增加指示癌症。
本发明还涉及ARMET在数种特定癌症类型的评估中的用途，所述癌症类型特别是肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌和/或胆管癌。
本发明还涉及针对RMET蛋白和/或其片段的抗体在癌症的评估中的用途，其中ARMET和/或其片段的浓度增加指示癌症。
本发明还提供用于进行本发明方法的试剂盒，其至少包括特异性检测ARMET蛋白和/或其片段以及一种或多种其他癌症标记物所需的试剂。
本发明还提供用于进行本发明方法的试剂盒，其至少包括特异性检测ARMET蛋白和/或其片段以及任选的一种或多种癌症标记物例如上述肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌和/或胆管癌的标记物所需的试剂，其中其他标记物可各自单独使用或者以其任意组合使用。
本发明还提供用于进行本发明方法的试剂盒，其至少包括特异性检测ARMET和CYFAR 21-1分别所需的试剂和任选的用于进行测量的辅助试剂。
本发明还提供用于进行本发明方法的试剂盒，其至少包括特异性检测ARMET和CEA分别所需的试剂和任选的用于进行测量的辅助试剂。
本发明还提供用于进行本发明方法的试剂盒，其至少包括特异性检测ARMET和NSE分别所需的试剂和任选的用于进行测量的辅助试剂。
本发明还提供用于进行本发明方法的试剂盒，其至少包括特异性检测ARMET和CA 19-9分别所需的试剂和任选的用于进行测量的辅助试剂。
本发明还提供用于进行本发明方法的试剂盒，其至少包括特异性检测RMET和CA 125分别所需的试剂和任选的用于进行测量的辅助试剂。
本发明还提供用于进行本发明方法的试剂盒，其至少包括特异性检测ARMET和PSA分别所需的试剂和任选的用于进行测量的辅助试剂。
本发明还提供用于进行本发明方法的试剂盒，其至少包括特异性检测ARMET和proGRP分别所需的试剂和任选的用于进行测量的辅助试剂。
本发明还提供用于进行本发明方法的试剂盒，其至少包括特异性检测ARMET和SCC分别所需的试剂和任选的用于进行测量的辅助试剂。
本发明还提供用于进行本发明方法的试剂盒，其至少包括特异性检测ARMET和NNMT分别所需的试剂和任选的用于进行测量的辅助试剂。
在优选实施方案中，本发明涉及用于体外评估癌症的方法，包括a)测量样品中ARMET蛋白和/或其片段的浓度，b)任选测量样品中一种或多种其他癌症标记物的浓度，以及c)在癌症的评估中利用步骤(a)和任选步骤(b)的测量结果，其中ARMET蛋白和/或其片段浓度增加指示癌症。
术语“测量”优选地包括定性、半定性或定量测量样品中的ARMET蛋白和/或其片段。在优选实施方案中，所述测量是半定量测量，即测定ARMET浓度是否高于或低于截断值(cut-off value)。正如技术人员所理解的，在是(存在)或否(不存在)试验中，通常设定试验灵敏度以匹配截断值。截断值可例如根据一组健康个体的测试测定。优选地，设定截断值以得到90％的特异性，还优选设定截断值以得到95％的特异性，或还优选设定截断值以得到98％的特异性。高于截断值的值例如可指示癌症的存在。具体地，高于截断值的值例如可指示肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌和/或胆管癌的存在。在又一优选实施方案中，ARMET的测量是定量测量。在又一实施方案中，ARMET的浓度与基本诊断问题例如病期、疾病进展或对治疗的反应相关。
在另一优选实施方案中，设定截断值以得到90％的灵敏度，还优选设定截断值以得到95％的灵敏度，或者还优选设定截断值以得到98％的灵敏度。
低于截断值的值例如可指示癌症的不存在。具体地，低于截断值的值例如可指示肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌和/或胆管癌的不存在。
在又一优选实施方案中，ARMET的测量是定量测量。在又一实施方案中，ARMET浓度与基本诊断问题例如病期、疾病进展或对治疗的反应相关。
ARMET(富含精氨酸在早期肿瘤中突变的ARP，Swiss-PROTID：P55145)蛋白的生物学作用和功能基本上仍不清楚。由SEQ IDNO：1(图6)中序列表征的ARMET蛋白是20.3kDa的蛋白。ARMET蛋白由179个氨基酸组成，并携带预测信号序列(aa 1-21)。相应的基因位于染色体带3p21.1上，并由Shridhar，V.等(Oncogene 12(1996)1931-1939)首次表征。该基因高度保守，可发现于多种哺乳动物物种，例如大鼠、小鼠、牛和仓鼠。ARMET如此命名是因为，初始研究表明ARMET在N-端携带超过50个氨基酸的精氨酸富含区域(Shridhar，V.等，Oncogene 12(1996)1931-1939；Shridhar，R.等，CancerRes.56(1996)5576-5578；Shridhar，V.等，Oncogene 14(1997)2213-2216)。然而，更多近期研究表明不编码精氨酸区域的较小开放阅读框的转录证据(Tanaka，H.等，Onco.Rep.7(2000)591-593；Mizobuchi，N.等，Cell Struct.Func.32(2007)41-50)。根据相应蛋白大小的修正，初始描述的突变密码子(ATG50)现在被鉴定为起始密码子。
ARMET基因的早期研究表明特定突变(ATG50→AGG)存在于多种实体瘤诸如肾细胞癌、非小细胞肺癌、头颈癌、乳腺癌和胰腺癌样品的某些亚型中(Shridhar，V.等，Oncogene 12(1996)1931-1939；Shridhar，R.等，Cancer Res.56(1996)5576-5578；Shridhar，V.等，Oncogene 14(1997)2213-2216)。然而，更多近期研究表明ARMET多态性与胰腺癌之间无关联(Piepoli，A.等，World J.Gastroenterology12(2006)6343-6348)。
Petrova，P.等(J.Mol.Neurosci.20(2003)173-188)从大鼠中脑1-型星形胶质细胞系的条件培养基纯化了ARMET基因产物，并命名为MANF(中脑星形胶质细胞衍生神经营养因子)。大多数近期研究证明ARMET通过“解折叠蛋白应答”(UPR)上调，UPR为错误折叠的蛋白一旦在内质网(ER)中积累则被激活的过程(Tanaka，H.等，Oncol.Rep.7(2000)591-593；Apostolou，A.等，Exp.Cell Res.314(2008)2454-2467)。基于此研究，ARMET被表征为UPR适应性途径的新型分泌介体。
除了关于ATG50突变的研究之外，文献中未发现将ARMET与癌症的诊断或预后联系的其他研究。尤其是，在转录分析或针对蛋白存在情况的研究方面，肿瘤相关过表达均还未曾见诸报导。
如本文所用，以下每个术语具有在该节中与其相关的意思。
冠词在本文中用于指一种或多于一种的(即至少一种)该冠词的语法宾语。例如，“标记物”意指一种标记物或多于一种的标记物。术语“至少”用于表示任选地可存在一种或多种另外的对象。例如，至少包括(标记物)ARMET和CYFRA 21-1的标记物组可任选地包括一种或多种其他标记物。
表达“一种或多种”指1-50种，优选指1-20种，还优选指2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或15种。
本文所用术语“标记物”或“生化标记物”指用作用于分析患者试样的靶标的分子。这种分子靶标的实例是蛋白质或多肽。本发明中用作标记物的蛋白质或多肽预期包括所述蛋白质天然存在的变体以及所述蛋白质或所述变体的片段，尤其是免疫学可检测片段。免疫学可检测片段优选包括所述标记物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20个连续氨基酸。本领域技术人员将认识到，由细胞释放或存在于细胞外基质中的蛋白质可在例如炎症期间被破坏，并可被降解或裂解成这种片段。某些标记物以随后可被蛋白酶解激活的无活性形式合成。如技术人员理解的，蛋白质或其片段还可作为复合体的部分存在。这种复合体在本发明的意义上也可用作标记物。标记物多肽变体由相同基因编码，但可例如由于备选的mRNA或前mRNA加工而在它们的等电点(＝PI)或分子量(＝MW)或两者方面不同。变体的氨基酸序列与相应的标记物序列具有95％以上的同一性。此外，或备选地，标记物多肽或其变体可带有翻译后修饰。翻译后修饰的非限制性实例为糖基化、酰基化和/或磷酸化。
ARMET：
在合适样品中可检测出ARMET蛋白，特别是ARMET蛋白和/或其片段的可溶形式。优选样品为组织样品或体液，例如血液、血浆、血清、痰、尿液、粪便、细支气管肺泡灌洗液(brochioalveolarlavage，BAL)、粘膜上皮液(ELF)或痰等。优选地，样品来源于人受试者，例如肿瘤患者或处于肿瘤风险中的人或疑似患肿瘤的人。还优选的是，在血清或血浆样品中检测ARMET。
在本发明的优选实施方案中，测定ARMET蛋白和/或其片段的浓度。在一个实施方案中，通过利用特异性结合物从样品特异性测量标记物ARMET。
特异性结合物例如是RMET的受体、结合ARMET的凝集素或抗ARMET抗体。特异性结合物对其相应靶分子的亲和力至少为107l/mol。该特异性结合物对其靶分子的亲和力优选为108l/mol，或还优选为109l/mol。如技术人员所理解的，术语“特异”用于表示，样品中存在的其他生物分子不显著结合ARMET特异性结合物。优选地，结合靶分子之外的生物分子的水平得到的结合亲和力分别为对靶分子的亲和力的最多仅10％或更少、仅5％或更少、仅2％或更少或者仅1％或更少。优选的特异性结合物将满足上述亲和力和特异性的最低标准。
特异性结合物优选为与ARMET反应的抗体。术语抗体指多克隆抗体、单克隆抗体、此类抗体的抗原结合片段、单链抗体以及包括抗体结合域的遗传构建体。
可使用保持特异性结合物的上述标准的任意抗体片段。抗体通过现有技术方法产生，例如Tijssen所述(Tijissen，P.，Practice andtheory of enzyme immunoassays(酶免疫测定实践和理论)，11，ElsevierScience Publishers B.V.，Amsterdam，全书，尤其第43-78页)。此外，技术人员十分了解基于可用于抗体的特异性分离的免疫吸附剂的方法。通过这些方法，可提高多克隆抗体的质量，从而增强它们在免疫测定中的性能。(Tijssen，P.，同上，第108-115页)。
为了实现本发明中公开的效果，可使用在兔中产生的多克隆抗体。然而，显然还可使用来自不同物种例如绵羊或山羊的多克隆抗体，以及单克隆抗体。由于单克隆抗体可以以任意需要量和稳定的性质产生，故它们代表了用于开发临床常规测定的理想手段。在本发明的方法中，抗ARMET的单克隆抗体的产生和使用分别代表了其他的优选实施方案。
由于技术人员现在会认识到ARMET已被鉴定为可用于评估癌症(优选肺癌或结肠癌)的标记物，故可使用多种免疫诊断方法以获得与本发明效果相当的结果。例如，可使用产生抗体的备选策略。这样策略尤其包括合成肽的使用、提供用于免疫的ARMET表位。备选地，可使用亦熟知为DNA疫苗接种的DNA免疫。
为了进行测量，将获自个体的样品在适合形成结合剂ARMET复合物的条件下与ARMET的特异性结合物一起孵育。这样的条件不必详述，因为技术人员无需任何创造性劳动就可容易地确定这样的合适孵育条件。在癌症优选肺癌的评估中测量和使用结合物ARMET复合物的量。专业技术人员将会理解，存在多种测量特异性结合物ARMET复合物的量的方法，其均详细描述于相关教科书(例如参见，Tijssen，P.，同上，或Diamandis，E.P.和Christopoulos，T.K.(编者)，Immunoassay，Academic Press，Boston(1996))。
优选地，在夹心型测定形式中检测ARMET。在这样的测定中，利用第一特异性结合物将ARMET捕获在一侧，并将经标记可被直接或间接检测的第二特异性结合物用于另一侧。用于夹心型测定形式的特异性结合物可以是特异性针对ARMET的抗体。可通过使用不同的捕获和标记抗体(即识别ARMET蛋白上不同表位的抗体)进行检测。
本发明意义上的“癌症标记物”，特别是“肺癌标记物”和“结肠癌标记物”，指这样的任意标记物：在一般性癌症评估或特定癌症类型的评估如LC或CRC的评估中，若与标记物ARMET联合，其增加癌症疾病评估中的相关信息。如果可通过将所述标记物包含到已包括标记物ARMET的标记物组合中来分别提高癌症评估在给定特异性下的灵敏度或在给定灵敏度下的特异性，那么该信息被认为是相关的或具有相加值。在癌症评估的优选实施方案中，灵敏度或特异性的提高分别在p＝.05、.02、.01或更低的显著性水平上是统计学上显著的。优选地，一种或多种其它肿瘤标记物选自CYFRA 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC和NNMT。
本文所用术语“样品”指为体外评估之目的而获得的生物样品。在本发明的方法中，样品或患者样品优选地可包括任意体液。优选的样品为全血、血清、血浆、细支气管肺泡灌洗液(BAL)、粘膜上皮液(ELF)或痰，以血浆或血清最佳。
本文所用术语“组织样品”和/或“组织切片”指为体外评估之目的在涉及细胞或组织移除的手术、治疗性切除或活组织检查(例如切开式活组织检查、切除式活组织检查、组织芯检查(core biospy)或针吸引活组织检查)过程中取自患者的生物样品。在进行根据本发明的分析时，直接或作为“组织裂解物”使用组织样品材料。本文所用“组织样品”亦指通常通过使用切片机完成的薄组织切片。在涉及生物样品的任意公开方法实施方案中，这样的生物样品可(但非必须)装载到显微镜载玻片上、是组织切片(例如甲醛固定和石蜡包埋的组织切片)和/或是肿瘤组织(例如肺癌、结肠直肠癌、头颈癌、胃肠或成胶质细胞瘤)。
本文所用“组织裂解物”、“细胞裂解物”、“裂解物”、“裂解样品”、“组织提取物”或“细胞提取物”指包括裂解组织或细胞的样品和/或生物样品材料，即其中组织或细胞的结构完整性已被破坏。为释放细胞或组织样品的内含物，通常用酶和/或化学试剂处理材料，以溶解、降解或破坏该组织或细胞的细胞壁和细胞膜。技术人员完全熟悉合适的裂解物获得方法。该过程为术语“裂解”所涵盖。
术语“评估癌症”，特别是“评估肺癌或结肠癌”，用于表示本发明方法将(单独或与其他标记物或变量如由UICC提出的标准(参见上文)一起)例如帮助医师确定或确认是否存在癌症尤其LC或CRC，或者帮助医师预后、检测复发(术后患者的随访)和/或监测治疗(尤其化学治疗)。
如技术人员将理解的，任何此类评估是在体外进行。之后丢弃患者样品。患者样品只用于本发明的体外诊断方法，且不将患者样品材料转移回患者体内。通常，样品是液体样品，例如全血、血清或血浆。
除非另外指明，根据常规用法使用技术术语。细胞和分子生物学中常见术语的定义可参见Lewin，B.，Genes V(基因V)，OxfordUniversity Press出版(1994)，ISBN 0-19-854287 9)；Kendrew，J.等(编者)，The Encyclopeda of Molecular Biology(分子生物学大全)，Blackwell Science Ltd.出版(1994)，ISBN 0-632-02182-9)；以及Meyers，R.A.(编者)，Molecular Biology and Biotechnology：a ComprehensiveDesk Reference(分子生物学和生物技术：综合性案头参考书)，VCHPublishers，Inc.出版(1995)，ISBN 1-56081-5698)。
在优选实施方案中，本发明涉及通过生化标记物体外评估癌症(例如LC)的方法，其包括测量样品中ARMET蛋白和/或其片段的浓度，并在癌症(例如LC)的评估中利用测定的浓度。
在另一优选实施方案中，本发明涉及通过生化标记物体外评估LC的方法，其包括测量样品中ARMET蛋白和/或其片段的浓度，并在LC的评估中利用测定的浓度。
意想不到的是，本发明的发明人已能够在显著百分比的获自癌症患者特别是肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆管癌患者的样品中检测到标记物ARMET浓度增加。更意想不到的是，他们已能够证明此类获自个体的样品中ARMET浓度增加可用于癌症特别是上述癌症疾病的评估。
诊断的理想情形是其中像是在例如感染性疾病中单个事件或过程将引起各自疾病的情况。在所有其他情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其在未完全弄清楚疾病的病因学时，许多癌症类型如LC的情况就是如此。如技术人员将理解的，没有生化标记物以100％的特异性同时以100％的灵敏度诊断给定多因子疾病，例如LC。更确切地，可利用生化标记物例如CYFRA 21-1、CEA、NSE、CA 125、proGRP或本文所示ARMET，以某种可能性或预测值评估例如疾病的存在、不存在或严重性。因此在常规临床诊断中，通常在隐晦疾病(underlying disease)的诊断、治疗和处理中将多种临床症状和生物学标记物一起考虑。
可单独测定生化标记物，或在本发明的优选实施方案中可使用基于芯片或珠粒的阵列技术同时测量它们。然后，例如使用各标记物的个体截断值独立地解释生物标记物的浓度，或将它们组合以进行解释。
在又一优选实施方案中，用包括下述步骤的方法进行根据本发明的癌症评估：a)测量样品中ARMET蛋白和/或其片段的浓度，b)测量样品中一种或多种其他癌症标记物的浓度，以及c)在癌症的评估中利用测量结果，例如步骤(a)和步骤(b)中分别测定的浓度。
在癌症的评估中，标记物ARMET在一个以上的下述方面中是有利的：筛查；诊断辅助；预后；治疗例如化学治疗、放射治疗和免疫治疗的监测。
筛查：
筛查定义为用以鉴定个体(例如风险个体)的疾病指标(例如疾病的存在)的测试的系统性应用。优选地，筛查群体由已知处在高于平均水平的癌症风险中的个体组成。例如，肺癌筛查群体由已知处在高于平均水平的肺癌风险中的个体(如吸烟者、有吸烟史者和暴露于铀、石英和石棉的工人)组成。
在优选实施方案中，在癌症如肺癌的筛查中将组织样品或任意体液样品例如血浆、血清、粪便、尿液、痰、细支气管肺泡灌洗液(BAL)或粘膜上皮液(ELF)用作样品。
在另一优选的LC实施方案中，在肺癌的筛查中将痰用作样品。
对于许多疾病，循环中没有单个生化标记物总是满足筛查目的所要求的灵敏度和特异性标准。这点对于癌症特别是肺癌似乎也是如此。期望在癌症筛查中不得不利用包括多个标记物的标记物组。本发明确定的数据表明标记物ARMET将形成适合筛查目的的标记物组的主要部分。本发明因而涉及ARMET作为癌症标记物组(即包括RMET和一种或多种用于癌症筛查目的的其他标记物的标记物组)中一种标记物的用途。具体地，本发明涉及ARMET作为一般癌症标记物组中一种标记物的用途。这样的标记物组包括标记物ARMET和一种或多种另外的标记物，例如一般癌症标记物和/或用于上述癌症类型的标记物。
ARMET还可能在用于某些特定癌症类型的标记物组中起作用，所述癌症类型例如肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌和/或胆管癌。
利用包括ARMET的标记物组评估的其它优选癌症类型是肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆管癌。
利用包括ARMET的标记物组评估的其它优选癌症类型是肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、胰腺癌或前列腺癌。
利用包括ARMET的标记物组评估的其它优选癌症类型是肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌或黑色素瘤癌。
利用包括ARMET的标记物组评估的其它优选癌症类型是肺癌、结肠癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌或卵巢癌。
利用包括ARMET的标记物组评估的其它优选癌症类型是肺癌、结肠癌、乳腺癌或卵巢癌。
利用包括ARMET的标记物组评估的其它优选癌症类型是肺癌(LC)或结肠直肠癌(CRC)。
利用包括ARMET的标记物组评估的优选癌症类型是肺癌(LC)。
利用包括ARMET的标记物组评估的优选癌症类型是结肠癌(CRC)。
本数据还表明标记物的某些组合在癌症的筛查中将是有利的。例如，关于筛查LC或CRC的优选实施方案，本发明还涉及以下标记物组的用途：包括ARMET和CYFRA 21-1的标记物组、或包括ARMET和CEA的标记物组、或包括ARMET和NSE的标记物组、或包括ARMET和CA 19-9的标记物组、或包括ARMET和CA 125的标记物组、或包括ARMET和PSA的标记物组、或包括ARMET和proGRP的标记物组、或包括ARMET和SCC的标记物组、或包括RMET和NNMT的标记物组、或包括ARMET和两种以上选自CYFRA 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC和NNMT的标记物的标记物组。
诊断辅助：
标记物可有助于特定器官中良性疾病与恶性疾病的区分诊断，帮助区分肿瘤的不同组织学类型或者在手术前建立基线标记物值。
当今，用于检测肺癌的重要方法是放射学和/或计算机断层(CT)扫描。可通过这些方法显现小瘤，即可疑组织的小区域。然而，许多此类小瘤(90％以上(通过CT测定))代表良性组织变化，仅少数小瘤代表癌性组织。标记物ARMET的使用可有助于区分良性疾病与恶性疾病。
在优选实施方案中，将标记物RMET用于免疫组织学方法，以便确定或证实肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌和/或胆管癌(优选LC)的不同组织学类型。
由于作为单一标记物的ARMET可能优于其他标记物，例如在LC的情况下优于其他标记物如CEA或NSE，因此期望将ARMET用作诊断辅助，尤其通过在手术前确定基线值。因此，本发明还涉及ARMET用于在癌症手术之前确定基线值的用途。
预后：
预后指标可定义为以一定的可能性预测疾病结果的癌症患者和他们的肿瘤的临床、病理学或生物化学特征。它们的主要用途是帮助合理地计划患者处理，即分别避免对侵袭性疾病处理不足和对怠惰性疾病(indolent disease)治疗过度。Molina，R.，等，Tumor Biol.24(2003)209-218评估了CEA、CA 125、CYFRA 21-1、SSC和NSE在NSCLC中的预后价值。在他们的研究中，标记物NSE、CEA和LDH(乳酸脱氢酶)的异常血清水平似乎表示更短的存活时间。
由于ARMET单独地显著有助于区分癌症患者(例如LC或CRC患者)和健康对照，因此期望其将有助于评估罹患癌症优选罹患LC或CRC的患者的预后。很可能会将术前ARMET水平与一种或多种其他癌症标记物和/或TNM分期系统组合。在优选实施方案中，ARMET用于罹患LC或CRC的患者的预后。
化学治疗的监测：
Merle，P.，等，Int.J.of Biological Markers 19(2004)310-315已评估了用诱导化疗法治疗的罹患局部晚期NSCLC的患者中CYFRA 21-1血清水平的变化。他们的结论是，CYFRA 21-1血清水平的早期监测可能是III期NSCLC患者中肿瘤反应和存活的有用的预后方法。此外，报告已描述了CEA在监测LC患者的治疗中的用途(Fukasawa，T.，等，Cancer & Chemotherapy 13(1986)1862-1867)。大多数此类研究是回顾性的、非随机化的和包括少量患者。如同CYFRA 21-1研究的情况，CEA研究表明：a)在接受化学治疗时CEA水平下降的患者相比CEA水平未能下降的那些患者通常具有更好的结果，以及(b)对于几乎所有患者，CEA水平上升与疾病进展相关。
预期ARMET将是分别与CYFRA 21-1或CEA至少同样好的用于化学治疗监测的标记物。本发明因此还涉及ARMET在监测处于化学治疗中的癌症患者，优选肺癌(LC)或结肠癌(CRC)患者中的用途。在一个优选实施方案的治疗监测中，将ARMET和至少一种选自CYFRA 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC和/或NNMT的标记物的测量组合，并用于肺癌(LC)的评估。
随访：
大部分经历旨在彻底去除癌组织的手术切除的LC患者日后发展为复发性或转移性疾病(Wagner，H.Jr.，Chest 117(2000)S110-S118；Buccheri，G.，等，Ann.Thorac.Surg.75(2003)973-980)。这些复发大部分发生于术后最初的2-3年内。由于复发性/转移性疾病若查出过迟将总是致命的，所以相当多的研究已集中于早期和从而潜在可治疗期的癌症复发。
因此，许多癌症患者例如LC患者经受术后监测方案，其往往包括利用CEA的定期监测。已表明，即使在疑似症状或体征不存在的情况下，手术切除一年后利用CEA的连续监测在大约97％的特异性下以大约29％的灵敏度检测到早期术后复发性/转移性疾病(Buccheri，G.，等，Ann.Thorac.Surg.75(2003)973-980)。因此，术后LC患者的随访是合适生化标记物最重要的应用领域之一。由于ARMET在受调查LC患者中的高灵敏度，ARMET单独或与一种或多种其他标记物联合可能极大地有助于LC患者的随访，尤其术后LC患者的随访。包括ARMET和一种或多种其他LC标记物的标记物组在LC患者的随访中的用途代表了本发明另一优选实施方案。
在优选实施方案中，本发明涉及ARMET在癌症诊断领域中的用途。优选地，ARMET分别用于评估肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆管癌。
在另一优选实施方案中，本发明涉及作为癌症例如一般性癌症或特定癌症类型(例如肺癌、结肠癌、食道癌、头颈癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌或前列腺癌)标记物分子的ARMET与一种或多种另外的癌症标记物分子组合的用途。另外的标记物分子可以是癌症类型非特异性一般标记物分子和/或癌症类型特异性标记物分子，例如肺癌或结肠癌标记物分子。ARMET和至少一种另外的标记物用于获自个体的液体样品中癌症例如肺癌或结肠癌的评估。优选选择的可与ARMET的测量组合的其他癌症标记物是Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 125、CA 19-9、PSA、proGRP、SCC和NNMT。特别地，优选选择的可与ARMET的测量组合的其他LC标记物为CYFRA 21-1、CEA、CA19-9、SCC、CA 125、proGRP和/或NSE。用于评估癌症例如LC的又一优选标记物组包括ARMET和至少一种选自CYFRA 21-1和CEA的其他标记物分子。
如技术人员将理解的，存在许多方法利用两个以上标记物的测量以改进受调查的诊断问题。在相当简单但通常仍然有效的方法中，如果样品对于至少一种受调查的标记物是阳性的，则假定为阳性结果。这可以是例如诊断感染性疾病如AIDS时的情况。
然而，往往评估标记物组合。优选地，标记物组的标记物例如ARMET和CYFRA 21-1的测量值进行数学组合，组合值与基本诊断问题相关。标记物值可通过任何合适的现有技术数学方法组合。用于使标记物组合与疾病相关联的公知数学方法使用例如以下方法：判别分析(DA)(即线性-、二次-、正则化DA)、Kernel法(即SVM)、非参数法(即k-最近邻分类法(k-Nearest-Neighbor Classifier))、PLS(偏最小二乘法)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林法(Random Forest Method)、Boosting/套袋法(Bagging Method))、广义线性模型(即逻辑斯谛回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义加法模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。技术人员在选择合适方法评估本发明的标记物组合中将没有问题。优选地，用于使本发明的标记物组合与例如LC的不存在或存在相关联的方法选自DA(即线性-、二次-、正则化判别分析)、Kernel法(即SVM)、非参数法(即k-最近邻分类法)、PLS(偏最小二乘法)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林法、Boosting法)或广义线性模型(即逻辑斯谛回归)。与这些统计方法相关的细节参见下列参考文献：Ruczinski，I.等，J.of Computational and Graphical Statistics，12(2003)475-511；Friedman，J.H.，J.of the American StatisticalAssociation 84(1989)165-175；Hastie，T.等，The Elements of StatisticalLearning，Springer Series in Statistics(2001)；Breiman，L.，等Classification and regression trees，California：Wadsworth(1984)；Breiman，L.，Random Forests，Machine Learning，45(2001)5-32；Pepe，M.S.，The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification andPrediction，Oxford Statistical Science Series 28(2003)；和Duda，R.O.等，Pattern Classification，Wiley Interscience，第2版(2001)。
本发明的优选实施方案是，对生物学标记物的基本组合利用优化的多变量截断值，并区分状态A和状态B，例如区分患病与健康状态。在该类型的分析中，标记物不再是独立的，而是形成标记物组。
诊断方法的准确性由其受试者工作特性(ROC)充分说明(特别参见Zweig，M.H.，和Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC图是由在整个观察到的数据范围内连续改变决策阈值产生的所有灵敏度/特异性对的曲线。
实验室测试的临床表现取决于其诊断准确性或正确地将受试者分类成临床相关亚群的能力。诊断准确性衡量所述测试正确区分被调查受试者两种不同状态的能力。此类状态是例如健康和疾病或良性疾病对恶性疾病。
在各种情况下，ROC曲线通过在整个决策阈值范围内将灵敏度对1-特异性作图来描述两个分布之间的重叠。灵敏度或真阳性分数[定义为(真阳性测试结果数)/(真阳性测试结果数+假阴性测试结果数)]在y轴上。这也称为在疾病或病状存在情况下的阳性。其只根据受影响的亚群来计算。假阳性分数或1-特异性[定义为(假阳性结果数)/(真阴性结果数+假阳性结果数)]在x轴上。它是特异性的指数，并完全根据未受影响亚群来计算。由于通过使用来自两个不同亚群的检测结果完全分别地计算真阳性分数和假阳性分数，因此ROC曲线不依赖于样品中疾病的流行程度。ROC曲线上的各点代表对应于特定决策阈值的灵敏度/1-特异性对。具有完美区分(两个结果分布中无重叠)的测试具有通过左上角的ROC曲线，其中真阳性分数是1.0或100％(完美的灵敏度)，并且假阳性分数为0(完美的特异性)。无区分(两组相同的结果分布)的测试的理论曲线是从左下角至右上角的45°对角线。大多数曲线在这两个极端情况之间。(如果ROC曲线完全落在45°对角线以下，那么这可通过将“阳性”标准从“大于”转变成“小于”容易地矫正，或者反之亦然)。定性地，曲线越接近左上角，则测试的总体准确性越高。
将实验室测试的诊断准确性定量的一个优选方法是利用单个数字表示其性能。这样的总体参数例如是所谓“总误差(total error)”或者备选的“曲线下面积＝AUC”。最普遍的全局测量是ROC曲线下面积。按常规，该面积总是≥0.5(如果不是，可颠倒决策规则来使其如此)。值在1.0(两组测试值的完美分离)至0.5(两组测试值之间无明显分布差异)之间变化。面积不仅取决于曲线的特定部分例如离对角线最近的点或在90％特异性下的灵敏度，而且还取决于整个曲线。这是ROC曲线接近完美曲线(面积＝1.0)的程度的定量描述性表述。
联合ARMET与其他标记物如CYFRA 21-1或CEA或者与尚未发现的其他LC标记物的测量，ARMET分别带来和将带来LC评估中进一步的改进。
在优选实施方案中，本发明涉及用于通过分别测量样品中至少ARMET和CYFRA 21-1以及任选地CEA、NSE、CA 19-9、CA125、PSA、proGRP、SCC和/或NNMT的浓度，并将测定的浓度与是否存在癌症(如LC)相关联来提高癌症(如LC)对健康对照的诊断准确性的方法，与基于单独受调查的任意单一标记物的分类法相比，所述提高使得更多患者被正确归类为罹患癌症(如LC)对比健康对照。
在根据本发明的优选方法中，至少分别测定生物标记物ARMET和CYFRA 21-1的浓度，并将标记物组合用于癌症例如LC的评估。
在根据本发明的另一优选方法中，至少分别测定生物标记物ARMET和CEA的浓度，并将标记物组合用于癌症例如LC的评估。
在根据本发明的另一优选方法中，至少分别测定生物标记物ARMET和NSE的浓度，并将标记物组合用于癌症例如LC的评估。
在根据本发明的另一优选方法中，至少分别测定生物标记物ARMET和CA 19-9的浓度，并将标记物组合用于癌症例如LC的评估。
在根据本发明的另一优选方法中，至少分别测定生物标记物ARMET和CA 125的浓度，并将标记物组合用于癌症例如LC的评估。
在根据本发明的另一优选方法中，至少分别测定生物标记物ARMET和PSA的浓度，并将标记物组合用于癌症例如LC的评估。
在根据本发明的另一优选方法中，至少分别测定生物标记物RMET和proGRP的浓度，并将标记物组合用于癌症例如LC的评估。
在根据本发明的另一优选方法中，至少分别测定生物标记物ARMET和SCC的浓度，并将标记物组合用于癌症例如LC的评估。
在根据本发明的另一优选方法中，至少分别测定生物标记物RMET和NNMT的浓度，并将标记物组合用于癌症例如LC的评估。
在根据本发明的另一优选方法中，至少分别测定生物标记物ARMET、CYFRA 21-1和CEA的浓度，并将标记物组合用于癌症例如LC的评估。
在根据本发明的另一优选方法中，至少分别测定生物标记物ARMET、CYFRA 21-1和NSE的浓度，并将标记物组合用于癌症例如LC的评估。
在根据本发明的另一优选方法中，至少分别测定生物标记物ARMET、CYFRA 21-1和CA 19-9的浓度，并将标记物组合用于癌症例如LC的评估。
在根据本发明的另一优选方法中，至少分别测定生物标记物ARMET、CYFRA 21-1和CA 125的浓度，并将标记物组合用于癌症例如LC的评估。
在根据本发明的另一优选方法中，至少分别测定生物标记物ARMET、CYFRA 21-1和PSA的浓度，并将标记物组合用于癌症例如LC的评估。
在根据本发明的另一优选方法中，至少分别测定生物标记物ARMET、CYFRA 21-1和proGRP的浓度，并将标记物组合用于癌症例如LC的评估。
在根据本发明的另一优选方法中，至少分别测定生物标记物ARMET、CYFRA 21-1和SCC的浓度，并将标记物组合用于癌症例如LC的评估。
在根据本发明的另一优选方法中，至少分别测定生物标记物ARMET、CYFRA 21-1和NNMT的浓度，并将标记物组合用于癌症例如LC的评估。
提供的下列实施例、序列表和附图用于帮助理解本发明，其真正的范围陈述于所附权利要求中。应当理解，可在提出的方法中进行修改而不背离本发明的精神。
附图说明
图1显示肺癌组织裂解物的蛋白质印迹分析。如实施例5所述，分析了10个腺CA(A组)和10个鳞状细胞CA组织裂解物(B组)以及匹配对照组织裂解物的15μg总蛋白。M＝分子量标记物；T＝肿瘤组织裂解物；N＝匹配对照组织裂解物；rec Ag＝重组产生的ARMET；箭头表示ARMET的位置。B＝B组，肿瘤样品；A＝A组，对照样品。
图2显示用于评估366个获自LC患者的样品相比50个获自明显健康个体的对照样品并具有0.86的AUC的LC样品中ARMET的受试者工作特性曲线(ROC曲线)。
图3显示用于评估50个获自CRC患者的样品相比50个获自明显健康个体的对照样品并具有0.75的AUC的CRC样品中ARMET的受试者工作特性曲线(ROC曲线)。
图4显示用于评估49个获自乳腺癌患者的样品相比50个获自明显健康个体的对照样品并具有0.86的AUC的BC样品中ARMET的受试者工作特性曲线(ROC曲线)。
图5显示用于评估43个获自卵巢癌患者的样品相比50个获自明显健康个体的对照样品并具有0.91的AUC的OC样品中ARMET的受试者工作特性曲线(ROC曲线)。
图6显示人RMET蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。
图7多克隆抗体K4344(Pab K4344)，肺正常P1381-TN20，200x放大
图7a Pab K4344，肺正常P1381-TN20，200x放大
图8Pab K4344，肺腺癌725006.8，200x放大
图8a Pab K4344，肺鳞状细胞癌F060010，200x放大
图8b Pab K4344，肺腺癌725006.1，200x放大
图9Pab K4344，结肠正常F07-2538A3
图9a Pab K4344，结肠癌F08-0978
图10Pab K4344，乳腺正常06-1143
图10a Pab K4344，乳腺癌06-1786
图11Pab K4344，喉癌(AST 292)
图11a Pab K4344，卵巢癌(TriStar 2n)
图12Pab K4344，黑色素瘤(TriStar 4g)
图12a Pab K4344，胰腺癌(TriStar 5K)
序列说明
SEQ ID NO：1显示根据图6的序列。人ARMET蛋白序列(SwissProt数据库登记号：P55145)。
SEQ ID NO：2显示合成的正向引物LC56for-EcoRI。
SEQ ID NO：3显示合成的反向引物LC56rev-BamHI。
SEQ ID NO：4显示合成的肽延伸链。
实施例1
鉴定作为潜在肺癌标记物的ARMET
组织来源：
为鉴定作为潜在肺癌诊断标记物的肿瘤特异性蛋白，进行利用蛋白质组学方法的两种不同组织分析。
总的来讲，分析来自11名罹患肺癌(LC)的患者的组织样品。由治疗切除从每名患者收集两个不同组织类型：肿瘤组织(＞80％肿瘤)(T)和邻近的健康组织(N)。后者用作匹配健康对照样品。在切除后，将组织立即迅速冷冻，并在处理前贮于-80℃。通过组织病理学标准诊断肿瘤。
组织制备：
将0.8-1.2g冷冻组织切成小片，转移到混合球磨机的已冷却磨具中并通过液氮彻底冷冻。将组织在球磨机中磨成粉，溶于10倍体积(w/v)裂解缓冲液(40mM柠檬酸钠、5mM MgCl2、1％Genapol X-080、0.02％叠氮化钠、Complete
无EDTA[Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，Germany，目录号1 873 580]，并随后在Wheaton
玻璃匀浆器(20x松配合，20x紧配合)匀浆化。将匀浆离心(5,000×g下10’)，将上清液转移到另一小瓶中，再次离心(20,000×g下15’)。所得上清液包含可溶性蛋白，并用于进一步分析。
用于LC-ESI-MSMS分析的样品制备：
利用Bradford assay测定可溶性蛋白级分的蛋白浓度。用Laemmli样品缓冲液将400μg每种样品稀释为2mg/ml的浓度，并在95℃孵育10分钟。按照“大块预制凝胶”(30min-25mA，2.5h-35mA)的BioRad说明手册进行凝胶电泳(3×120μg每种样品，BioRad 10-20％Tris-HCl，16×16cm)。在蛋白分离后，将凝胶与50％甲醇/10％醋酸室温孵育30min，接着与20mM DTT/100mMNH4HCO3孵育还原1h，并与100mM乙酰胺碘/100mM NH4HCO3孵育烷化2h。用20％甲醇/20％考马斯蓝(Novex染色试剂盒)室温下进行凝胶染色过夜。
切下由标记物蛋白指示的6和31kDa之间的区域，并切成1mm大小的片。通过与0.1M NH4HCO3/30％乙腈孵育实现凝胶的彻底脱染。在用水洗涤后，在speedvac中于45℃和10mbar条件下干燥凝胶片。室温下用胰蛋白酶(蛋白质组学级，Roche DiagnosticsGmbH)消化过夜，之后用35％乙腈/0.1％甲酸提取。在speedvac中蒸发提取液，并将样品溶于100μl 5％乙腈/0.5％醋酸/0.1％甲酸。
LC-ESI-MSMS分析：
将胰蛋白酶消化物(100μl)在Nano-LC系统(Ultimate，Famos，Switchos；LC Packings，Idstein，Germany)上通过二维HPLC(MudPIT)分离。用自组装的二维柱(熔融二氧化硅：PicoFrit 75μm，NewObjective；RP：ProntoSil 120-5-C18 AQ+，Bischoff；SCX：Partisil 10，Whatman)进行该分离。通过连续渐增量的NH4Ac(0-1500mM)的逐步洗脱，产生11SCX级分。将它们在柱的RP部分进一步分离，并通过利用ESI-MS离子阱的数据依赖性扫描(LCQ deca XP；ThermoElectron，Massachusetts，USA；参数见表X)进行在线分析。对各样品进行三次运行。利用以Sequest作为基本算法的非商用Roche自有数据管理系统处理原始数据(参数见表X)。组合重复运行鉴定的肽和蛋白的所得列表。
在已鉴定并在表2中给出的序列帮助下，确定蛋白ARMET。
ARMET作为潜在肺癌标记物的检测：
对于每名患者，将来自肿瘤样品的鉴定蛋白和相应肽数与来自邻近正常组织的匹配结果作比较。通过这种方法，发现蛋白ARMET特异存在，或者在肿瘤组织中非常丰富，而在健康对照组织中不能检测出或几乎不可检。
表1：MSMS数据采集和数据库查找参数
蛋白ARMET在来自罹患肺癌患者的肿瘤组织中非常过量地存在。通过数据库查找方式LCQ-MS2数据鉴定肿瘤组织中的蛋白ARMET的以下肽序列：
以下衍生自ARMET的序列利用上述方法鉴定。
表2：由ESI-MSMS鉴定的序列
实施例2
抗癌症标记物蛋白ARMET抗体的产生
产生抗肺癌标记物蛋白ARMET的多克隆抗体，以进一步使用该抗体通过免疫检测测定例如蛋白质印迹和ELISA测量ARMET的血清、血浆和血液水平。
大肠杆菌中的重组蛋白表达：
为了产生抗ARMET抗体，在大肠杆菌中产生重组抗原。因此，利用下述引物从获自German Resource Center for GenomeResearch(德国基因组研究资源中心)(RZPD，Berlin，Germany)的全长cDNA克隆IRAUp969D0638D来PCR扩增ARMET编码区：
正向引物LC56for-EcoRI：
5’acgtacgtgaattcattaaagaggagaaattaactatATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACATTGAAGGCCGTAGGAGGATGTGGGCCACGCAG(SEQ ID NO：2/EcoRI-下划线位点，编码核苷酸以大写字母表示)
反向引物LC56rev-BamHI：
5’acgtacgtggatcctcattaCAAATCGGTCCGTGCACTGG(SEQ IDNO：3/BamHI-下划线位点，编码核苷酸以大写字母表示)
正向引物以编码符合读框地引入ARMET蛋白的N-端MRGSHHHHHHIEGR肽延伸链(SEQ ID NO：4)的寡核苷酸为特征(除了EcoRI克隆位点和核糖体结合位点)。将EcoRI/BamHI消化的PCR片段连接到相应的pQE-30(Qiagen，Hilden，Germany)载体片段中，该载体片段随即被转化到大肠杆菌XL1-blue感受态细胞中。在序列分析之后，按照制造商说明书将质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，以在pQE载体系列的IPTG-可诱导T5启动子控制下进行表达。
为纯化MRGSHHHHHHIEGR-ARME融合蛋白，通过离心沉淀1l过夜诱导的细菌培养物，并通过在100mM磷酸钠缓冲液，pH8.0，7M盐酸胍，5mM咪唑，20mM硫代甘油中重悬来裂解细胞沉淀。通过离心沉淀不溶物，将上清液用于次氨基三乙酸镍(Ni-NTA)金属亲和色谱：用数倍床体积的裂解缓冲液洗涤柱子，之后用下述缓冲液洗涤：a)100mM磷酸钠缓冲液，pH 8.0，10mM Tris-HCl，pH 8.0，8M尿素，20mM硫代甘油；b)100mM磷酸钠缓冲液，pH8.0，0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)，20mM硫代甘油；和c)100mM磷酸钠缓冲液，pH 8.0，0.1％SDS，20mM硫代甘油。最后，在酸性条件下用100mM磷酸钠缓冲液，pH 5.0，0.1％SDS，20mM硫代甘油洗脱结合的抗原，并贮于4℃的相同缓冲液中。
多克隆抗体的产生：
a)免疫
为了免疫，以1∶1比例制备蛋白溶液(100μg/ml蛋白ARMET)和完全弗氏佐剂的新鲜乳液。在第1、7、14以及30、60和90天，每只兔用1ml乳液免疫。抽取血液，并将所得抗ARMET血清用于实施例3和4中所述进一步实验。
b)通过用辛酸和硫酸铵连续沉淀，自兔血清纯化IgG(免疫球蛋白G)
将1倍体积的兔血清用4倍体积的醋酸盐缓冲液(60mM，pH 4.0)稀释。用2M Tris碱将pH调至4.5。在剧烈搅拌下滴加辛酸(25μl/ml经稀释的样品)。30分钟后，将样品离心(13000×g，30分钟，4℃)，弃去沉淀并收集上清液。通过加入2M Tris碱将上清液的pH调节至7.5并过滤(0.2μm)。
在剧烈搅拌下通过滴加4M硫酸铵溶液至2M的终浓度沉淀上清液中的免疫球蛋白。通过离心(8000×g，15分钟，4℃)收集沉淀的免疫球蛋白。
弃去上清液。将沉淀溶解于10mM NaH2PO4/NaOH，pH 7.5，30mM NaCl，并彻底透析。将透析液离心(13000×g，15分钟，4℃)并过滤(0.2μm)。
多克隆兔IgG的生物素化：
使多克隆兔IgG在10mM NaH2PO4/NaOH，pH 7.5，30mM NaCl中达到10mg/ml。每mlIgG溶液加入50μl生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(3.6mg/ml的DMSO溶液)。在室温下保持30分钟后，将样品在Superdex 200(10mM NaH2PO4/NaOH，pH 7.5，30mM NaCl)上进行层析。收集含有生物素化IgG的流分。多克隆抗体已根据相同步骤生物素化。
多克隆兔IgG的地高辛化：
使多克隆兔IgG在10mM NaH2PO4/NaOH，30mM NaCl，pH 7.5中达到10mg/ml。每ml IgG溶液加入50μl地高辛-3-O-甲基羰基-ε-氨基辛酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany，目录号1 333 054)(3.8mg/ml的DMSO溶液)。在室温下保持30分钟后，将样品在Superdex
200(10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl)上进行层析。收集含有地高辛化IgG的流分。单克隆抗体已根据相同步骤用地高辛标记。
实施例3
用于测量人血清和血浆样品或其他体液中ARMET的ELISA
为了检测人血清或血浆中的ARMET，进行夹心ELISA。为了捕获和检测抗原，将抗ARMET多克隆抗体的等分试样(见实施例2)分别与生物素和地高辛缀合。
将链霉抗生物素蛋白包被的96孔微量滴定板与100μl生物素化抗ARMET多克隆抗体以10μg/ml在10mM磷酸盐，pH 7.4，1％BSA，0.9％NaCl和0.1％Tween 20中孵育60分钟。孵育后，用0.9％NaCl，0.1％Tween 20将板洗涤三次。随后将孔与作为标准抗原的重组蛋白(见实施例2)的系列稀释液或稀释的来自患者的血浆样品，孵育2小时。在结合ARMET后，用0.9％NaCl，0.1％Tween20将板洗涤三次。为特异检测结合的ARMET，将孔与100μl地高辛化抗ARMET多克隆抗体以10μg/ml在10mM磷酸盐，pH 7.4，1％BSA，0.9％NaCl和0.1％Tween 20中孵育60分钟。然后，洗涤板三次以除去未结合抗体。在下一步中，将孔与20mU/ml抗地高辛-POD缀合物(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目录号1633716)在10mM磷酸盐，pH 7.4，1％BSA，0.9％NaCl和0.1％Tween 20中孵育60分钟。随后用同样的缓冲液洗涤板三次。为了检测抗原-抗体复合物，将孔与100μl ABTS溶液(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，Germany，目录号11685767)一起孵育，并在30-60分钟后用ELISA读数器于405nm测量OD。
实施例4
作为肺癌血清标记物的ARMET
利用表3中给出的源自366名用UICC分类法充分表征的肺癌患者(148个腺-CA，87个鳞状细胞CA，44个小细胞CA，87个其他肺CA)的样品。
表3：研究群体
| 根据UICC的分期 | 样品数 |
| UICC I/II | 167 |
| UICC III | 112 |
| UICC IV | 58 |
| 未分期 | 29 |
| 明显健康的血液供者 | 50 |
与50个得自明显健康个体(＝对照群组)的对照样品相比，评估表3的LC样品中ARMET的水平，其具有0.86的AUC(图2)。
实施例5
作为结肠直肠癌(CRC)血清标记物的ARMET
利用表3中源自50名用UICC分类法充分表征的结肠直肠癌患者的样品。
表4：研究群体
| 根据UICC的分期 | 样品数 |
| UICC I/II | 26 |
| UICC III | 17 |
| UICC IV | 6 |
| 未分期 | 1 |
| 明显健康的血液供者 | 50 |
与50个得自明显健康个体(＝对照群组)的对照样品相比，评估表4的CRC样品中ARMET的水平，得到0.75的AUC(图3)。
实施例6
作为乳腺癌(BC)血清标记物的ARMET
利用表3中源自49名用UICC分类法充分表征的乳腺癌患者的样品。
表5：研究群体
| 根据UICC的分期 | 样品数 |
| UICC I/II | 26 |
| UICC III | 11 |
| UICC IV | 13 |
| 明显健康的血液供者 | 50 |
与50个得自明显健康个体(＝对照群组)的对照样品相比，评估表5的BC样品中ARMET的水平，得到0.86的AUC(图4)。
实施例7
作为卵巢癌(OC)血清标记物的ARMET
利用表3中源自43名用UICC分类法充分表征的卵巢癌(OC)患者的样品。
表6：研究群体
| 根据UICC的分期 | 样品数 |
| UICC I/II | 12 |
| UICC III | 21 |
| UICC IV | 10 |
| 明显健康的血液供者 | 50 |
与50个得自明显健康个体(＝对照群组)的对照样品相比，评估表6的OC样品中ARMET的水平，得到0.91的AUC(图5)。
实施例8
利用实施例2中产生的多克隆抗体检测人肺癌(LC)组织中ARMET的蛋白质印迹
根据实施例1中“组织制备”所述，制备来自肿瘤样品和健康对照样品的组织裂解液。
利用Invitrogen，Karlsruhe，Germany的试剂和设备进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。对于每个受试组织样品，将15μg组织裂解物稀释到还原NuPAGE
(Invitrogen)SDS样品缓冲液中，并于95℃加热10分钟。在MES运行缓冲系统的4-12％NuPAGE
凝胶上(Tris-甘氨酸)上运行样品。利用Invitrogen XCell IITM Blot Module(Invitrogen)和NuPAGE
转移缓冲系统将凝胶分离的蛋白混合物点样到硝酸纤维素膜上。将膜在PBS/0.05％Tween-20中洗涤3次，并用Roti
-Block封闭缓冲液(A151.1；Carl Roth GmbH，Karlsruhe，Germany)封闭2小时。将第一抗体多克隆兔抗MET血清(实施例2所述产生)以1∶10,000稀释到Roti
-Block封闭缓冲液中，并与膜孵育1小时。将膜在PBS/0.05％Tween-20中洗涤6次。特异结合的第一兔抗体用POD缀合多克隆绵羊抗兔IgG抗体标记，并在0.5x Roti-Block封闭缓冲液中稀释为10mU/ml。在孵育1小时后，将膜在PBS/0.05％Tween-20中洗涤6次。为检测结合的POD缀合抗兔抗体，将膜与Lumi-LightPLUS Western Blotting Substrate(序号2015196，RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)一起孵育，并暴露于放射自显影胶片。
ARMET的信号强度在18个得自20名不同LC患者的20个肿瘤组织裂解物中有提高(图1)。因此，通过蛋白质印迹分析清楚地证实了实施例1中由MALDI检测的肿瘤组织中ARMET的丰度增加。
实施例9
粘膜上皮液(ELF)中的ARMET-支气管镜微量取样
支气管镜微量取样(BMS)使得能够以基本上非侵袭性的方式采集接近肺部小瘤的粘膜上皮液(ELF)。随后，可测量ELF中的肿瘤标记物浓度以便鉴定恶性小瘤。
将BMS探测器(Olympus Medical Systems Corp.Tokyo，Japan，目录号：BC-402C)通过支气管镜插入肺中，该探测器由外层的聚乙烯鞘和内层的连接至不锈钢导向体(stainless steel guide)的棉探测器组成。将该内层探测器推进至小瘤邻近处，进行数秒的BMS。然后，将内层探测器收入外层鞘内并将两个装置同时取出。将棉尖(cotton tip)切下并直接在-80℃下冷冻。为了测定，将ELF自棉尖洗出并可随后分析。如实施例2所述，用ELISA测定ELF中的ARMET浓度。
实施例10
用Pab K4344对ARMET的免疫染色
从Roche肿瘤库(MML，Pharma Research Penzberg)获得石蜡包埋的组织。将组织切成2μm的连续切片，在二甲苯中去石蜡(3x 5分钟)，并通过一系列的分级乙醇再次水化，之后是利用去离子水和PBS(1x 2分钟)的两次洗涤步骤。用Retrivit pH 4.0(Biogenex)在97℃-100℃进行抗原回收20分钟。使载玻片冷却20分钟，并用PBS冲洗(2x 1分钟)。通过在3％H2O2的PBS溶液中孵育5分钟封闭内源过氧化物酶活性，载玻片接着用PBS冲洗两次，之后用TBS+Tween 20(LabVision 1666789)冲洗3分钟一次。用1％马血清的PBS溶液(Horse-Blocking Serum，Vectastain ABC试剂盒，Elite Universal，Vector PK 6200)在室温进行免疫球蛋白非特异性结合的封闭20分钟。按照制造商的说明书利用Biotin Blocking System(Dako X0590)封闭内源生物素。为了ARMET特异性染色，将切片与在Antibody-Dilutent(Dako S2022)中稀成3μg/ml的多克隆抗体K4344一起于4℃孵育过夜。载玻片用TBS+Tween 20(LabVision 1666789)洗涤(3x 2分钟)，之后与生物素化第二抗体(5ml PBS+1％马血清中的1滴)(Vectastain ABC试剂盒，Elite Universal，Vector PK6200)室温孵育30分钟。在用TBS+Tween 20洗涤(3x 2分钟)后，将切片与ABC试剂(5ml PBS中的1滴试剂A加1滴试剂B)一起室温孵育30分钟。用TBS+Tween 20洗涤载玻片(2x2分钟)，最后与二氨基联苯胺色原溶液(DAB+，LabVision TA-125-HDX)反应10分钟，在用蒸馏水冲洗后，用苏木精对它们复染并固定。
兔IgG级分(Dako X0903)用作阴性对照。
表7：肿瘤中的ARMET表达
Claims (15)
1.一种体外评估癌症的方法，包括：
(a)测量样品中ARMET(早期肿瘤中突变的富含精氨酸)蛋白和/或其片段的浓度，
(b)任选测量样品中一种或多种其他癌症标记物的浓度，和
(c)在癌症的评估中利用步骤(a)和任选步骤(b)的测量结果，其中ARMET蛋白和/或其片段浓度增加指示癌症。
2.权利要求1的方法，其特征还在于，所述方法用于评估癌症如肺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌或胆管癌，尤其肺癌和/或结肠癌。
3.权利要求2的方法，其特征还在于，所述癌症是肺癌。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其特征还在于，步骤(b)的所述一种或多种其他标记物选自Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC和/或NNMT。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其特征还在于，所述样品是血液、血浆、血清、痰、尿液、粪便、细支气管肺泡灌洗液(BAL)或粘膜上皮液(ELF)样品。
6.权利要求1-4中任一项的方法，其特征还在于，所述样品是组织样品。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其特征还在于，通过免疫学方法测量浓度。
8.ARMET蛋白和/或其片段在评估癌症中的用途。
9.权利要求8的用途，用于评估肺癌和/或结肠癌。
10.权利要求8的用途，用于评估肺癌、尤其非小细胞肺癌(NSCLC)。
11.针对ARMET蛋白和/或其片段的抗体在评估癌症中的用途，其中ARMET蛋白和/或其片段浓度增加指示癌症。
12.包括ARMET蛋白和/或其片段和任选的一种或多种其他癌症标记物的标记物组在评估癌症中的用途，其中ARMET蛋白和/或其片段浓度增加指示癌症。
13.权利要求12的标记物组的用途，其特征还在于，任选的一种或多种其他标记物选自Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA 19-9、CA125、PSA、proGRP、SCC和/或NNMT。
14.权利要求12-13的标记物组的用途，用于评估肺癌尤其NSCLC。
15.一种用于进行权利要求1所述方法的试剂盒，包括特异性检测ARMET蛋白和/或其片段和任选的一种或多种其他癌症标记物所需要的试剂。
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