CN102271669A - 非大脑组织中β-淀粉样肽负载的改性 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于调节通过非神经元(即周边的)细胞、液体或组织表现的淀粉样β肽(Aβ)水平的方法和组合物。本发明还涉及通过选择性调节(如抑制)γ-分泌酶的活性来调节Aβ水平。本发明还涉及通过施用导致非神经组织中γ-分泌酶的调节的化合物来预防、治疗或减轻包括但不限于Aβ相关障碍的障碍症状的方法，以直接或间接地预防、治疗或减轻大脑Aβ障碍(如阿尔茨海默氏症)的症状。

Description

非大脑组织中β-淀粉样肽负载的改性
本申请要求于2008年11月13日提交的美国临时专利申请第61/114,459号和2009年8月3日提交的美国临时专利申请第61/230,926号的优先权，它们的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及用于调节通过非神经(即周边的)细胞、体液或组织表现的淀粉样β肽(Aβ)水平的方法和组合物。本发明还涉及通过选择性调节(例如，抑制)周边组织中γ分泌酶活性调节大脑Aβ水平。本发明进一步涉及通过施用导致非神经组织中γ-分泌酶的调节的化合物预防、治疗或减轻包括但不限于Aβ相关障碍的障碍症状的方法，直接或间接地预防、治疗或减轻大脑Aβ障碍(如阿尔茨海默氏症)的症状。本发明还涉及通过周边施用以预防、治疗或减轻阿尔茨海默氏病症状的γ分泌酶活性调节剂的用途。
背景技术
淀粉样β(Aβ)肽是阿尔茨海默氏病相关前体蛋白(β-淀粉样前体蛋白(APP))的代谢产物，并被认为是阿尔茨海默氏病(AD)的主要病理因素。AD是一种以大脑脆弱区(尤其是额皮质和海马体)内Aβ的年龄相关性沉积物为特点的神经退化性疾病(Terry RD.J Geriatr Psychiatry Neurol 19：125-128，2006)。Aβ具有导致渐进性神经元缺失的致病作用，从而致使那些大脑区协调高级和基本神经过程能力的恶化。由于恶化加剧，受到影响的受试者面临痴呆和生活质量的日益恶化，最终的病症是致命的(Brookmeyer R，Johnson E，Ziegler-Graham K，Arrighi HM.Alzheimer′s Dement 3：186-191，2007；Powers JM.Neurobiol Aging 18：S53-S54，1997)。
据认为，AD的发展是与老化有关的自然生化过程的结果，而且几乎每个人最终显示这种疾病的症状是他或她活得够久了。年龄是AD发病率为25-50％的85岁或以上老人的最大已知风险因子(Giacobini E.Ann NYAcad Sci 920：321-327，2000)。对于某一个人，所述障碍显示的时间是其它系列风险因子的结果，而其中有些可能是由于环境原因，但其中许多是由于受试者的遗传因素：受试者基因结构和活性的自然变异产生的全体蛋白质，相互作用的复合骨架网使受试者增加或减少易于具有AD的危险。已鉴定出影响AD风险的蛋白质产物的一些基因。例如，有编码称为e2、e3和e4的血清蛋白载脂蛋白E的基因的三种常见变异。遗传e4编码等位基因的受试者比AD平均水平的受试者的风险高，而且往往比没有e4等位基因的受试者更早产生疾病。从亲本双方遗传e4等位基因的那些受试者比AD早期发病的受试者的风险高，而含有e2等位基因的受试者的风险非常低，一生中产生疾病比平均水平晚，如果真有的话(Cedazo-Minguez A.J CellMol Med.11：1227-38，2007)。还发现，创伤性脑损伤和重复性脑创伤能加快大脑Aβ沉积和认知障碍(Uryu et al.J.Neurosci.22(2)：446(2002)。
绝大部分(假如不是全部)的AD被认为具有与每个受试者风险界限有关的一些遗传成分。然而，人类AD的某些形式，特别是具有高度遗传性的。这些遗传形式是由编码与神经退行性疾病相关的蛋白质的单个基因的罕见突变引起的，并在疾病进程的起始中起着重要作用。这些基因的突变可以被遗传或者可以偶尔出现。
这些基因中的一种编码淀粉样前体蛋白(APP)(Tanzi RE.Ann Med.21：91-94，1989)。APP是一种生化功能目前未知的膜蛋白。据了解，APP是由几种内源蛋白酶水解的底物，而且蛋白质水解释放出具有不同结构的片段。两种蛋白酶活性被称为β分泌酶和γ分泌酶。通过β分泌酶的AP蛋白质水解产生可以随后被γ分泌酶在多个位点切割的片段，以产生Aβ肽。γ分泌酶是几种蛋白质(包括早老素1和早老素2)的复合物，通过γ分泌酶的APP切割产生Aβ的多种亚型，其范围为37至43个氨基酸残基(见，例如，Steiner H，Fluhrer R，Haass C.，J Biol Chem.2008 Jul 23)。Aβ的42残基形式被认为是最致病的(Wolfe MS.Biochemistry 45：7931-7939，2006)。除了形成AD感染大脑中的沉积斑块，Aβ片段的42残基形成低聚物结构，被认为导致认知缺陷(Barten DM，Albright CF.Mol Neurobiol 37：171-186，2008)。
易于具有蛋白切割位点附近AD群的APP变异影响了致病Aβ片段的产生率、其稳定性以及其形成低聚物的能力(Selkoe DJ.Physiol Rev81：741-766，2001)。遗传这些APP变异的受试者通常在他们50多岁时显示AD的迹象，而突发的AD是不常见的，直到受试者达到70多岁(Waring SC，Rosenberg RN.Arch Neurol.65：329-34，2008)。
γ分泌酶的完整分子标识仍是未知的。早老素1或密切相关的早老素2为γ分泌酶活性所需。γ分泌酶活性在早老素1基因删除的胚胎培养细胞中降低80％。所有γ分泌酶活性在同时缺乏早老素1和早老素2的细胞中失去。γ分泌酶活性的肽类抑制剂可与早老素1和早老素2交联，表明这些蛋白质是用于切割的催化亚基。然而，γ分泌酶活性是从细胞色谱分析中作为大于1M道尔顿的大复合物得到分离。最近的基因研究已鉴定出γ分泌酶活性所需的三种以上的蛋白质；呆蛋白、aph-1和pen-1(Francis et al.，2002，Developmental Cell 3(1)：85-97；Steiner et al.，2002，J.Biol.Chemistry：277(42)：3906239065；和Li et al.，2002，J.Neurochem.82(6)：1540-1548)。累积入高分子量复合物的早老素在缺乏这些蛋白质的细胞中发生改变。编码γ分泌酶的早老素1和早老素2成分的基因中的罕见变异还赋予早发性AD的高风险(Waring SC，Rosenberg RN.Arch Neurol.65：329-34，2008)。
第三种酶(α-分泌酶)，切割β和γ切割位点之间的前体蛋白，阻止Aβ产生，并释放约3kDa被称为P3的肽，其是非病理性的。β分泌酶和α分泌酶还都产生APP的可溶性分泌末端片段(被分别称为sAPPβ和sAPPα)。sAPPα片段被认为是神经保护性的。
作为这些遗传性观察以及相当的生化和神经解剖实验的结果，模型已发现增加Aβ(特别是Aβ-42)产生和累积的生化活动，加速了AD的发病和发展。因此，治疗和预防方案都已针对减少Aβ的产生或降低其积累。
目前AD治疗的重点是降低大脑中Aβ的产生和/或累积。几种方法目前仍在研究中(Rojas-Fernandez CH，Chen M，Fernandez HL.Pharmacotherapy 22：1547-1563，2002；Hardy J，Selkoe DJ.Science.297：353-356，2002)。AD素因性APP转基因以及另外携带β分泌酶基因中失活敲除突变的小鼠显示大脑中Aβ接近完全的减少(Luo Y，Bolon B，KahnS，Bennett BD，Babu-Khan S，Denis P，Fan W，Kha H，Zhang J，Gong Y，MartinL，Louis JC，Yan Q，Richards WG，Citron M，Vassar R.Nat Neurosci4：231-232，2001)。然而，已证明，这种小鼠仍然表现出认知缺陷、过早死亡和髓磷脂形成减少(Ohno M，Chang L，Tseng W，Oakley H，Citron M，KleinWL，Vassar R，Disterhoft JF.Eur J Neurosci 23：251-260，2006；Ohno M，Sametsky EA，Younkin LH，Oakley H，Younkin SG，Citron M，Vassar R，Disterhoft JF.Neuron 41：27-33，2004；Laird FM，Cai H，Savonenko AV，FarahMH，He K，Melnikova T，Wen H，Chiang H-C，Xu G，Koliatsos VE，BorcheltDR，Price DL，Lee H-K，Wong PC.J Neurosci 25：11693-11709，2005；Dominguez D，Tournoy J，Hartmann D，Huth T，Cryns K，Deforce S，SerneelsL，Camacho IE，Marjaux E，Craessaerts K，Roebroek AJ，Schwake M，D’Hooge R，Bach P，Kalinke U，Moechars D，Alzheimer C，Reiss K，Saftig P，De Strooper B.J Biol Chem 280：30797-30806，2005；Hu X，Hicks CW，He W，Wong P，Macklin WB，Trapp BD，Yan R.Nat Neurosci 9：1520-1525，2006)。这导致β分泌酶活性是大脑中健康神经功能必需的结论，降低β分泌酶的大脑活性的治疗可能产生不利的副作用。此外，很难设计有效的大脑渗透剂β分泌酶抑制剂(Barten DM，Albright CF.Mol Neurobiol 37：171-186，2008)，这一直是从事AD药物治疗工作的那些人的目标。
还对γ分泌酶抑制剂降低大脑中Aβ的效果进行了研究。大脑渗透剂γ分泌酶抑制剂已被证明能减少Aβ合成，并减少对小鼠AD模型的学习记忆障碍(Barten DM，Meredith JE Jr，Zaczek R，Houston JG，Albright CF.DrugsR D 7：87-97，2006)。然而，γ分泌酶具有除APP之外的靶(Pollack SJ，LewisH.Curr Opin Investig Drugs 6：35-47，2005)，其中之一是跨膜受体的Notch家族。通过γ分泌酶抑制剂慢性配量的Notch信号抑制能导致使用研究化合物达到体内限制Aβ抑制范围(胃肠道、脾脏和胸腺中)的变化(SearfossGH，Jordan WH，Calligaro DO，Galbreath EJ，Schirtzinger LM，Berridge BR，Gao H，Higgins MA，May PC，Ryan TP.J Biol Chem 278：46107-46116，2003；Wong GT，Manfra D，Poulet FM，Zhang Q，Josien H，Bara T，Engstrom L，Pinzon-Ortiz M，Fine JS，Lee HJ，Zhang L，Higgins GA，Parker EM.J BiolChem 279：12876-12882，2004；Milano J，McKay J，Dagenais C，Foster-BrownL，Pognan F，Gadient R，Jacobs RT，Zacco A，Greenberg B，Ciaccio PJ.ToxicolSci 82：341-358，2004)。
第2002/0128319号美国专利申请指出，某些非甾体抗炎药(NSAIDs)降低了表达APP切割产生的Aβ40和Aβ42的细胞培养中Aβ42的产生和/水平。由于有充分的证据证明，高Aβ42水平是AD的主要风险因子，所以这些药物可用于预防、延缓或逆转AD的发展。然而，使用这类药物的缺点就是Aβ42的显著降低和明显的胃肠道副作用(包括与长期使用高剂量的NSAIDs药物等有关的出血性溃疡)需要大剂量的NSAIDs(Langman etal.，1994，Lancet 343：1075-1078)。此外，仍存在由于不受Aβ42降低剂影响的Aβ40的淀粉样肽形成以及其它形式的阿尔茨海默氏症的未知风险。因此，本领域需要一种用于Aβ产生调节相关的疾病或障碍的发展疗法。
一类化合物已被发现能减少Aβ产生，而不影响Notch信号。这类化合物包括酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼(STI-571，商品名GLEEVEC)和相关化合物，6-(2，6-二氯苯基)-8-甲基-2-(甲基硫苯基-氨基)-8H-吡啶[2，3-d]嘧啶-7-酮，被称为抑制剂2(Netzer WJ，et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.100：12444-12449，2003)。另见第2004/0028673号美国专利申请公布和第WO 2004/032925号PCT专利申请公布，它们通过引用并入本文。目前STI-571被批准用于骨髓性白血病和胃肠间质瘤的治疗。STI-571通过不需要Abl酪氨酸激酶(这种药物在白血病细胞(Netzer，上文)中的重要靶之一)的机制有效地减少了Aβ(APP转染神经母细胞瘤细胞和转染细胞的无细胞提取物两者中)的产生。STI-571和名为“抑制剂2”的相关化合物被发现能降低胚龄18天大鼠(Netzer，上文)的脑皮质制得的初级神经元培养中Aβ的产生，表明这些药物影响内源性和转染APP基因的蛋白质的水解过程。
根据GLEEVEC的产物文献，STI-571是口服的。所述药物对大脑中Aβ累积的影响已被研究，所述药物已被证明具有差的血脑屏障渗透性。在接受药物的STI-571治疗白血病患者中，所述药物的脑脊髓液(CSF)水平比血液中低92倍(Takayama N，Sato N，O′Brien SG，Ikeda Y，Okamoto S.Br JHaematol.119：106-108，2002)。因此，它在作为AD潜在治疗的未改性形式中的效用已被摒弃(Netzer，上文)。
考虑到血脑屏障的差渗透性，研究STI-571对大脑Aβ影响的人员已使用植入渗透微型泵传送STI-571或将抑制剂2鞘内注射到豚鼠(Netzer，上文)的大脑中。虽然Netzer，et al.观察到大脑中Aβ累积的减少，但他们总结出“至于Gleevec和相关药物，实现对血脑屏障高渗透程度的能力对提高治疗效果的可能性是有必要的”(Netzer，上文)。
目前仍需要一种有效地降低大脑中Aβ水平的治疗。
发明概述
本发明涉及通过测试和/或治疗周边(非大脑，非CNS)组织治疗、预防或监测大脑Aβ障碍的方法。在一些优选实施例中，所述周边组织包含肝脏，而在其它实施例中，所述周边组织包含血液和/或血清。在一些实施例中，本发明包含评价AD或易于具有AD存在的受试者，将调节Aβ产生或累积的化合物进行周边施用，并评价所述AD或AD发展的受试者。
本发明提供了通过治疗受试者的肝脏与AD治疗或预防相关的方法、组合物及加工。特别是，本发明涉及通过对产生的直接抑制(例如，通过对APP表达的抑制)或通过依次调节肝脏中Aβ的产生、加工、累积或运输的因子调节改变受试者肝脏中Aβ的产生、加工、累积或运输。这些因子包括但不限于γ分泌酶、早老素1、早老素2、载脂蛋白E、calmyrin、neugrin、1，4，5-三磷酸肌醇受体(InsP3R)或Smad相互作用蛋白-1(SIP1，由Zfhx1b编码)、凝聚素(由CLU编码，也被称为ApoJ)、磷酸肌醇结合clatherin组装蛋白(由PICALM编码)、补体受体1(由CR1编码)及其调节剂。本发明包括通过直接(例如，通过对App产生或加工起作用)或间接(例如通过依次对App起作用的因子)调节受试者肝脏中Aβ产生的影响的任何因子的调节治疗或预防AD。本发明并不受限于调节或鉴定的性质或对调节受试者肝脏中Aβ起作用的因子数。
在一些实施例中，本发明提供了被诊断为具有大脑Aβ障碍或易于具有大脑Aβ障碍的受试者的治疗方法，其中包括周边施用调节周边组织中Aβ产生的化合物。在一些优选实施例中，所述化合物抑制Aβ的产生。在特别优选实施例中，周边施用化合物具有小于2.0的分配系数，较优选为小于1.5，更优选为小于约1.0。在特别优选实施例中，所述化合物并没有实质性地跨越血脑屏障。
在一些实施例中，本发明提供了大脑Aβ障碍或易于具有大脑Aβ障碍的受试者的治疗方法，其中包括周边施用调节所述受试者周边组织中基因表达的化合物。在优选实施例中，所述基因表达的调节导致所述周边组织中Aβ产生或累积的调节。在某些优选实施例中，所述周边组织是受试者的肝脏。
本发明包括影响肝脏中Aβ产生的任何方法，包括但不限于改变APP的表达和/或加工。在一些实施例中，本发明提供了包括周边施用调节Psen1、Apo E、InsP3R、Psen2、APP、Cib1、Ngrn、Zfhx1b、CLU(也被称为ApoJ)、PICALM和CR1基因中一种或多种的化合物的方法。在一些实施例中，本发明的方法包括周边施用调节早老素2、calmyrin、neugrin、Zfhx1b、凝聚素、磷酸肌醇结合clatherin组装蛋白、补体受体1或APP表达或活性中一种或多种活性的化合物。在一些实施例中，这些基因或活性的一种或多种是在受试者肝脏中被调节的。在一些实施例中，调节包括表达或活性的抑制，而在一些实施例中，调节包括表达或活性的刺激。
在一些实施例中，本发明包含(例如)治疗大脑Aβ障碍的方法，其中包括评价大脑Aβ障碍或易于具有大脑Aβ障碍存在的受试者和周边施用调节Aβ产生的化合物的步骤，其中所述化合物并没有实质性地跨越血脑屏障，并评价大脑Aβ障碍或大脑Aβ障碍发展的受试者。需要进一步考虑的是，在一些实施例中，对治疗前和治疗后的评价结果进行了比较，以确定(例如)对大脑Aβ障碍状况的治疗效果(例如，以确定对疾病发病或发展速度或减轻的影响)。Aβ产生的调节并不受任何特定的调节方法或途径的限制。产生的调节可包括(例如)APP表达的改变(例如，减少)或APP加工为Aβ的改变。
在一些实施例中，本发明包括评价大脑Aβ障碍或易于具有大脑Aβ障碍存在的受试者和周边施用调节Aβ产生的化合物的步骤，其中所述化合物并没有实质性地跨越血脑屏障，并评价大脑Aβ障碍或大脑Aβ障碍发展的受试者。Aβ累积的调节并不受任何特定方法的限制。累积的调节可包括(例如)降低Aβ产生和/或增加Aβ的降解或清除，或改变Aβ以产生不同性质的改性形式(例如，非致病性的形式)。
需要考虑的是，在本发明的一些实施例中，Aβ产生和/或累积的调节，所述施用化合物包含γ分泌酶活性的调节剂，而在一些优选实施例中，所述化合物包含γ分泌酶活性的抑制剂。
需要进一步考虑的是，在本发明的一些实施例中，Aβ产生和/或累积的调节，所述施用化合物包含早老素2的调节剂，在一些优选实施例中，所述化合物包含早老素2的抑制剂。在一些实施例中，所述化合物包含淀粉样肽前体蛋白切割的调节剂，而在一些实施例中，所述化合物包含淀粉样肽前体蛋白切割的抑制剂。
在一些实施例中，所述化合物包含选自由STI-571、化合物1、化合物2、LY450139、GSI-953、Flurizan和E2012(Eisei)化合物或其血脑屏障不渗透性变异体组成的组的组合物。在特别优选实施例中，所述组合物具有小于2.0的分配系数(例如，在辛醇/水系统中)，较优选为小于1.5，更优选为小于约1.0。在特别优选实施例中，所述化合物并没有实质性跨越血脑屏障。
在一些实施例中，所述化合物包含干扰寡核苷酸，而在优选实施例中，所述化合物包含干扰RNA。在更优选实施例中，所述干扰RNA选自由siRNA、shRNA和miRNA组成的组。在一些实施例中，所述干扰RNA包含淀粉样肽前体蛋白RNA针对的干扰RNA，而在其它实施例中，所述干扰RNA包含早老素2RNA针对的干扰RNA。
需要考虑的是，在一些实施例中，所述化合物进一步包含用于治疗、改善或减少大脑Aβ相关障碍的风险或严重程度的已知治疗剂。在某些优选实施例中，所述已知治疗剂选自由大麻素类、dimebom、强的松、布洛芬、naproxyn、消炎痛、他汀类药物、选择性雌激素受体分子、降压药、α-阻断剂、β-阻断剂、α-β阻断剂、血管紧张肽转换酶抑制剂、血管紧张肽受体阻断剂，钙通道阻断剂、利尿剂和抗氧化剂组成的组。
本发明方法中所述化合物的周边给药并不局限于任何特定的路径。给药途径包括但不限于通过眼睛(眼部给药)、口(口服)、皮肤(透皮给药)、鼻(鼻部给药)、肺(吸入)、口腔粘膜(口腔给药)、耳、通过(例如，静脉、皮下、腹腔等)注射等。在某些优选实施例中，所述周边给药包含口服。
在本发明方法的一些实施例中，所述评价包含精神状态评价。在一些优选实施例中，所述评价包含神经心理测试和脑成像中的一种或多种。
需要考虑的是，在一些实施例中，本发明提供了一种评价受试者中大脑Aβ障碍风险或存在的方法，其中包括确定所述受试者的周边组织中Aβ的水平。在其它一些实施例中，本发明提供了一种监测受试者中大脑Aβ障碍的方法，其中包括确定所述受试者的周边组织中Aβ的水平。在一些实施例中，所述周边组织是血液，而在一些实施例中，所述周边组织是血清。在一些特别优选实施例中，监测包含测量所述周边组织在多个时间点的Aβ。
在上文公开方法的优选实施例中，所述大脑Aβ障碍是阿尔茨海默氏病。
在一些实施例中，本发明提供了监测受试者中大脑Aβ障碍的方法，其中包括分析所述受试者的周边组织中基因产物的表达或活性。在某些优选实施例中，所述基因产物选自由Psen2、APP、Cib1、Ngrn和Zfhx1b组成的组的基因的基因产物。
在一些实施例中，本发明提供了一种方法，其中包括评价大脑Aβ障碍或易于具有大脑Aβ障碍存在的受试者和周边施用抑制周边Aβ跨血脑屏障运输的化合物的步骤，其中所述化合物不是抗Aβ抗体。在优选实施例中，进一步包含评价大脑Aβ障碍或大脑Aβ障碍发展的受试者。在特别优选实施例中，所述大脑Aβ障碍是阿尔茨海默氏病。
在一些实施例中，本发明提供了一种用于治疗大脑Aβ障碍的基因靶的鉴定方法，其中包括将具有或易于具有所述Aβ障碍的第一亲本与已减少所述Aβ障碍易患性的第二亲本的后代肝基因表达谱进行比较，以鉴定具有肝脏中表达水平的可遗传的基因标记，其中，相对于所述第一亲本肝脏中的表达水平，所述后代肝脏中的基因标记的增加或减少表达与所述第二亲本的基因标记的遗传密切相关。
在一些实施例中，本发明包含用于调节具有或易于发展Aβ障碍的受试者周边组织中Aβ产生的选自由STI-571、化合物1、化合物2、LY450139、GSI-953、Flurizan和E2012化合物或其血脑屏障不渗透性变异体组成的组的化合物。在一些实施例中，所述Aβ障碍是大脑Aβ障碍。在特别优选的实施例中，所述化合物具有小于2.0的分配系数，较优选为小于1.5，更优选为小于约1.0。在特别优选实施例中，所述化合物没有实质性跨越血脑屏障。
在一些实施例中，本发明提供了用于调节具有或易于发展Aβ障碍的受试者肝脏中Aβ产生的由STI-571、化合物1、化合物2、LY450139、GSI-953、Flurizan和E2012化合物或其血脑屏障不渗透性变异体组成的组的化合物。在一些实施例中，所述Aβ障碍是大脑Aβ障碍。在特别优选实施例中，所述化合物具有小于2.0的分配系数，较优选为小于1.5，更优选为小于约1.0。在特别优选实施例中，所述化合物并没有实质性跨越血脑屏障。
在一些实施例中，本发明涉及用于调节具有或易于具有大脑Aβ障碍的受试者周边组织中Aβ产生的药剂制备的选自由伊马替尼(STI-571)、WGB-BC-15、化合物1、化合物2、LY450139、GSI-953、Flurizan和E2012化合物或其血脑屏障不渗透性变异体，和/或其药学上可接受的盐类组成的组的化合物的用途。在优选实施例中，所述药物被制成口服。在特别优选实施例中，所述周边组织包含肝脏。在更优选实施例中，所述化合物具有小于2.0的分配系数，较优选为小于1.5，更优选为小于约1.0。在特别优选实施例中，所述化合物并没有实质性跨越血脑屏障。在一些优选实施例中，本发明涉及用于抑制具有或易于具有大脑Aβ障碍的受试者周边组织中Aβ产生的药剂制备的伊马替尼或其药学上可接受的盐类的用途。
本发明还提供了用于治疗大脑Aβ障碍的包含第二治疗剂的药剂制备的上述化合物的用途。在一些实施例中，第二治疗剂选自由伊马替尼(STI-571)、WGB-BC-15、化合物1、化合物2、LY450139、GSI-953、Flurizan和E2012化合物或其血脑屏障不渗透性变异体，和/或其药学上可接受的盐类。在某些优选实施例中，所述第二治疗剂包含选自由大麻素类、dimebom、强的松、布洛芬、naproxyn、消炎痛、他汀类药物、选择性雌激素受体分子、降压药、α-阻断剂、β-阻断剂、α-β阻断剂、血管紧张肽转换酶抑制剂、血管紧张肽受体阻断剂，钙通道阻断剂、利尿剂和抗氧化剂组成的组的一种或多种药剂。在上述方法和组合物的某些特别优选实施例中，所述化合物包含甲磺酸盐形式的伊马替尼。
附图简述
图1A显示了相比于小鼠Psen2位点基因型，受试者小鼠的肝样品的Psen2 mRNA量比较曲线图。
图1B显示了绘制Psen2位点基因型(B6/B6或D2/D2)与高达89个重组自交(RI)系的6个组织(任意单位)中Psen2mRNA的浓度关系曲线。绘制了RI系附近的亲本C57和DBA值。一些组织具有Psen2位点上杂合的单RI系的数据：这些都是以B6/D2的图表示。从GeneNetwork.org获得数据(J.Wang，R.W.Williams，K.F.Manly KF，Neuroinformatics 1，299(2003))。对于肝脏，表达数据最初表示为每个探针的标准mRNA样品产生的肝脏荧光信号比率。采用校准两个通道中信号非线性的robust LOWESS平滑法对数据进行归一化。然后，我们计算这些比率(中间值)的log基数2。-1的值表示肝脏中的表达大约是对照中的1/2；-2的值表示大约是对照中的1/4等。相反地，+2的值表示肝脏中的表达大约是对照中的4倍。来自40个重组自交系的肝脏数据集如D.Gatti，et al.，Hepatology 46，548(2007)所述。对于其它组织，表达值和替代正常化方法如上(Wang，上文)。
图2是STI-571、甲磺酸盐(GLEEVECTM)、STI-571变异(″WGB-BC-15″)、化合物1(PD173955，Moasser et aI.，1999，Cancer Research59：6145-6152；Wisniewski et al.，Cancer Research 2002，62(15)：4244-55)和化合物2(PD166326；Wisniewski et al.，Cancer Research 2002，62(15)：4244-55)的化学结构图。
图3A-3F显示了周边施用的STI-571对血浆和全脑中Aβ水平的影响。对野生型B6和D2小鼠(年龄8-12周[A-F]或15-18个月[G，H])通过腹腔注射施用药物或载体7天(每天两次)。图3A显示了经盐水载体或三种剂量的STI-571治疗的D2幼鼠的血浆中Aβ六聚体水平的蛋白质印迹(泳道1、2、9和10)，泳道3、4、11和12显示1mg/kg的结果；泳道5、6、13和14显示10mg/kg的结果；以及泳道7、8、15和16显示100mg/kg的结果；每组n＝4。图3B显示了图3A蛋白质印迹图像的柱状图量化。图3C显示了经20mg/kg盐水载体或STI-571治疗的B6幼鼠的大脑提取物中的Aβ六聚体水平的蛋白质印迹(每组共n＝10，仅n＝5显示于蛋白质印迹中)。图3D显示了图3C蛋白质印迹图像的柱状图量化。图3E和3F显示了经20mg/kg盐水载体或STI-571治疗的B6老龄鼠的大脑提取物(E)或血浆(F)中的Aβ六聚体水平的柱状图(每组n＝4)。
图4显示了相比于小鼠Ngrn位点基因型，受试者小鼠的肝样品的NgrnmRNA量比较曲线图。
图5显示了绘制Cib1(图5A)或Zfhx1b(图5B)基因型(B6/B6、B6/D2或D2/D2)与40个重组自交系肝脏的calmyrin(Fig.5A)或Zfhx1b(Fig5B)mRNA浓度(任意单位)的关系曲线，如图1B所示。从GeneNetwork.org获得数据(Wang，上文)；肝脏数据集如Gatti，上文所述。
定义
本文所用的术语“受试者”和“患者”可以互换使用。本文所用的术语“受试者”是指动物，优选为包括非灵长类动物(例如，牛、猪、马、驴、羊、骆驼、猫、狗、豚鼠、大鼠、小鼠、羊)和灵长类动物(例如，猴、如食蟹猴、大猩猩、黑猩猩和人类)的哺乳动物，优选为人类。在一个实施例中，所述受试者是患有阿尔茨海默氏病(AD)的受试者。
本文所用的术语“Aβ相关障碍”或“Aβ障碍”是一种涉及Aβ水平失常或失调的疾病(例如，阿尔茨海默氏病)或病症(例如，老年性痴呆症)。Aβ相关障碍包括，但不限于AD、脑创伤相关性淀粉样肽疾病、唐氏综合征和包涵体肌炎。
本文所用的术语“疾病的风险”是指易于具有某种疾病的受试者(例如，人类)易于经历某一特定的疾病。这种倾向可能是遗传的(例如，患所述疾病(如遗传性障碍)的特定遗传倾向)，或者由于其它因素(例如，年龄、体重、环境条件、接触存在于环境中的有害化合物等)。因此，这并不意味着本发明限定于任何特定的风险，也不意味着本发明限定于任何特定的疾病。
本文所用的术语“罹患疾病”是指经历某一特定疾病或被诊断已具有某一特定疾病的受试者(例如，人类)。这并不意味着本发明限定于任何特定的迹象或症状或疾病。因此，这并不意味着本发明包括经历任何疾病范围(例如，从亚临床表现到全面发作的疾病)的受试者，其中所述受试者表现出与特定的疾病相关的至少一些标记(例如，体征和症状)。
本文所使用的术语“疾病”和”病理状况”是指互换地用来描述与活动物或者其打断或改性正常功能表现的任何器官或组织的正常状态的任何损害相关的状态、迹象和/或症状，并可能是对环境因素(如情绪创伤、物理创伤、营养不良、工业危害或气候)、特定的传染物(如蠕虫病毒、细菌或病毒)、有机体的固有缺陷(不同的基因异常)或这些和其它因素的组合的反应。
本文所用的术语“具有AD的受试者”或“显示AD的迹象或症状或病理指标的受试者”或“怀疑显示AD的迹象或症状或病理指标的受试者”是指被鉴定或诊断为具有或可能具有基于A D的已知AD迹象、症状及病理指标的受试者。
本文所用的术语“处于显示AD病理指标风险中的受试者”和“处于AD风险中的受试者”是指被鉴定为发展AD的风险的受试者。
本文所用的术语“AD治疗剂”是指用来治疗或预防AD的药剂。这类药剂包括，但不限于，小分子、药物、抗体和药品等。
本文所用的术语“认知功能”一般是指思考、推理、专心或记住的能力。因此，术语“认知功能衰退”是指缺乏思考、推理、专心或记住的能力或能力的恶化。
本文所用的术语“调节”、“已调的”或“调整”应具有其通常的含义，并包括词“提高”、“促进”、“增加”、“折磨”、“抑制”、”减少”或“拮抗”的含义。例如，酶活性(如γ分泌酶的活性)的调节剂，可直接作用，即通过直接与具有已调活性的酶相互作用，或可间接作用，即没有直接与酶相互作用，而是通过导致活性调节的途径。
本文所用的术语“评价AD的受试者”是指实施一种或多种测试，以确定(例如)受试者中AD的存在或发展，或受试者中AD发展的风险。评价AD和/或识别阿尔茨海默氏病与其它原因的失忆的受试者，可包括评价以下的一种或多种：
1.病史，其中包括评价受试者的基本健康状况和过去的医疗问题，受试者进行日常活动可能具有的问题。
2.基本医疗测试，其中包括(例如)排除其它可能原因的痴呆症(如甲状腺障碍或维生素缺乏症)的血液测试。
3.心理状态评价，因此，(例如)屏蔽记忆、解决问题的能力、注意力、计算能力和表达能力。
4.神经心理测试，包括记忆、解决问题的能力、注意力、计算能力和表达能力的更广泛评价。
5.脑部扫描或成像，使用(例如)电脑断层扫描(CT磁共振成像(MRI)；和正电子放射断层摄影术(PET)以寻找可见异常。
本文所用的术语“激动剂”是指直接或间接作用于分子以产生药理功效的任何化合物，而“拮抗剂”是指直接或间接作用于分子以减少药理功效的任何化合物。
术语“样品”和“样本”被用于其最广泛的意义，包括样品或从任何来源获得的样品或样本。本文所用的术语“样品”是指从动物(包括人类)获得的生物样品，包括液体、固体、组织和气体。在本发明的一些实施例中，生物样品包括神经组织(例如，大脑组织)、脑脊液(CSF)、浆液、尿液、唾液、血液和血液制品(如血浆和血清等)。然而，这些例子不应被解释为限制发现用于本发明的样品的类型。
本文所用的术语“血脑屏障”是指中枢神经系统(CNS)中限制血液和神经组织之间的各种化学物质和微观物体(例如，细菌)的结构。涉及“里面”与“外面”血脑屏障分别是指血脑屏障的大脑/神经组织侧面上或血脑屏障的非大脑/神经组织侧面上的事物。
本文所用的关于物质或化合物(例如，药物)的术语“血脑屏障不渗透性变异体”是指，当周边施用给受试者时，具有降低能力以渗透血脑屏障的化合物，与亲本或标准化合物的渗透性相比，这样(例如)变异并不实质性地渗透所施用的受试者的血脑屏障。如下文所述，化合物跨越血脑屏障的能力可能以本领域任何已知的方法为特点，例如，通过与血脑屏障遗传性(例如，大小和电荷等)相关的特性的体内或体外测试、计算模型或由化合物表征(例如，通过物理测试或计算模型)。
测定或估计药物的大脑/CNS吸收的方法包括体内方法(例如，静脉或颈动脉注射，随后脑部采样或成像)、体外方法(使用(例如)分离脑血管或细胞培养模型)和计算(在硅片上)预测方法，通常基于如分子量和亲油性的因素。见，例如，U.Bickel，NeuroRx.2005 January；2(1)：15-26，测量药物运输跨越血脑屏障方法的评论和比较通过引用并入本文。
化合物的亲油性/亲水性通常与化合物进入大脑的速度和范围相关。当被分区于水/有机溶剂系统中时，药物的亲油性/亲水性通常被表示为代表药物性能的分配系数。1-辛醇/水分区系统已被广泛用于评价化合物跨越血脑屏障的能力。1-辛醇/水分配系数″log P″已长期用作亲油性的描述符号和提供计算log P值(如Clog P和Mlog P)的计算机程序法，通常密切配合实验测量值(在约0.3个log单位之内；Bickel，上文)。对于电离分子，采用分配系数，即采用已确定的pH值下的log P值(通常生理血浆的pH值为7.4)。如果log P和pKa值是已知的，log D(log分配系数)，可使用Henderson-Hasselbalch方程导出。pH7.4下的Log D经常被引用，以产生血浆pH值下药物亲脂性的指示。
Hansch和同事已测定了log P约为2的药物，并通常会发现其准备进入中枢神经系统(Hansch et al.，1987，J.Pharm.Sci.76(9)：663-687，通过引用并入本文)，那些药物是更亲水的，使得它们具有低的log P值(例如，约1)，并通常降低进入CNS的能力。这一观察已应用于药物的改性，以减少作为控制方法(例如，CNS毒性或副作用)的CNS渗透。例如，心脏病药物ARL-57的CNS渗透。此药被认为是一个很好的强心药物，但患者不能使用，因为它造成人类的“壮观亮丽的色彩视觉”。ARL-57在pH 8具有2.59的log P值。产生物质的一种更亲水变异ARL115(sulmazole；在pH 8下logP＝1.17；计算为1.82)，并发现缺乏CNS副作用，这表明亲油性/亲水性的改性可用作为一种改变(例如，降低)血脑屏障的药物渗透性的方法(Hansch，et al.，上文)。
甲磺酸伊马替尼的分配系数(log P)在25和37℃下已被分别计算为1.198和1.267(Velpandian，et al.，Journal of Chromatography B，804(2)：431-434(2004))。此log P值与显示没有实质性渗透血脑屏障的伊马替尼的数据相一致。
关于受试者的位点或组织所用的术语“周边的”和“周边”是指受试者的所有位点和组织是在血脑屏障之外。
本文中所用的短语“不实质性跨越血脑屏障”或“不实质性渗透血脑屏障”涉及如果向周边组织给药或口服时的物质或化合物，例如，GLEEVEC甲磺酸伊马替尼(STI-571)，在整个CNS采样(例如，在脑组织、脑脊髓液)中保持不存在，或存在于周边组织中发现的小浓度百分比的CNS采样中，例如，周边组织中发现的浓度小于约10％，优选为小于约5％，较优选为小于约2％。例如，GLEEVEC/STI-571具有差渗透性的血脑屏障，如STI-571治疗的白血病患者，其药物的脑脊髓液(CSF)水平比血液中低92倍(Takayama N，Sato N，O′Brien SG，Ikeda Y，Okamoto S.Br J Haematol.119：106-108，2002)。因此，GLEEVEC/STI-571甲磺酸伊马替尼并没有实质性跨越血脑屏障。
本文所用的术语“有效量”是指足以产生选择性效果的量(例如，包含本发明γ分泌酶活性的调节剂的组合物)。有效量可以是一种或多种给药、应用或剂量，并不意味着限制于特定的配方或给药途径。
本文所用的化合物的“足够量”或“化合物的足够量”是指要达到预期效果含有至少最低量的量。这种量通常可由本领域普通技术人员使用本文所述分析方法的研究数据测定。
本文所用的术语“约”是指在10至15％之内，优选为在5至10％之内。
本文所用的术语“控制的”和“控制”是指来源于化合物(如降低通过细胞或组织显示的Aβ水平的化合物)的受试者的有益效果，不会导致所述疾病的治愈。在某些实施例中，对受试者施用一种或多种这种药剂，以“控制”障碍，从而阻止或减缓这种障碍的发展或恶化。
本文所用的术语“预防”、“预防的”和“防止”是指受试者的Aβ相关障碍的复发或发病或Aβ相关障碍的一种或多种症状。
本文所用的“协议”包括给药时间和剂量方案。本文的协议是使用方法，而且包括预防和治疗协议。
本文所用的术语“给药”和“施用”是指向受试者(例如，受试者或体内、体外或间接体内的细胞、组织和器官)给予药物、前药或其它药剂或治疗方法(例如，本发明组合物)的行为。人体的典型给药路径可以通过眼睛(眼部给药)、口腔(口服)、皮肤(局部或经皮给药)、鼻(鼻部给药)、肺(吸入)、口腔粘膜(口腔给药)、耳、肛门、阴道、通过(例如，静脉、皮下、瘤内、腹腔等)注射等。“周边组织”是指给予外血脑屏障的任何给药途径。
本文所用的术语“共给药”和“共施用”是指向受试者施用至少两种药剂(例如，包含STI-571和一种或多种其它药剂的组合物，例如，Aβ相关疾病治疗剂)或治疗方法的给药。在一些实施例中，两种或多种药剂或治疗方法的共给药是同时发生的。在其它实施例中，第一药剂/治疗方法在第二药剂/治疗方法前施用。本领域的普通技术人员理解，各种药剂/治疗方法的配方和/或给药途径可能会有所不同。共给药的适当剂量可通过本领域的普通技术人员较快地确定。在一些实施例中，当药剂/治疗方法是共施用时，各自的药剂/治疗方法以比适合于它们单独给药低的剂量施用。因此，实施例中的共给药是特别可取的，其中药剂或治疗方法的共给药降低了潜在有害的(例如，有毒的)药剂的所需剂量和/或当两种或多种药剂或治疗方法施用时，通过其它药剂的共给药导致受试者产生药剂之一的有益效果的敏化作用。
本文所用的术语“治疗”包括施用治疗，以预防、治愈或减轻/防止与特定的障碍、疾病、损伤或病症相关的症状。
本文所用的术语“治疗”或语法对应词包括疾病症状的改善和/或逆转(例如，Aβ相关障碍，如阿尔茨海默氏病)。当在本发明的筛选方法中使用时，从而引起与疾病相关的任何参数的改善化合物可被鉴定为治疗化合物。术语“治疗”是指治疗方法和预防法或预防措施。例如，可得益于本发明的组合物和方法的治疗的那些人，包括已经患有疾病和/或障碍(例如，Aβ相关疾病或症状或与Aβ相关疾病一致的病理)以及要预防疾病和/或障碍的(例如，使用本发明的预防性治疗)那些人。
术语“化合物”是指可用于治疗或预防疾病、病、或身体功能障碍的任何化学实体、药物和药品等。本文所用的化合物可能是单一组合物(例如，化学品的纯配方)或可能是包含多种化学品(例如，一种或多种有效药剂和一种或多种惰性剂)的组合物。化合物可包含已知的潜在治疗组合物。化合物可以通过使用本发明的筛选方法被确定为治疗剂。
“已知治疗的”化合物或药剂包括已被证明(例如，通过动物试验或之前向人类给药)在治疗中具有治疗效果的治疗性化合物。然而，已知的治疗性化合物不仅限于疾病(例如，Aβ相关疾病)治疗或预防中具有特定水平效果的化合物，包括，例如，其中数据表明有一些有利影响、很少或没有负面影响的化合物(例如，一般被认为安全的化合物，如食品提取物和保健品化合物)。当单独使用或与其它化合物或疗法组合使用时，用于治疗、改善或减少风险或Aβ相关疾病(例如，阿尔茨海默氏病)严重程度的已知治疗剂实例包括，但不限于大麻类(见，例如，Ramirez，et al，The Journal ofNeuroscience，February 23，2005，25(8)：1904-1913)；dimebom(见，例如，RSDoody，et al.，The Lancet 372：207-215(2008))；抗炎剂，如强的松(类固醇)和非甾体抗炎药(NSAIDs)，包括但不限于布洛芬、naproxyn、消炎痛；降胆固醇和/或心脏保护药物，如他汀类药物，例如，阿托伐他汀(LIPITOR
Figure BPA00001403377900181
)、西立伐他汀(BAYCOL
Figure BPA00001403377900182
)、氟伐他汀(例如，LESCOL
Figure BPA00001403377900183
)、美伐他汀、匹伐他汀(例如，LIVALO
Figure BPA00001403377900184
)、普伐他汀(例如，PRAVACHOL
Figure BPA00001403377900185
)、瑞舒伐他汀(例如，CRESTOR)和辛伐他汀(例如，ZOCOR
Figure BPA00001403377900187
)；选择性雌激素受体分子(SERMs)，例如，雷洛昔芬(EVISTA
Figure BPA00001403377900188
)；降压药，包括α-阻断剂、β-受体阻断剂、α-β阻断剂、血管紧张肽转换酶抑制剂、血管紧张肽受体阻断剂(ARBs，如缬沙坦(例如，DIOVAN
Figure BPA00001403377900189
))、钙通道阻断剂和利尿剂(见，例如，I Hajjar，et al，The Journals of Gerontology Series A：Biological Sciences andMedical Sciences 60：67-73(2005))，以及抗氧化剂，如大蒜提取物、姜黄素、褪黑激素、白藜芦醇、银杏叶提取物、绿茶、维生素C和维生素E(见，例如，B Frank，et al.，Ann Clin Psychiatry 17(4)：269-86(2005))。
本文所用的术语“小分子”一般是指分子量小于10kDa的分子，包括但不限于天然或人工合成的有机或无机化合物、多肽、(聚)核苷酸和(寡)糖等。小分子特别包括小型非聚合(即不是肽或多肽)有机和无机分子。
本文所用的术语“提取”和类似术语是指从它们的天然来源分离和/或纯化一种或多种成分的过程，或当用作名词时，是指通过这样一个过程中产生的组合物。
本文所用的术语“试剂盒”是指任何运送物质的传送系统。在激酶活性或抑制试验的情况下，这种传送系统包括允许储存、运输或将反应试剂和/或辅助材料(例如，缓冲剂，实施实验的书面指示)从一个位置传送到另一个位置的系统。例如，试剂盒包括含有关反应试剂和/或辅助材料的一个或多个外壳(例如，盒)。本文所用的术语“分段式试剂盒”是指包含两个或多个单独容器的传送系统，其中每个容器都含有总试剂盒组件的子部分。这些容器可被一起或分开传送到接收者。例如，第一容器可含有用于实验的酶，而第二容器含有测试化合物的比较标准。术语“分段式试剂盒”意欲包括含有联邦食品、药品和化妆品法第520章规定的分析物特定试剂(ASR’s)的试剂盒，但不限于此。事实上，包含两个或多个单独容器(其中每个容器都含有总试剂盒组件的子部分)的任何传送系统，都被包括在术语“分段式试剂盒”之内。相比之下，“组合式试剂盒”是指单一容器中含有反应实验的所有组件的输送系统(例如，在容纳有每个所需组件的单一盒中)。术语“试剂盒”包括分段式和组合式试剂盒两种。
本文所用的术语“有毒的”是指相比于有毒物施用前的相同细胞或组织，对受试者、细胞或组织的任何不利或有害的影响。
本文所用的术语“药学上的纯化”是指药用制剂的足够纯度或质量的组合物。
本文所用的术语“纯化”是指起始组合物的处理，以除去至少一种其它成分(例如，起始组合物的另一种成分(例如，植物或动物组织、环境样品等)、污染物、合成前体或副产品等)，这样纯化成分与除去成分之间的比例大于其在起始组合物中的比例。
本文所用的术语“药物组合物”是指活性剂(例如，包含γ分泌酶活性调节剂的组合物)与惰性或活性载体的组合，使所述组合物特别适用于体外、体内或间接体内的诊断或治疗。
本文所用的术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当向受试者施用时，实质上不产生副作用(例如，毒性、过敏或免疫反应)的组合物。
本文所用的术语“药学上可接受的载体”，是指任何标准的药物载体，包括，但不限于，磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂(例如，油/水或水/油乳剂)、各种润湿剂、任何及所有溶剂、分散介质、包衣、十二烷基硫酸钠、等渗和吸收延缓剂，崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羧基乙酸淀粉钠)等。所述组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。例如，载体、稳定剂和佐剂。(见，例如，Martin，Remington′s Pharmaceutical Sciences，15th Ed..，Mack Publ.Co.，Easton，Pa.(1975)，通过引用并入本文)。
本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指靶受试者(例如，哺乳动物受试者和/或体内或间接体内的细胞、组织或器官)中生理学上可接受的本发明化合物的任何盐(例如，通过酸或碱的反应获得)。本发明的化合物“盐”可能来源于有机或无机酸和碱。酸的实例包括，但不限于，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、磺酸、萘二磺酸和苯磺酸等。其它酸，如草酸，本身不是药学上可接受的，可在获得本发明化合物及其药学上可接受的酸加成盐中用作中间体的盐制备。
碱的实例包括，但不限于，碱金属(例如，钠)氢氧化物、碱土金属(例如，镁)氢氧化物、氨和NW4 +形式的化合物，其中W是C1-4烷基等。
盐的实例包括，但不限于：醋酸盐、己二酸盐、藻朊酸盐、天门冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、反丁烯二酸盐、氟庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、顺丁烯二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、苯丙酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一酸盐等。盐的其它实例包括：本发明化合物的阴离子与合适的阳离子(如Na+、NH4 +和NW4 +(其中W是为C1-4烷基)等)化合的盐。对于治疗使用，本发明的化合物盐被设想为药学上可接受的。然而，非药学上可接受的酸和碱盐还可发现用于(例如)药学上可接受的化合物的制备或纯化中。
对于治疗使用，本发明的化合物盐被设想为药学上可接受的。然而，非药学上可接受的酸和碱盐还可发现用于(例如)药学上可接受的化合物的制备或纯化中。在本发明的一些实施例中，药剂组合物包含选自粉末、溶液、乳剂、微团、脂质体、凝胶和膏组成的组的形式。在一些实施例中，药剂组合物包含药片或填充胶囊，其中所述药片或填充胶囊可以选择性地包含肠溶衣材料。
本文所用的术语“辅料”是指添加到活性成分配方中的无效成分(即不具有药学活性的)。
术语“基因”是指包含多肽、前体或RNA(例如，rRNA、tRNA)产生所需的编码序列的核酸(例如，DNA)序列。只要全长或片段的所需活性或功能性质(例如，酶的活性、配体结合、信号传导和免疫原性等)被保留，多肽可由全长编码序列或由编码序列的任何部分。所述术语还包括结构基因编码区和在邻近编码区5′和3′末端并与任一末端距离约1kb或以上的序列，使所述基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区5′末端和存在于mRNA的序列被称为5′非翻译序列。位于3′末端或编码区下游的序列和存在于mRNA的序列被称为3′非翻译序列。所述术语“基因”包括cDNA和基因的基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有采用非编码区序列(术语为“内含子”或“介入区”或“介入序列”)打断的编码区的基因。内含子是被转录为核RNA(hnRNA)的基因片段；内含子可能含有调控基序，如增强子。将内含子从核或初级转录中移除或“拼接出”；因此，内含子并不存在于信使RNA(mRNA)的转录中。mRNA在翻译为新生多肽中特定序列或氨基酸顺序过程中起作用。
本文所用的术语“基因表达”与“表达”是指通过基因“转录”(即通过RNA聚合酶的酶作用)基因编码的遗传信息转换为RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)的过程，对于蛋白质编码基因，通过mRNA“翻译”转换为蛋白质的过程。基因表达可在这个过程的许多阶段进行调控。“上调”或“激活”是指增加和/或提高基因表达产物(如RNA或蛋白质)产生的调控，而“下调”或“抑制”是指降低产生的调控。涉及上调或下调的分子(例如，转录因子)通常分别被称为“激活剂”和“抑制剂”。
除了含有内含子，基因的基因组形式还可包括RNA转录存在的位于序列5′和3′末端的序列。这些序列被称为“侧翼”序列或区(RNA转录存在于5′或3′非翻译序列的这些侧翼序列)。5′侧翼区可含有调控序列，如控制或影响基因转录的启动子和增强子。3′侧翼区可含有指导转录、转录后切割和聚腺苷酸化终止的序列。
术语“野生型”是指从自然来源分离得到的基因或基因产物。野生型基因是种群中最常观察到的，因而被任意设计的“正常”或“野生型”基因形式。相比之下，术语“改性的”或“突变的”是指当与野生型基因或基因产物相比时，序列和/或功能性质(即改变特性)中显示改性的基因或基因产物。值得注意的是，自然发生的突变可以被分离；当与野生型基因或基因产物相比时，这些通过它们已经改变特性(包括改变核酸序列)的事实被鉴定。
本文所用的术语“核酸分子编码”、“DNA序列编码”和“DNA编码”是指沿着脱氧核糖核酸一条链的脱氧核糖核苷酸顺序和序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了沿着肽(蛋白质)链的氨基酸顺序。因此，DNA序列编码氨基酸序列。
本文所用的术语“真核生物”是指区别于“原核生物”的生物体。这意味着所述术语包括表现出真核生物通常特性(如在染色体中通过核膜结合真正细胞核的存在、膜结合细胞器和常见真核生物的其它特性的存在)的细胞的所有生物体。因此，所述术语包括，但不限于如真菌、原生动物和动物等生物体(例如，人类)。
本文所用的术语“体外”指的是人工环境以及在人造环境中发生的过程或反应。体外环境可以包括，但不限于，试管和细胞培养。术语“体内”是指自然环境(例如，动物或细胞)以及在自然环境中发生的过程或反应。
术语“测试化合物”和“候选化合物”是指任何化学实体、药物、药品和用于治疗或预防疾病、病或身体功能(例如，认知功能、淀粉样蛋白相关障碍、循环、高血压和心脏病等)障碍的候选类似物。测试化合物包含已知的和潜在的治疗化合物。测试化合物可以通过使用本发明的筛选方法进行筛选被确定为治疗剂。
本文所用的术语“功能的”分子是通过其特点表现出其性质的分子。举例来说，功能酶是通过酶的特点表现出其催化特性的酶。
本文所用的术语“反义寡核苷酸”是指核酸，例如，与靶RNA(或其片段)序列互补的RNA或DNA片段。通常情况下，所述靶RNA是通过细胞表达的mRNA。
本文所用的术语“干扰寡核苷酸”涉及能够抑制靶基因产物功能的寡核苷酸，不管抑制机制。本文所用的干扰寡核苷酸包括但不限于反义寡核苷酸、寡核苷酸适配子、微RNA(miRNAs)，短干扰RNA(siRNAs)和短发夹RNA(shRNA)。短干扰RNA通常组成为双链RNA分子，一般为19-22nt，而短发夹RNA组成为通过循环序列连接的回文序列，一般为19-29nt。干扰寡核苷酸的产生方法是本领域普通技术人员众所周知的，包括但不限于化学合成、重组DNA技术或较大的前体分子利用酶切割产生，例如，通过Dicer酶。
本文所用的术语“抗体”是指包含抗原识别位点的免疫球蛋白或免疫球蛋白源性蛋白。抗体包括但不限于包含两条重链和两条轻链的天然或重组免疫球蛋白，以及改性形式，包括，例如，包含重链和轻链部分的不同组合的片段抗体和单链抗体。所述术语包括多克隆和单克隆抗体。
发明详述
发明详述和发明概述描述了本发明的特定实施例，它们的内容通过引用并入本文。虽然已结合具体实施例对本发明进行了描述，应要了解的是，所声称的本发明不应受到具体实施例的不必要限制。例如，结合γ分泌酶活性的特定调节剂对本发明的方法和组合物进行了描述，例如，GLEEVEC(STI-571)甲磺酸伊马替尼和特定的大脑淀粉样蛋白障碍(例如，阿尔茨海默氏病)。应要了解的是，本发明并不局限于使用或包含甲磺酸伊马替尼的方法或组合物或AD。
本发明在某种程度上是基于申请人的周边组织中(例如，肝脏中)Aβ表达或累积的调节的惊人发现，提供大脑中Aβ相关疾病(例如，阿尔茨海默氏病)的治疗效果。因此，本发明通常涉及通过在非神经(即周边)细胞、流体和/或组织中施用调节Aβ产生和/或累积的化合物，预防或治疗大脑Aβ相关障碍(如AD)的方法和组合物。
如上所述，β淀粉样肽(Aβ)是淀粉样肽前体蛋白(APP)的代谢产物，并被认为是阿尔茨海默氏病(AD)的主要病理因素。APP通过β和γ分泌酶蛋白水解产生Aβ肽，含有被认为最致病的42残基形式的Aβ。β分泌酶为健康大脑功能所需，因而是降低Aβ比较差的候选抑制剂。由于打断γ分泌酶对其它靶(特别是跨膜受体的Notch家族)的作用，一些大脑渗透剂γ分泌酶抑制剂已表现出不良的副作用。一类化合物已被发现能降低Aβ的产生，而不影响Notch信号。这类化合物包括酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼(STI-571，商品名为GLEEVEC)和相关化合物，6-(2，6-二氯苯基)-8-甲基-2-(甲基硫苯基-氨基)-8H--吡啶[2，3-d]嘧啶-7-酮，被称为抑制剂2(NetzerWJ，et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.100：12444-12449，2003)。然而，这类化合物已从大脑Aβ障碍治疗中被排除，因为它并不实质性跨越血脑屏障，从而使传送给大脑组织过分地困难。
如上所述，我们已经发现，周边组织中(例如，肝脏中)Aβ表达或累积的调节的惊人发现，提供大脑Aβ相关疾病(例如，阿尔茨海默氏病)的治疗效果。本发明提供了通过治疗受试者的肝脏与治疗或预防AD相关的方法、组合物及过程。特别是，本发明涉及通过直接抑制产生(例如，通过抑制APP表达)或通过依次调节肝脏中Aβ产生、加工、累积或运输的因子改变受试者肝脏中Aβ的产生、加工、累积或运输。在优选实施例中，所述抑制是通过使用并不实质性跨越血脑屏障的化合物。在特别优选实施例中，治疗的组合物和方法包括使用STI-571或其药学上可接受的盐，进行周边给药(例如，口服)。
药剂制备中组合物的用途
伊马替尼是以下式I化合物4-(4-甲基哌嗪-1-甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基)嘧啶-2氨基)苯基]-苯甲酰胺的通用名称[国际非专有名称]：
Figure BPA00001403377900241
STI-571一般是指甲磺酸伊马替尼盐，并已被批准用于治疗慢性骨髓白血病和胃肠道间质瘤。伊马替尼治疗乳腺癌的用途在第WO 2004/032925号专利中有所描述。伊马替尼、其制备、其药学上可接受的盐(例如，酸加成盐)以及其蛋白激酶抑制特性在第55/21184号美国专利中有所描述，它们的全部内容通过引用并入本文。“伊马替尼”对应于作为游离碱或甲磺酸盐的4-(4-甲基哌嗪-1-甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基)嘧啶-2氨基)苯基]-苯甲酰胺。伊马替尼的制备及其用途在第EP-A-O 564 409号欧洲专利申请的例21中有所描述，它们的全部内容通过引用并入本文。
虽然周边给药并不局限于任何特定的给药路径，在一些优选实施例中，给药是口服的。因此，在一些优选实施例中，本发明包含用于治疗或预防大脑Aβ障碍的口服药剂制剂中使用STI-571。在一些实施例中，口服形式包含片剂，而在一些实施例中，口服形式包含胶囊剂。
在优选实施例中，本发明包含片剂或胶囊剂(其中包括有效量的伊马替尼)的制剂，以降低大脑中的Aβ水平。例如，胶囊剂或片剂可包含100至1000mg活性剂(例如，伊马替尼或其衍生物)。例如，片剂或胶囊剂可包含100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000mg，或其之间的任何方便剂量数(例如，125mg、150mg、175mg、225mg、250mg...975mg等)。在一些实施例中，片剂或胶囊剂被配置为含有较小有效剂量的伊马替尼，例如，1至5mg(如1、2、3、4或5mg，或其方便的小量)、6至10mg以及11至15mg等。
口服组合物和制剂包括，例如，粉末或颗粒剂、水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊剂、香囊片、可溶性创口贴和片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是可取的。在优选实施例中，片剂或胶囊剂(周边给药的其它形式)被配置为传送的剂量为或相当于1和1000mg之间的任何正整数mg(例如，1、2、3、4和5等)或1和1000mg之间的任何小数mg。在某些实施例中，制剂可包含，例如，填充有组合物混合物的胶囊剂：
甲磺酸伊马替尼(STI-571)119.5mg(相当于100毫克伊马替尼游离碱)
在一些实施例中，胶囊剂或片剂包含肠溶包衣。“肠”是指小肠，因此“肠溶衣”一般是指在到达小肠之前实质性阻止药物释放的包衣。虽然没有限制本发明的任何特定作用机理，应了解，大多数肠溶衣通过呈现于酸性pH值稳定的表面而工作，但在较高pH值下迅速分解。
肠道外给药组合物和制剂可包括还可包含缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂(例如，但不限于载体化合物及其它药学上可接受的载体或辅料)的无菌水溶液。
本发明的药物配方，可方便地存在于单位剂量形式中，可根据制药行业众所周知的常规技术制得。这些技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。一般而言，所述配方通过均匀地或密切地使活性成分与液体载体或细固体粉末载体或两者结合，然后，如有必要，成形所述产品。
健康受试者研究和药代动力学研究中已对甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC)的药代动力学进行评价。伊马替尼是口服后吸收良好，分别在给药后2-4小时达到Cmax。平均绝对生物药效率为98％。在健康志愿者口服后，伊马替尼及其主要活性代谢产物(N-去甲基衍生物)的消除半衰期分别约为18至40小时。平均伊马替尼AUC(血药浓度与随时间变化的曲线形成的面积)随剂量在25mg-1000mg之间的增加而增加。重复给药的伊马替尼的药代动力学没有显著变化，当每日一次给药时，处于稳定状态的累积是1.5-2.5倍。在体外实验中与血浆蛋白结合的伊马替尼的临床相关浓度约为95％，主要是与白蛋白和α1-酸性糖蛋白。见，例如，″Gleevec PrescribingInformation″2003版T2003-09；印刷于U.S.A.89019001(Novartis)。
CYP3A4是负责伊马替尼代谢的主要酶。其它细胞色素P450酶，如CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9和CYP2C19，在其新陈代谢中起的作用不大。人类的主要循环活性代谢产物是由CYP3A4为主形成的N-去甲基哌嗪衍生物。这表明体外药效类似于亲本伊马替尼。这种代谢产物的血浆AUC为约15％的伊马替尼AUC。
消除主要是在通常作为代谢物的粪便中。基于口服伊马替尼的14C标记剂量后化合物的回收，约81％的剂量(粪便(68％的剂量)和尿(13％的剂量))是在7天内被消除。未变化的伊马替尼占25％的剂量(5％尿液，粪便20％)，其余为代谢物。
通常情况下，体重50kg的50岁患者的伊马替尼清除预计为8L/h，而体重100kg的50岁患者的伊马替尼清除将增加至14L/h。然而，清除中40％的病人间可变性并不证明基于体重和/或年龄的初始剂量调整，但表示需要用于治疗相关毒性的密切监测。
据报道，在成年患者中，伊马替尼在口服后迅速吸收，在儿科患者中，2-4小时达到Cmax。表观口服清除率类似于成人值(儿童为11.0L/hr/m2，成人为10.0L/hr/m2)，正如半衰期(儿童为14.8小时，成人为17.1小时)。260mg/m2和340mg/m2的儿童剂量都获得与成人400mg剂量类似的AUC。在每天重复一次服用后，第8天AUC(0-24)与第1天260mg/m2和340mg/m2剂量水平的比较分别揭示了1.5和2.2倍的药物累积。平均伊马替尼AUC并没有随剂量的增加按比例增加″Gleevec Prescribing Information″2003版T2003-09；印刷于U.S.A.89019001(Novartis)。
虽然通过使用伊马替尼治疗的肝脏的Aβ产生的调节被用于上述的实例，本发明并不限于使用这种化合物治疗肝脏，并提供了用于治疗受试者患有大脑Aβ障碍或易于具有大脑Aβ障碍的一般方法，其中包括周边施用调节所述受试者的周边组织的基因表达的化合物。在优选实施例中，所述基因表达的调节导致所述周边组织中Aβ产生或积累的调节。在某些优选实施例中，所述周边组织是受试者的肝脏。
本发明包括影响肝脏中Aβ产生的任何方法，包括但不限于改变APP的表达和/或加工。在一些实施例中，本发明提供的方法，本发明提供了包含周边施用调节Psen 1、Apo E、InsP3R、Psen2、APP、Cib1、Ngrn、Zfhx1b、CLU(也称为ApoJ)、PICALM和CR1基因中一种或多种表达的化合物。在一些实施例中，本发明的方法包括周边施用调节早老素2、calmyrin、neugrin、Zfhx1b、凝聚素、磷酸肌醇结合clatherin组装蛋白、补体受体1或APP中一种或多种表达或活性的化合物。在一些实施例中，这些基因或活性的一种或多种是在受试者肝脏中被调节的。在一些实施例中，调节包括表达或活性的抑制，而在一些实施例中，调节包括表达或活性的刺激。
在周边治疗过程中评价和监测大脑Aβ障碍
本发明涉及通过受试者周边(例如，非大脑)组织的测试和给药，测试和治疗AD以及AD风险。如下文所述，本研究表明，肝脏和/或在一种或多种周边组织中的早老素2表达改变了Aβ累积，周边Aβ的降低足以改变其在大脑中的沉积。因此，尽管与文献中的大量过程相反，降低AD累积的有效治疗或预防治疗不必跨越血脑屏障并进入大脑。中枢神经系统外(即血脑屏障外)的Psen2或γ分泌酶活性的抑制或通过其它方法Aβ产生或累积的降低，在Aβ相关病理的大脑保护中获得运用。周边组织的治疗具有保护大脑不受可发生的任何不利副作用影响的其它好处。
在一些实施例中，本发明提供了剪裁处理为受试者或患者的生化状态的方法。正考虑的是，选自周边组织中Aβ调节的一种或多种化合物的有效剂量特征可通过受试者或患者的特定生化情况受到影响，包括但不限于其它药物或药剂的存在(例如，Aβ障碍或无关病症的治疗)或其它情况造成的生化变化。本发明提供了包括通过在施用调节Aβ产生(例如，在肝脏中)的化合物之前和之后评价大脑Aβ障碍或大脑Aβ障碍发展的所述受试者对受试者进行监测的方法。在一些实施例中，大脑Aβ障碍的治疗是相应地被选择、调整或改变的。
实施例
以下提供的实例是为了证明和进一步说明本发明的某些优选实施例和方面，并不能被解释为对其范围的限制。
实施例1
AD类似病理发展改性剂的鉴定
转基因小鼠模型已被发展为概括人类阿尔茨海默氏症的关键特征。人类中携带有一些AD素因性变异的APP基因已被连接到各种转录启动子并被介入小鼠生殖系中(Games D，Adams D，Alessandrini R，Barbour R，Berthelette P，Blackwell C，Carr T，Clemens J，Donaldson T，Gillespie F，et al.Nature 373：523-527；Hsia AY，Masliah E，McConlogue L，Yu GQ，Tatsuno G，Hu K，Kholodenko D，Malenka RC，Nicoll RA，Mucke L.Proc Natl Acad SciU S A.96：3228-3233，1999；Hsiao K，Chapman P，Nilsen S，Eckman C，Harigaya Y，Younkin S，Yang F，Cole G.Science 274：99-102，1996；Sturchler-Pierrat C，Abramowski D，Duke M，Wiederhold KH，Mistl C，Rothacher S，Ledermann B，Bürki K，Frey P，Paganetti PA，Waridel C，CalhounME，Jucker M，Probst A，Staufenbiel M，Sommer B.Proc Natl Acad Sci U S A94：13287-13292，1997；Moechars D，Dewachter I，Lorent K，ReverséD，Baekelandt V，Naidu A，Tesseur I，Spittaels K，Haute CV，Checler F，Godaux E，Cordell B，Van Leuven F.J Biol Chem.274：6483-6492，1999；Richardson JC，Kendal CE，Anderson R，Priest F，Gower E，Soden P，Gray R，Topps S，HowlettDR，Lavender D，Clarke NJ，Barnes JC，Haworth R，Stewart MG，Rupniak HT.Neuroscience 122：213-228，2003；Buttini M，Yu GQ，Shockley K，Huang Y，Jones B，Masliah E，Mallory M，Yeo T，Longo FM，Mucke L.J Neurosci.22：10539-10548，2002)。所得转基因小鼠发展了Aβ沉积，但时间为3个月至15个月的年龄。导致这些年龄差异的变量包括选择的特定转录启动子、APP基因中的特定AD素因性变异突变、转基因上保留的转基因整合染色体位点和小鼠背景品系(reviewed in Bloom FE，Reilly JF，Redwine JM，WuCC，Young WG，Morrison JH.Arch Neurol.62：185-187，2005)。
一份报道(Kulnane LS，Lamb BT.Neurobiol Dis.8：982-992，2001)将携带有所谓的Swedish突变的人类APP转基因R1.40介入混合C57Bl/6x129/S小鼠遗传背景(K670N，M671L，使人类易于具有遗传这种突变基因以发展为早期AD)。R1.40转基因的表达被排除出天然人类APP启动子。Aβ沉积首先是在这些14-16个月小鼠的大脑中被检测到。随后，R1.40转基因跨越分离为C57Bl/6(B6)、DBA/2(D2)和129/Sv背景的最初背景。然后，这3个品系的每一个被培养为对比构型：将10个或多个从背后跨越入相同的背景，这样产生相同的3个转基因品系，但产生不同的背景。虽然所有3个转基因品系产生相同量的APP前体(表明所述转基因在3个品系的背景下同等地表达)，通过在第21和60天采用ELISA法测定大脑组织匀浆和血浆，B6s比其它两品系累积了更多的Aβ(APP致病片段)，并在第13.5个月发展人类AD特有的淀粉样蛋白沉积，而D2s受到了保护(2年没有沉积)。因此，这表明有区分B6和D2小鼠的基因，并改变AD类似病理的发展，这些最可能涉及致病物质Aβ的累积(Lehman EJ，Kulnane LS，Gao Y，Petriello MC，Pimpis KM，Younkin L，Dolios G，Wang R，Younkin SG，LambBT.Hum Mol Genet.12：2949-2956，2003)。所述改性基因的同一性可表明治疗或预防方式，将模拟改性效果、延缓或阻止AD病理的出现。
为了将改性基因分配给染色体间隔，里曼和同事(Ryman D，Gao Y，Lamb BT.Neurobiol Aging 29：1190-1198，2008)使用雄性小鼠R1.40(也是转基因纯合)与雌性小鼠B6R1.40(转基因纯合)杂交，然后将其F1后代(所有这些具有2拷贝R1.40转基因)杂交为非转基因B6x D2 F1后代，产生516F2小鼠，其中每个携带有单一转基因。对这些进行了909SNPs的基因分型。通过ELISA法检测516小鼠的大脑匀浆中的Aβ。采用516小鼠累积基因型的Aβ量的回归分析允许3个改性的基因位点被分配至以下列位置为中心的广大区域：1号染色体，182.049374碱基(Mb)；2号染色体，41.216315Mb；7号染色体，63.680922Mb。
鉴定改性基因
编码早老素2(Psen2)的小鼠基因，位于182.06371Mb的1号染色体上(性状基因位点间隔的中心)，这意味着其作为改性Aβ累积和沉积的候选对象。这与它作为γ分泌酶成分的功能是一致的。对于代表通过Ryman和同事插入1号染色体的实际改性剂的Psen2，其活性必须在B6和D2小鼠品系之间可遗传地(以孟德尔方式)改变，B6小鼠必须大于D2小鼠的Psen2活性，因为较低的γ分泌酶活性预计将在AD中受到保护。我们通过测定B6和D2小鼠品系各种组织中Psen2基因累积的mRNA量对该组织进行了研究，通过B6和D2杂交并将其后代培养为对比构型产生高达89个重组近交系小鼠。B6和D2小鼠品系以及89个重组近交系小鼠的10个组织(大脑、小脑、肝脏、纹状体、肾脏、海马、眼睛、前额皮质、伏隔核和新皮质)中每种超过20,000mRNA的浓度和89个重组近交系小鼠的浓度可在http://www.GeneNetwork.org编译的公共数据库中得到。对于89个重组近交系小鼠中的每一个，通过基因分型所述品系是否遗传了其B6或D2亲本基因组的每个间隔对其进行测定。
探针rs13476267位于182.120454Mb的1号染色体上。采用软件在万维网公共网站的genenetwork.org/webqtl/WebQTL.py上，我们进行了rs13476267间隔的基因型和高达89个重组近交系小鼠的10个组织中每一个累积的Psen2 mRNA量之间的性状统计，计算皮尔森积矩。所述值分别为：
Figure BPA00001403377900311
脑源性组织样品均未显示Psen2表达的高遗传力(|r|＞0.9)，对于表现出Psen2 mRNA表达中等遗传力的两个大脑区、小脑和伏隔核，与B6基因型表达相比，较多的Psen2 mRNA与D2基因型更相关。然而，在肝脏中，Psen2 mRNA的量与Psen2基因位点的基因型(图1A)非常相关。此外，B6小鼠比D2小鼠表达了更多的Psen2。
数据表明，肝脏或一种或多种周边组织中的Psen2表达改变了Aβ的累积，并在周边组织中Aβ的降低足以改变其在大脑中的沉积。因此，尽管与文献中的大量过程相反，至少基于大脑疾病将由发生在大脑内的事件所造成的自然假设，降低Aβ累积的AD的有效治疗或预防治疗，不必跨越血脑屏障并进入大脑。中枢神经系统以外的Psen2或γ-分泌活性的抑制或通过其他方法的Aβ产生或累积的降低，足以保护大脑不受Aβ沉积的影响，而保护大脑免受可能发生的不良副作用是治疗剂进入大脑。周边Aβ累积的治疗可以通过使用不包括直接应用到CNS(例如，通过CSF传送)的给药途径实现，如通过口服。
实施例2
STI-571甲磺酸伊马替尼降低大脑中Aβ的周边给药
插入研究和我们进一步理念的数据表明，治疗AD(其启动、发展或严重程度)的新治疗途径基于调节肝脏中Aβ的产生。新治疗策略的依据是，降低血液中稳态Aβ水平的药物(通过抑制肝脏中Aβ的产生)将降低大脑中Aβ的浓度。
实验的目的是为了测试STI-571甲磺酸伊马替尼给药对2个小鼠品系的大脑和血液中Aβ蛋白水平的影响。通过一周期间的IP注射分别向小鼠施用STI-571甲磺酸伊马替尼，并通过ELISA或蛋白质印迹移除大脑和组织样品以及测量Aβ蛋白水平。
对野生型C57BL/6和DBA/2J雄性小鼠(8-12周龄)分别腹腔注射药物或载体7天，每天两次。采用100ul生理盐水注射载体组(每个品系n＝4只动物)，药物治疗组(n＝4)接受1、10或100mg/kg STI-571(GLEEVEC伊马替尼甲磺酸盐，产品编号I-5508，LC laboratories，Woburn，MA))。对人类癌症患者所开的STI-571剂量为100mg至1000mg。见，例如，GleevecPrescribing Information 2003 revision T2003-09；以U.S.A.89019001(Novartis)印刷，它们的全部内容通过引用并入全文。
在最后一次注射后12小时，将动物处死。采用异氟烷麻醉受试者小鼠，通过试验肝素化注射器的心脏穿刺采取血液样品(100-300ul)。在EDTA存在下，将样品置于冰上30分钟，然后在16,000xg、4℃下离心20分钟。将血浆部分移除并储存于-80℃下。将大脑移除，并在干冰上迅速冰冻，并储存于-80℃下。
通过使用市售的免疫检测试剂盒(Biosource mouse Aβ1-40，CatalogNo.KMB3481，Invitrogen，Carlsbad，CA)或蛋白质印迹对血液和大脑组织样品中的小鼠Aβ1-40进行检测。在实验议定书所述的5M盐酸胍和50mMTris盐酸(pH 8.0)存在情况下，通过在多稳原件中均质化大脑组织制备小鼠大脑组织样品。(见，例如，Masliah，E.，et al.，(2001)βamyloid peptidesenhance α-synuclein accumulation and neuronal deficits in a transgenic mousemodel linking Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease.PNAS98：12245-12250；Johnson-Wood，K，et al.(1997)Amyloid precursor proteinprocessing and A beta42 deposition in a transgenic mouse model of Alzheimerdisease PNAS 94：1550-1555；and Chishti，M.A.，et al.(2001)；Early-onsetamyloid deposition and cognitive defects in transgenic mice expressing adouble mutant form of amyloid precursor protein 695.J.Biol.Chem.276：21562-21570.)
对于实验，将大脑匀浆以1∶10的比例在含有Dulbecco磷酸缓冲生理盐水(5％BSA和0.03％吐温-20)的反应缓冲剂中稀释，并补充有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(目录号539131，EMD Biosciences，La Jolla，CA)。将血液样品以1∶5的比例在标准稀释缓冲剂中稀释。对样品以一式两份进行检测，并在Tecan infinite 2000板读取器上分别测定OD450。
在基本上描述的SDS馏分中萃取低聚物Aβ(T.Kawarabayashi，et al.，Neurosci 21，372(2001))。对于蛋白质印迹，样品经PAGE分析，被转移到PVDF膜，采用制造商推荐的协议(1∶1,000；Covance)针对小鼠Aβ的单克隆抗体4G8对Aβ六聚体进行可视化。通过显微测密术扫描印迹，然后使用抗体再次探测作为负载和转移对照的组蛋白H3(1∶50000；Abcam)。数据被描绘成归一化的光密度。
两个小鼠品系(C57BL/6和DBA/2J)间大脑和血液中的Aβ水平不同。C57BL/6小鼠的大脑和血液样品中比载体治疗对照组中DBA/2J小鼠的大脑和血液样品中的Aβ水平高，如先前所示。
图3显示了周边施用STI-571对血浆和大脑中Aβ水平的影响。图3A显示了经生理盐水载体或三种剂量的STI-571治疗(泳道1、2、9和10)的幼龄D2小鼠的血浆中Aβ六聚体水平的蛋白质印迹，泳道3、4、11和12显示了1mg/kg的结果；泳道5、6、13和14显示了10mg/kg的结果，以及泳道7、8、15和16显示了100mg/kg的结果，每组n＝4。图3B显示了图3A中蛋白质印迹图像的柱状图量化。图3C显示了经生理盐水载体或20mg/kg STI-571治疗的幼龄B6小鼠的大脑提取物中Aβ六聚体水平的蛋白质印迹(每组总共n＝10；蛋白质印迹中只显示n＝5)。图3D显示了图3C中蛋白质印迹图像的柱状图量化。图3E和3F显示了经生理盐水载体或20mg/kg STI-571治疗的老龄B6小鼠的大脑提取物(E)或血浆(F)中Aβ六聚体水平的蛋白质印迹(每组n＝4)。
血浆Aβ的剂量依赖性减少被观察到(图3A-B)，最高剂量减少约75％的循环Aβ。中间剂量(20mg/kg)被选定为大脑作用的研究。此剂量减少了幼龄和老龄B小鼠中约50％Aβ的大脑和血浆水平(图3B和3C)。Aβ的这些水平被观察到在R1.40小鼠模型中受到保护(E.J.Lehman，et al.，Hum MolGenet 12，2949(2003))。
这些结果表明，短期(一周)STI-571伊马替尼治疗显著降低了血液和大脑中的Aβ水平。此外，由于药物在本研究中所使用的浓度并没有明显跨越血脑屏障，结果表明，STI-571甲磺酸伊马替尼可以间接通过周边地调节Aβ产生，改变大脑中Aβ的水平。
实施例3
候选2号和7号染色体改性基因的鉴定
上述研究表明，致病Aβ很可能来自肝脏。使用上述相同的数据库和方法，我们还搜索到插入2号和7号染色体间隔的基因，其在肝脏中的活性可在B6和D2小鼠品系之间变化地遗传。
标记rs4226715位于80.138616Mb的7号染色体上，在所述染色体的改性基因位点之内。得自这个间隔的两个基因显示了肝脏内极高的遗传表达：Ngrn基因和Cib1基因。所述Ngrn基因编码neugrin(一种功能未知的广泛表达蛋白)，其表达在某些癌症中增加，并已与神经母细胞瘤分化相关(S.Ishigaki，et al.，Biochem Biophys Res Commun 279，526(2002)，S.R.Hustinx，et al.，Cancer Biol Ther 3，1254(2004))，Cib1基因编码calmyrin，最初发现十四烷基钙和整合蛋白结合膜相关蛋白是因为它与HeLa细胞的优先相互作用(S.M.Stabler，et al.，J Cell Biol 14，145，1277(1999))。这些基因分别显示了最高的相关性：Pearson值r＝0.945和r＝-0.913，都满足P＜4.99e-39(图5和4)。Ngrn位于80.138736Mb的7号染色体上和80.10150 7Mb的Cib1上，都与插入改性基因位点一致。
如上所述，calmyrin具有所示的与早老素2的相互作用。然而，由于大脑中的calmyrin分布与早老素分布或最易受到AD病理影响的区域不是很相关，过去研究已考虑过它在促进前脑中Aβ产生的潜在作用，但判断出这种作用不大可能(M.Blazejczyk，et al.，Biochim Biophys Acta 1762，66(2006))。然而，Calmyrin是通过肝脏(S.M.Stabler，上文)高效表达的。有人建议calmyrin活性为肌醇1，4，5-三磷酸肌醇受体Ca(2+)释放通道的蛋白配体(C.White，et al.，J Biol Chem 281，20825(2006).)，其门控活性在早老素基因突变转染的鸡细胞中是异常的(K.H.Cheung，et al.，Neuron 58，871(2008))。
肝calmyrin mRNA表达的遗传力极高。在从B6亲本遗传Cib1基因的每一个品系中，calmyrin mRNA的量比从D2亲本遗传其Cib1基因的品系所观察到的量高(图5A)。1一个品系(73系)似乎是探针杂合的，但表达calmyrin mRNA的D2类似量。这表明肝脏中的低calmyrin表达降低大脑中Aβ的累积，并保护小鼠不受副作用影响。
采用降低calmyrin Aβ强化活性的化合物的治疗应模拟D2基因型的低表达，从而起到预防作用。
Neugrin具有负相关(图4)。肝脏中的许多neugrin与降低Aβ累积相关，这表明采用增加Neugrin的化合物治疗应起到预防作用。
标记rs3669981位于44.943029Mb的2号染色体上，在所述染色体相当广泛的改性基因位点之内。编码锌指同源异型1b蛋白的Zfhx1b基因(44.810557Mb)显示出最高的相关性：r＝-0.919，p＝4.99e-39(图5B)。所述Zfhxb1蛋白是涉及Wnt和Hedgehog信号的一种Smad相互作用转录辅阻遏物(G.Bassez，et al.，Neurobiol Dis 15，240(2004)；G.Verstappen，et al.，Hum Mol Genet 17，1175(2008)；N.Isohata，et al.，Int J Cancer 125，1212(2009).)。有害的基因变异导致发育障碍莫厄特-威尔逊综合征，其伴有包括精神发育迟缓的多种先天性缺陷(C.Zweier，et al.，Am J Med Genet 108，177(2002))。虽然Zfhx1b基因在发育过程中广泛表达，尤其是在神经系统中，在成年小鼠肝脏中最高效表达(G.Bassez，上文)。Zfhx1b基因位于44.810557Mb的2号染色体上，与插入的改性基因位点一致。肝脏mRNA表达对这种基因的遗传力是非常高的。几乎在遗传B6亲本Zfhx1b基因的每一个品系中，Zfhx1b mRNA的量比其从D2亲本遗传的Zfhx1b基因的品系中的高(图5B)。12和36品系在探针基因型方面存在不同，但具有类似的mRNA水平。这些数据表明，肝脏中的低Zfhx1b表达降低了大脑中Aβ的累积，并保护小鼠不受副作用影响。治疗一种化合物，抑制Zfhx1b活动应模仿的D2基因的低表达，因此要保护。抑制Zfhx1b活性的化合物的治疗应模拟D2基因型的低表达，从而起到预防作用。
上述说明书中的所有出版物和专利通过引用并入本文。此外，第61/114459号美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。在不脱离本发明范围和精神的情况下，本发明所述组合物和方法的各种改性和变化对本领域的普通技术人员而言将是显而易见的。虽然已结合具体优选实施例对本发明进行了描述，应该认识到，所声称的本发明不应受到这些具体实施例的不必要限制。事实上，对相关技术领域普通技术人员而言显而易见的实施本发明的所述模式，意欲属于本发明的范围。

Claims (88)

1.伊马替尼或其药学上可接受的盐在药剂制备中的用途，所述药剂用于具有或易于发展大脑Aβ障碍的受试者的周边组织中Aβ产生的调节。
2.伊马替尼或其药学上可接受的盐在药剂制备中的用途，所述药剂用于具有或易于发展大脑Aβ障碍的受试者的肝脏中Aβ产生的调节。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述大脑Aβ障碍是阿尔茨海默氏病。
4.如权利要求1-3所述的用途，其中所述药剂配制用于口服。
5.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述药剂进一步包含用于治疗大脑Aβ障碍的有效量的第二治疗剂。
6.如权利要求5所述的用途，其中所述第二治疗剂包含选自由大麻素类、dimebom、强的松、布洛芬、naproxyn、消炎痛、他汀类药物、选择性雌激素受体分子、降压药、α-阻断剂、β-阻断剂、α-β阻断剂、血管紧张肽转换酶抑制剂、血管紧张肽受体阻断剂、钙通道阻断剂、利尿剂、NSAIDS和抗氧化剂组成的组的试剂。
7.如权利要求1-6中任一项所述的用途，其中所述伊马替尼是甲磺酸盐的形式。
8.选自由WGB-BC-15、化合物1、化合物2、LY450139、GSI-953、Flurizan和E2012化合物、其血脑屏障不渗透性变异体、和/或药学上可接受的盐组成的组的化合物在药剂制备中的用途，所述药剂用于具有或易于发展大脑Aβ障碍的受试者的周边组织中Aβ产生的抑制。
9.选自由WGB-BC-15、化合物1、化合物2、LY450139、GSI-953、Flurizan和E2012化合物、其血脑屏障不渗透性变异体、和/或药学上可接受的盐组成的组的化合物在药剂制备中的用途，所述药剂用于具有或易于发展大脑Aβ障碍的受试者的肝脏中Aβ产生的抑制。
10.如权利要求8或9所述的用途，其中所述大脑Aβ障碍是阿尔茨海默氏病。
11.如权利要求8-10中任一项所述的用途，其中所述药剂配制用于口服。
12.如权利要求8-11中任一项所述的用途，其中所述药剂进一步包含用于治疗大脑Aβ障碍的有效量的第二治疗剂。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述第二治疗剂包含选自由大麻素类、dimebom、强的松、布洛芬、naproxyn、消炎痛、他汀类药物、选择性雌激素受体分子、降压药、α-阻断剂、β-阻断剂、α-β阻断剂、血管紧张肽转换酶抑制剂、血管紧张肽受体阻断剂、钙通道阻断剂、利尿剂、NSAIDS和抗氧化剂组成的组的试剂。
14.一种受试者的大脑Aβ障碍或易于具有大脑Aβ障碍的治疗方法，包括周边施用调节周边组织中Aβ产生的化合物。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述调节包括抑制。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述化合物具有小于2.0的分配系数。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述分配系数小于1.5。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述分配系数小于约1.0。
19.如权利要求14所述的方法，其中所述化合物没有实质性跨越血脑屏障。
20.一种受试者的大脑Aβ障碍或易于具有大脑Aβ障碍的治疗方法，包括周边施用调节所述受试者的周边组织中基因表达的化合物。
21.如权利要求14或20所述的方法，其中所述周边组织是肝脏。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述基因选自由Psen2、APP、Cib1、Ngrn和Zfhx1b组成的组。
23.如权利要求14或20所述的方法，其中所述Aβ产生的调节包括早老素2、calmyrin、neugrin、Zfhx1b或APP表达或活性中一种或多种的调节。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述早老素2、calmyrin、neugrin、Zfhx1b或APP表达或活性中的一种或多种的调节包括所述表达或活性的抑制。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述Aβ产生的调节包括在所述受试者肝脏中早老素2表达或活性的调节。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述Aβ产生的调节包括在所述受试者肝脏中calmyrin表达或活性的调节。
27.如权利要求23所述的方法，其中所述Aβ产生的调节包括在所述受试者肝脏中neugrin表达或活性的调节。
28.如权利要求23所述的方法，其中所述Aβ产生的调节包括在所述受试者肝脏中Zfhx1b表达或活性的调节。
29.如权利要求23所述的方法，其中所述Aβ产生的调节包括在所述受试者肝脏中淀粉样前体蛋白(APP)表达或活性的调节。
30.如权利要求23所述的方法，其中所述Aβ产生的调节包括在所述受试者肝脏中早老素2表达或活性的抑制。
31.如权利要求23所述的方法，其中所述Aβ产生的调节包括在所述受试者肝脏中calmyrin表达或活性的调节。
32.如权利要求23所述的方法，其中所述Aβ产生的调节包括在所述受试者肝脏中neugrin表达或活性的刺激。
33.如权利要求23所述的方法，其中所述Aβ产生的调节包括在所述受试者肝脏中降低neugrin表达或活性的因素的抑制。
34.如权利要求23所述的方法，其中所述Aβ产生的调节包括在所述受试者肝脏中Zfhx1b表达或活性的抑制。
35.如权利要求23所述的方法，其中所述Aβ产生的调节包括在所述受试者肝脏中淀粉样前体蛋白(APP)表达或活性的抑制。
36.如权利要求23所述的方法，其中所述Aβ的调节包括选自由早老素2、calmyrin、neugrin、Zfhx1b和APP组成的组的至少两种蛋白在肝脏中的表达或活性的调节。
37.一种方法，包括：
a)评价大脑Aβ障碍或易于具有大脑Aβ障碍存在的受试者；
b)周边施用调节Aβ产生的化合物，其中所述化合物没有实质性渗透血脑屏障；
c)评价大脑Aβ障碍或大脑Aβ障碍发展的所述受试者。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述Aβ产生的调节包括在所述受试者肝脏中Aβ产生的调节。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述调节包括抑制。
40.一种方法，包括：
a)评价大脑Aβ障碍或易于具有大脑Aβ障碍存在的受试者；
b)周边施用调节Aβ的累积的化合物，其中所述化合物没有实质性渗透血脑屏障；
c)评价大脑Aβ障碍或大脑Aβ障碍发展的所述受试者。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述Aβ的累积的调节包括在所述受试者肝脏中Aβ的累积的调节。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述调节包括在所述受试者肝脏中降低Aβ的累积。
43.如权利要求14-42中任一项所述的方法，其中所述大脑Aβ障碍是阿尔茨海默氏病。
44.如权利要求14-42所述的方法，其中所述化合物包含γ分泌酶活性的调节剂。
45.如权利要求14-42所述的方法，其中所述化合物是非γ分泌酶的蛋白调节剂。
46.如权利要求44所述的方法，其中所述化合物包含γ分泌酶活性的抑制剂。
47.如权利要求14-42所述的方法，其中所述化合物包含早老素2的调节剂。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述化合物包含早老素2的抑制剂。
49.如权利要求14-42所述的方法，其中所述化合物包含淀粉样前体蛋白切割的调节剂。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述化合物包含淀粉样前体蛋白切割的抑制剂。
51.如权利要求14-42所述的方法，其中所述评价包含精神状态评价。
52.如权利要求37或40所述的方法，其中所述评价包含神经心理测试。
53.如权利要求37或40所述的方法，其中所述评价包含脑成像。
54.如权利要求37或40所述的方法，其中所述化合物包含选自由STI-571、WGB-BC-15、化合物1、化合物2、LY450139、GSI-953、Flurizan和E2012化合物组成的组的组成。
55.如权利要求14-42所述的方法，其中所述化合物包含干扰寡核苷酸。
56.如权利要求1-14-42所述的方法，其中所述化合物包含干扰RNA。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述干扰RNA选自由siRNA、shRNA和miRNA组成的组。
58.如权利要求56所述的方法，其中所述干扰RNA包含针对淀粉样前体蛋白RNA的干扰RNA。
59.如权利要求56所述的方法，其中所述干扰RNA包含针对早老素2RNA的干扰RNA。
60.如权利要求14-59所述的方法，其中所述化合物进一步包含用于治疗、改善或减低大脑Aβ相关障碍的风险或严重程度的已知治疗剂。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述已知治疗剂选自由大麻素类、dimebom、强的松、布洛芬、naproxyn、消炎痛、他汀类药物、选择性雌激素受体分子、降压药、α-阻断剂、β-阻断剂、α-β阻断剂、血管紧张肽转换酶抑制剂、血管紧张肽受体阻断剂，钙通道阻断剂、利尿剂和抗氧化剂组成的组。
62.如权利要求14-61所述的方法，其中所述周边施用包含口服。
63.一种评价受试者中大脑Aβ障碍的风险或存在的方法，包括测定所述受试者的周边组织中Aβ的水平。
64.一种评价受试者中大脑Aβ障碍的风险或存在的方法，包括分析所述受试者的周边组织中基因产物的表达或活性。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述基因产物选自由Psen2、APP、Cib1、Ngrn和Zfhx1b组成的组的基因。
66.如权利要求63-65所述的方法，其中所述周边组织是肝脏。
67.如权利要求63-65所述的方法，其中所述周边组织是血液。
68.如权利要求63-65所述的方法，其中所述周边组织是血清。
69.一种监测受试者中大脑Aβ障碍的方法，包括测定所述受试者的周边组织中Aβ的水平。
70.一种监测受试者中大脑Aβ障碍的方法，包括分析所述受试者的周边组织中基因产物的表达或活性。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述基因产物选自由Psen2、APP、Cib1、Ngrn和Zfhx1b组成的组的基因。
72.如权利要求69-71所述的方法，其中所述周边组织是肝脏。
73.如权利要求69-71所述的方法，其中所述周边组织是血液。
74.如权利要求69-71所述的方法，其中所述周边组织是血清。
75.如权利要求69-71所述的方法，其中所述监测包括在多个时间点测量所述周边组织中的Aβ。
76.如权利要求63-75所述的方法，其中所述大脑Aβ障碍是阿尔茨海默氏病。
77.一种方法，包括：
a)评价大脑Aβ障碍或易于具有大脑Aβ障碍存在的受试者；
b)周边施用抑制周边Aβ跨越血脑屏障运输的化合物，其中所述化合物不是抗Aβ抗体。
78.如权利要求77所述的方法，进一步包括：
c)在所述施用后，评价大脑Aβ障碍或大脑Aβ障碍发展的所述受试者。
79.如权利要求77所述的方法，其中所述大脑Aβ障碍是阿尔茨海默氏病。
80.一种用于治疗大脑Aβ障碍的基因靶的鉴定方法，包括将具有或易于具有所述Aβ障碍的第一亲本与减少所述Aβ障碍易患性的第二亲本的后代的肝基因表达谱进行比较，以鉴定在肝脏中具有表达水平的可遗传的基因标记，其中，相对于所述第一亲本和所述第二亲本的肝脏中的表达水平，所述后代肝脏中的所述可遗传的基因标记的增加或减少表达与来自所述第二亲本的所述基因标记的遗传性相关。
81.选自由STI-571、化合物2、LY450139、GSI-953、Flurizan和E2012化合物、或其血脑屏障不渗透性变异体组成的组的化合物，所述化合物用于具有或易于发展Aβ障碍的受试者的周边组织中Aβ产生的调节。
82.选自由STI-571、化合物2、LY450139、GSI-953、Flurizan和E2012化合物、或其血脑屏障不渗透性变异体组成的组的化合物，所述化合物用于具有或易于发展大脑Aβ障碍的受试者的周边组织中Aβ产生的调节。
83.选自由STI-571、化合物2、LY450139、GSI-953、Flurizan和E2012化合物、或其血脑屏障不渗透性变异体组成的组的化合物，所述化合物用于具有或易于发展Aβ障碍的受试者的肝脏中Aβ产生的调节。
84.选自由STI-571、化合物2、LY450139、GSI-953、Flurizan和E2012化合物、或其血脑屏障不渗透性变异体组成的组的化合物，所述化合物用于具有或易于发展大脑Aβ障碍的受试者的肝脏中Aβ产生的调节。
85.如权利要求81-84中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有小于2.0的分配系数。
86.如权利要求81-84中任一项所述的化合物，其中所述分配系数小于1.5。
87.如权利要求81-84中任一项所述的化合物，其中所述分配系数小于约1.0。
88.如权利要求81-84中任一项所述的化合物，其中所述化合物没有实质性跨越血脑屏障。
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