CN102296095B

CN102296095B - 一种发酵制柠檬酸的方法

Info

Publication number: CN102296095B
Application number: CN 201110275995
Authority: CN
Inventors: 周勇; 杨儒文; 卢宗梅; 章辉平; 冯志菲
Original assignee: Cofco Biochemical Anhui Co Ltd
Current assignee: COFCO Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2011-09-16
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2031-09-16
Also published as: CN102296095A

Abstract

本发明提供一种发酵制柠檬酸的方法，该方法包括在通入空气和搅拌的条件下，依次将第一柠檬酸发酵种子接入到依次排列的多组发酵罐中进行第一发酵培养，再依次将第二柠檬酸发酵种子接入所述多组发酵罐中进行第二发酵培养至发酵培养基中的还原糖为1-3g/L时，停止发酵培养，在不停空气和搅拌状态下对发酵液进行固液分离，得到菌体残渣和柠檬酸发酵清液；所述多组发酵罐中的每组包括一个或多个并联设置的发酵罐，其中，一组发酵罐中的第一柠檬酸发酵种子来自柠檬酸发酵种子培养液，第二柠檬酸发酵种子为多组发酵罐得到的所述菌体残渣的一部分；所述第一发酵培养的时间为10-50小时。根据本发明的方法能够有效利用柠檬酸发酵种子，降低柠檬酸发酵成本。

Description

一种发酵制柠檬酸的方法

技术领域

本发明涉及一种发酵制柠檬酸的方法。

背景技术

柠檬酸是有机酸中第一大酸，由于物理、化学等方面的优异性能，广泛应用于医药、化学、电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域。

目前柠檬酸发酵行业采取的发酵技术是间歇式的液体深层二级发酵技术。其发酵过程为：淀粉质原料的酶解制备种子培养基和发酵培养基；种子罐接入黑曲霉孢子培养成熟后转接到发酵罐中进行发酵生产柠檬酸，发酵初始糖为14.5％，发酵停止后发酵液经板框分离出菌体残渣和发酵清液，发酵清液进入后续工序提取柠檬酸，菌体残渣进入饲料烘干工序。

由于现有黑曲霉种子的耐酸性能在14％左右，当高糖发酵时由于后期的柠檬酸浓度较高，严重抑制黑曲霉的活性和合成柠檬酸的能力。因此，为了使柠檬酸发酵效益比较合理，当发酵酸度达到14％左右，严重抑制菌体活性时停止发酵。也就是说，现有技术中每次发酵均使用来自种子罐培养的种子作为发酵罐的发酵种子。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的柠檬酸发酵的方法。该方法能够有效利用柠檬酸发酵种子，降低柠檬酸发酵成本。

本发明的发明人经过研究发现，现有柠檬酸发酵中，在发酵终点的柠檬酸菌体黑曲霉菌体并没有完全衰老，仍然还具有充分的活性，将其接入到发酵罐中时，还可以继续发挥其柠檬酸合成能力，被直接烘干成饲料是一种很大的浪费，从而完成了本发明。

即，本发明提供一种发酵制柠檬酸的方法，该方法包括在通入空气和搅拌的条件下，依次将第一柠檬酸发酵种子接入到依次排列的多组发酵罐中进行第一发酵培养，再依次将第二柠檬酸发酵种子接入所述多组发酵罐中发酵罐中进行第二发酵培养至发酵培养基中的还原糖为1-3g/L时，停止发酵培养，在不停空气和搅拌状态下对发酵液进行固液分离，得到菌体残渣和柠檬酸发酵清液；所述多组发酵罐中的每组包括一个或多个并联设置的发酵罐，

其中，一组发酵罐中的第一柠檬酸发酵种子来自柠檬酸发酵种子培养液，第二柠檬酸发酵种子为多组发酵罐得到的所述菌体残渣的一部分；所述第一发酵培养的时间为10-50小时。

根据本发明的发酵制柠檬酸的方法，由于该方法能够有效地利用柠檬酸发酵中，经固液分离得到的菌体残渣，从而降低了发酵培养中孢子接入量，一般发酵培养中孢子接入量为：以每毫升发酵培养基为基准，发酵菌的接种量为5×10⁴-2.5×10⁵个菌落形成单位，本发明中发酵培养中孢子接入量为：以发酵罐中每毫升发酵培养基为基准，第一柠檬酸发酵种子的接种量为5×10³-5×10⁴个菌落形成单位。使柠檬酸的发酵成本降低同时提高了糖酸转化率；另一方面，由于只是使用菌体残渣代替部分的柠檬酸发酵种子，每次发酵均有部分新鲜的柠檬酸发酵种子，因此能够避免柠檬酸发酵种子因多次连续使用而导致的活性减低的问题。

具体实施方式

本发明提供一种发酵制柠檬酸的方法，该方法包括在通入空气和搅拌的条件下，依次将第一柠檬酸发酵种子接入到依次排列的多组发酵罐中进行第一发酵培养，再依次将第二柠檬酸发酵种子接入所述多组发酵罐中发酵罐中进行第二发酵培养至发酵培养基中的还原糖为1-3g/L时，停止发酵培养，在不停空气和搅拌状态下对发酵液进行固液分离，得到菌体残渣和柠檬酸发酵清液；所述多组发酵罐中的每组包括一个或多个并联设置的发酵罐，

在本发明中，术语“还原糖”是指具有还原性的糖类物质。

本发明通过先将来自柠檬酸发酵种子培养液的第一柠檬酸发酵种子接入发酵罐中进行发酵，再将发酵罐得到的菌体残渣接入发酵罐中，使得两种柠檬酸发酵种子的的活性相当，从而有利于提高柠檬酸发酵的水平。因此，根据本发明的柠檬酸发酵的方法，优选的情况下，所述第一发酵培养的时间为15-45小时。

根据本发明的柠檬酸发酵的方法，一组发酵罐中的第二柠檬酸发酵种子为多组发酵罐中的一组发酵罐得到的所述菌体残渣；优选的情况下，一组发酵罐中的所述第二柠檬酸发酵种子为与该组发酵罐相邻的上一组发酵罐中得到的所述菌体残渣。

在本发明中，所述一组发酵罐可以是一个发酵罐，也可以是多个并联的发酵罐。所述一组发酵罐中的第二柠檬酸发酵种子为多组发酵罐中的一组发酵罐得到的所述菌体残渣，也可以理解为一组发酵罐中多个发酵罐中的第二柠檬酸发酵种子为多组发酵罐中的一组发酵罐中一个发酵罐得到的所述菌体残渣；还可以理解为一组发酵罐中一个发酵罐中的第二柠檬酸发酵种子为多组发酵罐中的一组发酵罐中多个发酵罐得到的所述菌体残渣。

根据本发明的柠檬酸发酵的方法，由于本发明能够有效地利用柠檬酸发酵中，经固液分离得到的菌体残渣，并可以使其继续发挥柠檬酸合成能力。因此，相对于现有的柠檬酸发酵过程中接入到发酵培养基的柠檬酸发酵种子，所述第一柠檬酸发酵种子的用量较小。优选的情况下，以发酵罐中每毫升发酵培养基为基准，第一柠檬酸发酵种子的接种量为5×10³-5×10⁴个菌落形成单位；更优选的情况下，以发酵罐中每毫升发酵培养基为基准，第一柠檬酸发酵种子的接种量为1×10⁴-2.5×10⁴个菌落形成单位。

在本发明中，将第二柠檬酸发酵种子接入所述多组发酵罐中发酵罐中进行第二发酵培养至发酵培养基中的还原糖为1-3g/L时，停止发酵培养；优选的情况下，当发酵培养基中的还原糖为1-2g/L时，停止发酵培养。

根据本发明的柠檬酸发酵的方法，在不停空气和搅拌状态下对发酵液进行固液分离，得到菌体残渣和柠檬酸发酵清液。为了保持菌体残渣中的菌体的活性，从固液分离开始到接入发酵罐中的时间间隔越短越好。优选的情况下，从固液分离开始到接入发酵罐中的时间间隔小于8分钟；更优选从固液分离开始到接入发酵罐中的时间间隔小于5分钟；进一步优选从固液分离开始到接入发酵罐中的时间间隔小于4分钟。

上述固液分离可以采用碟片式或卧螺式离心机均可，该离心机可以通过商购得到，例如张家港市凯迪公司的LW卧式离心机，其使用方法为本领域所公知。另外，为了缩短固液分离开始到接入发酵罐中的时间间隔，上述固液分离得到菌体残渣中可以含有一定量的水。一般情况下，上述固液分离得到菌体残渣中的水含量可以为75-85重量％；优选的情况下，上述固液分离得到菌体残渣中的水含量为80-85重量％。

根据本发明的柠檬酸发酵的方法，依次将第一柠檬酸发酵种子接入到依次排列的多组发酵罐中的时间间隔可以根据第一发酵培养的时间和第二发酵培养的时间进行选择，只要能够保证将第一柠檬酸发酵种子接入到发酵罐中进行第一发酵培养后，立刻能够将第二柠檬酸发酵种子(即多组发酵罐得到的所述菌体残渣的一部分)接入该发酵罐中进行第二发酵培养即可。优选的情况下，将第一柠檬酸发酵种子接入到多组发酵罐中的相邻的两组发酵罐中的时间间隔为10-50小时；更优选为将第一柠檬酸发酵种子接入到多组发酵罐中的相邻的两组发酵罐中的时间间隔为15-45小时。

根据本发明的柠檬酸发酵的方法，将一组发酵罐发酵得到的所述菌体残渣接入到下一组发酵罐发酵称为一个循环。如果所述第二柠檬酸发酵种子的接入量过多，经过多次该循环后会导致所述第二柠檬酸发酵种子的活性降低，从而影响发酵的水平。因此，所述第二柠檬酸发酵种子的接入量可以根据所述第一柠檬酸发酵种子的接入量以及发酵罐中发酵培养基的重量来选择。优选的情况下，所述第二柠檬酸发酵种子的接入量为发酵罐中发酵培养基的重量的5-20重量％；更优选所述第二柠檬酸发酵种子的接入量为发酵罐中发酵培养基的重量的7.5-15重量％。另外，从第二柠檬酸发酵种子的活性上来考虑，优选上述循环的次数为8以下；从第二柠檬酸发酵种子的有效利用上考虑，更优选为上述循环的次数为1-5次。

在本发明中，所述种子培养基可以为本领域所公知的各种柠檬酸种子培养基。优选的情况下，使用淀粉质原料酶解液(即，酶解后的产物)，以该淀粉质原料酶解液的总量为基准，淀粉质原料酶解液中的总糖为8-14重量％、以氮元素计，氮源为0.1-0.5重量％；优选地，该淀粉质原料酶解液中的总糖为9-12重量％、氮源为0.1-0.25重量％。根据需要，可以向种子培养基中添加补充氮源。所述补充氮源的添加量可以为培养基总重量的0.01-0.05重量％。所述补充氮源的种类为本领域技术人员所公知，例如，所述补充氮源可以为尿素、硫酸铵和硝酸铵等中的一种或多种。

上述淀粉质原料酶解液可以通过将水、粉碎后的淀粉质原料以及淀粉酶混合酶解而得到。具体地，以每克粉碎后的淀粉质原料的干重计，所述淀粉酶的用量为15-40个酶活力单位，所述水的用量为1-6克；优选地，所述淀粉酶的用量为20-30个酶活力单位，所述杂质溶液的用量为2-5克。

本发明所述酶的酶活力单位的定义为：在pH值为6.0、温度为70℃的条件下，1分钟将1毫克淀粉转化为还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。

所述酶解的温度可以在很大范围内改变，优选为70-115℃，更优选为90-95℃。所述酶解的时间理论上越长越好，考虑到设备利用率，优选所述酶解的时间为90-150分钟，更优选为100-120分钟。所述酶解的pH值可以在很大范围内改变，优选为5.0-7.0，更优选pH值为5.8-6.2。

淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。

α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，它能够任意地、不规则地切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。

β-淀粉酶又称淀粉1，4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1，4-糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和内孢霉产生。

糖化酶又称淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶，此酶作用于淀粉分子的非还原性末端，以葡萄糖为单位，依次作用于淀粉分子中的α-1，4-糖苷键，生成葡萄糖。糖化酶作用于支链淀粉后的产物有葡萄糖和带有α-1，6-糖苷键的寡糖；作用于直链淀粉后的产物几乎全部是葡萄糖。此酶产生菌主要是黑曲霉(左美曲霉、泡盛曲霉)、根霉(雪白根酶、德氏根霉)、拟内孢霉、红曲霉。

异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于枝链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将枝链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。此酶产生菌主要是嫌气杆菌、芽孢杆菌及某些假单孢杆菌等细菌。

根据本发明，优选使用α-淀粉酶和/或异淀粉酶。

根据本发明，所述淀粉质原料可以为本领公知的各种可以用于酶解、发酵制备柠檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类(如木薯)和小麦中的一种或多种。优选地，所述含有淀粉的原料为玉米。

根据本发明，所述种子培养的柠檬酸发酵菌为黑曲霉。本发明发酵所使用的黑曲霉可以为商购的黑曲霉固体制剂或黑曲霉菌种，例如，黑曲霉Co827(上海工业微生物研究所)和黑曲霉T01(天津工业微生物所)。

根据本发明，发酵种子培养的程度可以通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH在2.0-2.5、酸度0.5-2.0％、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时停止培养。

上述种子培养的条件可以在很大范围内改变，例如所述培养的条件可以包括：培养的温度可以为30-45℃，pH值可以为2-6，通气量可以为0.05-0.5体积：(体积分钟)，培养的时间可以为20-40小时；更优选的情况下，所述培养的条件可以包括：培养的温度可以为34-38℃，pH值可以为2.5-6，通气量可以为0.15-0.4体积∶体积·分钟，所述培养的时间可以为22-30小时。

根据本发明，所述第一发酵培养和第二发酵培养的条件包括：培养的温度为30-42℃，pH值为1-6，通气量为0.06-0.2体积：(体积分钟)，第一发酵培养和第二发酵培养的总培养的时间为50-60小时。

根据本发明，所述发酵培养基中各组分的含量可以在很大范围内改变。优选地，所述发酵培养基中碳源(糖)含量为13-21重量％，氮源含量为0.06-0.14重量％，磷源含量为0.005-0.07重量％，无机盐含量0.1-2.6重量％，水含量为77-86重量％。

优选所述发酵培养基中总糖为13-18重量％，更优选发酵培养基中总糖为14-16重量％。术语总糖是指发酵培养基中所含糖的总含量。

优选情况下，还可以根据需要向所述发酵培养基中添加补充氮源，所述补充氮源(如尿素)的添加量可以为发酵培养基总重量的0.01-0.05重量％。根据本发明，所述补充氮源的种类为本领域技术人员所公知，例如，所述补充氮源可以为尿素、硫酸铵和硝酸铵等中的一种或多种。

根据本发明的的柠檬酸发酵的方法，该方法还包括从所述柠檬酸发酵清液中提取柠檬酸。从所述柠檬酸发酵清液中提取柠檬酸的方法为本领域所公知。例如采用钙盐法、离子交换提取的方法和色谱提取的方法。

下面通过实施例对本发明进行进一步的说明，但本发明并不仅限于下述实施例。

根据GB 1987-2007标准检测以下实施例中所得柠檬酸发酵液的浓度(简称酸度)，计算柠檬酸的发酵转化率，发酵转化率(％)＝柠檬酸发酵液的浓度(简称酸度)×柠檬酸发酵液的体积/总糖的重量×100％。

以下实施例中的种子培养液、菌体残渣以及发酵罐中发酵培养基采用以下的方法得到。

1)将55吨玉米进行粉碎，得到平均粒子直径为400微米的粉碎产物。将粉碎后的产物与230m³自来水和淀粉酶(相当于每克粉碎的玉米使用25个酶活力单位的淀粉酶，诺维信公司，α-淀粉酶)混合均匀后，进入喷射器，在95℃、pH为6.0的条件下酶解100分钟后得到258m³酶解液。

2)种子培养液的制备方法：向种子罐中投入28m³步骤1)中的玉米粉酶解液后，对种子罐的种子培养基进行121℃灭菌30分钟，降温到36℃接入黑曲霉种子，接种量为每克酶解液2×10⁵个菌落形成单位，在温度36℃、通风量为0.3体积：(体积分钟)，罐压0.1MPa的条件下培养27小时得到种子培养液。

3)发酵培养基的制备方法：将步骤1)中的玉米粉酶解液向发酵罐中投入20m³，其余的210m³进行过滤后得到的200m³酶解清液，将该酶解清液投入发酵罐中后，加入37.5kg尿素。在80℃灭菌10min后降温到37℃，得到发酵培养基。

开搅拌、通风量为0.1体积：(体积·分钟)，接入上述的种子培养液(接入量：相对于每毫升发酵培养基为10⁵个菌落形成单位)，在温度为37℃，pH值为3，通气量为0.06体积：(体积·分钟)的条件下，发酵进行到第58小时，发酵培养基中的还原糖在1g/L时停止发酵，得到柠檬酸发酵液。

4)接着，在不停空气和搅拌状态下采用卧螺沉降式离心机(购于张家港市凯迪公司，以下相同)对发酵液进行固液分离，得到柠檬酸发酵清液和菌体残渣，该菌体残渣的含水量为75重量％。

实施例1

该实施例采用依次排列设置的5组发酵罐，每组发酵罐由一个种子罐构成，5组发酵罐分别编号为第一发酵罐、第二发酵罐、第三发酵罐、第四发酵罐和第五发酵罐。将种子培养液接入到第一发酵罐中开始发酵的时间记为起始时间。

搅拌下、在通风量为0.12体积：(体积分钟)下，将种子培养液(即所述第一柠檬酸发酵种子)接入到第一发酵罐中，接入量为：相对于每毫升发酵培养基中得到的发酵培养基为1.0×10⁴个菌落形成单位，在温度为35℃，初始pH值为4.3，通气量为0.08体积：(体积分钟)的条件下，进行第一发酵培养，得到发酵培养液，第一发酵培养的时间为24小时。在第一发酵培养结束后，将菌体残渣(即所述第二柠檬酸发酵种子)接入到发酵培养液中进行第二发酵培养，该菌体残渣的接入量为发酵培养基的15重量％，且该菌体残渣从固液分离开始到接入发酵罐中的时间间隔为4分钟，在温度为35℃，通气量为0.08体积：(体积分钟)的条件下进行第二发酵培养，当发酵培养基中的还原糖在1g/L时停止发酵，得到柠檬酸发酵液。发酵周期(即第一发酵培养时间+第二发酵培养时间，以下相同)、柠檬酸发酵液的发酵酸度和发酵转化率的结果如表2所示。

接着，在不停空气和搅拌状态下采用密闭式离心机对柠檬酸发酵液进行固液分离，得到柠檬酸发酵清液和菌体残渣，该菌体残渣的含水量为85重量％。

按照上述方式依次进行第二发酵罐、第三发酵罐、第四发酵罐和第五发酵罐的发酵培养，不同的是，第二发酵罐、第三发酵罐、第四发酵罐和第五发酵罐开始接入第一柠檬酸发酵种子的时间为上一发酵罐第一发酵培养结束的时间，开始接入第二柠檬酸发酵种子的时间为上一发酵罐第二发酵培养结束的时间，且第二柠檬酸发酵种子为上一发酵罐得到的菌体残渣。接入第一柠檬酸发酵种子的时间、接入第二柠檬酸发酵种子的时间以及发酵结束时间如表1所示；发酵周期、柠檬酸发酵液的发酵酸度和发酵转化率的结果如表2所示。

实施例2

采用实施例1的方法进行，不同的是：将种子培养液(即所述第一柠檬酸发酵种子)接入到第一发酵罐中的接入量为：相对于每毫升发酵培养基中得到的发酵培养基为2.5×10⁴个菌落形成单位，在第一发酵罐的第一发酵培养的时间为30小时，菌体残渣接入到第一发酵罐中的接入量为发酵培养基的重量的7.5重量％，且该菌体残渣从固液分离开始到接入发酵罐中的时间间隔为4分钟；第二发酵罐、第三发酵罐、第四发酵罐和第五发酵罐开始接入第一柠檬酸发酵种子的时间为上一发酵罐第一发酵培养结束后6小时。其中，接入第一柠檬酸发酵种子的时间、接入第二柠檬酸发酵种子的时间以及发酵结束时间如表1所示；发酵周期、柠檬酸发酵液的发酵酸度和发酵转化率的结果如表2所示。

实施例3

采用实施例1的方法进行，不同的是：菌体残渣接入到第一发酵罐中的接入量为发酵培养基的重量的13.5重量％，且该菌体残渣从固液分离开始到接入发酵罐中的时间间隔为2分钟。第二发酵罐、第三发酵罐、第四发酵罐和第五发酵罐开始接入第一柠檬酸发酵种子的时间为上一发酵罐第一发酵培养结束后6小时。接入第一柠檬酸发酵种子的时间、接入第二柠檬酸发酵种子的时间以及发酵结束时间如表1所示；发酵周期、柠檬酸发酵液的发酵酸度和发酵转化率的结果如表2所示。

对比例1

采用实施例1的方法进行，不同的是，第一发酵罐中第一柠檬酸发酵种子的接入量为10⁵个菌落形成单位，第一发酵培养的时间为60小时(此时发酵培养基中的还原糖为1g/L)，不包括接入第二柠檬酸发酵种子和第二发酵培养的步骤，且也不包括第二发酵罐、第三发酵罐、第四发酵罐和第五发酵罐的发酵培养的步骤，在第一发酵罐中，接入第一柠檬酸发酵种子的时间、以及发酵结束时间如表1所示；发酵周期、柠檬酸发酵液的发酵酸度和发酵转化率的结果如表2所示。

表1

表2

通过上述实施例1-3以及对比例1可以看出，实施例1-3中使用了经固液分离得到的菌体残渣，从而降低了发酵培养中孢子接入量，使柠檬酸的发酵成本降低；并且，由于菌体残渣能够继续发挥柠檬酸合成能力，进而还能够提高糖酸转化率和缩短发酵周期。

Claims

1.一种发酵制柠檬酸的方法，该方法包括在通入空气和搅拌的条件下，依次将第一柠檬酸发酵种子接入到依次排列的多组发酵罐中进行第一发酵培养，再依次将第二柠檬酸发酵种子接入所述多组发酵罐中进行第二发酵培养至发酵培养基中的还原糖为1-3g/L时，停止发酵培养；所述多组发酵罐中的每组包括一个或多个并联设置的发酵罐，

其特征在于，一组发酵罐中的第一柠檬酸发酵种子来自柠檬酸发酵种子培养液，第二柠檬酸发酵种子为在不停空气和搅拌状态下对柠檬酸发酵液进行固液分离得到的菌体残渣；所述第一发酵培养的时间为10-50小时。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，一组发酵罐中的第二柠檬酸发酵种子为多组发酵罐中的一组发酵罐得到的所述菌体残渣。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，一组发酵罐中的所述第二柠檬酸发酵种子为与该组发酵罐相邻的上一组发酵罐中得到的所述菌体残渣。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，将第一柠檬酸发酵种子接入到多组发酵罐中的相邻的两组发酵罐中的时间间隔为10-50小时。

5.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，以发酵罐中每毫升发酵培养基为基准，第一柠檬酸发酵种子的接种量为5×10³-5×10⁴个菌落形成单位，所述第二柠檬酸发酵种子的接入量为所述发酵培养基的5-20重量%。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第二柠檬酸发酵种子的接入量为所述发酵培养基的7.5-15重量%。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，当发酵培养基中的还原糖为1-2g/L时，停止发酵培养。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述菌体残渣中的水含量为75-85重量%。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，从固液分离开始到接入发酵罐中的时间间隔小于8分钟。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括从固液分离后得到的柠檬酸发酵清液中提取柠檬酸。