CN102282465B - 用于检测二醇的设备和方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种检测各种材料中污染物的方法和设备，该污染物例如乙二醇和二甘醇，该材料包括家用产品和药物。污染物可利用酶活性测定来检测，该测定在光吸收和/或光荧光方面产生了可测量的变化。

Description

用于检测二醇的设备和方法
相关申请 
本申请要求2008年11月14日提交的美国临时申请No.61/199,289的优先权，其内容在此整体引为参考。 
关于联邦资助研究的声明 
本发明是部分利用政府支持在来自CIMIT的资金下完成的，该资金的母资金是来自美国国防部军队医疗研究和材料指挥部。合作协议号为W81XWH-07-2-0011。政府对于本发明可拥有一定权利。 
技术领域
本发明涉及一种用于检测污染物的方法和设备，具体涉及一种提供测定分析的方法和设备，该测定分析用于检测消费者产品中的二醇。 
背景技术
各种产品和材料的污染会对人类和财产造成严重损害。例如，诸如乙二醇（ethylene glycol（EG））和二甘醇（diethylene glycol（DEG））的有毒物质对于通常的家居产品和药物造成的污染近年来已经在全世界杀死了数千人。另外，工艺材料的污染，例如核反应堆中使用的蒸发器和供给水，会造成昂贵设备的腐蚀和提前失效。US20070196927A1记载了一种检测溶液中或生物流体样品中聚乙二醇的定量或半定量方法，该方法包括加入包括碘酒、碘化碱金属和酸的试剂，分别测量高分子量PEGs和低分子量PEGs在所述溶液中或所述生物流体样品中的浓度。但是，仍然需要能够在诸如EG和DEG的污染物产生破坏之前在各种材料中检测到它们。 
发明内容
本发明提供一种方法和设备，用于确定在测试样品中一种或多种污染物的存在和/或存在量。 
一个实施例中，提供一种检测试样中乙二醇和二甘醇中至少一种的方法，其包括在醇脱氢酶的存在下使得二醇与NAD+反应以产生NADH，利用氧化酶氧化NADH以产生过氧化氢，在过氧化氢和过氧化物酶存在下氧化荧光底物以将染料转化成荧光形式，以第一波长照射试样，在第二波长检测 光发射，并且提供与检测到的光的量相对应的信号。 
另一个实施例中，提供一种检测乙二醇和二甘醇的方法，其包括在醇脱氢酶的存在下使得试样与辅酶反应以产生测量溶液，以电致发光的形式产生单波长紫外光，以单波长紫外光照射测量溶液，检测通过测量溶液传递的紫外光，并且产生与检测到的光的量相对应的信号。 
另一个实施例中，提供一种装置，包括第一和第二小池空间，每个小池空间包括：单波长光源，其构造和设置成照射小池空间的至少一部分；第二光源，与第一光源波长不同，第二光源构造和设置成照射小池空间的至少一部分；光探测器，定位成检测来自第二光源穿过小池空间传递的光；和荧光探测器，定位成接受以与任一个光源发射的波长不同的波长从小池空间发射的光。 
另一个实施例中，提供一种检测试样中污染物的方法，其包括间歇性地产生场致发光的紫外光，间歇性的产生场致发光的可见光，检测穿过试样传递的紫外光的量，检测从试样荧光发射的波长与紫外光和可见光不同的光的量，并且利用传递的光的量以及发荧光发出的光的量来确定污染物的浓度。 
这里公开的方法和设备可包括多个不同特征中的一个或多个。例如，任何下列元素可以加入本发明的实施例中：产生醛；醇脱氢酶是酵母醇脱氢酶；氧化荧光底物包括将N-乙酰基-3，7-二羟基吩 
Figure BDA0000075719760000021
嗪 或者AMPLEX 转化成它的荧光形式；二醇与NAD+在碱性环境中反应；二醇与NAD+在大于或等于7.5的pH值下反应；二醇与NAD+在7.3和9之间的pH值下反应；二醇与NAD+在具有大约7.8pH值的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中反应；二醇与NAD+在从包括下列成分的组中选择的缓冲液中反应：三羟甲基氨基甲烷(Tris)，N-二羟乙基甘氨酸(bicine)，Tris碱(Tris Base)HCl，N-二羟乙基甘氨酸NaOH，碱性pH“Good’s”，以及磷酸盐缓冲液；将信号拟合到V(t)＝βexp(t/T)+V0的步骤；通过对于纯二醇的时间常数将对于试样的时间常数归一化的步骤；信号包括电压信号；通过将电压信号除以在时间等于零时记录的第二电压信号，将电压信号归一化；将归一化的电压信号拟合到V(t)＝1-a*exp(b*t)；确定在时间等于零时的归一化电压信号的初始斜率-dV/dt；装置由便携式电池供电；装置能够同时在两个不同的试样中测量荧光；重复步骤一和二至少两次，且在产生可见光 之前消除紫外光，在产生紫外光之前消除可见光。 
结合附图，根据下面对于本发明的详细描述，本发明的其它优点、新特征和目的将显而易见。为了清楚起见，当对于本领域技术人员理解本发明来说并不必要时，附图中并未标出每个部件，也没有示出本发明每个实施例的每个部件。 
附图说明
图1示出了本发明一个实施例中使用的酶反应路径。 
图2示出了本发明一个实施例中使用的酶反应路径。 
图3示出了根据本发明一个实施例的吸光率方法。 
图4示出了用于荧光方法一个实施例的反应和酶路径。 
图5示出了根据本发明一个实施例的荧光方法。 
图6a是根据本发明一个实施例的电压相对时间的曲线。 
图6b是根据本发明一个实施例的归一化的酶活性相对于乙二醇浓度的曲线。 
图7a是根据本发明一个实施例的电压相对时间的曲线。 
图7b是根据本发明一个实施例的归一化酶活性相对二甘醇浓度的曲线。 
图8是根据本发明一个实施例的探测器的示意图。 
图9是根据本发明一个实施例的探测器的电路图。 
图10示出了根据本发明一个实施例的光源和光探测器的布置。 
图11是根据本发明一个实施例的测量装置的等角视图。 
图12a是根据本发明一个实施例的测量装置的侧视图。 
图12b是根据本发明一个实施例的测量装置的剖视图。 
图13是根据本发明一个实施例的测量装置的底部等角视图。 
图14是根据本发明一个实施例的测量装置的底部等角视图。 
具体实施方式
家用产品和消费者产品被诸如乙二醇(EG)和/或二甘醇(DEG)之类有毒物质污染是一个致命的公共健康风险，已经偶发地杀死了数百至数千人。如果没有立刻得到检测和救治，即使摄入少量，也会导致中枢神经系统 抑制、心肺功能衰竭、以及肾衰竭。这个污染在过去几十年全世界范围内已经导致了数个大规模中毒事件。 
目前，没有简单特定的方法来以工业规模检测诸如EG和DEG的污染物的相关水平，特别是在第三世界国家，它们最容易受到受污染货物的威胁，并且健康系统不能做出反应。标准的通用检测方法，例如气相色谱或者色谱/质谱分析法，非常昂贵，速度较慢，有具体的能量要求且需要专门训练的人员，所以它们甚至很少用在发达国家用于识别商业产品中的污染。这里描述了多个装置和过程，它们可提供可靠的、确定的和/或廉价的测试，用以在宽范围的家用和其它材料中检测诸如EG和DEG的污染物。 
“检测”或“探测”表示确定目标化合物或者化合物的类的存在或者量。例如，“检测”试样中的EG可表示识别EG的存在和/或试样中EG的阈值水平和/或确定试样中存在的EG的量或浓度。 
“单波长”表示80％的输出落在20nm范围内。例如，“单波长”光可使得它的输出的80％落在350和370nm之间。 
“场致发光地产生”表示利用场致发光装置来发光，例如发光二极管(LED)或者激光器。 
“试样”包括任何可包括污染物和/或感兴趣的物种的物质。 
本发明提供用于检测基底中一种或者多种污染物的方法和装置。该方法和装置可基于酶活性测定(enzyme assay)，该测定根据存在的污染物的浓度在光吸收和/或荧光(light fluorescence)中产生可测量的变化。例如，在一个方面，提供一种吸光率方法，其使用动态测定来产生吸光率变化，该吸光率变化随着污染物浓度而变化。吸光率变化可利用廉价的单波长装置来测量。另一个方面，提供一种荧光方法，其使用动态测定来产生荧光变化。荧光变化可利用廉价的单波长装置来确定。任意这些方法和装置可以以成套部件的形式来提供，其例如包括：包装，这里公开的试剂的任意组合，试样制备材料，反应容器和/或小池(cuvette)，检测装置和使用说明。试剂可以是稳定的形式，可密封在胶囊中或者小瓶中。 
在一组实施例中，底物(substrate)可以是任意类型材料，包括：液体，凝胶，溶胶，悬液，泡沫，乳剂，和弥散物(dispersion)。另一组实施例中，底物可以是任意类型的家用产品或工业材料。在家用产品中，底物可以例如是下列中的任一种或者组合：药物，食品，酒精饮料，非酒精饮料，护肤液， 清洁剂，空气清新剂，或者任何其它的会与人或其它生物接触的家用产品。 
另一个实施例中，测试的底物可具有任何的流变能力(rheology)、密度和热特性。例如，底物可具有牛顿或者非牛顿流变能力。底物也可具有对于工业材料和家用产品来说常见的任何特定的重力。在一个典型实施例中，特定的重力将大约为1.0。关于热特性，底物可以是热传导或者隔热的。 
一个实施例中，检测的污染物可以是包括一个或多个羟基的任何化合物。另一个实施例中，污染物可包括醇(alcohol)、二醇(glycol)、和/或甘油(glycerol)中的任何类型或者组合。另一个实施例中，污染物可以是乙二醇和/或二甘醇。另一个实施例中，污染物可以是可以在其它羟基化的(hydroxylated)化合物存在下被检测的乙二醇和/或二甘醇，所述化合物例如醇，甘油和丙二醇。 
另一个实施例中，污染物可以在一种或多种其它羟基化的化合物(非污染物)的存在下被检测。例如，底物可以是含有乙醇的饮料，例如葡萄酒，且检测的污染物可以是二醇，例如乙二醇和/或二甘醇。另一个实施例中，污染物可以是可在其它二醇的存在下被检测的乙二醇和/或二甘醇，所述其它二醇例如丙二醇和甘油。 
检测的污染物的浓度可以从低于FDA限制直到100％的污染物。一个实施例中，乙二醇在从低于大约1％重量百分比到大约100％重量百分比的范围中被检测。另一个实施例中，二甘醇在从低于大约3％重量百分比到大约100％重量百分比的浓度范围中被检测。 
在另外的方面，本公开提供了酶活性测定，用于检测底物中一种或多种污染物。用于测定的一类有用的酶是脱氢酶。一些实施例中，酶可包括醇脱氢酶和/或醛脱氢酶。例如，酶可包括酵母醇脱氢酶，例如酵母醇脱氢酶USB 10895。 
另外的实施例中，酶活性测定可包括辅酶。辅酶可以是但不限于NAD+。例如，辅酶可以是NADP+。 
一个实施例中，酶活性测定包括一个或多个缓冲剂。例如，使用的缓冲剂可以是三羟甲基氨基甲烷缓冲液或者N-二羟乙基甘氨酸缓冲液。另外，缓冲剂可以是Tris碱HCl，N-二羟乙基甘氨酸NaOH，N-二羟乙基甘氨酸HCl，一种或多种碱性pH范围的“Good’s缓冲液”和/或磷酸盐缓冲液。测定材料的pH可以从大约4.0到大约10.0。一组实施例中，pH可以在大约6.0 到10.0之间，7.0和9.0之间，7.5和8.6之间，或者大约7.8。 
测试中，测定材料的温度可以从大约零度到大约100摄氏度。一个实施例中，测试材料的温度范围在大约10到大约40摄氏度之间。另外，测试材料的温度可以接近室温(大约20摄氏度)，并且保持在大约正负0.5摄氏度内。 
一组实施例中，诸如EG和DEG的污染物可以借助于吸光率方法100(图1)采用动态测定来检测。吸光率方法100允许测量的EG和DEG的浓度从低于美国食品药品管理局(FDA)规定的安全限制一直到高于各种历史污染事故中检测到的浓度的水平。一组实施例中，在酵母醇脱氢酶的存在下，吸光率方法100可将分析物例如EG和DEG转化成它们相应的醛，如图1对于EG所示以及如图2对于DEG所示。这些反应中，辅酶NAD+可以被转化成NADH。通过监测NADH浓度的增加来确定EG和/或DEG浓度，NADH浓度可通过利用分光测光仪测量在大约340nm处的吸收来获得。 
一个实施例中，如图3，吸光率方法100在步骤110以收集包括一种或多种二醇的测试样品开始。在步骤120，测试试样与酶和辅酶结合，酶例如酵母醇脱氢酶，辅酶例如NAD+。在步骤130，测试试样、酶、和辅酶被放置在小池(cuvette)中。在步骤140，试样中的一种或多种二醇被转化成一种或多种醛，且NAD+被转化成NADH以形成测量溶液。在步骤150，可以利用诸如发光二极管(LED)的装置场致发光地产生单波长光。在步骤160，用单波长光照射小池和测量溶液。在步骤170，检测穿过小池和测量溶液传递的光的量。在步骤180，提供与检测到的光的量相对应的信号，且在步骤190，根据检测到的光的量确定试样中二醇的浓度。这个动态测定中吸光率改变可与存在的污染物的量成比率。 
上述的以及图3中的步骤110-190中的一个或多个可以是可选的，并且步骤110-190的顺序并不重要。另外，虽然上述方法100可以用于检测二醇，它也可用于检测可包括一个或多个羟基的任何其它污染物。 
另外的实施例中，来自步骤180的信号可通过在时间为零时的信号值来归一化(normalized)。具体的，该信号例如可以是电压，并且全部时刻的电压可以除以在时间为零时的电压。这样，背景被归一化，从而例如如果在步骤150产生的光的强度逐月改变，这个变化不会影响分析结果。如果电压直到在该时间之后才能得到和/或被记录，时间为零时的电压可通过外推法 确定。 
来自步骤180的数据可以通过利用函数形式将其拟合(fitting)而被进一步处理。一个实施例中，函数形式可以是指数函数，例如V(t)＝1-a*exp(b*t)，其中V可以是归一化的电压(相对于t＝0时的电压)，t是时间，a和b是待定常量，例如，通过最小二乘法曲线拟合确定。一旦函数形式已经通过时间历史数据被拟合，该数据可以被进一步分析以例如外推电压值到没有进行测量的时刻。另外，函数形式可用于例如获得不同时刻的电压之间的差和/或比。t＝0时刻的电压可以是在t＝0时刻测量的电压，或者例如可以是外推到t＝0时刻的电压，而不是t＝0时刻测量的实际电压。 
在被放置到小池中之前，测试试样可被加热以去掉一些非目标污染物，或者被离心。当试样含有颗粒例如硅酸盐颗粒(例如牙膏中)，可使用离心，这些颗粒会散射光并干涉光学测量。 
利用酵母醇脱氢酶的实施例可要求相对大的底物浓度(例如1.5-1000mM)以实现合理的反应速率。利用酵母醇脱氢酶，定义Michaelis-Menten常数KM为酶活性最大值的一半时的底物浓度，对于EG和DEG来说KM都比较大。为了迅速检测少量的底物，可使用测量初始吸收率的动态测定，而不是等待直到反应完成并且对整体吸收变化进行量化。相比于等待终点测定来说，这可在较短时间内提供准确结果。 
吸光率方法100可用于具有不同的pH值和离子强度的水溶液。一些实施例中，pH保持在7和9之间。可重复的精确结果已经利用在8.0附近的pH获得。一个实施例中，吸光率方法100利用了缓冲液，例如三羟甲基氨基甲烷-盐酸。其它实施例中，可使用生物相容的缓冲液，例如磷酸盐或者N-二羟乙基甘氨酸。 
吸光率方法100可用于测量溶液中的污染物浓度，该溶液的温度在大约0和100摄氏度之间。优选的，温度在大约10和40摄氏度之间。当温度保持恒定时，例如在大约1摄氏度内，诸如26±0.5摄氏度内，已经获得了极好的结果。 
对于吸光率方法100的一个实施例，醇脱氢酶-NAD试剂可通过市场上可买到的用于乙醇确定的成套试剂盒来制备(no.331-CMA；Sigma化学公司，St.Louis，MO 63178)。向NAD-ADH Multitest Vial(Sigma no.331-10)添加5.3ml的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH8.8(Biorad，0.1M，从1.5M 利用ddH2稀释)。试剂的最终成分大致为(每升)：1.5×10^5U的醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)，1.89mmol的NAD，以及100mmol的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH 8.8)。试剂可以在室温下稳定至少8小时。通常的测量中，乙二醇底物可以以1比2的比率被添加到NAD-ADH溶液(例如300和600微升，或者120和240微升)。吸收率的变化例如可以在340nm处被监测10分钟。 
另一组实施例中，可利用荧光方法200来检测诸如EG和DEG的污染物，该方法使用了酶偶联测定法来产生荧光发射中的变化。例如，诸如EG和/或DEG的污染物可用于将荧光底物(染料)间接转化成它的荧光形式，且EG和/或DEG的浓度可根据来自试样的荧光发出的光的量来确定。 
图4示出了对于荧光方法200的一个实施例的反应和酶路径。在反应a和b中，EG和DEG分别与醇脱氢酶反应以产生醛和NADH。通过使用酵母醇脱氢酶作为特定类型的醇脱氢酶，已经发现，可以使得与存在的甘油、丙二醇和/或聚乙二醇发生的干扰最小化，或者消除。反应c中，NADH然后可利用NADH氧化酶被转化回到NAD+，其对于NADH的每个等效物产生了过氧化氢的一个等效物。过氧化氢然后分解以产生两个自由基。反应d中，在辣根(horseradish)过氧化物酶(HRP)的存在下，自由基将诸如荧光底物的染料从它的非荧光形式转化成它的发荧光形式。荧光底物包括这样的材料，其可以在自由基和过氧化物酶的存在下从非荧形式转化成发荧光形式。荧光底物可以来自刃天青(resazurin)/试卤灵(resorufin)族，实例包括N-乙酰基-3，7-二羟基吩 
Figure BDA0000075719760000081
嗪(dihydroxyphenoxazine)(Amplex Red)，可以从InvitrogenA36006获得，以及它的衍生物以及相关化合物，例如AmplexUltraRed。过氧化物酶可包括HRP，例如类型1和类型2。 
图5示出了荧光方法200的另一个实施例，用于检测诸如二醇的污染物。在步骤210，包括二醇的试样被收集。在步骤212，二醇被转化成醛，NAD+被转化成NADH。在步骤214，NADH被氧化以产生化学当量的过氧化氢。在步骤216，在过氧化氢的存在下，Amplex UltraRed染料利用辣根过氧化物酶被氧化以产生含有试卤灵的测量溶液。在步骤218，例如利用LED场致发光的产生具有大约530nm频率的单波长光。在步骤220，利用单波长光照射测量溶液。在步骤222，检测从测量溶液以大约590nm的不同波长荧光发射的光的量。在步骤224，提供与检测的光的量相对应的信号。在步骤226，确定二醇的存在或者浓度。在步骤228，确定是否继续测量。 
上述的图5中的步骤210-228中的一个或多个是可选的，且步骤的顺序可以变化。另外，虽然上述方法200可用于检测二醇(一种或多种)，它也可用于检测具有羟基的任何其它污染物。另一组实施例中，背景扣除过程可以在来自步骤224的信号上进行。具体的，两个不同时间点之间的信号的变化可以例如通过下面的方法确定：将较早时间时的信号从较晚时间的信号中减去。例如，如果信号是电压，三分钟和八分钟之间的绝对电压变化是八分钟时的电压减去三分钟时的电压。利用这个方法，可以去除恒定的荧光背景，允许更高的测试灵敏度。 
许多类型的家用材料和药品，例如牙膏和止咳糖浆，会含有甘油或者丙二醇。这里描述的测试能够分析这些试样中的EG和DEG，而不存在来自甘油和/或丙二醇产生的显著的干扰。其它情况中，试样制备也是有帮助的。虽然吸光率方法100和荧光方法200可用于分析任何类型的底物材料，测试样品制备过程可取决于待分析的底物的特定类型。例如，当制备用于荧光方法200的牙膏试样时，牙膏试样可溶解在缓冲液中并被离心。例如，通过使得混合物产生涡流运动(vortexing)，3g的牙膏试样可溶解在20ml的三羟甲基氨基甲烷-盐酸0.1M pH 7.8缓冲液中。试样然后可以3000rpm的速度被离心十分钟，从而去除硅酸盐颗粒，该颗粒会散射光且干扰测量。试样然后可利用缓冲液被进一步稀释。表1示出了缓冲液的总量，其可以被添加以获得给定量的牙膏和DEG浓度。 
 wt％DEG   mM DEG   DEG(μl)  牙膏(μl)   总的缓冲液(ml)
 100   569   135  0   2.365
 80   455   108  180   2.212
 60   341   81  360   2.059
 40   228   54  540   1.825
 30   171   40.5  630   1.830
 20   114   27  720   1.753
 10   57   13.5  810   1.680
 5   28   6.7  849   1.650
 3   17   4.05  873   1.623
 1   6   1.35  891   1.608
  0   0   0   900   1.600
表1.牙膏试样制备 
当制备牙膏之外的其它底物用于荧光方法200时，诸如止咳糖浆和抗过敏糖浆(allergy syrup)，试样可以与0.1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸pH7.8缓冲液混合。试样混合物然后可以在使用前猛烈晃动。测量试样可以每天新鲜地制备。对于难以精确吸移(pipet)的粘性试样，例如对乙酰氨基酚(paracetamol)糖浆，更实用的是在将它吸移到混合物中之前称出试样或者任选地利用缓冲液提前稀释试样。表2示出了对于给定量的试样和DEG浓度可添加的缓冲液的总量。 
  wt％DEG   mM DEG   DEG(μl)   试样(μl)   总的缓冲液(ml)
  100   569   135   0   2.365
  80   455   108   27   2.365
  60   341   81   54   2.365
  40   228   54   81   2.365
  30   171   40.5   94.5   2.365
  20   114   27   108   2.365
  10   57   13.5   121.5   2.365
  5   28   6.7   127.3   2.365
  3   17   4.05   130.95   2.365
  1   6   1.35   133.65   2.365
  0   0   0   135   2.365
表2.试样制备 
一些情况中，分析可以涉及EG而非DEG。EG试样制备可与上面表1和2中对于DEG描述的性质上相同。然而，因为在酵母醇脱氢酶的存在下EG比DEG活性更高，可使用较小浓度的EG。试样浓度的实例包括0-112mMEG和相对应量的家用产品(例如牙膏，止咳糖浆，对乙酰氨基酚糖浆)，以制备0-100％重量百分比的乙二醇试样。 
在荧光方法200的一个实施例中，醇脱氢酶-NAD-NADH氧化酶试剂可以如下制备。首先，15ml的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液pH7.8(BM-318波士顿生物产品，0.1M，利用ddH20从1.0M稀释)，可以添加到NAD小瓶 (Sigma Aldrich 50mg no.331-10)。其次，1.2KU/ml的酵母醇脱氢酶(USB/Affymetrix 10895)储备溶液可通过稀释来制备。这直接在测量前进行。储备溶液可新鲜制备，不需要在测量之间冷冻。第三，1000U/ml的辣根过氧化物酶类型1(Sigma Aldrich P8125-5KU)存储溶液可利用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液制备，该缓冲液pH7.8(BM-318波士顿生物产品，0.1M，利用ddH20从1.0M稀释)。这个储备溶液可分份并且在-20摄氏度下在小瓶中存储达到大约两个月。每次测量前，一小瓶的储备溶液可解冻且利用100mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(来自波士顿生物产品)稀释到10单位/ml。第四，NADH氧化酶(EMD化学，481925-5U)储备溶液可通过下列方法制备：将5单位的酶稀释在800微升的磷酸盐缓冲液中，该缓冲液pH7.4(Sigma Aldrich P3619-1GA)。100微升的等份可在-20摄氏度存储在离心管中。储备溶液可在实验之间解冻，且可在它们已经解冻之后被丢弃。第五，Amlex Ultra Red(Invitrogen A36006)储备溶液可在每次测量前通过下列方法新鲜制备：将小瓶的1mg Amplex Ultra Red稀释在400微升的DMSO(EMD Omnisolv MX1456-6)中，且使其产生涡流数秒以溶解染料。 
另外的实施例中，利用荧光方法200开始反应，测量试样、过氧化氢溶液，以及醇脱氢酶-NAD-NADH氧化酶试剂可以结合在小池中。含有例如DEG的120微升的试样可以利用1ml的移液器(pipettor)添加到塑料小池(VWR 97000-586)中。新的移液端头可用于每个试样以避免交叉污染。利用10微升的VWR移液器，3.5微升的10U/ml的辣根过氧化物酶类型1溶液可以注入每个小池中。新的移液端头可用于注入辣根过氧化物酶类型1溶液。为了开始反应，240微升的醇脱氢酶-NAD-NADH氧化酶反应混合物可添加到每个小池中。1ml移液器的相同端头可用于添加反应混合物。对于八个小池足够的酒精-脱氢酶-NAD-NADH氧化酶反应混合物可由下列的制成：1.95ml NAD，13微升Amplex Ultrared，6.5微升NADH氧化酶，和40微升醇脱氢酶。另一个实施例中，多个试样可以在不同的小池中平行进行。另外，1.95ml的酒精-脱氢酶-NAD-NADH氧化酶反应混合物可在每次进行之前新鲜制备，且在开始反应之前被充分混合。 
酶偶联测定通常涉及到不同的酶，这些酶在不同的底物上发挥作用且具有不同的pH和温度最佳值。利用单个酶，优化活性通常涉及到仅选择酶和底物的适当pH、温度和浓度，相对简单的任务。然而已经发现，对于这 里描述的酶偶联反应，参数空间变得不可预测。第一酶和底物的浓度可选择成使得最终产物将在这样的浓度范围中，在该范围中，第二酶可以显著的起作用并且不会饱和。第二酶的产物，第二酶和第一酶产物的浓度的函数，将类似的落在对于第三酶有效的浓度范围中。识别对于所有涉及的酶和底物的有效浓度不那么容易，因为对于一个酶的最有效的浓度或条件在第二酶上可能具有有害影响。例如，如果一个酶的产物的浓度对于下一个来说太低，将不会显示出(register)活性；相反，如果一个酶的产物的浓度过高，那么下一个最高酶活性率将限制它的产物的产生。除非酶活性相当，不可能使用酶偶联测定来确定污染物诸如DEG或EG的浓度。 
用于EG和/或DEG的任何测试会具有与其它的二醇干扰的可能性，特别是与甘油和丙二醇。利用来自不同种的多个醇脱氢酶，与甘油和丙二醇的干扰可导致高的检测活性以至于DEG和/或EG的浓度不能精确确定。然而已经发现，一种特定的醇脱氢酶、酵母醇脱氢酶(USB 10895)会对于较高浓度的DEG产生较高的活性，即使在具有较大比例甘油或者丙二醇的试样中也一样。 
测定混合物的pH可以是4和10之间的任何值。一个实施例中，pH在7和9之间。另一个实施例中，pH为大约7.8。 
醇脱氢酶的浓度可以是任何适当值，例如高于5.5U/mL，在一组实施例中，接近16.5U/mL或者是16.5U/mL。NAD的浓度可以是高于0.7mg/mL的任何值，在一组实施例中，接近2.22mg/mL或者是2.22mg/mL。NADH氧化酶的浓度可以是高于4.5mU/mL的任何值，并且例如可以是14.1mU/mL或者接近。HRP的浓度可以是高于35mU/mL的任何值，但是优选为97.2mg/mL或者接近。Amplex Ultrared的浓度可以是高于4mg/L的任何值，但在优选实施例中为11.3mg/L或者接近。 
醇脱氢酶(ADH)，以及实际上许多或者所有脱氢酶，能够将OH基转化成醛。已经发现，醇脱氢酶在甲醇(具有一个碳)和乙醇(具有两个碳)上作用非常有效，对其，它初始在生物有机体中进化。它同样作用在其它醇上，以及二醇上，具有多个OH基的化合物。可以期待它在乙二醇上的活性(两个碳)，并且也可以期待作用在DEG上的较低活性率，其具有四个碳，具有较高的分子量。我们因此可以期待醇脱氢酶在三碳的丙二醇和甘油上具有相当的(如果不是较快的)活性率。因此不能期待在甘油和丙二醇的存在 下使用醇脱氢酶来检测DEG能够发挥作用，这是由于与这些化合物发生的干扰；相反，给定EG与ADH的高反应率，相对于DEG，我们可以期待对于丙二醇和甘油较高的活性率。然而，如所示方法披露的，利用特定类型的ADH，DEG的浓度可以被检测和定量，即使是在丙二醇和甘油存在的情况下。 
对于给定的酶，存在对于活性来说最佳的条件集合，特别是温度和pH。上述测定可以在室温下进行(大约25摄氏度)，虽然这对于这些反应来说不是最佳的温度。室温的微小变化(例如在20-25摄氏度的范围中)不会显著影响结果。当进行单酶反应时，例如单醇脱氢酶反应，pH选择成使得活性最大化。对于上述测定中使用的每个酶来说最优的pH范围可以在文献中找到。然而，当这些最优范围对于耦联测定中使用的每种酶来说不是相同的时，耦合反应不会成功，因为酶会不相容。例如，错误的pH条件中的酶会不稳定，并且会分解。例如，将酸性最优的酶放置在强碱性环境中，在许多情况中，将使得酶变性，使其失去它的适当结构，并使其完全不能发挥作用。特别的，醇脱氢酶在pH9.0具有最大活性，是在碱性区域；在pH8.0，它的活性为最大值的10％。相反，NADH氧化酶在6.5的酸性pH具有最大活性。使得醇脱氢酶反应(理想的在碱性环境中进行)的产物耦合到涉及NADH氧化酶的反应(应当在酸性环境中进行)，不能期待其有效工作。辣根过氧化物酶甚至更加嗜酸，具有5-7的最优pH范围。有不同的方法来解决这个问题。来自第一醇脱氢酶反应的产物可以被离析、纯化，并且然后在对于NADH氧化酶最优的条件下被重新引入反应中；然而，在成本和复杂性方面，这个离析和纯化对于便携式装置，例如装置400来说不实际。任选的，对于单锅式(one-pot)反应，不能期待这样的单组条件，在该条件下，酶足够充分的发挥作用，更别说保证存在该条件。对于这里公开的方法，反应可以在对于所涉及所有酶来说的最优范围以外的pH运行。 
图6a示出了对于各种浓度的EG来自光探测器的电压输出相对于时间的图形，利用吸光率方法100获得。如图所示，利用吸光率方法100，输出电压会以指数递减的方式减小，其中二醇的浓度越高，下降速度越快。所有时刻的电压可以被时刻为零时的电压除。这样，背景被归一化，从而例如如果在步骤150产生的光的强度逐月改变，这个改变不会影响分析结果。如果电压直到该时刻之后才可获得和/或记录，时刻为零时的电压可通过外推法 来确定。 
电压的变化率可提供二醇浓度的指示。例如，图6b提供了在时间为零时对于各种底物和EG浓度来说电压变化率-dV/dt的图形的复制，其中V是通过时刻为零处它的值被归一化的原始电压。如图，电压的初始变化率可随着EG浓度而增加。同样，测量结果可能对于被测的底物的类型不敏感，因为图6b中对于水、牙膏、止咳糖浆、泰诺林糖浆(Tylenol syrup)和抗冻剂的结果几乎是相同的。为了参考，图6b还包括竖直线，表示与巴拿马(Panama)和尼日利亚(Nigeria)发生的大规模中毒相关的EG浓度以及抗冻剂的EG浓度(大约45％)。应当注意，这些试样中的大部分含有丙二醇的水平高达30％，且测试过程在这些情况下没有提供假阳性结果。 
图7a提供了对于各个浓度的DEG来自光探测器的电压输出相对于时间的图形的复制，利用荧光方法200获得。如图，利用荧光方法200，输出电压可随着时间以指数增长的方式增大。另外，即使当DEG浓度为0％时，指数增长也会发生，可能是由于在热平衡中少量NADH的存在，其依次可能会驱使荧光底物生成它的荧光形式。 
一个实施例中，来自光探测器的输出电压作为时间的函数被测量。例如，在通常的测量中，输出电压可以大约每秒被记录一次。另外，在反应开始之后大概三分钟开始，电压可以被记录，并且在反应开始之后大约10分钟结束。在混合之后，第一个十分钟，探测器测量的电压可能会符合函数形式： 
Vfl＝βexp(t/Tfl)+V0
其中Vo是基线，对于探测器来说是恒定电压，其可以例如利用填充水的小池来测量。不同的EG和/或DEG浓度产生不同的酶活性值，表征为特征时间常数Tfl。然而，由于不同酶的活性的差异，以及信号的化学放大，在表面上相同的条件下，对于相同试样的不同测量，产生的变化会达到±20％绝对酶活性。 
对于吸光率方法100和荧光方法200，为了使得这种测量误差最小化，测量可在多个装置上同时进行，且结果可以被归一化。例如，测试试样可以在一个装置中被测量，且100％DEG(标准)的试样可以同时在另一个装置中测量。酶活性值可以根据这些测量来确定，且由对于测试试样的酶活性产生的时间常数Tfl，可以除以由对于100％DEG试样的酶活性产生的时间常数 
Figure BDA0000075719760000151
以获得归一化的酶活性。 
T ′ ≡ T fl / T fl 100 %
利用这个多个检测器策略和归一化，对于一定范围的家用产品和药物来说，归一化的酶活性与DEG的浓度单调相关联，即使在甘油和丙二醇存在的情况下，如图7b所示。图7b是对于各种家用产品和药物来说归一化的酶活性相对DEG浓度的图形，通过荧光方法200获得。 
对于上述吸光率方法100和荧光方法200来说，适当的是在测量某些测试试样之前加热它们。例如，当醇脱氢酶用作酶时，在与缓冲溶液混合之前，乙醇可以从试样液体去除。一个实施例中，乙醇可通过将试样加热到乙醇沸点(78.4℃)之上来去除。例如，可利用可透蒸汽的聚合物薄膜来在微流体通道中加热试样，该薄膜例如聚二甲硅氧烷或者高氟化树脂(Nafion)。另外，材料例如牙膏中存在的胶和颗粒会干扰测量。一个实施例中，这些胶和颗粒可通过将测试试样放置在沸水中大约10分钟来分解。 
一个方面，提供一种装置，其可以利用单波长照射和光电二极管检测来量化吸光率和/或荧光。装置可包括塑料壳体，该壳体精确地将照射和检测部件保持就位，确保这些部件和试样小池的相对位置随着时间保持不变，从而实现可重现的测量。该装置的制造和装配比传统的实验室荧光计和分光光度计廉价很多。它可以由电池供电，因此完全便携。它还可包括两个互补的半部，两个半部可模制成相同的，每个半部构造和设置成保持标准的1Gm小池，并且其中，两个半部可扣合在一起以形成单个双侧仪器，该仪器可以同时测量两个试样。 
图8示意性示出了低成本的单波长仪表240的一个实施例，其可以与上述的吸光率方法100和/或荧光方法200一起使用。仪表240包括光源250、容纳测量试样的小池252，以及光探测器254。光源250照射小池252，光探测器254检测从小池252的一部分离开的光的量。 
光源250产生的光可以是单波长光。这种光可以利用场致发光装置产生，例如LED或者激光器。光源250可以被选择成使得产生的波长范围接近酶活性产物例如NADH的吸收峰值。NADH在大约362nm处具有吸收峰值。该情况中，光可以是UV，在大约365nm具有发射峰值。光源250还可以选择成使得产生的波长范围接近荧光材料的峰值激发频率。例如，当使用Amplex Ultrared荧光染料时，光可以是绿色的，且在大约527nm具有发射 峰。 
光探测器254产生依赖于时间的电压256，与接收的光的量成比率。电压256可以利用电压计或类似装置来记录，且利用模拟-数字转化器258来转化成数字信号。模拟-数字转化器258可以利用数字数据传输器260连接到微处理器262。微处理器262可以程序控制以将数字信号转化成污染物的浓度，例如EG和/或DEG。最后，数字读数装置264可用于显示来自微处理器262的结果，例如测量的浓度。 
当与上述的吸光率方法100一起使用时，来自光探测器254的电压可以随着时间指数下降。在动态测定中，这个下降的初始速率直接正比于污染物的量，例如试样中存在的EG和/或DEG。结果，仪表240在短时间内能够检测污染物(例如小于30分钟，小于20分钟，或小于10分钟)。 
图9示出了仪表240的实施例的电路图。仪表240可以由5V电源266驱动，该电源可设置有AC电源，该AC电源通过功率调节器(未示出)逐步下降，或者设置DC电源，例如具有多个电池。光源250可连接到可变电阻268，从而产生的光的量可以根据需要调节。光穿过小池252，且入射光探测器254以产生电压256。 
相比传统的分析光学设备，例如分光光度计，仪表240没那么昂贵。对于传统仪器的高成本的一个原因在于，它们具有在非常大范围上产生精确波长光的能力。虽然需要这种灵活性以分析更宽范围的可能遇到的试样和反应，但是不需要它来分析利用上述吸光率方法100和荧光方法200进行的反应，其中，待检测的材料的光学特性是已知的。后一种情况中，可使用单波长光源，从而避免更加昂贵和复杂的灯，以及在分光光度计中发现的衍射光栅对(pairing)。 
上述NADH吸光率方法特别容易进行单波长方法。NADH具有宽泛的吸收峰，集中在大约340nm处，从而在340nm处测量的光传输应当提供最灵敏的结果。然而已经发现，350-360nm范围中的波长也可产生有用的结果。在这个波长范围上的光可以通过三倍频Nd:YAG和Nd:YVO4激光器产生(其将初始1064nm的波长切成三份，产生355nm的光束)，相对廉价，并且可产生大量的能量。另外，在360nm范围中产生大约毫瓦能量的LED可以相对廉价买到。 
除了廉价的光源，仪表240可包括其它廉价部件。例如，光探测器254 可以是来自TAOS的TSL257-LF光电二极管。另外，模拟-数字转化器258、微处理器262、和数字读数装置264可以结合到单个低成本的低功率微处理器中，例如来自德州仪器的MSP430系列。通过使用这些部件，仪表240可以比传统分光光度计更加廉价地制造。另外，仪表240可以制造成手持式的，且方便的用在艰苦的野外环境中。 
图10示意性示出了装置300的一个实施例，其能够同时测量光吸收率和荧光。装置300可用于进行用于上述吸光率方法100和/或荧光方法200的测量。装置300结合了荧光探测器301、UV光探测器302、绿光探测器303、绿色LED 304、UV LED 305、和小池311。小池311可容纳测量试样。绿色LED 304和UV LED 305向小池311发光。荧光探测器301、UV光探测器302和绿光探测器检测从小池311接收的光。 
绿色LED 304可用于吸光率和荧光测量。绿色LED 304用单波长绿光照射小池311。对于吸收测量，设置在小池311的与绿色LED 304相反一侧上的绿光探测器303检测来自绿色LED 304的绿光的量，该绿光穿过测量试样和小池311。对于荧光测量，荧光探测器301检测从小池311内测量试样荧光发出的红光的量。 
绿色LED 304可选择成使得：绿光的发射峰在用于荧光方法200的荧光染料的激发峰内。例如，一个实施例中，绿色LED 304可在大约527nm处具有发射峰，其落在Amplex Ultrared的激发峰内。另外，绿色LED 304的发射峰可以接近用于荧光方法200的荧光染料的吸收峰。例如，AmplexUltrared染料在绿色中具有很强的吸收。因此，当绿色LED 304在大约527nm处具有发射峰时，与Amplex Ultrared染料结合使用的绿色LED 304可适于荧光和吸收测量。 
因为荧光可以是各向同性的，来自小池311的荧光的强度可以几乎独立于荧光探测器301相对于来自绿色LED 304的光束放置的角度，该绿色LED用于激发。荧光探测器301因此可以相对于光束以任意角度放置。例如，如图10，荧光探测器301可放置成与绿色LED 304产生的入射光束通路成几乎九十度，从而增加检测的荧光发射的信噪比。 
为了吸收测量，装置300也可包括UV LED 305。UV LED 305可产生单波长UV光，并将其发送到小池311中。UV光探测器302，设置在小池311的与UV LED 305相反一侧上，检测来自UV LED 305的UV光的量， 该UV光穿过测量试样和小池311。 
UV LED 305可选择成使得它在反应剂和/或化学反应产物的吸收峰附近具有发射峰。例如，UV LED 305可在大约365nm附近具有发射峰，因为NADH，图4中酶反应的产物，在该波长附近强烈吸收。 
另一个实施例中，为了提高吸收和荧光测量的精度，装置300可包括长通滤波器(longpass filter)306、短通滤波器(shortpass filter)307、和带通滤波器(bandpass filter)308。通过阻止不需要的光到达荧光探测器301、UV光探测器302、和绿光探测器303，滤波器306、307、308可提高信噪比。例如，带通滤波器308可设置在绿光探测器303和小池311之间，从而仅绿光可入射绿光探测器303。另外，短通滤波器307可设置在UV光探测器和小池311之间，从而仅UV光可入射UV光探测器302。最后，长通滤波器306可设置在荧光探测器301和小池311之间，从而仅荧光可到达荧光探测器301。 
为了进一步提高信噪比，装置300也可包括：短通滤波器309，设置在UV LED 305和小池311之间；以及带通滤波器310，设置在绿色LED 304和小池311之间。带通滤波器310可仅允许绿光从绿色LED 304的附近到达小池。短通滤波器309可仅允许UV光从UV LED 305附近到达小池311。 
为了确保精确和可重现的测量，光源、试样小池、和探测器的相对位置应当随着时间仔细地保持。实验室荧光计中，这些部件安装在精确制造的壳体中，该壳体对于野外使用来说过于精密和昂贵。因此为了降低成本和提高耐用性，用于试样和镜片的保持器可以利用精确注射成型塑料制造，以提供小池在便携装置中的精确和可重复的对正。 
图11示出了装置400的一个实施例，其包括相同的模制半部1a和1b。模制的半部1a和1b均包括传感器保持结构7a和7b、按钮2a、2b、和指示器3a、3b、4a、4b。传感器保持结构7a、7b包括试样保持接收器6a、6b。模制半部1a和1b可以由任何固体材料或者固体材料的组合制成。例如，模制半部1a和1b可以由一种或多种塑料制成，例如聚苯乙烯，聚丙烯，ABS，聚氨酯，聚乙烯，聚酰胺(尼龙)，或者聚缩醛树脂 
Figure BDA0000075719760000181
装置400可用于同时测量两个单独的试样。例如，模制半部1a可用于测量基准试样，模制半部1b可用于测量测试试样。这两个试样可同时或者顺序测量。具有罩5a且容纳基准试样的小池可插入到试样保持接收器6a中， 具有罩5b且容纳测试试样的小池可插入到试样保持接收器6b中。测量可通过按下按钮2a和/或2b来开始。 
指示器3a、3b、4a和4b可指示小池中污染物是否存在。例如，指示器3a和3b可以是红色的，且如果在一个或两个小池中检测到污染物，就会发光。类似的，指示器4a和4b可以是绿色的，如果在一个或两个小池中没有检测到污染物，就会发光。可利用例如LED来照亮指示器3a、3b、4a、4b。按钮2a和2b以及指示器3a、3b、4a、4b可安装到装置400的基座8中的电路板20。 
图12a是装置400的侧视图，图12b是剖视图，其中电路板20可以看到。装置400的每个模制半部1a、1b包括绿色LED 29b、UV LED 29A、绿光探测器31b、UV光探测器31c、和荧光探测器31a。这些LED 29b、29a和探测器31b、31c、31a可利用引线21、22连接到电路板20。电路板20还可容纳(未示出)基本电路，用于控制LED 29b、29a且处理来自探测器31b、31c、31a的信号。小池15b中的基准试样15c可被制备，且插入到试样保持接收器6a中。类似的，检测试样可插入到试样保持接收器6b中。 
图13和14示出了模制半部1a的底部等角视图。模制半部1a包括LED凹部(pocket)28a、28b和探测器凹部33a、33b、33c。LED凹部28a和28b容纳绿色LED 29b和UV LED 29a。绿色LED 29b例如可以是具有CREE模型号LC503FPG1-15P-A3的类型。UV LED 29a例如可以是具有LED供应型号L5-0-U5TH15-1的类型。探测器凹部33a、33b和33c容纳绿光探测器31b、UV光探测器31c和荧光探测器31a。绿光探测器31b、UV光探测器31c和荧光探测器31a中的一个或多个可以是TAOS的TSL257高灵敏光-电压转化器。这些LED和探测器可以与装置240和300中示出的那些相同。 
另一个实施例中，装置400还包括滤波器32a、32c、32b、30a、30b和聚焦狭缝34a、34c、34b、27a、27b。为了到达绿光探测器31b，来自绿色LED 29b的光穿过滤波器30b、聚焦狭缝27b、小池15b、聚焦狭缝34b和滤波器32b。为了到达UV光探测器31c，来自UV LED 29a的光穿过滤波器30a、聚焦狭缝27a、小池15b、聚焦狭缝34c和滤波器32c。为了到达荧光探测器31a，来自测量试样的荧光发射的光穿出小池15b、穿过聚焦狭缝34a和滤波器32a。聚焦狭缝34a、34c、34b、27a、27b可有助于空间上限制光，且例如可成形为狭缝和/或微孔。 
来自探测器31b、31c、31a的信号可以在电路板20上处理，如上所述，且如果一种或多种污染物存在，指示器3a、3b会发光。如果没有污染物，指示器4a、4b会点亮。 
滤波器32a、32c、32b、30a、30b可以由透明塑料过滤材料制成。该材料例如可以是常用于剧场照明的廉价类型。过滤材料可以被模切成所需要的尺寸以配合到凹部28a、28b中。对于比例而言，绿色LED 29b和UV LED 29a均可以是大约5mm直径，滤波器32a、32c、32b、30a、30b可以大约0.5mm厚，5mm宽，且20mm长。 
为了提高测量精度，LED 29b、29a和探测器31b、31c、31a可以利用粘结剂和/或可压缩材料件固定就位，该材料例如泡沫橡胶，填充在LED凹部28a、28b和/或探测器凹部33a、33b、33c中。泡沫橡胶还可有助于将LED29b、29a和探测器31b、31c、31a从漫射光隔离开。电路板20可以与用于引线21、22的压配连接器(press-fit connector)的任一个预钻孔，从而电路板可以移除，或者引线21、22可以穿过金属覆盖的通路孔从而被焊接就位。如果电路板20必须被移除，引线21、22可以被去焊。 
装置400的模块化设计允许两个相同的模制半部1a、1b被组合以形成设备主体。模制半部1a和1b具有裙座(skirt)39a和39b，当两个半部被装配时，所述裙座形成用于电路板的凹部。为了提供对正，如图13，翼片40和41可以与相对应的翼片42和表面44通过下面的方式配合：将模制半部1a、1b面对面放置，但是相对彼此旋转，并且然后扭转该模制半部1a、1b，直到翼片40、41、42落座。滚圆部(round)43有助于允许该扭转-落座运动进行。粘结剂可以在组装之前施加，或者螺钉固定的电路板20以及铆钉就位的底罩36的存在可以将设备保持在一起。 
独立的荧光计通常包括单个试样小池。不可能同时运行多个试样(在盘式读数器上可以，是大的复杂的且昂贵的设备，其从来没有被制成便携的)。这些设备的高成本至少部分由于激发和发射波长的可选择性，具有高度光谱分辨率，利用了衍射光栅。因为上述底物、酶和染料都具有在光谱特性方面被良好的表征，单波长的激发源(例如LED)可以与特定的滤波器一起选择从而隔离开发射和激发波长。这允许多个低成本探测器的结构，从而使得多个试样同时进行现在变的可行和有效。这意味着利用相同的酶以及在相同的温度、时间、压力、和其它环境参数的条件下，100％DEG的标准基 准试样可以与测试试样同时进行。通过平行运行两个试样，测试试样的结果可以被归一化，如上所述，从而去除由于酶活性中的累积差异而造成的波动。这个测量可以通过不同批次的所有酶成分来重复，并且相比利用单个探测器和试样，它允许污染物浓度被更加准确的测定。 
虽然已经描述和示出了本发明的多个实施例，本领域普通技术人员将容易的构想出多个其它装置和/或结构用于执行那些功能和/或获得结果和/或一个或多个上述优点，这些变形和/或修改中的每一个都被认为是在本发明的范围内。更一般的，本领域技术人员将知道，上述所有参数、尺寸、材料和结构都是示例性的，实际的参数、尺寸、材料和/或结构将取决于本发明的教导用于其上的具体应用。在采用不超过惯用实验的情况下，本领域技术人员将知道或者能够确定这里描述的本发明特定实施例的许多等效物。因此应当理解，上述实施例仅是通过实例给出的，并且在权利要求及其等效物的范围内，本发明可以以与上述和权利要求限定的方式不同的方式来实施。本发明涉及到上述每个单独的特征、系统、物品、材料、试剂盒、和/或方法。另外，这些特征、系统、物品、材料、试剂盒、和/或方法中的两个或多个的任意组合落在本发明的范围内，只要这些特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法没有相互不一致。 
这里限定和使用的所有定义应当理解为控制着字典解释、引入参考文献中的定义、和/或所限定术语的通常含义。 
说明书和权利要求中使用的冠词“一”，除非清楚地相反限定，应当理解为“至少一个”。 
说明书和权利要求中使用的术语“和/或”应当理解成所连接的元素的“任一个或者二者”，即一些情况中结合存在且在其它情况中分离存在的元素。除了通过“和/或”特别指出的元素，其它元素可以可选的存在，无论与那些特别指出的元素相关或者不相关，除非清楚的相反指出。 
这里引用的所有参考文献、专利和专利申请以及公开文献都整体引为参考。 

Claims (21)

1.一种检测怀疑含有二醇的试样中乙二醇和二甘醇中至少一种的方法，该方法包括：
在醇脱氢酶的存在下使得二醇与NAD+反应以产生NADH；
利用氧化酶氧化NADH以产生过氧化氢；
在过氧化氢和过氧化物酶的存在下氧化荧光底物从而将荧光底物转化为荧光形式；
以第一波长照射试样；
以第二波长检测光发射；和
提供与检测到的光的量相对应的信号。
2.如权利要求1所述的方法，其中，使二醇反应的步骤包括产生醛。
3.如权利要求1所述的方法，其中，醇脱氢酶是酵母醇脱氢酶。
4.如权利要求1所述的方法，其中，使得荧光底物氧化的步骤包括将N-乙酰基-3,7-二羟基吩
Figure FDA0000395283680000011
嗪(Amplex Red)或者Amplex Ultrared转化成其荧光形式。
5.如权利要求1所述的方法，其中，二醇在碱性环境中与NAD+反应。
6.如权利要求1所述的方法，其中，二醇在大于或等于7.5的pH与NAD+反应。
7.如权利要求1所述的方法，其中，二醇在7.3和9之间的pH与NAD+反应。
8.如权利要求1所述的方法，其中，在具有7.8pH的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中，二醇与NAD+反应。
9.如权利要求1所述的方法，其中，二醇与NAD+在从下列组中选择的缓冲液中反应，该组包括：三羟甲基氨基甲烷，N-二羟乙基甘氨酸，Tris碱HCl,N-二羟乙基甘氨酸NaOH，碱性pH“Good’s”，以及磷酸盐缓冲液。
10.如权利要求1所述的方法，其还包括将信号拟合到V(t)=βexp(t/T)+V0的步骤。
11.如权利要求10所述的方法，其还包括通过对于纯二醇的时间常数将对于试样的时间常数归一化的步骤。
12.一种检测怀疑含有二醇的试样中乙二醇或二甘醇的方法，该方法包括：
在醇脱氢酶的存在下使试样与辅酶反应以形成测量溶液；
场致发光地产生单波长紫外光；
利用该单波长紫外光照射测量溶液；
检测穿过测量溶液传递的紫外光；和
产生与检测到的光的量相对应的信号。
13.如权利要求12所述的方法，其中，该信号包括电压信号。
14.如权利要求13所述的方法，其包括通过下列方法来归一化该电压信号：将该电压信号除以在时刻为零时记录的第二电压信号。
15.如权利要求14所述的方法，其包括将归一化的电压信号拟合到V(t)=1-a*exp(b*t)。
16.如权利要求15所述的方法，其包括确定在时刻为零时归一化电压信号的初始斜率-dV/dt。
17.一种装置，包括：
第一和第二小池空间，每个小池空间包括：
单波长光源，其构造和设置成照射小池空间的至少一部分；
波长与第一光源不同的第二光源，第二光源构造和设置成照射小池空间的至少一部分；
光探测器，定位成检测来自第二光源穿过小池空间传递的光；和
荧光探测器，定位成接收以与任一个光源发射的波长不同的波长而从小池空间发出的光。
18.如权利要求17所述的装置，其中，该装置由便携式电池供电。
19.如权利要求17所述的装置，其中，该装置能够同时在两个不同的试样中测量荧光。
20.一种检测试样中污染物的方法，包括：
间歇性地产生场致发光的紫外光；
间歇性的产生场致发光的可见光；
检测穿过试样传递的紫外光的量；
检测以不同于紫外光和可见光的波长从试样荧光发射的光的量；和
利用传递的光的量和荧光发射的光的量，确定污染物的浓度。
21.如权利要求20所述的方法，其包括至少两次重复步骤一和步骤二，且在产生可见光之前消除紫外光，且在产生紫外光之前消除可见光。
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