CN102286073A

CN102286073A - 一种与牙釉质表面轴向特异性结合的七肽及其应用

Info

Publication number: CN102286073A
Application number: CN2011101756421A
Authority: CN
Inventors: 周彬; 龚士强
Original assignee: Tongji Hospital Affiliated To Tongji Medical College Of Huazhong University Of Science & Technology
Current assignee: Tongji Hospital Affiliated To Tongji Medical College Of Huazhong University Of Science & Technology
Priority date: 2011-06-27
Filing date: 2011-06-27
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2031-06-27
Also published as: CN102286073B

Abstract

本发明涉及一种与牙釉质表面轴向特异性结合的七肽序列及其应用。本发明应用噬菌体表面展示技术，筛选出一种能与牙釉质表面轴向特异性结合的七肽，其氨基酸序列如下：Asn-Asn-His-Tyr-Leu-Pro-Arg。该七肽具有与与牙釉质表面轴向特异性结合的特性，并且能够促进脱矿牙釉质表面的再矿化过程。该发明提供的七肽对龋病的诊断以及龋坏牙体再矿化修复具有很高的应用前景。

Description

一种与牙釉质表面轴向特异性结合的七肽及其应用

技术领域

本发明涉及利用噬菌体表面展示技术，筛选出能与牙釉质表面轴向特异性结合的多肽，具体地说，是应用随机七肽噬菌体展示文库筛选与牙釉质表面轴向特异性结合的噬菌体，得到能促进脱矿牙釉质表面再矿化的七肽序列。

背景技术

龋病是人类最常见口腔疾病之一，其进展最终会导致牙体硬组织缺损并严重影响人们的日常生活。牙齿暴露于口腔中的唾液中，正常人体牙齿处于脱矿与再矿化的动态矿化平衡之中，二者相互依存，相互拮抗。当促进脱矿的因素加重时，即以脱矿为主，牙体中的羟基磷灰石开始溶解。从病因学以及病理学的角度出发，龋病可以理解为致病细菌(变性链球菌等)酸性代谢产物干扰下，牙体矿物质脱矿与再矿化的失衡(以脱矿为主)。

近年，随着保存齿科学的兴起，人们针对龋病的策略开始强调龋病早期诊断和再矿化治疗(龋病早期治疗)。这样可以最大程度的减少牙体组织的缺损。众所周知，有机物在矿物的形成中起着生物调控作用，该过程称为生物矿化。牙体硬组织的生物形成就是生物矿化的一个典型例子。有机物对矿物的调控具体表现为：对矿物晶体的成核，晶体生长和矿物的形态的调控。国内外学者已经证实，有机分子对羟基磷灰石等晶体的成核和晶体结构起着引导作用。如，牙釉质中的釉原蛋白，被证实可以促进牙釉质表面再矿化。但是这些有机大分子，分子结构复杂，具体应用时环境条件要求苛刻，同时蛋白的生产提纯费用昂贵。因此找出能够与无机物晶体特异性结合并能调控其矿化过程的小分子多肽具有相当的应用前景。

噬菌体表面展示技术可以筛选出能够与无机物特异性结合并且调控无机物矿化过程的小分子多肽(7-12个氨基酸序列)。学者们已经筛选出包括羟基磷灰石在内的许多无机物特异性结合的多肽。但由于这些筛选过程中由于忽略了作为筛选基底的晶体的各向异性特征，这些多肽的调控作用缺乏特异性。本研究利用随机七肽噬菌体展示文库，筛选能与牙釉质表面特异性结合的七肽，在国内外尚未报道。

发明内容

本发明的目的是应用噬菌体表面展示技术，筛选出一种能与牙釉质表面轴向特异性结合的七肽。当龋病发生牙釉质脱矿，羟基磷灰石晶体大量暴露，与牙釉质表面晶体特异性结合的多肽相应增加，该多肽若融合某些可检测分子(荧光蛋白)可作为脱矿开始的诊断工具(即龋病的早期诊断)。

本发明的另一目的是利用该多肽对脱矿牙釉质表面再矿化过程的作用，将该多肽用于龋坏牙体再矿化修复。

该发明通过以下技术方案实现：

本发明应用随机七肽噬菌体展示文库对牙釉质表面进行了4轮筛选，获得能与牙釉质表面特异性结合的重组噬菌体，从得到的重组噬菌体分离制备单克隆噬菌体，提取单克隆噬菌体单链基因组DNA，共获得了32个七肽，通过Output/Input比值比较不同单克隆噬菌体的结合能力，获得了能与牙釉质表面轴向特异性结合，结合力最高的七肽，其氨基酸序列如下：Asn-Asn-His-Tyr-Leu-Pro-Arg。实验表明该七肽对脱矿牙釉质表面再矿化具有促进作用，可用于龋坏牙体再矿化修复。

本发明的优点是：

1、本发明制备的与牙釉质表面轴向特异性结合的七肽，能与牙釉质表面特异性结合，尤其是酸蚀后的牙釉质表面，该七肽可应用于龋病的诊断。

2、本发明制备的七肽具有促进酸蚀牙釉质表面再矿的作用，可用于龋坏牙体再矿化修复。

附图说明

图1：是四轮筛选所获得的洗脱噬菌体的滴度。

图2：是单克隆噬菌体E-1至E-32对牙釉质表面的结合力。

图3：是与牙釉质表面特异性结合能力最强的七肽EHBP的氨基酸序列结构式。

图4：是EHBP与不同牙釉质表面(未酸蚀，酸蚀，纵剖面)结合时的荧光强度比较。其中

图4(A)：未酸蚀牙釉质表面未结合七肽EHBP时的荧光图；图4(B)：未酸蚀牙釉质表面结合七肽EHBP的荧光图；图4(C)：酸蚀牙釉质表面未结合七肽EHBP的荧光图；

图4(D)：酸蚀牙釉质表面结合七肽EHBP的荧光图；图4(E)：牙釉质纵剖面未结合七肽EHBP的荧光图；图4(F)：牙釉质纵剖面结合七肽EHBP的荧光图。

图5：是不同七肽对酸蚀牙釉质表面的再矿化的促进作用比较(电镜图)。其中图5(A)：酸蚀牙釉质表面未加入任何多肽再矿化16h；图5(B)：酸蚀牙釉质表面未加入任何多肽再矿化24h；图5(C)：酸蚀牙釉质表面加入随机多肽RP后再矿化16h；图5(D)：酸蚀牙釉质表面加入随机多肽RP后再矿化24h；图5(E)：酸蚀牙釉质表面加入低结合力多肽ELBP后再矿化16h；图5(F)：酸蚀牙釉质表面加入低结合力多肽ELBP后再矿化24h；图5(G)：酸蚀牙釉质表面加入高结合力多肽EHBP后再矿化16h；图5(H)：酸蚀牙釉质表面加入高结合力多肽EHBP后再矿化24h。

具体实施方式

以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。

实施例1：与牙釉质表面轴向特异性结合的重组噬菌体的筛选

1.第一轮筛选与洗脱：

1)取正畸原因拔除前磨牙，去除牙齿表面附着软组织，将前磨牙放入蒸馏水中超声清洗30分钟，经环氧乙烷消毒后备用。

2)将消毒后的前磨牙放入封阻缓冲液(0.1M NaHCO₃[pH 8.6]，5mg/ml BSA，0.02％NaN₃)，4℃过夜封阻。

3)第二天，将经过过夜封阻的前磨牙取出，放入灭菌水，4℃继续封阻1小时。

4)将牙齿悬吊于24孔板的一个孔中，用500uL TBST(TBS+0.1％[v/v]Tween-20)缓冲液快速冲洗牙齿6次。注意每次冲洗吸取TBST缓冲液后，再次加入TBST缓冲液要快，避免牙齿干燥。

5)经过6次TBST缓冲液冲洗后，去除缓冲液，立即加入10uL噬菌体原库(10¹¹pfu)(噬菌体试剂盒购自New England Biolabs公司)和490uL TBST缓冲液的混合溶液。注意控制牙齿悬吊高度，以保证液体仅浸泡牙釉质表面，不超过牙冠部分。室温下置于摇床温和摇动结合40分钟。

6)吸掉噬菌体原库和TBST混合溶液，用500uL TBST缓冲液快速冲洗牙齿10次。具体注意事项同步骤4)。

7)吸掉TBST缓冲液，加1000uL洗脱缓冲液(0.2M Glycine-HCl[pH 2.2]，1mg/ml BSA)洗脱结合的噬菌体，室温下置于摇床温和摇动10分钟。立即将洗脱噬菌体液转移至另一干净微量离心管，然后再用150uL Tris-HCl(1M，pH 9.1)中和上述洗脱噬菌体液。4℃保存直到用于噬菌体滴度测定或扩增用于下一轮筛选。

2.扩增，第二，三，四轮筛选与洗脱：

1)准备5mL LB-Tet培养基(LB培养基并加入5uL四环素贮液[四环素20mg/mL溶解于乙醇])放入15mL离心管。枪头挑取ER2378菌落一个，放入培养基，置于37℃恒温摇床，230rpm，过夜培养。

2)第二天，将ER2738细菌过夜培养物1∶100稀释于20mLLB培养基中(用250mL三角烧瓶盛装)，37℃恒温摇床，230rpm，预培养1小时。

3)加入200uL未扩增洗脱噬菌体液，37℃恒温摇床，250rpm，培养4.5小时.

4)转移培养物至50mL高速离心管，4℃，10,000rpm，离心10分钟。上清液转移至新离心管，相同条件下再次离心。

5)将上清的上部80％转移至新离心管，加入1/6体积的PEG/NaCl溶液，4℃过夜沉淀。

6)第三天，4℃，10,000rpm，离心15分钟。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。

7)沉淀物重悬于1mL TBS中，悬液转入微量离心管中，4℃，10,000rpm离心5分钟使残余细胞沉淀。

8)上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育60分钟。4℃，10,000rpm离心10分钟，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。

9)沉淀物重悬于200uL TBS中。离心1分钟，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新鲜管中。此即为扩增后的洗脱噬菌体液。4℃保存用于测定滴度和下一轮的筛选。

10)按照第一轮的方法进行第二，三，四轮筛选实验，但是TBST缓冲液的Tween浓度增至0.5％(v/v)。

3.噬菌体滴度的测定：

1)枪头挑取ER2378菌落一个，放入含5mL LB-Tet培养基的15mL离心管。置于37℃恒温摇床，230rpm，培养至对数中期(OD～0.5)。

2)微波炉融化上层琼脂，分成3mL等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。保存于45℃备用。

3)37℃预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。

4)在LB培养基中准备10倍系列稀释的噬菌体。稀释度如下：

对于扩增噬菌体液，10⁹至10¹¹稀释度；

对于洗脱噬菌体液，10³至10⁶稀释度。

5)菌体培养物分成200uL等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。

6)每管加入10uL不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育5分钟。

7)将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。

8)平板冷却5分钟，倒置平板，37℃培养过夜。

9)计数平板上噬菌斑的数目，根据稀释度计算噬菌体的浓度。

结果：经过四轮筛选，第一轮至第三轮从牙釉质表面基底洗脱下来的噬菌体总量升高，第四轮开始，洗脱噬菌体滴度未升高(图1)，说明噬菌体与牙釉质表面的结合已到最大程度。

实施例2：单克隆噬菌体的分离制备

1)根据实施例1所述，在第三轮和第四轮筛选中噬菌体与牙釉质结合已达最大程度。因此，从第三，四轮筛选所得噬菌体中分别挑取约15个单克隆。

2)将ER2738过夜培养物按1∶100稀释接种于LB培养基，分5mL到离心管中。

3)用灭菌牙签或者枪头每次挑取一个蓝色噬菌斑，转移至上述的5mL离心管中。注意，要从噬菌斑总量不满100个的平板中挑取，以保证每个被挑的噬菌斑仅含一个DNA序列。

4)37℃恒温摇床，230rpm，培养4-5小时。

5)将培养物4℃，10,000rpm，离心10分钟。

6)将上清的上部80％转移至新离心管，加入1/6体积的PEG/NaCl溶液，4℃沉淀至少1小时。

7)4℃，10,000rpm，离心15分钟。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。

8)沉淀物重悬于1mL TBS中。4℃，10,000rpm，离心5分钟，沉淀任何残余的不溶物。

9)上清转入新鲜离心管中，此即挑取的单克隆噬菌体。4℃保存800uL用于测序，余部分1∶1与甘油混合后置于-20℃长期保存。

结果：从原库随机挑取的随机单克隆噬菌体E-1，从第三轮挑取单克隆噬菌体15个(E-2至E-16)，从第四轮挑取单克隆噬菌体16个(E-17至E-32)。

实施例3：噬菌体单链基因组DNA的提取和七肽氨基酸序列的获得

1)取实施例2所得800uL扩增后的单克隆噬菌体液，加入300uL PEG/NaCl溶液，颠倒混匀，室温放置30分钟。

2)10,000rpm离心10分钟，弃上清液，短暂离心，小心吸去残留上清。

3)上步所得沉淀物重悬于100uL碘化物缓冲液中，再加入250uL无水乙醇，室温孵育10分钟。

4)10,000rpm离心10分钟，弃上清。用70％乙醇洗沉淀。

5)10,000rpm离心10分钟，弃上清，干燥。

6)沉淀重悬于30uL TE(10mM Tris-HCl[pH 8.0]，1mM EDTA)中，此即该单克隆噬菌体的单链基因组DNA。

7)以-96gIII测序引物(5’-^HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’)对上述单链DNA测序。用Align软件翻译，得到七肽氨基酸序列。

结果：从原库随机挑取的随机七肽以及第三轮(15个)和第四轮(16个)筛选到的七肽的氨基酸序列如表1所示。

表1：单克隆噬菌体E-1至E-32表达的七肽的氨基酸序列。

实施例4：所筛选的噬菌体的结合能力的鉴定

1.通过Output/Input比值比较不同单克隆噬菌体的结合能力

1)取实施例2所得扩增后的单克隆噬菌体液，测定其滴度，计算每个单克隆投入量(input)。

2)将不同单克隆噬菌体分别进行筛选试验，其步骤同实施例1，但是TBST缓冲液的Tween浓度增至0.5％(v/v)，结合时间改为30分钟，同时作为筛选基底的牙釉质表面积控制在0.5cm²。

3)将筛选得到的洗脱噬菌体液进行滴度测定，即为各个单克隆噬菌体的产出量(output)。

4)计算Output/Input比值，比较不同单克隆噬菌体的结合能力。

结果：根据不同单克隆噬菌体结合能力的比较(图2)，可以推断不同七肽序列对牙釉质表面的结合特异性，其中最高结合力七肽氨基酸序列结构式如图3所示。为方便后续的结合力鉴定以及再矿化实验，选取高结合力七肽命名为EHBP，低结合力七肽为ELBP，随机七肽肽为RP，并人工合成七肽。

2.激光共聚焦荧光显微镜(LCFM)对特定单克隆噬菌体结合能力的鉴定

1)未酸蚀，酸蚀牙釉质表面，牙冠纵剖面分别作为基底，用于LCFM检测。基底用1000目碳化硅打磨纸打磨抛光，超声清洗，环氧乙烷消毒。

2)上述基底放入封阻缓冲液4℃封阻1小时。

3)将表达有EHBP，ELBP，RP七肽的单克隆噬菌体以10¹¹pfu的浓度分别孵育在基底，4℃过夜。TBST缓冲液孵育基底作为对照组。

4)TBST缓冲液冲洗基底5分钟，重复三遍以洗去未结合的噬菌体。

5)37℃鼠来源一抗anti-M13 IgG孵育30分钟。TBST缓冲液冲洗基底5分钟，重复三遍。

6)37℃羊抗鼠二抗goat anti-mouse IgG孵育30分钟。TBST缓冲液冲洗基底5分钟，重复三遍。

7)载玻片上滴一滴甘油，基底面倒扣于载玻片上。送LCFM观察。Iamge-pro plus软件通过荧光强度计算相对荧光增强量，计算方法为(F₁-F₀)/F₀。

结果：相对荧光强度增强量由大至小分别为，酸蚀牙釉质表面＞未酸蚀牙釉质表面＞纵剖面(图4)，三者之间具有统计学意义。

实施例5：七肽对脱矿牙釉质表面再矿化过程的作用

1)取无龋坏正畸前磨牙冠，利用牙冠颊面制作釉质块，超声清洗后指甲油封闭表面，仅剩3*3mm²暴露用于再矿化实验。牙釉质块经过3％HNO₃酸蚀30秒后，双蒸水冲洗后备用。

2)牙釉质块分别放入24孔板的一个孔中，各加入2mL矿化液(2.58mM CaCl₂·2H₂O，1.55mM KH₂PO₄，50mM Tris-HCl，pH 7.6)。同时加入0.4mM浓度的EHBP，ELBP，RP，不加七肽组作为空白对照。

3)将24孔板封闭，37℃矿化。分别在16小时，24小时取出，喷金后环境扫描电镜观察(ESEM)。

结果：可见不同七肽对脱矿牙釉质表面再矿化不同的促进作用(图5)。在16小时，空白对照组，RP七肽组，ELBP七肽组牙釉质表面组仍可见酸蚀后的釉柱结构，而EHBP组釉柱轮廓已经模糊，说明EHBP能够加快脱矿牙釉质表面的再矿化中成核作用。在24小时，EHBP以及ELBP七肽组形成了一层致密的矿物沉积。故EHBP多肽能够加快牙釉质表面再矿化成核，并促进表面矿物质的形成。

Claims

1.一种与牙釉质表面轴向特异性结合的七肽，其氨基酸序列如下：

Asn-Asn-His-Tyr-Leu-Pro-Arg。

2.根据权利要求1所述的与牙釉质表面轴向特异性结合的七肽，其特征在于：所述的七肽的制备步骤如下：

1)应用随机七肽噬菌体展示文库对牙釉质表面进行四轮筛选，获得能与牙釉质表面特异性结合的重组噬菌体；

2)从步骤1)得到的重组噬菌体分离制备单克隆噬菌体；

3)提取单克隆噬菌体单链基因组DNA，获得七肽氨基酸序列；

4)测定单克隆噬菌体对牙釉质表面结合能力，筛选出对牙釉质表面特异性结合力最强的七肽氨基酸序列，其氨基酸序列如下：Asn-Asn-His-Tyr-Leu-Pro-Arg。

3.根据权利要求1所述的与牙釉质表面轴向特异性结合的七肽，其特征在于：所述的与牙釉质表面轴向特异性结合的七肽在龋病的诊断以及龋坏牙体再矿化修复中的应用。