CN102266341A

CN102266341A - 嗓唑并嘧啶类化合物在制备治疗肺癌药物中的应用

Info

Publication number: CN102266341A
Application number: CN2011101650605A
Authority: CN
Inventors: 刘斌
Original assignee: Guangzhou No12 People's Hospital
Current assignee: Guangzhou No12 People's Hospital
Priority date: 2011-06-20
Filing date: 2011-06-20
Publication date: 2011-12-07

Abstract

本发明涉及嗓唑并嘧啶类化合物在制备治疗肺癌药物中的应用。本发明还提供嗓唑并嘧啶类化合物在制备治疗恶性黑素瘤和人卵巢癌药物中的应用。本发明优点在于：本发明的嗓唑并嘧啶类化合物作为MNK1抑制剂，针对肺癌治疗的新靶点，抑制肺癌发病的两种机制通路，MAPK和mTOR信号通路，而非针对单一机制，以避免和减少耐药；针对目前肺癌和恶性黑色素瘤的治疗效果不佳、生存率低的缺点，极大地改观这两种疾病的治疗效果，对社会有重大的积极意义；本发明具有巨大的经济效益。

Description

嗓唑并嘧啶类化合物在制备治疗肺癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及一类化合物的应用，具体地说，是嗓唑并嘧啶类化合物在制备治疗肺癌药物中的应用。

背景技术

肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮，故亦称支气管肺癌。近50多年来，世界各国特别是工业发达国家，肺癌的发病率和病死率均迅速上升，死于癌病的男性病人中肺癌已居首位。现有技术中对于肺癌的治疗主要有三种药物：A，传统化疗药物：SCLC常用化疗药物包括环磷酰胺（CTX）、异环磷酰胺（IFO）、阿霉素（ADM）、长春新碱（VCR）、长春花碱（VBL）、依托泊甙（VP16）、威猛（Vumon）、卡铂（CBP）和甲氨蝶呤（MTX）等，单药复发率（RR）在30-60%间；NSCLC常用氯氨铂（DDP），其他有IFO、VP16、丝裂霉素（MMC）、长春花碱酰胺（VDS）、ADM、表阿毒素（EPI）、异长春花碱等，但单药RR均≥15%。B，单抗类药物：如阿瓦斯汀(Avastin)，化学名为“贝伐单抗”，是罗氏公司的癌症治疗畅销药物。可治疗转移性肺癌。C，小分子类药物：如新药吉非替尼（Gefitinib）、厄洛替尼（erlotinib）。

现有药物往往存在很多不足：A，传统化疗药物：化疗虽然可以杀死癌细胞，但也在侵蚀着人体的正常细胞和内脏，毒副作用是相当严重的；同时对已转移的肺癌患者往往无效，目前世界范围内肺癌5年存活率只有15%，化疗药物的毒副反应及肿瘤转移为主要死因。B，单抗类药物：Avastin对转移性肺癌有效，其最大问题是容易产生耐用性，有效期往往只有3-6个月，对延长转移性肺癌患者生命有限。究其主要原因，肿瘤发病、复发等机理有多种致癌信号通路引起，该药只抑制其中一种机制（阻断血管内皮生长因子的作用），很快其他多致癌信号通路被激活，产生耐药。C，小分子类药物：显示出了良好的发展势头，如erlotinib在多项临床研究的推动下，已从最初的二、三线治疗扩展至一线用药、维持治疗和序贯治疗等多个阶段。但目前该领域针对靶点过于单一，可应用的药物种类过少（如Gefitinib和erlotinib都是表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)类药物，主要针对EFGR基因突变），因而很多晚期肺癌患者找不到合适药物进行治疗。

中国专利文献CN101466716A公开了用于药物组合物的具有MNK1/MNK2抑制活性的噻吩并嘧啶，该发明涉及包含噻吩并嘧啶化合物的新的药物组合物，和噻吩并嘧啶化合物在制备药物组合物中的用途，该药物组合物用于预防和/或治疗可通过抑制Mnk1和/或Mnk2（Mnk2a或Mnk2B）和/或其变体的激酶活性来影响的疾病。中国专利文献CN101472912A公开了作为MNK激酶抑制剂的吡啶和吡嗪衍生物，所述的化合物是MNK2和 MNK1的抑制剂，所述药物用于预防和治疗与MNK2和/或MNK1激酶的不合乎需要的活性相关的疾病。但是关于嗓唑并嘧啶类化合物在制备治疗肺癌药物中的应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种嗓唑并嘧啶类化合物在制备治疗肺癌药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：嗓唑并嘧啶类化合物在制备治疗肺癌药物中的应用。

所述的嗓唑并嘧啶类化合物选自：

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所述的嗓唑并嘧啶类化合物的结构式为：

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嗓唑并嘧啶类化合物在制备治疗恶性黑素瘤药物中的应用。

所述的嗓唑并嘧啶类化合物的结构式为：

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嗓唑并嘧啶类化合物在制备治疗人卵巢癌药物中的应用。

所述的嗓唑并嘧啶类化合物的结构式为：

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本发明优点在于：

1、本发明的嗓唑并嘧啶类化合物作为MNK1抑制剂，针对肺癌治疗的新靶点，抑制肺癌发病的两种机制通路，MAPK和mTOR信号通路，而非针对单一机制，以避免和减少耐药；

2、针对目前肺癌和恶性黑色素瘤的治疗效果不佳、生存率低的缺点，极大地改观这两种疾病的治疗效果，对社会有重大的积极意义；

3、本发明具有巨大的经济效益。

附图说明

附图1是Mnk1蛋白上的激酶活性区域。

附图2是CGP57380对两种细胞株增殖的抑制。

附图3是CGP57380（浓度12 μmol/L）处理两种细胞株后G0+G1细胞比例。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例

（1）设计思路：针对肺癌发病最主要的两个信号通路，寻找其交汇点作为可能的靶点。采用小分子药物抑制该靶点，达到治疗肺癌的目的。

（2）选择切入的关键信号通路：选择丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和雷帕霉素标靶( mTOR )两条信号通路作为切入点，原因如下：

①这两条信号通路的基因在肺癌中突变率最高：美国国立卫生研究院（NIH）下属国家人类基因组研究所（NHGRI）资助的肿瘤测序项目（TSP）发现，在188例肺癌组织中，超过70%的肺癌组织中会出现至少一个以上MAPK通路基因的突变；而至少30%的肺癌组织会出现一个以上MAPK通路基因的突变。

②MAPK信号通路属应激信号通路，是放射、有毒物品、重金属等致癌刺激引起细胞增殖和／或凋亡抑制等细胞效应，进而引起癌细胞自发生长、人侵外围组织及转移所必定会激活的信号通路。

③mTOR信号通路是调控细胞生长与增殖的一个关键通路，该通路将从营养分子、能量状态以及生长因子传来的信号整合在一起，在肿瘤细胞增生过程中期重要作用。

（3）选择的靶点：MAP激酶相互作用丝/苏氨酸激酶1(MAP kinase-interacting serine/threonine-protein kinase 1，MKNK1，又称为MNK1)。选择理由：

①MKNK1是MAPK和mTOR两条肺癌发生最重要信号通路的交汇点，阻断其功能理论上可抑制肺癌细胞的增殖、生长，导致肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤的转移；

有其他肿瘤的研究支持这一论点：抑制这两条通路，将抑制恶性黑素瘤细胞的生长，导致肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤的转移（详见：Lasithiotakis KG, Sinnberg TW, Schittek B, Flaherty KT, Kulms D, Maczey E, Garbe C, Meier FE. Combined inhibition of MAPK and mTOR signaling inhibits growth, induces cell death, and abrogates invasive growth of melanoma cells. J Invest Dermatol. 2008 Aug;128(8):2013-23.）

与该文献不同的是，本发明采用一种物质抑制MNK1活性，进而抑制这两种通路（而非分别采用两种物质各抑制一种通路），在技术方法要简便，也更可行。

②不仅如此，MNK1在功能上还与ERK1、ERK2、p38、PKC、c-src family kinases、CREB及eIF4E等肿瘤相关蛋白的功能密切相关。阻断其功能理论上可抑制上游ERK1、ERK2、p38、PKC、c-src family kinases等致癌信号，也可影响下游eIF4E及CREB等效应蛋白的激活，从而从多机制阻断肿瘤细胞的增殖和生长。

③在小鼠Mnk1基因中发现了重要的突变：Mnk1蛋白上的激酶活性区域被称为smart00220，见图1。上游激酶分子如ERK、p38、PKC等通过磷酸化smart00220基域（motif）上第189及第194位苏氨酸（Thr）而使其激活，进而Mnk1进一步磷酸化激活eIF4E、CREB等效应蛋白，产生细胞效应。而在Mnk1蛋白的活性区域smart00220发现第293位氨基酸由丙氨酸（Ala）突变为丝氨酸（Ser），增加了一个可能的磷酸化丝氨酸位点，有可能增强其致癌性。

④验证Mnk1基因突变293 Ala>Ser的致癌性：

观察采用致癌剂N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）导致小鼠罹患肺癌的情况，数据来自公共数据库Mouse Phenome Database的Graubert1项目（MPD111657）。Graubert1项目总共研究了20种品系计476只小鼠。观察携带突变293 Ala>Ser的小鼠是否肺癌发病率增高。

该研究发现携带突变293 Ala>Ser的小鼠品系A/J肺癌发病率最高（雄性和雌性的发病率均在60%以上）。见表1，表1是突变293 Ala>Ser致肺癌风险，统计分析突变293 Ala>Ser致肺癌风险增加近5倍。

表1 突变293 Ala>Ser致肺癌风险

⑤该基因突变与人类肺癌有关：在人类肺癌组织中，发现MNK1蛋白smart00220基域（第59-333位氨基酸）上有突变。Ding（2008 Oct 23; 455(7216):1069-75.）就报道了一例肺癌患者（男性老年患者，有吸烟史，样本编码：1423685）存在该基因编码区突变，导致第254氨基酸由苏氨酸（Thr）突变为丝氨酸（Ser）。

另该基因突变还见于卵巢癌患者（样本编号TCGA-24-1558），突变为基因缺失p.N344del (Deletion - In frame)。

（4）选择的小分子化合物药物：

①嗓唑并嘧啶类（pyrazolopyrimidine）化合物：

大量文献报道嗓唑并嘧啶类化合物可作为体内激酶分子（包括MNK1）的抑制剂，但体内激酶分子抑制剂，并不一定都能够治疗肺癌，虽然MNK1基因突变能够导致小鼠肺癌发病率增高，但也不能直接推断抑制MNK1活性就能够对肺癌有治疗作用。虽然已有报道MNK1抑制剂具有治疗糖尿病、心血管疾病等作用，但是关于嗓唑并嘧啶类化合物治疗肺癌的应用目前还未见报道，也无法通过现有技术和文献报道直接推导得出。

以下分子可作为肺癌治疗的备选化合物药物：

。

②具体化合物的细胞学实验：

购买Tocris Bioscience（美国，Ellisville）现成化合物（Cat. No. 2731）进行细胞学实验，具体信息如下：

CGP57380，CAS number：522629-08-9

分子量：244.23

化学名：N3-(4-Fluorophenyl)-1H-pyrazolo-[3,4-d]pyrimidine-3,4-diamine

分子式：C₁₁H₉FN₆。

③CGP 57380抑制MNK1活性的效能，以及其对正常细胞的安全性（生物毒性）已被证明：

抑制效能：Tocris Bioscience产品介绍提示，该产品可抑制MNK1活性（IC50 = 2.2μmol/L）；而对其他多种激酶p38、JNK1、ERK1、ERK2、PKC及c-src family kinases无抑制作用，证明其对MNK1活性的特异抑制作用。进一步提高浓度（IC50 = 3.0μmol/L），可抑制MNK1对下游底物eIF4E的激活；抑制细胞毒素LPS对小鼠巨噬细胞的激活作用。

生物安全性：Knauf等证明直至达到浓度30 μmol/L（是有效浓度的10倍），对正常细胞无明显毒性（详见：Knauf et al (2001) Negative regulation of protein translation by mitogen-activated protein kinase-interacting kinases 1 and 2. Mol.Cell.Biol. 21:5500.），提示此类化合物作为分子靶向药物的安全性。

④CGP 57380抑制肺癌细胞增殖，引起肺癌细胞凋亡。

A.细胞株：

采用两种肺腺癌细胞株A549和NCI-520，均购自中国医学科学院肿瘤细胞库。

B.储存和培养条件：

储存：两种细胞株在细胞传代后采用5%DMSO+95%完全培养液（RPMI-1640培养基+10%胎牛血清）保存于液氮中。

培养：从液氮取出细胞株后，于42℃快速溶解后，采用配制好的完全培养基培养于4℃洗去冷冻保护液，置于24孔培养板采用完全培养基培养。培养条件为37℃、5%CO₂及饱和湿度。显微镜下细胞长满80%培养瓶底后，采用0.25%胰酶消化、吹打。调节细胞浓度至10⁵/ml。

采用设备为FRESCO17高速低温离心机（Thermo，美国）、超静工作台（苏州）及福玛CO₂培养箱（上海）。

C.CGP57380处理细胞：

参考Ishida实验方法(详见：Ishida et al (2003) Mnk1 is required for angiotensin II-induced protein synthesis in vascular smooth muscle cells. Circ.Res. 93:1218.)，对A549和NCI-520两种细胞株分别加3、6、9及12 μmol/L的CGP57380（购自Tocris Bioscience）处理48小时（37°C、5%CO2）。对照为不加CGP57380的A549和NCI-520细胞株。CGP5738处理后采用PBS洗涤2次，洗去处理液，进行后续实验。

对照：因CGP57380溶于DMSO，本发明选取各相应浓度的DMSO作为3-12μmol/L的CGP57380处理组对照。

D.MTT法检测CGP57380对细胞增殖的影响：

吸取2000个肿瘤细胞至96孔酶标板，加80μL补充至100μL。实验设置调零孔（无细胞）、对照孔（未进行CGP57380处理）及实验孔（经CGP57380处理）。每种实验重复3孔。每孔加20μLMTT溶液（北京富众科技）。继续培养4小时后终止培养。在FL600型酶标仪上（Bio-Tek，美国）上于OD570nm处测量吸光度值。

实验结果：如附图2所示，在CGP57380浓度为12μmol/L时，对两种细胞株增殖的抑制均超过70%。

E.流式细胞术检测肿瘤细胞周期：

在CGP57380处理细胞后采用胰蛋白酶（美国Sigma公司）消化细胞，收集到试管后离心去培养液，调节细胞浓度至10⁶/ml，用预冷PBS洗细胞两次，加入预冷70％乙醇，于4℃固定过夜。离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30分钟。采用FACSCalibur流式细胞仪 (BD Biosciences)检测细胞周期。

实验结果：如图3所示，CGP57380（浓度12 μmol/L）处理两种细胞株后G0+G1细胞比例明显增加(P<0.01)，。

本发明主要优点是针对了肺癌治疗的新靶点，同时该靶点力求针对肺癌发病的两种主要机制MAPK和mTOR信号通路，而非针对单一机制，以避免和减少耐药。

另外，根据现有文献，抑制这两种机制对恶性黑素瘤也是有治疗效果的（详见：Lasithiotakis et al. J Invest Dermatol. 2008 Aug;128(8):2013-23）。与该文献不同的是，本发明采用一种物质抑制MNK1活性，进而抑制这两种通路。

因该基因突变也见于人卵巢癌，本发明可适用于人卵巢癌的治疗。

因为目前肺癌和恶性黑素瘤的治疗效果都非常不佳，5年生存率乃至1年生存率都非常低，如本发明能最终应用到临床，将极大改观这两种疾病的治疗效果，对社会的积极意义不言而喻。

肿瘤的分子靶向药物如能成功上市，其经济效益也将是非常可观的。如Avastin，尽管存在很多短期使用即耐药者，其在2009年的销售额达到了惊人的59亿美元。如本发明能最终成为上市药物，其年销售额也将达到数十亿美元。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.嗓唑并嘧啶类化合物在制备治疗肺癌药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的嗓唑并嘧啶类化合物选自：

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3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的嗓唑并嘧啶类化合物的结构式为：

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4.嗓唑并嘧啶类化合物在制备治疗恶性黑素瘤药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的嗓唑并嘧啶类化合物的结构式为：

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6.嗓唑并嘧啶类化合物在制备治疗人卵巢癌药物中的应用。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的嗓唑并嘧啶类化合物的结构式为：

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