CN102292455A - 染色质结构检测 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于测定DNA修饰剂在基因组DNA中的可接近性的方法和组合物。

Description

染色质结构检测

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2008年12月2日提交的美国临时专利申请号61/119,280的优先权，该申请通过引用结合用于所有目的。

发明背景

在已知为核小体的结构中细胞中的大多数DNA包装在一组组蛋白周围。此核小体DNA可以进一步被包装进紧密压紧DNA的卷曲结构中。此紧密包装可以限制DNA接触转录因子和转录机器。以此方式包装的基因组DNA有时被称为染色质(chromatin)。

染色质分为两类，常染色质和异染色质，在常染色质中DNA疏松地包装，是可接近的并且通常但不总是有转录活性的，在异染色质中DNA是紧密包装的，不可接近的且通常但不总是转录沉默的。

控制这两种染色质状态之间转变的是表观遗传学。存在两种主要的表观遗传学事件：DNA甲基化和组蛋白修饰。这些事件影响DNA如何被包装以及DNA是否是有转录活性的或转录沉默的。

发明的简述

本发明提供了分析染色体DNA的方法，包括但不限于，确定染色体上的DNA区与DNA修饰剂的可接近性，任选地将所述可接近性与染色质结构相关联。在一些实施方案中，该方法包括：

a.同时地：

i.透化或破坏细胞的细胞膜；和

ii使所述细胞与DNA切割剂或修饰剂在一定的条件下接触，所述条件使得所述试剂切割或修饰所述细胞中的基因组DNA，其中所述基因组DNA的不同区域被所述试剂切割或修饰至不同的程度，从而产生切割的和完整的DNA区，或修饰的和未修饰的DNA区；和

b.检测至少一个完整的或未修饰的或修饰的DNA区的物理特性或量或对至少一个完整的或未修饰的或修饰的DNA区进行克隆、分离或核苷酸测序。

在一些实施方案中，该方法还包括将所述量与所述细胞中所述DNA区的染色质结构相关联。

在一些实施方案中，该方法包括检测至少第一染色体完整的或未修饰的或修饰的DNA区和第二染色体完整的或未修饰的或修饰的DNA区的物理特性或量；和比较所述第一和第二DNA区的物理特性或量。

在一些实施方案中，该方法包括定量第一染色体DNA区和第二染色体DNA区的完整拷贝数，从而评估所述第一和第二DNA区与所述DNA切割剂的相对可接近性。

在一些实施方案中，在所述接触步骤之后和检测步骤之前分离所述基因组DNA。

在一些实施方案中，所述细胞被透化并与所述DNA切割剂或修饰剂接触，同时所述细胞直接或间接地附着于人工培养表面。

在一些实施方案中，所述透化步骤包括使所述细胞与透化细胞膜的试剂接触。在一些实施方案中，透化细胞膜的所述试剂是溶血脂质(lysolipid)。在一些实施方案中，所述溶血脂质是溶血卵磷脂。

在一些实施方案中，所述透化或破坏步骤包括用非离子型洗涤剂破坏细胞膜。在一些实施方案中，所述非离子型洗涤剂选自由NP40、Tween20和Triton X-100组成的组。

在一些实施方案中，所述细胞与DNA切割剂接触，且所述DNA切割剂是酶。

在一些实施方案中，所述细胞与DNA修饰剂接触，且所述DNA修饰剂选自由甲基转移酶和修饰DNA的化学制剂组成的组。在一些实施方案中，所述DNA切割剂是DNA切割酶；所述基因组DNA中的修饰是切割位点；并且所述检测步骤包括定量切割后DNA区的完整拷贝的量。在一些实施方案中，所述检测步骤包括定量扩增。在一些实施方案中，定量扩增选自由定量聚合酶链反应(任选地实时的)和定量连接介导聚合酶链反应(任选地实时的)组成的组。

在一些实施方案中，所述DNA切割剂选自DNase和限制酶组成的组。在一些实施方案中，所述DNA修饰剂是甲基转移酶；所述修饰是不会被所述细胞的天然甲基化酶甲基化的核苷酸序列中核苷酸上的甲基；并且所述检测步骤包括检测所述修饰存在与否的方法。在一些实施方案中，所述甲基转移酶是DAM甲基转移酶并且所述定量步骤包括用限制酶切割所述修饰的DNA，所述限制酶识别被DAM甲基转移酶甲基化的DNA序列。在一些实施方案中，所述甲基转移酶将甲基结构部分添加至DNA中的胞嘧啶，并且所述检测步骤包括用甲基化特异性限制酶切割所述修饰的DNA和/或用亚硫酸氢盐处理所述修饰的DNA。

在一些实施方案中，所述DNA修饰剂是具有相对于染色质结构的空间位阻的分子，其中所述分子连接修饰DNA的化学制剂。一些实施方案中，所述修饰DNA的化学制剂选自由硫酸二甲酯和肼组成的组。

在一些实施方案中，所述检测步骤包括定量靶DNA区的至少一部分和对照DNA区的至少一部分，其中所述对照DNA区包含这样的序列，所述序列

i.在动物的基本上所有细胞中是可接近的；或

ii在动物的大多数细胞中是不可接近的；或

iii.根据细胞的类型或生长环境具有可变的可接近性。

在一些实施方案中，所述对照DNA区使用下列的每一种定量扩增：

引发所述对照DNA区的一部分扩增的引物，所述对照DNA区的一部分不包括所述DNA修饰剂的可能修饰位点；和

引发所述对照DNA区的一部分扩增的引物，所述对照DNA区的一部分确实包括所述DNA修饰剂的至少一个可能修饰位点。

在一些实施方案中，所述物理特性是DNA甲基化。

一些实施方案中，步骤a包括使所述DNA与DNA切割剂接触，并且步骤b包括使所述完整的DNA与亚硫酸氢盐接触。

在一些实施方案中，该方法还包括确定亚硫酸氢盐处理的DNA的解链温度，并且将所述解链温度与DNA甲基化的存在、不存在或程度相关联。

在一些实施方案中，步骤b包括制备下列的文库：完整DNA区；或修饰的DNA区；或未修饰的DNA区。

在一些实施方案中，步骤b包括使至少一个完整的或未修饰的或修饰的DNA区与多核苷酸文库在允许所述DNA区与所述文库的一个或多个成员杂交的条件下接触，并且检测所述DNA区与所述一个或多个成员的杂交。在一些实施方案中，所述文库组织在微阵列上。

在一些实施方案中，步骤b包括扩增至少一个完整的或未修饰的或修饰的DNA区。

在一些实施方案中，步骤b包括对至少一个完整的或未修饰的或修饰的DNA区进行核苷酸测序。

本发明还提供了用于确定染色体上的基因座与DNA修饰剂的可接近性的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包含细胞膜透化剂或破坏剂；和限制酶、DNase或其他DNA修饰剂。

在一些实施方案中，所述细胞膜透化剂或破坏剂和所述限制酶或DNase处于同一容器中的同一缓冲液中。

在一些实施方案中，所述细胞膜透化剂或破坏剂和所述限制酶或DNase处于单独的容器中。

在一些实施方案中，该试剂盒还包含亚硫酸氢盐。

在一些实施方案中，该试剂盒还包含用于扩增真核生物的基因组DNA的区的引物对。

在一些实施方案中，该试剂盒还包含：

a.引发对照DNA区的一部分扩增的引物，所述对照DNA区的一部分不包括所述DNA修饰剂的可能修饰位点；和/或

b.引发对照DNA区的一部分扩增的引物，所述对照DNA区的一部分确实包括所述DNA修饰剂的至少一个可能修饰位点。

在一些实施方案中，该试剂盒包含：

a.引发对照DNA区的一部分扩增的引物，所述对照DNA区的一部分不能接近所述修饰剂；和/或

b.引发对照DNA区的一部分扩增的引物，所述对照DNA区的一部分可接近所述修饰剂。

通过阅读本文件的其余部分，本发明的其他实施方案将是明显的。

定义

本文使用的“透化(Permeabilizing)”细胞膜是指降低细胞膜的完整性从而允许修饰剂进入细胞中。具有透化的细胞膜的细胞通常保留细胞膜使得细胞的结构仍然基本上是完整的。相反，本文使用的“破坏”细胞膜是指降低细胞膜的整合性使得细胞的结构不保持完整性。例如，使细胞膜与非离子型洗涤剂接触将去除和/或溶解细胞膜，从而允许修饰剂进入保留了至少一些染色体结构的基因组DNA中。

本文使用的“DNA修饰剂”是指以可检测到的方式改变DNA的分子。示例性的修饰包括DNA切口形成或DNA切割或将化学结构部分引入至DNA或从DNA去除化学结构部分。不导致DNA切割的DNA修饰剂包括，但不限于DNA甲基化酶。

本文使用的“DNA区”是指基因组DNA内的目的靶序列。所述DNA区可以具有任意的目的长度，所述长度可以被使用的DNA修饰剂所接近。在一些实施方案中，所述DNA区可以包括单个碱基对，但也可以是基因组DNA内的短序列节段(例如，2-100，2-500，50-500bp)或较大的节段(例如，100-10,000，100-1000，或1000-5000bp)。DNA区中DNA的量有时通过要在PCR反应中扩增的序列的量来确定。例如，标准PCR反应通常可以扩增约35-5000个碱基对。

不同“程度”的修饰是指样品间或一个或多个样品中两个或多个DNA区之间一个或多个DNA区的修饰的拷贝数不同(实际不同或相对不同)。例如，如果100拷贝的两个DNA区(为了方便起见标为“A区”和“B区”)各自存在于细胞中的染色体DNA中，则修饰至不同的程度的实例为如果10个拷贝的A区被修饰而70个拷贝的B区被修饰。

术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核酸”可互换使用，是指单体的聚合物，其可以对应于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物，或其类似物。这包括核苷酸诸如RNA和DNA，以及其修饰形式，肽核酸(PNAs)，锁核酸(LNA^TM)和类似物的聚合物。在某些应用中，核酸可以是包括多种单体类型的聚合物，例如，包括RNA和DNA亚单位两者。

核酸典型是单链的或双链的并且通常包含磷酸二酯键，尽管在一些情况下，如本文所概述的，包括这样的核酸类似物，其可以具有备选的主链，包括，例如和不限于，磷酰胺(Beaucage等(1993)Tetrahedron(四面体)49(10)：1925和本文的参考文献；Letsinger(1970)J.Org.Chem.(有机化学杂志)35：3800；Sprinzl等(1977)Eur.J.Biochem.(欧洲生物化学杂志)81：579；Letsinger等(1986)Nucl.Acids Res.(核酸研究)14：3487；Sawai等(1984)Chem.Lett.(化学快报)805；Letsinger等(1988)J.Am.Chem.Soc.(美国化学会会志)110：4470；和Pauwels等(1986)Chemica Scripta 26：1419)，硫代磷酸盐(phosphorothioate)(Mag等(1991)Nucleic Acids Res.(核酸研究)19：1437和美国专利申请号5,644,048)，二硫代磷酸盐(Briu等(1989)J.Am.Chem.Soc.(美国化学会会志)111：2321)，O-methylphophoroamidite键(Eckstein，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，(寡核苷酸和类似物：实践方法)Oxford University Press(牛沣大学出版社)(1992))，和肽核酸主链和键(Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.(美国化学会会志)114：1895；Meier等(1992)Chem.Int.Ed.Engl.(化学英文版)31：1008；Nielsen(1993)Nature(自然)365：566；和Carlsson等(1996)Nature(自然)380：207)，这些参考文献的每一篇均通过引用结合。其他类似物核酸包括带正电荷主链的那些(Denpcy等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)92：6097)；带非离子主链的那些(美国专利号5,386,023，5,637,684，5,602,240，5,216,141和4,469,863；Angew(1991)Chem.Intl.Ed.English(应用化学英文版)30：423；Letsinger等(1988)J.Am.Chem.Soc.(美国化学会会志)110：4470；Letsinger等(1994)Nucleoside & Nucleotide(核苷和核苷酸)13：1597；第2章和第3章，ASC Symposium Series 580(ASC研讨会系列580)，″Carbohydrate Modifications in Antisense Research(反义研究中的碳水化合物修饰)″，Y.S.Sanghvi和P.Dan Cook编辑；Mesmaeker等(1994)Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.(生物有机化学和医药化学通讯)4：395；Jeffs等(1994)J.Biomolecular NMR(生物分子NMR杂志)34：17；Tetrahedron Lett.(四面体通讯)37：743(1996))和带非核糖主链的那些，包括美国专利号5,235,033和5,034,506，以及第6章和第7章，ASC Symposium Series 580(ASC研讨会系列580)，CarbohydrateModifications in Antisense Research(反义研究中的碳水化合物修饰)，Y.S.Sanghvi和P.Dan Cook编辑中所述的那些，这些参考文献的每一篇均通过引用结合。包含一种或多种碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内(Jenkins等(1995)Chem.Soc.Rev.(化学会评论)169-176页，该文献通过引用结合)。几种核酸类似物也描述在例如，Rawls，C & E News(C&E新闻)6月2日，1997，35页中，该文献通过引用结合。核糖-磷酸盐主链的这些修饰可以被用来促进附加的结构部分诸如标记结构部分的添加，或用来改变这些分子在生理环境中的稳定性和半衰期。

除了天然存在的杂环碱基(它们典型地存在于核酸中)(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)以外，核酸类似物也包括具有非天然存在的杂环或其他修饰的碱基的那些，它们中的许多记载在本文中，或另外提及。具体地，许多非天然存在的碱基还记载在，例如，Seela等(1991)Helv.Chim.Acta(瑞士化学学报)74：1790，Grein等(1994)Bioorg.Med.Chem.Lett.(生物有机化学与医药化学通讯)4：971-976，和Seela等(1999)Helv.Chim.Acta(瑞士化学学报)82：1640，它们的每一篇均通过引用结合。为了进一步说明，任选地包括在核苷酸中使用的充当解链温度(Tm)修饰剂的某些碱基。

例如，这些中的一些包括7-去氮杂嘌呤(deazapurines)(例如，7-去氮杂鸟嘌呤，7-去氮杂腺嘌呤等)，吡唑并[3，4-d]嘧啶，丙炔基-dN(例如，丙炔基-dU，丙炔基-dC等)，等等。参见，例如，美国专利号5,990,303，题目为“7-去氮杂-2’-脱氧鸟苷核苷酸的合成”，该专利于1999年11月23日授权给Seela，并通过引用结合。其他代表性的杂环碱基包括，例如，次黄嘌呤，肌苷，黄嘌呤；2-氨基嘌呤，2，6-二氨基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤，次黄嘌呤，肌苷和黄嘌呤的8-氮杂衍生物；腺嘌呤，鸟嘌呤，2-氨基嘌呤，2，6-二氨基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤，次黄嘌呤，肌苷和黄嘌呤的7-去氮杂-8-氮杂衍生物；6-氮杂胞嘧啶；5-氟胞嘧啶；5-氯胞嘧啶；5-碘胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶等。

本文使用的DNA区与DNA修饰剂的“可接近性(accessibility)”是指特定的DNA修饰剂接触和修饰细胞的染色体中的特定DNA区的能力。不希望限制本发明的范围，相信包含该DNA区的特定染色质结构将影响DNA修饰剂修饰该特定DNA区的能力。例如，该DNA区可以缠绕在组蛋白周围并且可以进一步具有其他的核小体结构，所述结构防止或减少DNA修饰剂接近目的DNA区。

“II-S型限制酶”使用其本领域中的通常含义，指识别DNA中的特定识别序列，然后切割该识别序列外部的DNA分子的限制酶。示例性的II-S型限制酶包括，但不限于，MnII，FokI，和AlwI。

附图简要说明

图1图示了染色质的示意性图示。真核生物DNA可以分成两种一般状态，常染色质和异染色质，在常染色质中DNA疏松地包装，是可接近的和有转录活性的，在异染色质中DNA是紧密包装的，不可接近的和转录沉默的。表观遗传学控制这两种状态之间的转变。本文所述的测定可以评估染色质结构，表观遗传学事件的功能结果。

图2图示了测定的示意性图示。吸取培养基并且加入透化/消化缓冲液。核酸酶扩散至细胞中，进入细胞核中并消化可接近的染色质，但不消化不可接近的染色质(表示为朝向图底部的粗线)。

图3图示了示例性工作流程的示意性图示。

图4图示了一种评估当Mnl 1用作探针时生成的数据的分析方法。在每个测定中分析两个DNA样品，一个DNA样品是对照，其分离自用不含核酸酶的缓冲液处理的细胞，另一个样品分离自用缓冲液和核酸酶处理的细胞。两个样品使用总引物组和完整引物组通过实时PCR分析。(A)使用对照DNA样品数据通过从总Ct中减去完整的Ct计算ΔCt(未切割的)。(B)使用核酸酶处理的DNA样品数据通过从总Ct中减去完整的Ct计算ΔCt(切割的)。可接近的基因在MnlI位点处被切割，其具有较少的完整DNA和较大的ΔCt(切割的)，该ΔCt与消化的程度成正比并反映较大的染色质可接近性。不可接近的或“锁定的(locked-down)”DNA的量通过公式2^Λ(ΔCt(未切割的)-ΔCt(切割的))来计算。

图5是分析的靶基因的图。灰色区域代表转录的区域。指出了Mnl 1位点和TATA盒的位置。GAPDH是一种管家基因，其在大多数细胞系中表达并且预期位于可接近的染色质结构中。血红蛋白β链(HBB)在大多数细胞中是沉默的并且预期位于不可接近的染色质结构中。谷胱甘肽-s-转移酶pi(GSTP1)在前列腺癌中表观遗传地失活，其在非癌性RWPE-1前列腺细胞中表达，但在癌性LNCaP前列腺细胞中是沉默的。

图6图示了分析的靶基因和引物组的位置。使用总引物组和完整引物组分析所有基因，所述总引物组不跨越任何MnlII位点并且扩增所有DNA链，所述完整引物组跨越2-4个MnlI位点的完整引物组并仅扩增在这些位点处未被切割的DNA链。

图7提供了对使用琼脂糖凝胶电泳分析gDNA完整性的概述。Hela细胞用不含核酸酶的透化/消化缓冲液(M，MnlI；D，DNase I)，不含溶血卵磷脂的透化/消化缓冲液，或含有核酸酶和溶血卵磷脂两者的透化/消化缓冲液处理。通过琼脂糖凝胶电泳分离和分析gDNA。结果表明核酸酶和溶血卵磷脂两者对于显著的gDNA消化均是必需的。

图8图示了作为MnlI处理的Hela细胞中HBB的循环数的函数的荧光。Hela细胞如指示的那样处理。用扩增HBB基因的引物分离和分析gDNA。当使用HBB完整引物组时完全反应(+，x)的Ct值类似于对照反应。这提示在Hela细胞中HBB处于不可接近的染色质构型中。

图9图示了作为MnlI处理的Hela细胞中GAPDH的循环数的函数的荧光。Hela细胞如指示的那样处理。用扩增GAPDH基因的引物分离和分析gDNA。当使用GAPDH完整引物组时完全反应(+，x)的Ct值高于对照反应(曲线右移)。这提示在Hela细胞中GAPDH处于可接近的染色质构型中。

图10图示了作为MnlI处理的Hela细胞的循环数的函数的荧光。Hela细胞如指示的那样处理。用扩增GSTP1基因的引物分离和分析gDNA。当使用GSTP1完整引物组时完全反应(+，x)的Ct值高于对照反应(曲线右移)。这提示在Hela细胞中GSTP1处于可接近的染色质构型中。

图11以图表的形式图示了三个DNA区(HBB，GAPDH和GSTP1)的数据，输出值计算为不可接近的总DNA的百分比。

图12图示了作为MnlI处理的前列腺细胞中HBB的循环数的函数的荧光。在两种细胞系中，使用HBB完整引物组(x)的+酶反应的Ct值类似于使用HBB总引物组(o)的+酶反应。这提示在RWPE-1和LNCaP细胞中HBB处于不可接近的染色质构型中。

图13图示了作为MnlI处理的前列腺细胞中GAPDH的循环数的函数的荧光。在两种细胞系中，使用GAPDH完整引物组(x)的+酶反应的Ct值高于(曲线右移)使用GAPDH总引物组(o)的+酶反应。这提示在RWPE-1和LNCaP细胞中GAPDH处于可接近的染色质构型中。

图14图示了作为MnlI处理的前列腺细胞中GSTP1的循环数的函数的荧光。在RWPE-1细胞中，使用GSTP1完整引物组(x)的+酶反应的Ct值高于(曲线右移)使用GSTP1总引物组(o)的+酶反应。这提示在RWPE-1细胞中GSTP1处于可接近的染色质构型中。相反，在LNCaP细胞中，使用GSTP1完整引物组(x)的+酶反应的Ct值类似于使用GSTP1总引物组(o)的+酶反应。这提示在LNCaP细胞中GSTP1处于不可接近的染色质构型中。

图15图示了来自前列腺细胞的数据的概述。如材料和方法章节中所述计算不可接近的DNA的百分比。结果表明在两种细胞系中，HBB处于不可接近的染色质结构中，GAPDH处于可接近的染色质结构中。GSTP1在RWPE-1细胞中处于可接近的染色质中，并在LNCaP细胞中处于不可接近的染色质结构中。

图16图示了一种评估当DNase I用作染色质结构探针时生成的数据的分析方法。在每个测定中分析两个DNA样品，一个DNA样品是对照，其分离自用不含核酸酶的缓冲液处理的细胞，另一个样品分离自用缓冲液和核酸酶处理的细胞。两个样品使用扩增不可接近的参照基因(HBB)的引物组通过实时PCR分析。ΔCt(参照)代表不可接近的染色质的核酸酶消化程度，并且通过从与+核酸酶曲线相关的Ct中减去与无核酸酶曲线相关的Ct来计算。ΔCt(靶)代表靶染色质区的核酸酶消化程度，并且通过从与+核酸酶曲线相关的Ct减去与无核酸酶曲线相关的Ct来计算。不可接近的或“锁定的(locked-down)”DNA的量通过公式2^Λ(ΔCt(参照)-ΔCt(靶))来计算。

图17是分析的靶基因和引物组的位置的图。灰色区域代表转录的区域。带有箭头的黑色区域代表每个引物的位置和方向。

图18图示了作为DNase I处理的细胞系中HBB的循环数的函数的荧光。在所有细胞系中，+核酸酶反应(灰线)的Ct值类似于无核酸酶反应(黑线)。这提示在所有细胞系中HBB处于不可接近的染色质构型中。

图19图示了作为DNase I处理的细胞系中GAPDH的循环数的函数的荧光。在所有细胞系中，+核酸酶反应(灰线)的Ct值明显高于无核酸酶反应(黑线)的Ct值。这提示在所有细胞系中GAPDH处于可接近的染色质构型中。

图20图示了作为DNase I处理的细胞系中GSTP1的循环数的函数的荧光。我们观察到ΔCt(GSTP1)值的细胞系依赖性差异。在Hela和HCT15细胞中，ΔCt(GSTP1)很大，表明在这些细胞系中，GSTP1处于可接近的构型中。在LNCaP细胞中，ΔCt(GSTP1)很小，表明GSTP1处于不可接近的染色质中。在PC3细胞中，ΔCt(GSTP1)具有中等值，表明GSTP1处于部分可接近的染色质结构中。这些结果与在不同细胞系中检测到的GSTP1mRNA表达的水平高度一致(参见图21)。

图21图示了来自使用DNase I作为染色质结构探针的实验的数据的概述。不可接近的DNA的百分比如图16中所述进行计算。GAPDH和GSTP1RNA表达的相对水平通过qRT-PCR分析分离自不同细胞系的mRNA来计算。结果表明靶基因染色质结构与靶基因表达的水平的相关性良好。这提示所述的测定是评估对基因调控的表观遗传作用的有用工具。

详述

I.介绍

本发明允许通过透化或破坏细胞膜和修饰细胞中的基因组DNA，然后定量不同基因座中的修饰程度来分析染色质结构。特定基因座处的修饰程度反映了染色体的该部分与修饰剂的可接近性，并且因此反映了染色质的状态。

本发明的一个优点是发现了可以同时地透化和修饰细胞中的完整染色质，例如，通过使细胞与一种缓冲液接触，所述缓冲液包含透化剂和DNA修饰剂或切割剂。这允许非常快速地产生结果。此外，此方法消除了繁琐的和可能人工施加的步骤诸如细胞核的分离，等等，这些步骤在一些以前的染色质分析方法中是必需的。

II.一般方法

本发明的方法涉及同时透化细胞并使细胞与DNA修饰剂在一定的条件下接触，所述条件使得细胞中的基因组DNA与所述修饰剂具有不同的可接近性(由于染色质结构差异所导致)，然后定量DNA区中修饰的量。DNA的不同的可接近性可以反映基因组DNA的核小体结构。例如，在一些实施方案中，较易接近DNA修饰剂的DNA区有可能处于较“疏松”的染色质结构中。

在本发明中可以使用多种真核细胞。在一些实施方案中，所述细胞是动物细胞，包括但不限于，人，或非人哺乳动物细胞。非人哺乳动物细胞包括但不限于，灵长类细胞，小鼠细胞，大鼠细胞，猪细胞和牛细胞。在一些实施方案中，所述细胞是植物细胞。细胞可以是，例如，培养的原代细胞，永生化培养细胞或可以来自活组织检查或组织样品，所述样品在测定前任选地被培养和刺激以发生分裂。培养细胞在透化和/或DNA修饰步骤之前和/或期间可以处于悬液中或是粘附的。细胞可以来自动物组织、活组织检查等。例如，所述细胞可以来自肿瘤活组织检查。

本发明的方法可以包括将DNA区的可接近性与来自该相同区域的转录相关联。在一些实施方案中，进行实验以确定可接近性和基因表达之间的相关性，并且随后DNA修饰剂与特定DNA区的可接近性可以用来预测来自该DNA区的转录。在一些实施方案中，来自DNA区的转录和该区与DNA修饰剂的可接近性两者均被确定。已知有大量测量转录的方法，所述方法包括但不限于northern印迹和RT-PCR的应用。

在一些实施方案中，一个区域的DNA甲基化状态可以与DNA区与DNA修饰剂的可接近性相关联。在一些实施方案中，进行实验以确定该区域的可接近性和DNA甲基化之间的相关性，随后DNA修饰剂与特定DNA区的可接近性可以用来预测来自该DNA区的DNA甲基化。在一些实施方案中，DNA区的甲基化和该区与DNA修饰剂的可接近性两者均被确定。已知有大量测量DNA甲基化的方法，所述方法包括但不限于应用亚硫酸氢盐(例如，用于测序中和/或与甲基化敏感的限制酶结合使用(参见，例如，Eads等，Nucleic Acids Research(核酸研究)28(8)：E32(2002))和高分辨率熔解测定(HRM)(参见。例如，Wodjacz等，Nucleic AcidsResearch(核酸研究)35(6)：e41(2007))。

本发明在透化/DNA修饰后，提供了细胞基因组中第一DNA区与第二DNA区的量或其他物理特性的比较。备选地，或另外地，可以比较两种不同的细胞中第一DNA区的量或其他物理特性。例如，所述两种细胞可以代表患病的和健康的细胞或组织，不同的细胞类型，发育的不同阶段(包括但不限于干细胞或祖细胞)等。因此，通过使用本发明的方法，可以检测细胞之间染色质结构的差异和/或确定一个细胞内两个或多个DNA区(例如，基因)之间相对的染色质结构。另外，可以确定药物、化学制剂或环境刺激物对相同细胞或不同细胞中的特定区域的染色质结构的作用。

III.透化和破坏细胞

细胞膜可以以本领域中已知的任何方式被透化或破坏。如本文所解释的那样，本发明的方法包括在分离基因组DNA之前接触所述基因组DNA，因此透化或破坏细胞膜的方法将不会破坏细胞的基因组DNA的结构从而破坏核小体或染色质结构。

在一些实施方案中，细胞膜与透化或破坏细胞膜的试剂接触。溶血磷脂是示例类型的透化细胞膜的试剂。示例性的溶血磷脂包括，但不限于，溶血卵磷脂(在本领域中也称为溶血卵磷脂)或单棕榈酰磷脂酰胆碱。多种溶血磷脂也记载在，例如，WO/2003/052095中。

非离子型洗涤剂是示例类型的破坏细胞膜的试剂。示例的非离子型洗涤剂包括但不限于，NP40、Tween 20和Triton X-100。

本发明的一个优势是同时递送透化剂和DNA切割剂或DNA修饰剂。因此，在一些实施方案中，包含两种试剂的缓冲液与细胞接触。缓冲液应当适于保持两种试剂的活性，同时维持细胞染色质的结构。

备选地，可以使用电穿孔或基因枪法来透化细胞膜，使得DNA修饰剂引入至细胞中，并且因此接触基因组DNA。大量的电穿孔法是公知的，并且可以适于递送如本文所述的DNA修饰剂。示例性的电穿孔法包括但不限于，WO/2000/062855中所述的那些。基因枪法包括但不限于美国专利号5,179,022中所述的那些。

IV.DNA修饰剂

在透化后，或与透化同时(例如，在电穿孔期间或与透化剂温育期间)，引入DNA修饰剂，使得该试剂接触基因组DNA，从而在DNA中引入修饰作用。根据本发明可以使用大量的DNA修饰剂。

在一些实施方案中，在去除透化剂后，DNA修饰剂与被透化的细胞接触，任选地更换缓冲液。备选地，在一些优选的实施方案中，DNA修饰剂与基因组DNA接触，而没有一个或多个中间步骤(例如，不更换缓冲液，不洗涤细胞等)。如上所述，此后一种方法可以便于减少必需的劳力和时间的量，并且还去除了测定中潜在的误差和污染的来源。

使用的DNA修饰剂的量，以及与DNA修饰剂反应的时间将取决于使用的试剂。本领域技术人员将认识到如何根据使用的试剂来调整条件。通常，DNA修饰步骤的条件被调节为使得不达到“完全的”消化。因此，例如，在一些实施方案中，设定修饰步骤的条件使得阳性对照(即，其中修饰是可接近的并发生修饰的对照)以高水平但小于100％的水平，例如，80-95％，80-99％，85-95％，90-98％等之间的水平出现。

A.限制酶

在一些实施方案中，DNA修饰剂是限制酶。因此，在这些实施方案中，引入至基因组DNA中的修饰是序列特异的单链(例如，切口)或双链切割剂。大量的限制酶是已知的并且可以用于本发明中。

可以使用任何类型的限制酶。I型酶远离其识别序列随机地切割DNA。II型酶在靠近其识别序列或其识别序列内的限定位置处切割DNA。一些II型酶在其识别序列内切割DNA。II-S型酶切割其识别序列的外侧成一侧。第三种主要类型的II型酶，更确切地称为“IV型”，切割其识别序列的外侧。例如，识别连续序列(例如，AcuI：CTGAAG)的那些仅在一侧上切割；识别不连续序列(例如，BcgI：CGANNNNNNTGC)的那些在两侧上切割，释放包含识别序列的小片段。III型切割其识别序列的外侧，并且需要同一DNA分子内处于相反方向上的两个这样的序列以完成切割。

本发明的方法可以适于使用任何类型的限制酶或其他DNA切割酶。在一些实施方案中，该酶是相对接近地(例如，5、10或20个碱基对内)切割识别序列的一种或多种酶。这样的酶可以特别地用于测定染色质结构，因为必须是可接近的从而实现切割的DNA的跨度比识别序列本身更大，因此可能涉及较宽跨度的DNA，所述DNA不处于“紧密的”染色质结构中。序列特异的限制酶可以提供部分改善的定量结果，因为基于同一DNA区的对照可以如本文所述那样设计(例如，在实施例中)。因此，与例如用序列非特异的核酸内切酶(″DNase″)消化相比，可以更精确地确定总的和消化的拷贝数。不象DNase I，II-S型限制酶的切割可以对组蛋白与一个或多个目标DNA区的结合敏感。示例性的切割其识别序列外侧的酶包括，例如，II-S型、III型和IV型酶。II-S型限制酶包括，但不限于，MnII、FokI和AlwI。

在一些实施方案中，使用超过一种的(例如，两种、三种、四种等)限制酶。酶的组合可以包括所有均来自一种类型的酶的组合或可以是不同类型的混合物。

随后可以单独地检测和定量完整的或切割的DNA，并且可以如本文所述确定DNA区的完整和/或切割拷贝数。

在一些实施方案中，透化剂或膜破坏剂在加入限制酶之前加入。在一些实施方案中，限制酶和透化剂或破坏剂同时加入(例如，在适当的缓冲液中或与适当的缓冲液一起)。即使两种试剂开始不在同一时刻与细胞接触，仍然可以获得同时透化和与DNA修饰剂的接触，因为透化可以是一个一直进行的过程。因此，例如，在添加透化剂稍后(在透化基本完成之前)添加DNA修饰剂可以被认为“同时”透化细胞和将细胞与DNA修饰剂接触。“同时”是指在添加透化剂和修饰剂之间没有中间操作发生(包括但不限于更换缓冲液，离心等)。

在一些实施方案中，使用0.5％溶血卵磷脂(w/v)，50mM NaCl，10mMTris-HCl pH7.4，10mM MgCl2，1mM DTT，100μg/ml BSA和0-500单位/ml MnlI(或其他限制酶)。在一些实施方案中，使用0.25％溶血卵磷脂(w/v)，50mM NaCl，10mM Tris-HCl pH7.4，10mM MgCl2，1mM DTT，100μg/ml BSA和0-500单位/ml MnlI(或其他限制酶)。在一些实施方案中，使用0.75％溶血卵磷脂(w/v)，50mM NaCl，10mM Tris-HCl pH7.4，10mMMgCl2，1mM DTT，100μg/ml BSA和0-500单位/ml MnlI(或其他限制酶)。在一些实施方案中，使用1％溶血卵磷脂(w/v)，50mM NaCl，10mMTris-HCl pH7.4，10mM MgCl2，1mM DTT，100μg/ml BSA和0-800单位/ml MnlI(或其他限制酶)。

在透化和消化后，任选地停止消化并且溶解细胞，所述溶解细胞任选地通过同时地添加溶解/终止缓冲液和/或增加温度。示例性的溶解/终止缓冲液可以包含足量的螯合剂和洗涤剂以终止反应和溶解细胞。例如，在一些实施方案中，溶解/终止缓冲液包含100mM Tris-HCl pH8，100mM NaCl，100mM EDTA，5％SDS(w/v)和3mg/ml蛋白酶K。在一些实施方案中，溶解/终止缓冲液包含100mM Tris-HCl pH8，100mM NaCl，100mMEDTA，1％SDS(w/v)和3mg/ml蛋白酶K。在一些实施方案中，溶解/终止缓冲液包含200mM Tris-HCl pH8，100mM NaCl，500mM EDTA，5％SDS(w/v)和5mg/ml蛋白酶K。

B.DNase

在一些实施方案中，使用以序列非特异的方式切割或切口DNA的酶作为DNA修饰剂。因此，在一些实施方案中，DNA修饰剂是序列非特异的核酸内切酶(本文中也称为“DNase”)。

根据本发明可以使用任何序列非特异的核酸内切酶(例如，DNase I，II，III，IV，V，VI，VII中的任一种)。例如，可以使用任何DNase，包括但不限于DNase I。使用的DNase可以包括天然存在的DNase以及修饰的DNase。修饰的DNase的一个实例是TURBO DNase(Ambion)，其包括允许“高活性(hyperactivity)”和耐盐性的突变。示例性的DNase包括但不限于牛胰腺DNase I(可获自，例如，New England Biolabs)。

随后可以单独地检测和定量完整的DNA，并且可以如本文所述确定DNA区的完整和/或切割拷贝数。

在一些实施方案中，透化剂或膜破坏剂在加入DNase之前加入。在一些实施方案中，DNase和透化剂或破坏剂同时加入(例如，与适当的缓冲液一起)。在一些实施方案中，透化/消化缓冲液包含0.25％溶血卵磷脂(w/v)，10mM Tris-HCl pH7.4，2.5mM MgCl₂，0.5mM CaCl2和0-200单位/mlDNase I。在一些实施方案中，透化/消化缓冲液包含0.5％溶血卵磷脂(w/v)，10mM Tris-HCl pH7.4，2.5mM MgCl₂，0.5mM CaCl2和0-200单位/mlDNase I。在一些实施方案中，透化/消化缓冲液包含0.75％溶血卵磷脂(w/v)，10mM Tris-HCl pH7.4，2.5mM MgCl₂，0.5mM CaCl2和0-500单位/ml DNase I。在一些实施方案中，透化/消化缓冲液包含0.25％溶血卵磷脂(w/v)，10mM Tris-HCl pH7.4，2.5mM MgCl₂，0.5mM CaCl2和0-500单位/ml DNase I。透化和溶解可以例如，如上面对限制酶所述的那样被终止。

如其他地方所讨论的那样，通过监测至少两个不同的DNA区之间的切割程度来增强DNase或其他一般DNA切割剂的使用，所述一个DNA区是靶标，另一个是在任何测试条件下通常总是可接近的DNA区或通常总是不可接近的DNA区。这样的基因的实例在本文其他地方讨论，并且是已知的或可以被鉴定。例如，包括“管家”基因的DNA区通常总是可接近的。其余靶标与对照相比的相对量然后可以用来确定靶DNA区处的相对染色质结构。

C.甲基转移酶

在本发明的一些实施方案中，DNA修饰剂对DNA产生共价修饰。例如，在一些实施方案中，本发明的DNA修饰剂是甲基转移酶。

许多甲基转移酶在本领域中是已知的，并且可以在本发明中使用。在一些实施方案中，使用的甲基转移酶向DNA中的腺苷添加甲基结构部分。这样的甲基转移酶的实例包括，但不限于，DAM甲基转移酶。因为在真核细胞中腺苷是被未甲基化，因此特定DNA区中甲基化腺苷的存在表明DAM甲基转移酶(或具有类似活性的其他甲基转移酶)能够接近该DNA区。腺苷甲基化可以被检测到，例如，使用其识别序列包含甲基化腺苷的限制酶。此类酶的实例包括，但不限于，DpnI。然后可以如本文所述定量由限制酶进行的切割(例如，其中完整的DNA被扩增，但切割的DNA不被扩增，或使用LM-PCR来扩增切割的DNA但不扩增完整的DNA)。

在一些实施方案中，甲基转移酶甲基化GC序列中的胞嘧啶。此类甲基转移酶的实例包括但不限于MCviPI。参见，例如，Xu等，Nuc.Acids Res.(核酸研究)26(17)：3961-3966(1998)。因为在真核细胞中GC序列是未甲基化的，因此特定DNA区中甲基化GC序列的存在表明DNA修饰剂(即，甲基化GC序列中的胞嘧啶的甲基转移酶)能够接近该DNA区。可以使用任何数量的技术来鉴定甲基化的GC序列。在一些实施方案中，检测甲基化GC序列的方法包括亚硫酸氢盐转变。亚硫酸氢盐转变包括使DNA与足量的亚硫酸氢盐接触从而将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。甲基化胞嘧啶未被转变。因此，包含GC序列的DNA区可以与甲基化GC序列中的胞嘧啶的甲基转移酶接触，分离，然后与亚硫酸氢盐接触。如果GC序列中的C未被甲基化，则C将被转变为U(如果随后被扩增，则转变为T)，而甲基化的C将仍然为C。任何数量的方法，包括但不限于，核苷酸测序和涉及引物延伸或基于引物的扩增和/或甲基化敏感的限制酶消化的方法可以用来检测亚硫酸氢盐转变的C的存在与否(例如，MSnuPE，MSP或Methyllight，高分辨率熔解分析；焦磷酸测序，等)。参见，例如，Fraga等，Biotechniques(生物技术)33：632，634，和636-649(2002)；El-Maarri OAdv Exp Med Biol(实验医学与生物学进展)544：197-204(2003)；Laird，NatRev Cancer(自然评论：癌症)3：253-266(2003)；和Callinan，Hum Mol Genet(人类分子遗传学)15 Spec No 1：R95-101(2006)。

在一些实施方案中，甲基转移酶甲基化CG(也称为“CpG”)序列中的胞嘧啶。此类甲基转移酶的实例包括但不限于M.SssI。此类甲基转移酶的使用通常限于用于未典型地甲基化的那些DNA区。这是因为在真核细胞中CG序列被内源性地甲基化，因此除了在其中甲基化很少见的DNA区中以外，通常不可能假定CG序列被修饰剂甲基化而不是被内源性甲基转移酶甲基化。如GC序列一样，CG序列的甲基化可以通过任何数量的方法来检测，包括涉及亚硫酸氢盐转变的方法。

D.化学制剂

在一些实施方案中，DNA修饰剂包括修饰DNA的化学制剂。因为大多数修饰DNA的化学制剂与染色质相比相对较少，因此在不使用融合伴侣的条件下使用修饰DNA的化学制剂在一些情况下可能无效，因为如果不同DNA区的可接近性程度有任何差异也将是很小的。因此，在一些实施方案中，DNA修饰剂包含与修饰DNA的化学制剂连接的具有位阻的分子。具有位阻的分子可以是根据染色质结构导致DNA修饰剂的可接近性产生差别的任何蛋白或其他分子。这可以例如，如本文所述通过将结果与使用DNase或限制酶的结果相比较来测试。

在一些实施方案中，具有位阻的分子的大小为至少5，7，10或15kD。本领域技术人员将有可能发现使用多肽作为具有位阻的分子是很适宜的。可以使用不显著地干扰DNA修饰剂修饰DNA的能力的任何多肽。在一些实施方案中，所述多肽是下面进一步详述的双链的序列非特异的核酸结合结构域。

本发明的修饰DNA的化学制剂可以与具有位阻的分子直接连接或经由接头连接。多种同型和异型双功能接头是已知的，并且可以用于此目的。

示例性的修饰DNA的化学制剂包括但不限于肼(及其衍生物，例如，如Mathison等，Toxicology and Applied Pharmacology(毒理学和实用药理学)127(1)：91-98(1994)中所述)和硫酸二甲酯。在一些实施方案中，肼将甲基引入至DNA中的鸟苷或否则损坏DNA。在一些实施方案中，硫酸二甲酯甲基化鸟嘌呤或通过破坏鸟嘌呤中存在的咪唑环导致DNA中鸟嘌呤的碱基特异性切割。

检测修饰DNA的化学制剂的修饰作用将取决于发生的DNA修饰的类型。在一些实施方案中，为了检测硫酸二甲酯或肼修饰，在高温(90℃)下用哌啶处理DNA。DNA在DNA修饰的位点处断裂，并且可以以与本文所述的检测核酸酶切割的相同方式检测到该断裂。

E.改善DNA修饰剂的DNA结合结构域

在一些实施方案中，本发明的DNA修饰剂或切割剂与双链的序列非特异的核酸结合结构域(例如，DNA结合结构域)融合或以其他的方式连接。在DNA修饰剂为多肽的情况下，双链的序列非特异的核酸结合结构域可以通过重组DNA技术合成为，例如，与DNA修饰剂的蛋白融合体。双链的序列非特异的核酸结合结构域是以序列非依赖性方式结合双链核酸的蛋白或蛋白的指定区域，即，对于特定序列结合不显示明显的偏好性。在一些实施方案中，双链的核酸结合蛋白显示对双链核酸的亲和力为对单链核酸的亲和力的10倍以上。在本发明的一些实施方案中双链的核酸结合蛋白是热稳定的。此类蛋白的实例包括，但不限于，古细菌的小碱性DNA结合蛋白Sac7d和Sso7d(参见，例如，Choli等，Biochimica etBiophysica Acta(生物化学与生物物理学报)950：193-203，1988；Baumann等，Structural Biol.(结构生物学)1：808-819，1994；和Gao等，Nature Struc.Biol.(自然结构生物学)5：782-786，1998)，古细菌HMf-样蛋白(参见，例如，Starich等，J.Molec.Biol.(分子生物学杂志)255：187-203，1996；Sandman等，Gene(基因)150：207-208，1994)，和PCNA类似物(参见，例如，Cann等，J.Bacteriology(细菌学杂志)181：6591-6599，1999；Shamoo和Steitz，Cell(细胞)：99，155-166，1999；De Felice等，J.Molec.Biol.(分子生物学杂志)291，47-57，1999；和Zhang等，Biochemistry(生物化学)34：10703-10712，1995)。对于关于DNA结合结构域的其他信息还参见欧洲专利1283875B1。

Sso7d和Sac7d

Sso7d和Sac7d是分别来自极端嗜热的古细菌(hyperthermophilicarchaeabacteria)硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)和嗜硫菌(S.acidocaldarius)的小的(约7,000kd MW)，碱性染色体蛋白。这些蛋白富含赖氨酸并且具有高度的热、酸和化学制剂稳定性。它们以序列非依赖性方式结合DNA，并且当结合时，在一些条件下将DNA的T_M增加至至多40℃(McAfee等，Biochemistry(生物化学)34：10063-10077，1995)。这些蛋白和它们的同源物一般被认为在高温下参与稳定基因组DNA。

HMF-样蛋白

HMf-样蛋白是古细菌的组蛋白，其在氨基酸序列和在结构方面均与真核生物H4组蛋白共享同源性，真核生物H4组蛋白被认为与DNA直接相互作用。HMf蛋白家族在溶液中形成稳定的二聚体，并且已经从热稳定的物种(例如，炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)和焦球菌属(Pyrococcus)菌株GB-3a)中鉴定了几种HMf同源物。HMf蛋白家族一旦与Taq DNA聚合酶或任何具有低的固有持续合成能力(intrinsic processivity)的DNA修饰酶结合，就可以增强该酶沿DNA底物滑动的能力，并且因此增加其持续合成能力。例如，二聚体HMf-样蛋白可以与Taq DNA聚合酶的N末端共价连接，例如，通过化学修饰，并且因此改善了聚合酶的持续合成能力。

本领域技术人员将认识到其他双链的序列非特异的核酸结合结构域在本领域中是已知的并且也可以如本文所述的那样使用。

F.在DNA修饰步骤后分离DNA

在一些实施方案中，在DNA修饰/切割步骤后，根据可利用的任何方法将基因组DNA从细胞中分离。可以使用基本上任何DNA纯化方法只要其产生了可接受纯度的DNA用于随后的定量步骤。例如，可以使用标准的细胞溶解试剂来溶解细胞。任选地可以使用蛋白酶(包括但不限于蛋白酶K)。如本领域中已知的那样，DNA可以从混合物中分离。在一些实施方案中，使用苯酚/氯仿萃取，并且DNA可以随后被沉淀(例如，通过乙醇)和纯化。在一些实施方案中，如果需要，去除或降解RNA(例如，使用RNA酶或使用DNA纯化柱)。

任选地，扩增基因组DNA或否则从细胞溶胞产物中直接检测基因组DNA，无需中间的纯化步骤。

在一些实施方案中，将完整的、修饰的或未修饰的DNA分离并克隆至文库中。在一些情况下，分离和/或克隆一个或多个特异的完整的、修饰的或未修饰的序列。备选地，具有完整的、修饰的或未修饰的DNA区的样品用来制备为这些区富集的文库。在与DNA切割剂接触后完整的DNA代表了不太容易接近该试剂的DNA。同样，在与DNA修饰剂接触后未修饰的DNA代表不太容易接近的DNA。相反，修饰的DNA代表较容易接近修饰剂的DNA。在上面的一些实施方案中，从切割的DNA中纯化(例如，分离)完整的DNA和/或在克隆前从未修饰的DNA中纯化修饰的DNA，从而为一类DNA富集克隆池。对修饰的/未修饰的DNA的富集将根据修饰作用的性质而变化。在一些实施方案中，与修饰的(或未修饰的DNA)特异性结合的亲合试剂用来从未修饰的DNA中分离修饰的DNA。

在一些实施方案中，产生差减文库(subtractive libraries)。例如，可以产生对患病细胞DNA区富集的文库，在本发明的方法中所述DNA区是完整的、修饰的或未修饰的，随后该文库用来自健康细胞的相应文库差减，从而产生差异DNA序列的文库，所述DNA序列均是完整的、修饰的或未修饰的，并且对于特定疾病是特异的。可以使用任何患病细胞，包括但不限于，癌细胞。也可以采用可选的差减策略，例如，在不同的细胞类型之间，细胞期，治疗期间，等等。

G.检测DNA的物理特性

在使细胞与DNA修饰剂或DNA切割剂接触后可以检测DNA的任何数量的物理特性。物理特性包括，但不限于，DNA甲基化，解链温度，GC含量，核苷酸序列和与多核苷酸杂交的能力。多种方法已知用于检测此类特性，并且可以采用。在一些实施方案中，在DNA修饰/切割步骤后，确定的物理特性不包括确定DNA足迹(例如，一种或多种特定蛋白对DNA的特定区域的能力)。例如，在非限制性的实施中，完整DNA的定量，例如，使用qPCR，不包括DNA足迹。

在一些实施方案中，所述物理特性是DNA甲基化。例如，一旦相对可接近的DNA被DNA切割剂切割，则可以分离其余的完整DNA(代表不太容易接近的DNA)，然后可以分析甲基化状态。大量DNA甲基化检测方法是已知的。在一些实施方案中，在与DNA修饰剂或切割剂接触后，DNA与亚硫酸氢盐接触，从而将DNA中未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。然后可以通过任何数量的甲基化检测方法，包括本文中讨论的那些确定特定DNA区的甲基化。在一些实施方案中，采用高分辨率熔解测定(HR)来检测亚硫酸氢盐转变后的甲基化状态。在此方法中，在亚硫酸氢盐转变后扩增DNA区，并测定得到的扩增子的解链温度。因为解链温度根据胞嘧啶是否被亚硫酸氢盐转变(并且随后在扩增反应中被拷贝为“T”)而不同，因此扩增子的解链温度可与甲基化含量相关。

V.靶DNA区

DNA区是基因组DNA内的目的靶序列。可以如本文所述评价细胞的基因组DNA中的任何DNA序列的DNA修饰剂可接近性。可以筛选DNA区以鉴定目的DNA区，所述目的DNA区例如在不同的细胞类型中，在未处理的细胞和暴露于药物、化学制剂或环境刺激物的细胞之间，或正常和患病组织之间展示不同的可接近性。因此，在一些实施方案中，本发明的方法用来鉴定DNA区，所述DNA区的可接近性变化用作疾病的标志物(或缺少该变化)。示例性的疾病包括但不限于癌症。已经描述了大量基因，与非癌细胞相比，它们在癌细胞中改变DNA甲基化和/或染色质结构。

在一些实施方案中，所述DNA区已知根据特定细胞的疾病或发育状态而具有不同的可接近性。在这些实施方案中，本发明的方法可以用作诊断或预后工具。一旦使用本发明的方法确定了诊断或预后，则可以确定治疗方案或考虑该诊断或预后而改变现有的治疗方案。例如，根据本发明的方法检测癌细胞可以导致向检测到癌细胞的个体施用化疗剂和/或放射线。

为了研究目的和/或作为对照DNA区可以检测许多DNA区从而确认试剂正如期望的那样发生作用。例如，在一些实施方案中，测定DNA区，该DNA区在动物的基本上所有细胞中均是可接近的。这样的DNA区，例如，可用作可接近性的阳性对照。这样的DNA区可以见于，例如，为组成性的或几乎组成性的基因内或邻近该基因。这样的基因包括通常被称作“管家”基因的那些，即，其表达对于维持基本细胞功能是必需的基因。这样的基因的实例包括，但不限于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和β肌动蛋白(ACTB)。DNA区可以包括此类基因的全部或一部分，任选地包括启动子的至少一部分。

在一些实施方案中，DNA区包含在动物的大多数细胞中是不可接近的DNA的至少一部分。这样的DNA区例如，可用作可接近性的阴性对照。在此背景中“不可接近的”是指这样的DNA区，该DNA区的拷贝中的不超过约20％的拷贝被修饰。此类基因序列的实例包括通常被认为是“异染色质”的那些，并且包括仅在非常特殊的细胞类型中表达的基因(例如，以组织或器官特异性方式表达)。通常不可接近的示例性基因(除了特殊细胞类型外)包括，但不限于，血红蛋白-β链(HBB)和免疫球蛋白轻链κ(IGK)。

在一些实施方案中，DNA区这样的基因序列，其根据细胞的疾病状态具有不同的可接近性，或否则根据细胞的类型或生长环境具有可变的可接近性。例如，一些基因通常在非癌细胞中是不可接近的，但在癌细胞中是可接近的。具有可变的可接近性的基因的实例包括，例如，谷胱甘肽-s-转移酶pi(GSTP1)。

在一些实施方案中，本发明的DNA区选自来自下列基因中的一种或多种的基因序列(例如，启动子序列)：1型钙粘蛋白(cadherin)1(E-钙粘蛋白)，细胞色素P450-1A1(CYP1A1)，Ras相关结构域家族1A(RASSF1A)，p15，p16，死亡相关蛋白激酶1(DAPK)，结肠的腺瘤性息肉(APC)，甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)，乳腺癌1基因(BRCA1)和hMLH。

在一些实施方案中，随机地选择DNA区，例如，以鉴定在不同的细胞类型、不同的条件、正常细胞相对于患病细胞，等之间具有的差别的可接近性的区域。

VI.定量靶基因座的拷贝

定量DNA修饰的方法将取决于引入至基因组DNA中的DNA修饰的类型。例如，使用设计用来产生包含目的DNA区的扩增子的扩增反应可以方便地检测到双链DNA切割事件(例如，通过限制酶或DNase引入或在修饰后引入，例如，在甲基转移酶处理后，或在如本文所述被修饰DNA的化学制剂修饰后通过甲基化敏感的或甲基化依赖的限制酶引入)。在确定的位点处发生切割事件的情况下，诸如当使用序列特异的限制酶时，设计产生跨越潜在切割位点的扩增子的引物。仅完整的DNA会被扩增。如果还知道总DNA的量，则可以将总DNA和完整DNA之间的差值计算为切割的DNA的量。可以根据本领域中已知的任何DNA定量方法来确定DNA的总量。在一些实施方案中，可以通过设计一组引物来方便地确定总DNA的量，所述引物扩增DNA无论其是否存在修饰。这可以例如，通过设计同一基因区内或另一DNA区内的不跨越潜在切割位点的引物来实现。在不确定的位点处发生切割事件的情况下，诸如当使用非序列特异性核酸酶，诸如使用DNase I时，使用不可接近的参照基因应当加入作为内部对照。

如下面所更详细地讨论的那样，定量扩增(包括，例如，实时PCR)法允许确定DNA区的完整拷贝量，并且当用多种对照使用时，可以用来确定与细胞中的总拷贝数相比完整DNA的相对量。因此可以计算出该DNA区的修饰的或未修饰的实际或相对拷贝数(例如，相对于总拷贝数或相对于第二DNA区的修饰的或未修饰的拷贝数)。

在本发明的一些实施方案中，直接测定DNA区的修饰的拷贝数。例如，也可以例如，通过检测特定的连接事件，例如仅在存在特定粘端或钝端时发生的事件来检测和定量限制酶切割。例如，包含粘端的核酸适体可以与切割的基因组DNA连接，所述粘端与由限制酶产生的粘端是互补的。然后可以检测和定量连接事件的次数(例如，通过定量扩增方法)。

在一些实施方案中，采用连接介导的PCR(LM-PCR)来定量DNA区的切割拷贝数。LM-PCR的方法在本领域中是已知的，并且最初记载在Pfeifer等，Science(科学)246：810-813(1989)中。如果需要，LM-PCR可以实时进行以获得定量结果。

定量扩增方法(例如，定量PCR或定量线性扩增)涉及扩增核酸模板，直接或间接地(例如，确定Ct值)确定扩增的DNA的量，然后基于扩增的循环次数计算初始模板的量。使用反应扩增DNA基因座是公知的(参见美国专利号4,683,195和4,683,202；PCR PROTOCOLS：A GUIDE TOMETHODS AND APPLICATIONS(PCR实验技术：方法和应用指南)(Innis等，编辑，1990))。典型地，PCR用来扩增DNA模板。然而，已经描述了可选的扩增方法并且也可以采用，只要该可选方法将完整DNA扩增至大于扩增切割的DNA的方法的程度。定量扩增的方法公开在，例如，美国专利号6,180,349；6,033,854；和5,972,602,以及在，例如，Gibson等，Genome Research(基因组研究)6：995-1001(1996)；DeGraves等，Biotechniques(生物技术)34(1)：106-10，112-5(2003)；Deiman B等，MolBiotechnol.(分子生物技术)20(2)：163-79(2002)。扩增可以“实时地”监测。

在一些实施方案中，定量扩增基于对信号(例如，探针的荧光)的监测，所述信号代表在扩增(例如，PCR)反应的循环中模板的拷贝。在PCR的初始循环中，观察到非常低的信号，因为形成的扩增子的量不支持从测定中输出可测量到的信号。在初始循环后，当形成的扩增子的量增加时，信号强度增加至可测量到的水平，并且当PCR进入非对数期时在后面的循环中达到平台期。通过信号强度相对于循环次数的作图，可以推算出从PCR反应获得可测量到的信号时的特定循环，并且用来逆算出PCR开始前靶标的量。通过此方法确定的特定循环的次数典型地称为循环阈值(Ct)。示例性方法记载在，例如，关于水解探针的Heid等Genome Methods(基因组方法)6：986-94(1996)中。

一种检测扩增产物的方法是5′-3′核酸外切酶″水解″PCR测定(也称为TaqMan^TM测定)(美国专利号5,210,015和5,487,972；Holland等，PNAS USA88：7276-7280(1991)；Lee等，Nucleic AcidsRes.(核酸研究)21：3761-3766(1993))。此测定通过扩增反应期间双标记的荧光探针(″TaqMan^TM探针)的杂交和断裂来检测特定PCR产物的积累。该荧光探针由用荧光报告染料和淬灭剂染料两者标记的寡核苷酸组成。在PCR期间，如果，并且只有如果此探针与被扩增的区段杂交，则该探针被DNA聚合酶的5′-核酸外切酶活性切割。探针的断裂产生报告染料的荧光强度增加。

另一种检测扩增产物的方法依赖于能量转移的使用，其是由Tyagi和Kramer，Nature Biotech.(自然生物技术)14：303-309(1996)描述的″灯塔探针(beacon probe)″法，该方法也是美国专利号5,119,801和5,312,728的主题。此方法采用了可以形成发夹结构的寡核苷酸杂交探针。在该杂交探针的一端上(5′或3′端)，存在给体荧光团，在另一端上为受体结构部分。在Tyagi和Kramer方法的情况下，此受体结构部分是淬灭剂，即，该受体吸收给体释放的能量，但然后其本身不发荧光。因此，当灯塔处于开放构型时，给体荧光团的荧光是可检测到的，而当灯塔处于发夹(闭合)构型时，给体荧光团的荧光被淬灭。当在PCR中使用时，与PCR产物的一条链杂交的分子灯塔探针处于开放构型，并且检测到荧光，同时未杂交的那些不会发出荧光(Tyagi和Kramer，Nature Biotechnol.(自然生物技术)14：303-306(1996))。结果，当PCR产物的量增加时荧光的量将增加，并且因此荧光量可以用作PCR继续进行的量度。本领域技术人员将认识到也可利用其他定量扩增方法。

用于进行核酸的定量扩增的多种其他技术也是已知的。例如，一些方法学采用一种或多种探针寡核苷酸，所述探针寡核苷酸被构造为当一种或多种寡核苷酸与靶核酸杂交时产生荧光变化。例如，一种此类方法包括一种双荧光团法，该方法利用荧光共振能量转移(FRET)，例如，LightCycler^TM杂交探针，其中两个寡核苷酸探针复性成扩增子。寡核苷酸被设计为以头对尾方向与荧光团杂交，所述荧光团以与有效能量转移相容的距离相隔。被构造成当与核酸结合或掺入至延伸产物中时发出信号的标记寡核苷酸的其他实例包括：Scorpions^TM探针(例如，Whitcombe等，NatureBiotechnology(自然生物技术)17：804-807，1999，和美国专利号6,326,145)，Sunrise^TM(或Amplifluor^TM)探针(例如，Nazarenko等，Nuc.Acids Res.(核酸研究)25：2516-2521，1997，和美国专利号6,117,635)，和形成二级结构的探针，所述二级结构在无淬灭剂的条件下导致信号减小并且当与靶标杂交时发出增加的信号(例如，Lux探针^TM)。

在其他实施方案中，可以使用嵌入剂，所述嵌入剂当嵌入至双链DNA中时产生信号。示例性的试剂包括SYBR GREEN^TM，SYBR GOLD^TM和EVAGREEN^TM。由于这些试剂不是模板特异的，因此假定基于模板特异的扩增产生信号。这可以通过监测作为温度的函数的信号来证实，因为模板序列的熔点通常比例如，引物-二聚体等高得多。

在一些实施方案中，DNA区的量通过对样品中的拷贝进行核苷酸测序，然后确定样品中具有相同序列的拷贝的相对数或绝对数来确定。

在一些实施方案中，根据本发明的方法定量修饰的(或未修饰的)DNA区可以通过确定该DNA区的修饰的或未修饰的拷贝与该同一区的总拷贝数相比的相对量(例如，归一化值诸如比率或百分比)来进一步改进。在一些实施方案中，一个DNA区的修饰的或未修饰的拷贝的相对量与第二个(或更多个)DNA区的修饰的或未修饰的拷贝数相比较。在一些实施方案中，当在两个或多个DNA区之间比较时，每个DNA区的修饰的或未修饰的拷贝的相对量可以首先针对该DNA区的总拷贝数归一化。备选地，在一些实施方案中，当获自同一样品时，可以假定每个DNA区的总拷贝数大致相同，并且因此，当在两个或多个DNA区之间比较时，确定每个DNA区之间修饰的或未修饰的拷贝的相对量(例如，比率或百分比)而不用首先将每个值针对总拷贝数进行归一化。

在一些实施方案中，修饰的或未修饰的拷贝的实际或相对(例如，相对于总DNA)量与对照值进行比较。对照值可以适宜地使用，例如，在想知道特定DNA区的可接近性是否超过或低于特定值的情况下。例如，在特定DNA区在正常细胞中典型地是可接近的，但在患病细胞中是不可接近的(或反之亦然)的情况下，可以简单地将修饰的或未修饰的拷贝的实际数或相对数与对照值进行比较(例如，大于或小于20％修饰的或未修饰的，大于或小于80％修饰的或未修饰的，等)。备选地，对照值可以代表关于对照DNA区的历史数据或预期数据。在这些情况下，确定对照DNA区的实际量或相对量(任选地确定多次)，得到的数据用来产生对照值，该对照值可以与对目的DNA区确定的修饰的或未修饰的拷贝的实际数或相对数进行比较。

对本文所述的方法的计算可以涉及基于计算机的计算和工具。所述工具有利地以计算机程序的形式提供，所述计算机程序可由常规设计的通用计算机系统(本文中称为“主机(host computer)”)执行。该主机可以配置以许多不同的硬件元件并且可以以许多尺寸和样式制造(例如，台式PC，膝上型计算机，平板PC，掌上电脑，服务器，工作站，大型电脑)。可以包括标准元件，诸如监视器、键盘、磁盘驱动器、CD和/或DVD驱动器等。在主机与网络连接时，所述连接可以通过任何合适的传输介质(例如，有线的、光纤的、和/或无线的介质)和任何合适的通信协议(例如，TCP/IP)来提供；主机可以包括合适的网络硬件(例如，调制解调器，以太网卡，WiFi卡)。主机可以执行多种操作系统中的任一种，包括UNIX，Linux，MicrosoftWindows，MacOS，或任何其他操作系统。

用于实现本发明的各个方面的计算机代码可以以多种语言编写，包括PERL，C，C++，Java，JavaScript，VBScript，AWK或任何其他脚本或编程语言，它们可以在主机上执行或可以被编译从而在主机上执行。代码还可以以低级语言编写或分配，所述低级语言诸如汇编语言或机器语言。

主机系统有利地提供界面，通过所述界面用户控制所述工具的操作。在本文所述的实施例中，软件工具作为脚本来实现(例如，使用PERL)，其执行可以由用户从操作系统诸如Linux或UNIX的标准命令行界面来启动。本领域技术人员将理解命令可以根据需要被改编以适应操作系统。在其他实施方案中，可以提供图形用户界，该界面允许用户使用点击设备控制操作。因此，本发明不限于任何特殊的用户界面。

加入了本发明的各种特征的脚本或程序可以编码在多种计算机可读介质上用于保存和/或传输。合适的介质的实例包括磁盘或磁带，光存储介质诸如光盘(CD)或DVD(多功能数码光盘)，快闪存储器，和适于通过符合多种协议的有线、光纤和/或无线网络包括互联网(Internet)传输的载波信号。

VII.反应混合物

本发明还提供了包含本文所述的一种或多种试剂的反应混合物，任选地含有真核细胞(其染色质状态待确定)。在一些实施方案中，该反应混合物包含，例如，DNA修饰剂(例如，限制酶，DNase，甲基转移酶或修饰DNA的化学制剂)和细胞透化剂和/或细胞破坏剂和真核细胞。本文所述的其他试剂(包括但不限于亚硫酸氢盐)也可以包含在本发明的反应混合物中。

VIII.试剂盒

本发明还提供了用于进行本发明的可接近性测定的试剂盒。试剂盒可以任选地包括书面说明书或电子说明书(例如，在CD-ROM或DVD上)。本发明的试剂盒可以包括，例如，DNA修饰剂和细胞透化剂和/或细胞破坏剂。DNA修饰剂可以包括本文详述的那些，包括，例如，限制酶，DNase，甲基转移酶或修饰DNA的化学制剂。在一些实施方案中，DNA修饰剂是II-S型限制酶，包括但不限于，MnII，FokI和AlwI。本发明的试剂盒可以在相同的瓶/容器中包含透化剂和DNA修饰剂(并且因此在相同的缓冲液中)。备选地，透化剂和DNA修饰剂可以处于单独的瓶/容器中。

本发明的试剂盒还可以包含一种或多种对照细胞和/或核酸。示例性的对照核酸包括，例如，包含在动物的基本上所有细胞中均是可接近的(例如，管家基因序列或其启动子)或在动物的大多数细胞中均是不可接近的基因序列的那些。在一些实施方案中，该试剂盒包括一个或多个用于扩增所述基因序列的引物组(无论该基因序列或细胞是否实际包括在试剂盒中)。例如，在一些实施方案中，该试剂盒包括DNA修饰剂，和细胞透化剂和/或细胞破坏剂，和一个或多个用于扩增对照DNA区的引物组，和任选地一个或多个用于扩增第二个DNA区(例如，靶DNA区)的引物组。在其中DNA修饰剂是限制酶的实施方案中，每个DNA区可以包括至少两个引物组：一个引物组用于扩增DNA区的一部分，所述部分包括限制酶的至少一个(例如，1个，2个，3个，4个等)潜在切割位点(例如，可用于计算未修饰的拷贝数)，和至少第二引物组用于扩增DNA区的一部分，所述部分不包含任何潜在切割位点(例如，可用于计算总拷贝数)。

在一些实施方案中，本发明的试剂盒包括下面各项中的一个或多个：

(i)细胞膜透化剂或破坏剂；

(ii)限制酶，DNase，或其他DNA修饰剂；

(iii)能够防止修饰剂进一步修饰的“终止”溶液；

(iv)用于提取和/或纯化核酸的材料(例如，用于纯化基因组DNA的离心柱(spin column)和/或去除非DNA成分诸如“终止”溶液的成分)；

(vi)用于PCR/qPCR扩增DNA的试剂，任选地包含模板和/或聚合酶以外的PCR或qPCR所必需的所有成分的一种混合物；

(vii)用于PCR/qPCR扩增特定靶基因的引物组。

实施例

提供下面的实施例以说明，但不限于要求保护的本发明。

实施例1：一般方法

本测定利用了DNA修饰剂对细胞中染色质的不同部分的可接近性差异。如图2中所示，DNA修饰剂可以比其他部分更容易地接近染色质的某些部分。图3图示了该测定的示例性工作流程。粘附细胞生长在24孔板中作为起始材料。在此实施方案中，对于每个实验使用两个孔：一个孔用不含核酸酶的透化缓冲液处理；另一孔用含有核酸酶的透化缓冲液处理。整个过程，从细胞至实时PCR，需要约3个小时，并且在收获细胞的当天就可得到结果。

图4图示了当MnlI用作染色质结构探针时分析分离自细胞的DNA的示意图。在此情况下该测定使用“无核酸酶”对照平行地进行。两个引物组用于每个基因。一个引物组不跨越任何MnlI消化位点，而另一个引物组跨越至少一个MnlI位点。用透化试剂处理但不用核酸酶处理的细胞导致从两个引物组完全扩增(即，所有拷贝被扩增)并且因此应该具有类似的Ct值，如图4左图中所图示。ΔCt值(总Ct减去完整的Ct)反映了基于引物特性，未切割的DNA中这些引物组之间Ct值的差异。

相反，在已经用MnlI处理的细胞中，可接近的基因应该在MnlI位点处被切断。不跨越MnlI位点的引物组仍会扩增所有DNA分子(用作总拷贝数的量度)，因此Ct将反映DNA的总拷贝的量。另一引物组(跨越至少一个MnlI位点)将仅能够扩增未切割的或完整的序列。取决于消化的程度，Ct值将改变随着消化的量而成比例地移动和增加。然后ΔCt可以通过从总Ct中减去完整的Ct来计算，如果DNA是可接近的，则这将产生负数。为不可接近的MnlI位点的百分比通过图4中显示的方程来计算。

将此技术应用于不同类型的DNA区图示在图5-6中。图5显示GAPDH，HBB，和GSTP1基因的至少一部分的图示。显示了Mnl I、TATA盒、启动子区和外显子。GAPDH用作阳性对照。GAPDH是管家基因，其在大多数细胞系中表达并且应当是可接近的。血红蛋白β链基因被选择为阴性对照。血红蛋白在大多数细胞中不表达，是表观遗传沉默的，并且预期处于不可接近的染色质结构中。最后分析谷胱甘肽-s-转移酶pi，或GSTP1，其在前列腺癌中是表观遗传失活的。图6显示可以被靶向用于扩增的区。对于每种基因，使用不跨越任何MnlI位点并且将扩增所有DNA链的总引物组。还使用跨越至少一个(例如，2-4个)MnlI位点并且将仅扩增在这些位点处未被切割的DNA链的“完整”引物组。

实施例2：在Hela细胞中使用MnlI的数据

此实施例显示了使用如上所概述的实验方法产生的数据的结果。

材料和方法

化学制剂.L-α-溶血磷脂酰胆碱(溶血卵磷脂)购自Sigma-Aldrich。MnlI，DNase I，BSA和蛋白酶K购自New England Biolabs。RNA酶A购自Qiagen。组织培养板购自VWR。iQ SYBR购自Bio-Rad。

细胞的处理.生长在24孔板中的细胞当达到90％汇合时被处理。吸取培养基并且将100μl透化/消化缓冲液轻轻地铺在细胞上。对于用MnlI处理的细胞，透化/消化缓冲液由溶血卵磷脂，NaCl，Tris-HCl，MgCl₂，DTT，BSA和MnlI组成。对于用DNase I处理的细胞，透化/消化缓冲液由溶血卵磷脂，Tris-HCl，MgCl₂，CaCl2和DNase I组成。然后透化的细胞在37℃下孵育1小时。孵育后，25μl溶解/终止溶液(100mM Tris-HCl pH7.4，100mM NaCl，100mM EDTA，5％N-月桂酰肌苷酸(w/v)，80μg/ml RNA酶A和3mg/ml蛋白酶K)加入至透化/消化缓冲液中，并且细胞溶胞产物在37℃下孵育10分钟。

DNA的分离.收集细胞溶胞产物，并且使用市售的核酸纯化试剂盒(Aurum，Bio-Rad)遵照标准方法分离DNA。DNA以100μl洗脱，并且使用NanoDrop 1000分光光度计(Thermo Scientific)测定DNA的浓度。然后将样品稀释至1-10ng DNA/μl的浓度。

分析的基因.我们分析了三个人类基因的启动子区：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，血红蛋白，β(HBB)和谷胱甘肽-s-转移酶π(GSTP1)。GAPDH是一种管家基因；其在大多数细胞中表达并且预期具有可接近的染色质结构。HBB在大多数细胞中不表达，并且预期具有不可接近的染色质结构。GSTP1在前列腺癌中是表观遗传失活的。在非癌性前列腺细胞系RWPE-1中，GSTP1处于可接近的染色质结构中并且被表达，在癌性前列腺细胞系LNCaP中，GSTP1处于不可接近的染色质结构中并且不表达(Okino，S.T.等，Chromatin changes on the GSTPI promoter associated with itsmactivation in prostate cancer(GSTP1启动子上的染色质改变与其在前列腺癌中的失活有关).Mol Carcinog(分子癌症发生)，2007.46(10)：p.839-46)。GSTP1mRNA在Hela和HCT15细胞系中高度表达；在PC3细胞系中，GSTP1mRNA表达的水平大约为Hela和HCT15细胞中发现的水平的一半。

实时PCR.分离自用MnlI处理的细胞的DNA样品使用每种引物组在装有Chromo4连续荧光检测器(MJ Research)的PTC-200热循环仪中分析。每个反应的体积为20μl，并且包含50ng DNA，500nM每种引物和10μl iQSYBR green supermix (Bio-Rad)。PCR条件为96℃ 10分钟；96℃ 30秒和68℃ 1分钟进行40个循环；在72℃下5分钟；在每个步骤中从72℃至98℃的熔解曲线以0.2℃的间隔保持5秒。分离自用DNase I处理的细胞的DNA样品在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)中分析。每个反应的体积为20μl并且包含5ng DNA，500nM每种引物和10μl含有ROX的iTaq Fast SYBR green supermix(Bio-Rad)。PCR条件为95℃ 5分钟；95℃ 30秒和72℃ 1分钟进行40个循环；72℃下5分钟；在每个步骤中从72℃至95℃的熔解曲线以0.2℃的间隔保持5秒。

数据分析.为了使用MnlI作为核酸酶探针确定不可接近的染色质的水平，我们进行了下列的计算。当分析分离自用缺少MnlI的消化/透化缓冲液处理的细胞的DNA时，ΔCt(未切割的)计算为(完整的Ct-总Ct)。当分析分离自用MnlI处理的细胞的DNA时，ΔCt(切割的)计算为(完整的Ct-总Ct)。不可接近的染色质的水平计算为2^Λ(ΔCt(未切割的)-ΔCt(切割的))(参见图4)。

对于GAPDH和GSTP1为了使用DNase I确定不可接近的染色质的水平，我们不能使用分析MnlI时使用的相同计算，因为DNase I在可接近的染色质中的总扩增区和完整扩增区内均进行切割。我们发现HBB启动子高度耐受DNase I消化，我们使用HBB ΔCt作为内参照标准，其反映了不可接近的染色质的低水平消化(图示在图16中)。ΔCt(参照)计算为(HBB+核酸酶Ct-HBB无核酸酶Ct)。ΔCt(靶)计算为GAPDH/GSTP1+核酸酶Ct-GAPDH/GSTP1无核酸酶Ct。GAPDH或GSTP1靶基因的不可接近的染色质的水平计算为2^Λ(ΔCt(参照)-ΔCt(靶))。

结果

Hela细胞在下面任一种中孵育：无核酸酶的消化缓冲液，缺少溶血卵磷脂(细胞透化试剂)和核酸酶的消化缓冲液，或含有溶血卵磷脂和核酸酶的完全消化缓冲液(MnlI[M]或DNase I[D])。

然后基因组DNA(gDNA)从细胞中分离并且进行琼脂糖凝胶电泳(参见图7)。数据表明溶血卵磷脂和核酸酶是消化gDNA必不可少的。在缺少溶血卵磷脂或核酸酶中任一种的反应中仅检测到轻微的gDNA消化。这表明在被溶血卵磷脂透化的细胞中，内源性核酸酶对染色质的消化不明显，并且在缺少溶血卵磷脂的条件下消化缓冲液中存在的核酸酶不进入细胞中。

随后，分离自MnlI处理的细胞的DNA样品使用图6中所示的引物组通过实时PCR分析。如图8中所示，阴性对照反应分析血红蛋白β链基因(其在Hela细胞中是沉默的)。对于总引物组和完整引物组两者，Ct值是大致相同的。这表明在Hela细胞中此基因区处于不可接近的染色质结构中。

图9显示了阳性对照GAPDH的结果。GAPDH的Ct值与阴性对照中对HBB获得的Ct值大致是相同的，但使用“完整”引物组的扩增右移，表明与“总”DNA相比不太完整。这意味着MnlI接近GAPDH启动子中的其识别位点并在该处消化。因此，我们推断在Hela细胞中GAPDH启动子处于可接近的染色质中。

图10显示了分析GST pi的结果。GST pi在前列腺癌中是失活的并且在Hela细胞中表达。在完整引物组反应中完全反应的Ct值右移，但在总引物组反应中不右移。这表明在Hela细胞中GST pi处于可接近的染色质结构中。

图11在表中总结了上述数据。计算的值是与通过“总”引物组确定的总拷贝数相比完整的拷贝的百分比(并且因此对核酸酶是不可接近的)。

实施例3：在前列腺癌细胞中使用MnlI的数据

上述的方法也应用于不同的细胞类型以确定可接近性是否与GSTP1的表达相关。使用两个细胞类型：

RWPE-1细胞，其来自非癌性人前列腺并且高度表达GSTP1；和LNCaP细胞，其来自人前列腺癌并且其中GSTP1被表观遗传修饰沉默。

分析这些细胞的方法基本上如上所述。图12显示了对照反应(即，针对血红蛋白基因)。在两个细胞系中，无酶样品中的ΔCt与有酶样品的ΔCt大致相同。因此ΔCt大约为0，表明在两个细胞系中此基因是不可接近的。

图13显示分析GAPDH基因的阳性对照反应的结果。对于无酶的反应，总Ct和完整Ct两种大致是相同的。然而，对于有酶的反应，完整Ct右移，表明存在较少完整的DNA，因此GAPDH基因处于可接近的染色质结构中。

图14显示来自分析GST pi基因的数据。在非癌RWPE-1细胞系中，在酶的存在下完整Ct右移。相反，在癌性LNCaP细胞系中，完整Ct没有改变至可察觉的程度。这表明在RWPE-1细胞中GSTP1处于可接近的染色质中，在LNCaP细胞中处于不可接近的染色质中。

这些实验重复4次。结果的总结显示在图15中，其再次使用不可接近(或“锁住”)的拷贝的百分比计算。

实施例4：使用DNase I的数据

本实施例显示使用下述方法获得的数据，其中DNase I而非MnlI是核酸酶。在此实施例中，我们分析4种人癌细胞系：Hela(宫颈癌)，PC3(前列腺癌)，LNCaP(前列腺癌)和HCT 15(结肠癌)。我们还分析在MnlI实施例中分析的相同基因：HBB，GAPDH和GSTP1。

因为DNase I不在限定位点处消化DNA，因此我们不能使用当MnlI为染色质结构探针时使用的相同数据分析策略。代之我们利用了表观遗传沉默的参照基因(HBB)作为内部对照，其反映了不可接近的染色质的消化程度。使用此策略，可以如图16中所详述确定特定靶基因的染色质结构。图17是分析的基因和用来评估染色质结构的引物的位置的示意性图示。

如图18中所示，在所有细胞系中DNase I均未将HBB消化至可察觉的程度(无合成酶和+核酸酶曲线几乎重叠)。此结果表明在所有细胞系中HBB处于不可接近的染色质构型中，并且验证了其作为参照基因对照的应用。这些结果也是预期的，因为HBB mRNA在这些细胞系的任一个中均不表达(未显示的数据)。

我们对GAPDH基因的分析显示在图19中。在所有细胞系中，我们观察到+核酸酶曲线相对于无核酸酶曲线显著右移。这提示在所有细胞系中GAPDH处于可接近的染色质结构中。这些结果是预期的，因为GAPDH是“管家”基因，其在大多数细胞系(如果不在所有细胞系中表达的话)中表达(未显示的数据)。

GSTP1mRNA以不同的水平在分析的细胞系中表达。Hela和HCT 15细胞表达大量的GSTP1mRNA，PC3细胞表达中等量(约为Hela和HCT 15细胞中发现的一半)，LNCaP细胞不以可察觉的程度表达GSTP 1mRNA(未显示的数据)。我们对GSTP1染色质结构的分析显示在图20中。在Hela和HCT 15细胞中，我们观察到+核酸酶曲线相对于无核酸酶曲线显著右移，提示GSTP1处于可接近的染色质结构中。在PC3细胞中，我们观察到+核酸酶曲线相对于无核酸酶曲线中等程度右移，提示GSTP1处于部分可接近的染色质结构中。最后，在LNCaP细胞中，我们观察到+核酸酶曲线和无核酸酶曲线几乎重叠。这提示在LNCaP细胞中，GSTP1处于不可接近的染色质构型中。很显然，我们在分析的所有细胞系中观察到了GSTP1染色质结构和GSTP1mRNA表达之间的良好相关性。

图21显示了结果的总结。如图16中所述计算不可接近的DNA的百分比，并且显示为“锁住的”染色质。通过标准方法通过qRT-PCR分析分离自不同细胞系的mRNA来计算GAPDH和GSTP1RNA表达的相对水平。结果表明靶基因染色质结构与靶基因表达水平的相关性良好。这提示所述的测定代表了一种用来评估对基因表达的表观遗传作用的有用工具。

总结

我们已经开发了一种快速的和灵敏的测定，该测定可以评估培养细胞中的染色质结构。我们的测定提供了几个优于其他染色质结构测定的优势(Okino，ST.等，Mol Carcinog(分子癌症发生)46(10)：839-46(2007)；Okino，S.T.和J.P.Whitlock，Jr.，Mol Cell Biol(分子细胞生物学)15(7)：p.3714-21(1995)；Rao，S.，E.Procko，和M.F.Shannon，J Immunol(免疫学杂志)167(8)：4494-503(2001)；Kilgore，J.A.等，Methods(方法)41(3)：320-32(2007))。最显著地，在我们的方法中，我们在一个步骤中原位消化了透化的细胞中的染色质。其他方法需要分离细胞核，这需要较多的劳力、较多的时间和较多的细胞作为起始材料。另外，我们的引物组设计得到了对染色质可接近性的更准确的和内部控制的评估。

实施例5：评估DNA甲基化的变型

本发明的另一应用是确定不可接近的染色质区的DNA甲基化状态。DNA甲基化是指在5-位处胞嘧啶的天然甲基化，产生5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化参与调节基因活性和染色质结构；DNA甲基化的异常谱型与人类病理学和特定疾病状态有关。在此变型中，遵照以前所述的方法，但不包括PCR扩增的步骤。然后使用标准方法通过亚硫酸氢盐修饰纯化的基因组DNA，使得未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，并且5-甲基胞嘧啶没有变化。然后靶向特定DNA区的引物组用来扩增从已经用核酸酶处理的细胞纯化的亚硫酸氢盐-修饰的DNA。因此，仅最初处于不可接近的染色质构型并且因此不被DNA修饰剂切割的DNA可以被扩增。然后通过标准方法诸如熔解曲线分析、高分辨率熔解分析、亚硫酸氢盐-DNA测序、数字PCR、甲基化特异的PCR、焦磷酸测序等对扩增的DNA分析DNA甲基化。这样的分析可以确定不可接近的染色质区的DNA甲基化状态，并且可以提供关于与表观遗传基因失活相关的DNA甲基化的特定谱型的有价值信息。

要理解本文所述的实施例和实施方案仅用于说明的目的，并且提议本领域技术人员据此作出多种修改或变化，并且这些修改或变化包括在本申请的精神和界限以及附带的权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容通过引用合并于此用于所有目的。

Claims (39)

1.一种用于分析染色体DNA的方法，该方法包括：

a.同时地：

i.透化或破坏细胞的细胞膜；和

ii使所述细胞与DNA切割剂或修饰剂在所述试剂切割或修饰所述细胞中基因组DNA的条件下接触，其中所述基因组DNA不同的区被所述试剂切割或修饰至不同的程度，从而产生切割的和完整的DNA区，或修饰的和未修饰的DNA区；和

b.检测至少一个完整的或未修饰的或修饰的DNA区的量或对至少一个完整的或未修饰的或修饰的DNA区进行克隆、分离或核苷酸测序。

2.权利要求1所述的方法，包括将所述至少一个完整的或未修饰的或修饰的DNA区的量与所述细胞中所述DNA区的染色质结构相关联。

3.权利要求1所述的方法，包括

检测至少第一染色体完整的或未修饰的或修饰的DNA区和第二染色体完整的或未修饰的或修饰的DNA区的量；和

比较所述第一和第二DNA区的量。

4.权利要求1所述的方法，包括定量第一染色体DNA区和第二染色体DNA区的完整拷贝数，从而评估所述第一和第二DNA区与所述DNA切割剂的相对可接近性。

5.权利要求1所述的方法，其中在所述接触步骤之后和所述检测步骤之前分离所述基因组DNA。

6.权利要求1所述的方法，其中在所述细胞直接或间接地附着于人工培养表面时，所述细胞被透化并与所述DNA切割剂或修饰剂接触。

7.权利要求1所述的方法，其中所述透化步骤包括使所述细胞与透化细胞膜的试剂接触。

8.权利要求7所述的方法，其中所述透化细胞膜的试剂是溶血脂质。

9.权利要求8所述的方法，其中所述溶血脂质是溶血卵磷脂。

10.权利要求1所述的方法，其中所述透化或破坏步骤包括用非离子型洗涤剂破坏细胞膜。

11.权利要求10所述的方法，其中所述非离子型洗涤剂选自NP40、Tween20和Triton X-100的组。

12.权利要求1所述的方法，其中所述细胞与DNA切割剂接触，且所述DNA切割剂是酶。

13.权利要求1所述的方法，其中所述细胞与DNA修饰剂接触，且所述DNA修饰剂选自由甲基转移酶和修饰DNA的化学制剂组成的组。

14.权利要求12所述的方法，其中

所述DNA切割剂是DNA切割酶；

所述基因组DNA中的修饰是这样的位点，在所述位点处DNA已经被切割；和

所述检测步骤包括定量切割后DNA区的完整拷贝的量。

15.权利要求14所述的方法，其中所述检测步骤包括定量扩增。

16.权利要求15所述的方法，其中定量扩增选自由定量聚合酶链反应和定量连接介导聚合酶链反应组成的组。

17.权利要求12所述的方法，其中所述DNA切割剂选自DNase和限制酶。

18.权利要求13所述的方法，其中：

所述DNA修饰剂是甲基转移酶；

所述修饰是不被所述细胞的天然甲基化酶甲基化的核苷酸序列中核苷酸上的甲基；和

所述检测步骤包括检测所述修饰存在或不存在的方法。

19.权利要求18所述的方法，其中所述甲基转移酶是DAM甲基转移酶并且所述定量步骤包括用限制酶切割所述修饰的DNA，所述限制酶识别被DAM甲基转移酶甲基化的DNA序列。

20.权利要求18所述的方法，其中所述甲基转移酶将甲基部分添加至DNA中的胞嘧啶，并且所述检测步骤包括用甲基化特异性限制酶切割所述修饰的DNA和/或用亚硫酸氢盐处理所述修饰的DNA。

21.权利要求1所述的方法，其中所述DNA修饰剂是相对于染色质结构具有空间位阻的分子，其中所述分子连接修饰DNA的化学制剂。

22.权利要求21所述的方法，其中所述修饰DNA的化学制剂选自由硫酸二甲酯和肼组成的组。

23.权利要求1所述的方法，其中

所述检测步骤包括定量靶DNA区的至少一部分和对照DNA区的至少一部分，其中所述对照DNA区包含下列序列，所述序列

i.在动物的基本上所有细胞中是可接近的；或

ii在动物的大多数细胞中是不可接近的。

24.权利要求1所述的方法，其中所述对照DNA区使用下列每一种进行定量扩增：

引发所述对照DNA区的一部分扩增的引物，所述对照DNA区的一部分不包括所述DNA修饰剂的可能修饰位点；和

引发所述对照DNA区的一部分扩增的引物，所述对照DNA区的一部分确实包括所述DNA修饰剂的至少一个可能修饰位点。

25.权利要求1所述的方法，其中确定所述DNA区的DNA甲基化。

26.权利要求25所述的方法，其中步骤a包括使所述DNA与DNA切割剂接触，并且步骤b包括使所述完整的DNA与亚硫酸氢盐接触。

27.权利要求26所述的方法，还包括确定亚硫酸氢盐处理的DNA的解链温度，并且将所述解链温度与DNA甲基化的存在、不存在或程度相关联。

28.权利要求1所述的方法，其中步骤b包括制备下列的文库：

完整DNA区；或

或修饰的DNA区；或

未修饰的DNA区。

29.权利要求1所述的方法，其中步骤b包括使至少一个完整的或未修饰的或修饰的DNA区与多核苷酸文库在允许所述DNA区与所述文库的一个或多个成员杂交的条件下接触，并且检测所述DNA区与所述一个或多个成员的杂交。

30.权利要求29所述的方法，其中所述文库组织在微阵列上。

31.权利要求1所述的方法，其中步骤b包括扩增至少一个完整的或未修饰的或修饰的DNA区。

32.权利要求1所述的方法，其中步骤b包括对至少一个完整的或未修饰的或修饰的DNA区进行核苷酸测序。

33.一种用于确定染色体上的基因座与DNA修饰剂的可接近性的试剂盒，所述试剂盒包含

细胞膜透化剂或破坏剂；

限制酶或DNase。

34.权利要求33所述的试剂盒，其中所述细胞膜透化剂或破坏剂和所述限制酶或DNase处于同一容器中的同一缓冲液中。

35.权利要求33所述的试剂盒，其中所述细胞膜透化剂或破坏剂和所述限制酶或DNase处于单独的容器中。

36.权利要求33所述的试剂盒，还包含亚硫酸氢盐。

37.权利要求33所述的试剂盒，还包含用于扩增真核生物的基因组DNA的区的引物对。

38.权利要求33所述的试剂盒，包含：

a.引发对照DNA区的一部分扩增的引物，所述对照DNA区的一部分不包括所述DNA修饰剂的可能修饰位点；和/或

b.引发对照DNA区的一部分扩增的引物，所述对照DNA区的一部分确实包括所述DNA修饰剂的至少一个可能修饰位点。

39.权利要求33所述的试剂盒，包含：

a.引发对照DNA区的一部分扩增的引物，所述对照DNA区的一部分不能接近所述修饰剂；和/或

b.引发对照DNA区的一部分扩增的引物，所述对照DNA区的一部分可接近所述修饰剂。

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