CN102264381A

CN102264381A - 提供对疟原虫的长效免疫应答的用于疟疾的多组分疫苗

Info

Publication number: CN102264381A
Application number: CN2009801483158A
Authority: CN
Inventors: R·施尼森; J·库布勒-吉尔布; J·B·罗宾斯; F·马加德利; C·P·沫卡; J·基思; Z·贝索娃; L·米勒; R·纽森兹威格; D·刘
Original assignee: US Department of Health and Human Services; New York University NYU
Current assignee: US Department of Health and Human Services; New York University NYU
Priority date: 2008-10-01
Filing date: 2009-10-01
Publication date: 2011-11-30
Anticipated expiration: 2029-10-01
Also published as: WO2010040000A8; US20110182929A1; US20130216570A1; EP2346523A4; CN102264381B; WO2010040000A3; US8444996B2; US9096653B2; EP2346523A2; WO2010040000A2

Abstract

本发明公开了可激发针对疟原虫(Plasmodium)蛋白的免疫应答的免疫原性缀合物。在具体的实例中，所述疟原虫蛋白包括有性阶段表面蛋白、环子孢子蛋白(CSP)或CSP的免疫原性部分。本发明还提供了包含一种或多种所公开的免疫原性缀合物和可药用载体的免疫原性组合物。本发明还提供了一种在受试者中激发针对疟原虫的免疫应答的方法，包括给予所述受试者本发明所公开的免疫原性组合物。

Description

提供对疟原虫的长效免疫应答的用于疟疾的多组分疫苗

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2008年10月1日提交的美国临时申请No.61/101,944和2008年11月7日提交的美国临时申请No.61/112,572的权益，每件申请都以引用的方式全文纳入本文。

技术领域

本发明公开了用于在受试者中激发对疟原虫(Plasmodium)的免疫应答并且保护受试者不受疟原虫感染的免疫原性缀合物。

背景技术

疟疾可归为全球三大致命疾病之一(每年约3亿病例)。恶性疟原虫(P.falciparum)可导致最严重的形式，每年导致约一百万人死亡(其中90％是幼儿)。

感染开始于蚊子将疟疾子孢子注入至宿主血流之时。在注射后，它们迁移到肝脏并在肝细胞中繁殖一至两周。子孢子分化为裂殖子，裂殖子从肝脏释放进入血流，而它们在血液中感染红细胞。当裂殖子在红细胞中成熟时，它被称为滋养体，并且当完全发育后成为裂殖体。裂殖体阶段出现核分裂以形成单个裂殖子，所述裂殖子被释放以侵入其他红细胞。在数个裂体生殖周期后，一些寄生虫不再通过无性生殖形成裂殖体，而是发育为大单核寄生虫。这些寄生虫发生性发育。

疟原虫的性发育涉及雌性大配子母细胞和雄性小配子细胞。如果蚊子摄食感染宿主的血液，它将摄入血液中的配子母细胞。在蚊子的消化道中发生寄生虫的受精和性结合。随后，被称为接合子的受精寄生虫发育为动合子。动合子穿透蚊子的中肠壁并发育为囊合子，其中形成许多小子孢子。当囊合子破裂时，子孢子经血淋巴迁移至蚊子的唾液腺。一旦寄生虫在蚊子的唾液中，其就能被注入至宿主，重复生命周期。

还没有疫苗，并且疟原虫正在日益变得对已经用于治疗所述疾病数十载的抗疟药具有抗性。

发明内容

本发明公开了可激发针对疟原虫蛋白的免疫应答的免疫原性缀合物。在具体的实例中，所述疟原虫蛋白包括有性阶段表面蛋白(如P25、P28、P48/45或P230)、无性环子孢子蛋白(CSP)或其免疫原性部分。本文提供了免疫原性缀合物，所述免疫原性缀合物包括与至少一种疟原虫环子孢子蛋白(CSP)或CSP的免疫原性部分共价连接的至少一种疟原虫有性阶段表面蛋白(例如，P25、P28、P48/45或P230)。所述蛋白或肽通过如非肽接头(如酰胺键、腙键或硫醚键)或通过肽接头(如约1至12个肽键)共价连接。在具体的实例中，所述免疫原性缀合物包括与至少一种CSP共价连接的至少一种有性阶段表面蛋白Pfs25或Pvs25(例如，至少1、2、3、4或5种Pfs25或Pvs25蛋白)。在另外的实例中，所述免疫原性缀合物包括与至少一种来自疟原虫CSP的免疫原性重复共价连接的至少一种有性阶段表面蛋白(如P25、P28、P48/45或P230)，所述免疫原性重复例如至少一种Asn-Ala-Asn-Pro(NANP)(SEQ ID NO：1)重复、至少一种Asn-Pro-Asn-Ala(NPNA)(SEQ ID NO：2)重复、至少一种Pro-Asn-Ala-Asn(PNAN)(SEQ ID NO：3)重复、至少一种Ala-Asn-Pro-Asn(ANPN)(SEQ ID NO：4)重复或者其两种或多种的结合物。

本发明还提供了免疫原性缀合物，所述免疫原性缀合物包括具有至少一种来自疟原虫CSP的免疫原性重复的肽，所述重复例如与至少一种其他免疫原性蛋白(如非疟原虫蛋白的免疫原性蛋白，如激发免疫应答的蛋白，例如细菌毒素)共价连接的至少一种NPNA(SEQ IDNO：2)重复、至少一种PNAN(SEQ ID NO：3)重复或至少一种ANPN(SEQ ID NO：4)重复。所述蛋白或肽通过例如非肽接头(linker)(如酰胺键、腙键或硫醚键)或通过肽接头(如约1至12个肽键或氨基酸)共价连接。

本发明还提供了包括具有疟原虫T细胞表位(如来自CSP的T细胞表位)和与至少一种其他免疫蛋白(如非疟原虫蛋白的免疫原性蛋白，如可激发免疫应答的人病原体蛋白，如细菌毒素)共价连接的至少4种CSP免疫原性重复(例如，NANP(SEQ ID NO：1)、NPNA(SEQID NO：2)、PNAN(SEQ ID NO：3)或ANPN(SEQ ID NO：4)重复)的肽的免疫原性缀合物。所述蛋白通过例如非肽接头(如酰胺键、腙键或硫醚键)或通过肽接头(如约1至12个肽键)共价连接。

本文还提供了包括一种或多种所公开的免疫原性缀合物和可药用载体的免疫原性组合物。还提供了一种激发对宿主中的疟原虫(例如，恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)、三日疟原虫(P.malariae)或诺氏疟原虫(P.knowlesi))的免疫应答的方法，所述免疫应答例如对宿主(如需要加强对疟原虫的免疫性的宿主)中有性或无性阶段的疟原虫或者对疟原虫CSP或其部分的免疫应答，所述方法包括给予所述宿主本文公开的免疫原性组合物。

本公开的上述特征和其他特征根据以下的具体实施方式将更加明显，这是参考附图进行的。

附图说明

图1A的图表显示了用于制备Pfs25-Pfs25蛋白缀合物的一步方法。

图1B的图表显示了用于制备Pfs25-Pfs25蛋白缀合物的两步方法。

图2的图表显示了通过形成硫醚键缀合至NANP重复的蛋白。

序列表

在所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列是使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母密码子来显示，如37C.F.R.1.822中所定义。虽然仅示出每个核酸序列的一条链，但应理解任何提及所示链时均包括互补链。在所附序列表中：

SEQ ID NO：1是氨基酸序列NANP。

SEQ ID NO：2是氨基酸序列NPNA。

SEQ ID NO：3是氨基酸序列PNAN。

SEQ ID NO：4是氨基酸序列ANPN。

SEQ ID NO：5和6分别是示例性恶性疟原虫CSP蛋白的核酸和氨基酸序列，所述恶性疟原虫CSP蛋白被修饰以除去GPI锚并且加了用于纯化的C-末端6×His标签。

SEQ ID NO：7是示例性恶性疟原虫Pfs25蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8是示例性间日疟原虫Pvs25蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9是间日疟原虫VK210CSP重复的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10是间日疟原虫VK247CSP重复的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11是三日疟原虫CSP重复的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12是诺氏疟原虫CSP重复的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13是卵形疟原虫CSP重复的氨基酸序列。

SEQ ID NO：14是来自恶性疟原虫CSP的通用T细胞表位的氨基酸序列。

SEQ ID NO：15是来自恶性疟原虫CSP的T细胞表位的氨基酸序列。

SEQ ID NO：16是4个NANP重复的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17是5个NANP重复的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：18是4个NPNA重复的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19是5个NPNA重复的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：20是4个PNAN重复的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：21是5个PNAN重复的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：22是4个ANPN重复的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：23是5个ANPN重复的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：24是6个NANP重复的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：25是具有与来自恶性疟原虫CSP的通用T细胞表位缀合的4个NANP重复的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：26是具有与来自恶性疟原虫CSP的通用T细胞表位缀合的5个NANP重复的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：27是具有与来自恶性疟原虫CSP的通用T细胞表位缀合的4个ANPN重复的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：28是具有与来自恶性疟原虫CSP的通用T细胞表位缀合的5个ANPN重复的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：29是具有与来自恶性疟原虫CSP的通用T细胞表位缀合的4个NPNA重复的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：30是具有与来自恶性疟原虫CSP的通用T细胞表位缀合的5个NPNA重复的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：31是具有与来自恶性疟原虫CSP的通用T细胞表位缀合的4个PNAN重复的肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：32是具有与来自恶性疟原虫CSP的通用T细胞表位缀合的5个PNAN重复的肽的氨基酸序列

具体实施方式

I.缩写

ADH：己二酸二酰肼

BSA：牛血清白蛋白

CSP：环子孢子蛋白

EDC：1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺氢氯化物

ELISA：酶联免疫吸附测定法

IFA：免疫荧光测定法

Pfs25：恶性疟原虫动合子表面蛋白25

Pvs25：间日疟原虫动合子表面蛋白25

SBAP：N-琥珀酰亚胺基-3-溴乙酰胺丙酸酯

SFB：N-琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酸酯

SPDP：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯

II.术语

除非另有说明，技术术语依其常规用法使用。分子生物学中对常规术语的定义可见于Benjamin Lewin，Genes V，published byOxford University Press，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(edss.)，The Encyclopedia of Molecular Biology，published by BlackwellScience Ltd.，1994(ISBN 0-632-02182-9)；Robert A.Meyers(ed.)，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，published by VCH Publishers，Inc.，1995(ISBN 1-56081-569-8)。

为了有助于理解本公开内容的各种实施方案，提供了以下对具体术语的解释：

辅剂：非特异性地增强对抗原的免疫应答的物质或载体。辅剂可包括其上吸附了抗原的矿物质(如铝、氢氧化铝或磷酸盐)悬液剂；或油包水乳剂，其中抗原溶液被乳化在矿物油(例如弗氏不完全佐剂)中，有时包含灭活的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性。免疫刺激性寡核苷酸(如包含CpG基序的那些)也可被用作辅剂(例如，参见美国专利No.6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116、6,339,068、6,406,705和6,429,199)。辅剂还包括生物分子，如共刺激分子。示例性的生物辅剂包括IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L和41BBL。

抗体：由B淋巴样细胞产生的具有特定氨基酸序列的免疫球蛋白分子。在人和其他动物中，抗体由特定抗原(免疫原)所诱发。抗体的特征是与所述抗原以某种可证明的方式特异性反应，抗体和抗原彼此相互界定。“激发抗体应答”是指抗原或其他分子诱发抗体产生的能力。

抗原：可以刺激动物体产生抗体或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收至动物中的组合物。抗原可与特定体液免疫或细胞免疫的产物(包括由异源免疫原诱导的产物)反应。在一个实施方案中，抗原是疟原虫抗原(如疟原虫有性阶段表面蛋白、CSP或其免疫原性部分)。

环子孢子蛋白(CSP)：所述环子孢子蛋白(CSP)是孢子生成周期中的主要疟原虫表面蛋白。CSP覆盖疟原虫子孢子的表面，所述子孢子是从蚊子的唾液腺传播到宿主肝细胞中。它是高度免疫原性的，并且在地方病区域，可在循环系统血液中观察到抗该蛋白的高抗体效价。参见，例如Dame et al.，Science 225：593-599，1985；Zavala et al.，Science 228：1436-1440，1985；国际公开文本No.WO 2008/107370。

CSP序列是公众可获得的。例如，GenBank编号NC_000521.3(在2008年11月7日以引用的方式纳入本文)公开了来自恶性疟原虫3D7的CSP基因。GenBank编号XM_001351086.1和XP_001351122.1(在2008年11月7日以引用的方式纳入本文)分别公开了恶性疟原虫3D7CSP cDNA和蛋白序列。在一个实例中，CSP是分别显示在SEQ ID NO：5和6中的恶性疟原虫CSP核酸和蛋白序列。CSP的直系同源物存在于其他疟原虫种(如间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和诺氏疟原虫)中并且为本领域技术人员所知晓。

缀合物：通过将两个或多个化合物(如两个或多个蛋白或蛋白片段，例如两个或多个免疫原性蛋白、蛋白的免疫原性片段或它们的结合物)连接而形成的化合物。本文描述的缀合物是通过将两个或多个蛋白或其免疫原性片段(例如免疫原性肽)共价连接而形成的。在一些实例中，所述蛋白或肽是通过非肽接头例如腙接头、酰胺接头、硫醚接头或者其两种或多种的结合物连接。在其他实例中，所述蛋白或肽是通过肽接头例如包括约1至12个肽键的接头连接。

宿主：携带另一种生物体或生物实体--通常是寄生物(如疟原虫)--的细胞或生物体。在一个实例中，宿主是能被或被疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫或诺氏疟原虫)感染的人或非人灵长类。在本文中，术语“宿主”可与术语“受试者”互换使用。

免疫应答：免疫系统的细胞(如B细胞、T细胞、巨噬细胞或多形核细胞(polymorphonucleocyte))对刺激物(例如抗原)的应答。免疫应答可包含参与宿主防御应答的任何身体细胞，包括例如分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫应答包括但不局限于先天免疫应答或炎症。本文使用的保护性免疫应答是指保护受试者不受感染(防止感染或防止与感染相关的疾病发生)的免疫应答。

免疫原：在合适的条件下能刺激动物中免疫应答的化合物、组合物或物质，所述免疫应答例如产生抗体或T细胞应答，包括注射或吸收至动物中的组合物。本文使用的“免疫原性组合物”是包含免疫原的组合物。

免疫：通过例如疫苗接种而保护受试者免受传染性疾病。

分离的：“分离的”生物组分(例如核酸、蛋白或病原体)已从其他生物组分(如细胞碎片或者其他蛋白或核酸)中基本上分离或纯化出来。已被“分离的”生物组分包括通过标准纯化方法纯化的那些组分。该术语还包括重组核酸、蛋白或病原体，以及化学合成的核酸或肽。

疟疾：疟疾是人和非人灵长类被疟原虫种--恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和诺氏疟原虫--感染的寄生虫传染病。人在被感染的按蚊(疟原虫的宿主)叮咬之后受到感染。疟疾有时候会在输血后或共用针头后发生。可能出现的疟疾感染临床表现包括黑尿热、脑型疟、呼吸衰竭、肝坏死和心肌毛细血管阻塞。其他疟原虫种可感染其他宿主，如啮齿动物(柏格氏鼠疟原虫(P.berghei)、夏氏鼠疟原虫(P.chabaudi)、文氏疟原虫(P.vinckei)和约氏疟原虫(P.yoelii))、其他哺乳动物、鸟和爬行动物。

P25：富含半胱氨酸的25kDa抗原的家族，包括恶性疟原虫蚊子阶段抗原Pfs25及其间日疟原虫中的直系同源物Pvs25(参见Kaslow etal.，Nature 333：74-76，1988；Malkin et al.，Vaccine 23：3131-3138，2005)。P25蛋白由4个串联表皮生长因子样结构域构成，并且在蚊子体内寄生虫的合子和成熟动合子阶段表达。由于P25仅在蚊子中肠中而不是在脊椎动物宿主中表达，这些蛋白不处在宿主免疫系统的选择压力下并且P25的抗原性变化似乎比出现在无性血内阶段中的大多数候选疫苗局限性更大。参见，例如美国专利No.5,853,739，国际公开文本No.WO 2006/124712。P25的直系同源物存在于其他疟原虫种(如卵形疟原虫、三日疟原虫和诺氏疟原虫)中，并且为本领域技术人员所知晓。

Pfs25序列是公众可获得的。例如，GenBank编号NC_004314.1(2008年11月7日以引用的方式纳入本文)公开了来自恶性疟原虫3D7的Pfs25基因。GenBank编号XM_001347551.1和XP_001347587.1(2008年11月7日以引用的方式纳入本文)分别公开了恶性疟原虫3D7的Pfs25cDNA和蛋白序列。在一个具体实例中，Pfs25蛋白是SEQID NO：7的氨基酸序列。

Pvs25序列也是公众可获得的。例如，GenBank编号NC_009911.1(2008年11月7日以引用的方式纳入本文)公开了来自间日疟原虫SaI-1的Pvs25基因。GenBank编号XM_001608410.1和XP_001608460.1(2008年11月7日以引用的方式纳入本文)分别公开了间日疟原虫SaI-1Pvs25cDNA和蛋白序列。在一个具体的实例中，Pvs25蛋白是SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

可药用载体：可用于本公开内容的可药用载体(运载体)是常规的。Remington：The Science and Practice of Pharmacy，The Universityof the Sciences in Philadelphia，Editor，Lippincott，Williams，& Wilkins，Philadelphia，PA，21st Edition(2005)描述了适于药物递送一种或多种治疗性化合物或分子(如一种或多种肽缀合物)和另外的药剂的组合物和制剂。

一般而言，载体的性质依赖于所使用的具体给药方式。例如，肠胃外制剂一般包括可注射流体，所述可注射流体包括可药用的或可生理可接受的流体，如水、生理盐水、平衡盐溶液、水性葡萄糖、甘油等载体。对于固体组合物(例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可包括，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载体，可给予的药物组合物可包含微量的无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂、pH缓冲剂等，例如乙酸钠或山梨聚糖单月桂酸酯。

多肽：其中单体为通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的多聚体。当氨基酸是α氨基酸时，可使用L-旋光异构体或D-旋光异构体。本文使用的术语“多肽”或“蛋白”意欲包括任何氨基酸序列，并且包括经修饰的序列，如糖蛋白。术语“多肽”特别地意欲包括天然存在的蛋白，以及以重组方法或合成方法产生的那些。术语“残基”或“氨基酸残基”包括指纳入蛋白、多肽或肽的氨基酸。

保守性氨基酸残基置换是指当进行所述置换时对原始蛋白的性质干扰最小的氨基酸置换，也就是说，所述蛋白的结构特别是功能是保守的，不会被这样的置换显著改变。下面是保守性置换的实例。

保守性置换一般可保持(a)所述置换区域中多肽主链的结构，例如作为片层或螺旋构象，(b)所述分子在靶位点处的电荷或疏水性或(c)所述侧链的大小。

一般预计产生蛋白性质最大改变的置换应是非保守性的，例如如下改变：(a)亲水残基(例如丝氨酰基或苏氨酰基)置换疏水残基(例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基)，或被疏水残基(例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基)置换；(b)半胱氨酸或脯氨酸置换任何其他残基，或被任何其他残基置换；(c)具有带正电侧链的残基(例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基)置换具有带负电侧链的残基(例如谷氨酰基或天冬氨酰基)，或被具有带负电侧链的残基(例如谷氨酰基或天冬氨酰基)置换；或者(d)具有大侧链的残基(例如苯丙氨酸)置换不具有侧链的残基(例如甘氨酸)，或被不具有侧链的残基(例如甘氨酸)置换。

预防、治疗或改善疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的完全发展。“治疗”是指在疾病或病症开始出现后改善其征兆或症状的治疗性干涉。“改善”是指减少疾病的征兆或症状的数目或严重程度。

纯化的：术语“纯化的”不需要绝对纯净；更确切地说，它意欲作为相对术语。因此，例如，纯化的肽、蛋白、寄生物或其他活性化合物是指全部或部分地与天然相关的蛋白和其他污染物分离。在一些实施方案中，术语“基本上纯化的”是指已经从细胞、细胞培养基或其他粗制品中分离并且进行分级分离以除去初始制品中的多种组分(例如蛋白、细胞碎片和其他组分)的肽、蛋白、寄生物或其他活性化合物。

重组体：重组的核酸、蛋白或寄生物具有非天然存在的序列或具有通过将两个原本分离的序列片段人工组合而制备的序列。这种人工组合经常是通过化学合成或通过对分离的核酸片段的人工操作(例如通过基因工程技术)来完成。

序列同一性：两条核酸序列或两条氨基酸序列之间的相似性以所述序列之间的相似性表示，或者被称为序列同一性。序列同一性常常以同一性百分数(或相似性或同源性)度量；该百分数越大，两条序列越相似。

用于比较的序列比对方法是本领域中公知的。多种程序和比对算法记载于：Smith and Waterman(Adv.Appl.Math.，2：482，1981)；Needleman and Wunsch(J.Mol.Biol.，48：443，1970)；Pearson andLipman(Proc.Natl.Acad.Sci.，85：2444，1988)；Higgins and Sharp(Gene，73：237-44，1988)；Higgins and Sharp(CABIOS，5：151-53，1989)；Corpet et al.(Nuc.Acids Res.，16：10881-90，1988)；Huang et al.(Comp.Appls.Biosci.，8：155-65，1992)；和Pearson et al.(Meth.Mol.Biol.，24：307-31，1994)。Altschul等人(Nature Genet.，6：119-29，1994)提出了序列比对方法和同源性计算的详细考虑事项。

可使用比对工具ALIGN(Myers and Miller，CABIOS 4：11-17，1989)或LFASTA(Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448，1988)进行序列比较(Internet Program

1996，W.R.Pearson and the University of Virginia，“fasta20u63”version 2.0u63，release date December 1996)。ALIGN相对于彼此比较整个序列，而LFASTA比较局部相似的区域。这些比对工具和它们各自的教程可以在NCSA网站的互联网上得到。或者，为了比较超过约30个氨基酸的氨基酸序列，可使用“Blast 2sequences”函数，所述函数使用设置为默认参数(空位出现得分为11、每残基空位得分为1)的默认BLOSUM62矩阵。当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，应使用“Blast2 sequences”函数进行比对，使用设置为默认参数(开放空位为9，延伸空位罚分为1)的PAM30矩阵。BLAST序列比较系统可从例如NCBI网站得到；还可参见Altschul et al.，J.Mol.Biol.，215：403-10，1990；Gish and States，Nature Genet.，3：266-72，1993；Madden et al.，Meth.Enzymol.，266：131-41，1996；Altschul et al.，Nucleic Acids Res.，25：3389-402，1997；和Zhang and Madden，Genome Res.，7：649-56，1997。

蛋白的直系同源物(相当于其他物种的蛋白)在一些情况下的特征是与特定蛋白氨基酸序列进行全长序列比对时具有超过75％的序列同一性，所述序列同一性是使用设置为默认参数的ALIGN计算的。与参照序列具有甚至更大相似性的蛋白在用这种方法评估时出现同一性百分数增大，如至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。此外，可对所公开的融合蛋白的一个或两个结合结构域在全长上比较序列同一性。

当对显著少于全序列的序列进行序列同一性比较时，同源序列在10-20的短窗口上一般具有至少80％的序列同一性，并且依赖于它们与所述参考序列的相似性可具有至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性。在这样的短窗口上的序列同一性可使用LFASTA确定；方法在NCSA网站上有描述。本领域技术人员应理解，提供这些序列同一性区间仅为指导的目的；完全可能得到落在提供的区间之外的非常重要的同源物。如针对蛋白所描述的那样，类似的同源性概念适用于核酸。两个核酸分子密切相关的另一表征是两个分子在严格条件下相互杂交。

由于遗传密码子的简并性，未显示出高度同一性的核酸序列仍可以编码相似的氨基酸序列。应理解，可使用该简并性制造核酸序列的改变以产生每种都编码基本相同的蛋白的多个核酸序列。

受试者：活的多细胞脊椎动物，该类别包括人和非人哺乳动物。受试者包括兽医学受试者，包括家畜如牛和羊、啮齿动物如小鼠和大鼠，以及非人灵长类。

治疗有效量：在以具体试剂治疗的受试者中足以达到所需效果的该试剂的量。例如，这可以是用于在受试者中激发免疫应答和/或预防疟疾感染的疟疾蛋白或肽缀合物的量。在本公开文本的上下文中，疟疾蛋白或肽缀合物的治疗有效量是足以在受试者中增强对由疟原虫引起的感染的抗性，预防、改善和/或治疗由疟原虫引起的感染而不在受试者中引起大量细胞毒性作用的量。用于在受试者中增强对感染的抗性，预防、改善和/或治疗感染的疟疾蛋白或肽缀合物的有效量依赖于，例如待治疗的受试者、所述治疗性组合物的给药方式和其他因素。

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属技术领域中普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。除非上下文另有明确说明，单数术语“一种”、“一个”和“该”包括复数的指代物。类似地，除非上下文另有明确说明，词语“或”意欲包括“和”。因此，“包括A或B”是指包括A或B，或者包括A和B。还应理解，针对核酸或多肽所给出的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子质量值都是近似值，并且提供这些仅是为了进行说明。下文描述了合适的方法和材料，但是与本文描述的方法或材料类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本公开内容。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以引用的方式全文纳入。与2008年11月7日的GenBank编号相关的序列以引用的方式纳入本文。在有冲突的情况下，以本说明书(包括对术语的解释)为准。此外，所述材料、方法和实例仅是示例性的，而不是意欲进行限制。

III.对数个实施方案的综述

本文公开了可激发对疟原虫蛋白的免疫应答的免疫原性缀合物。在一些实例中，本文提供的免疫原性缀合物可激发对疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫或诺氏疟原虫)的有性阶段和无性阶段的免疫应答。所公开的免疫原性缀合物包括疟原虫有性阶段表面蛋白(如来自恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫或诺氏疟原虫的P25、P28、P48/45或P230)和疟原虫环子孢子蛋白(CSP，如来自恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫或诺氏疟原虫的CSP)或其免疫原性部分的缀合物。在其他实例中，本文提供的免疫原性缀合物可激发对疟原虫CSP的免疫应答。在一些实例中，所公开的免疫原性缀合物包括全长CSP、经修饰的CSP，或与CSP或其免疫原性部分缀合的CSP免疫原性部分(如至少一个NANP(SEQ ID NO：1)重复或其变体，或CSP的T细胞表位)和/或免疫原性载体蛋白。

在一些实例中，所公开的免疫原性缀合物包括一种或多种疟原虫有性阶段表面蛋白或其免疫原性部分。所述有性阶段表面蛋白是在疟原虫有性阶段在配子母细胞或动合子表面表达的蛋白家族。所述有性阶段表面蛋白家族的成员包括P25、P28、P48/45和P230。靶向有性阶段表面蛋白的抗体可潜在地减少或阻断受精并且/或者减少或防止疟原虫微生物传播。

在一些实例中，所述有性阶段表面蛋白是P25--一种约25kDa的富含半胱氨酸的蚊阶段抗原(参见，例如Kaslow et al.，Nature333：74-76，1988；Malkin et al.，Vaccine 23：3131-3138，2005)。P25蛋白由4个串联表皮生长因子样结构域构成并且在蚊子体内的寄生虫的合子和成熟动合子阶段表达。由于P25仅在蚊子中肠内表达而不再脊椎动物宿主中表达，这些蛋白不处在所述宿主的免疫系统选择压力下，并且P25的抗原性变化似乎比出现在红细胞前期和无性血内阶段的大多数疫苗候选物局限性更大。参见，例如美国专利No.5,853,739；国际公开文本No.WO 2006/124712。在具体的实例中，在所公开的组合物中使用的P25蛋白是恶性疟原虫Pfs25蛋白(如GenBank编号XP_001347587.1或SEQ ID NO：7)、间日疟原虫Pvs25蛋白(如XP_001608460.1或SEQ ID NO：8)、来自其他疟原虫种(如卵形疟原虫、三日疟原虫或诺氏疟原虫)的P25蛋白直系同源物或其保持免疫原性的变体。

在其他实例中，所述有性阶段表面蛋白是P28--一种在疟原虫感染的蚊阶段期间在合子和动合子表面表达的约28kDa蛋白。P28在结构上与P25相似，具有4个串联的表皮生长因子样结构域(参见，例如Duffy and Kaslow，Inf.Immun.65：1109-1113，1997)。在具体的实例中，在所公开的缀合物中使用的P28蛋白是恶性疟原虫Pfs28蛋白(如GenBank编号L25843)、间日疟原虫Pvs28蛋白(如GenBank编号AF083503、XM_001608411、EU514789或AB091745)、来自其他疟原虫种(如卵形疟原虫、三日疟原虫或诺氏疟原虫)的P28蛋白直系同源物，或其保持免疫原性的变体。

在另外的实例中，所述有性阶段表面蛋白是P48/45--一种由雄性和雌性疟原虫配子表达的且含有2个6半胱氨酸结构域的蛋白(vanDijk et al.，Cell 104：153-164，2001)。抗Pfs48/45的抗体已被证明可阻断或减少恶性疟原虫的传播(参见，例如Outchkourov et al.，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 105：4301-4305，2008)。在具体的实例中，在所公开的缀合物中使用的P48/45蛋白是恶性疟原虫Pfs48/45蛋白(如GenBank编号Z22145)、间日疟原虫Pvs48/45蛋白(如GenBank编号XP_001614246.1)、来自其他疟原虫种(如卵形疟原虫、三日疟原虫或诺氏疟原虫)的P45/48蛋白直系同源物，或其保持免疫原性的变体。

在其他实例中，所述有性阶段表面蛋白是P230--一种出现后保留在配子表面的配子母细胞表面抗原(参见，例如美国专利No.5,733,772)。抗Pfs230的抗体已被证明可阻断或减少疟原虫的传播(参见，例如Healer et al.，Infect.Immun.65：3017-3023，1997)。在具体的实例中，在所公开的缀合物中使用的P230蛋白是恶性疟原虫Pfs230蛋白(如GenBank编号L08135或AF269242)、间日疟原虫Pvs230蛋白(如GenBank编号XM_001613322.1或XM_001612970)、来自其他疟原虫种(如卵形疟原虫、三日疟原虫或诺氏疟原虫)的P230蛋白直系同源物，或其保持免疫原性的变体。

在一些实例中，所公开的免疫原性缀合物包括疟原虫CSP或其免疫原性部分。CSP是孢子生殖周期中覆盖疟原虫子孢子表面的主要寄生虫表面蛋白，所述子孢子从蚊子的唾液腺传播到宿主的肝细胞中。它是高度免疫原性的，并且在地方病区域，可在循环系统血液中观察到该蛋白的高抗体效价。参见，例如Dame et at al.，Science 225：593-599，1985；Zavala et al.，Science 228：1436-1440，1985；国际公开文本No.WO2008/107370。

在具体的实例中，在所公开的缀合物中使用的CSP是恶性疟原虫CSP(如GenBank编号XP_001351122.1或SEQ ID NO：6)、间日疟原虫CSP(如GenBank编号XP_001616893.1)、来自其他疟原虫种(如卵形疟原虫、三日疟原虫或诺氏疟原虫)的CSP直系同源物，或其保持免疫原性的变体。

CSP的免疫原性部分是本领域技术人员已知的。在一些实例中，所述疟原虫CSP包括至少一个可形成CSP免疫显性表位的多重复氨基酸基序。在一个实例中，该基序是恶性疟原虫CSP中的NANP(SEQID NO：1)(参见，例如Dame et al.，Science 225：593-599，1985；Zavalaet al.，Science 228：1436-1440，1985；国际公开文本No.WO2008/124712)。在其他实例中，CSP的免疫原性部分包括所述多重复的恶性疟原虫NANP(SEQ ID NO：1)基序，如NPNA(SEQ ID NO：2)、PNAN(SEQ ID NO：3)或ANPN(SEQ ID NO：4)，的变体。本领域技术人员可识别来自疟原虫CSP的免疫显性重复基序。在其他非限制性实例中，所述CSP重复基序包括来自间日疟原虫VK210CSP的(D/A)GQPAGDRA(SEQ ID NO：9)、来自间日疟原虫VK247 CSP的(G/D)NGPGANGA(SEQ ID NO：10)、来自三日疟原虫CSP的NAAG(SEQ ID NO：11)、来自诺氏疟原虫CSP的QAQGDGANGQP(SEQ ID NO：12)或来自卵形疟原虫CSP的APGANQEGGAA(SEQID NO：13)。

在一些实例中，所述CSP重复基序的末端基团可以影响包含所述重复的缀合物的免疫原性。所述重复的末端氨基酸基团可以是Asn、Ala或Pro。在具体的实例中，所述末端基团是Asn。在其他实例中，所述末端基团是Pro。

疟原虫CSP还包括作为T细胞表位(如CSP通用T细胞表位)的免疫原性部分。在一个具体的实例中，所述CSP通用T细胞表位来自恶性疟原虫，并且具有序列EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQ IDNO：14)(参见，例如，美国专利公开文本2005/0249750)、其保持免疫原性的变体或来自直系同源CSP蛋白的等价序列。在另一实例中，所述CSP T细胞表位来自恶性疟原虫，并且具有序列(DPNANPNV)₂(SEQ ID NO：15)(参见，例如美国专利公开文本2005/0249750)、其保持免疫原性的变体或来自直系同源CSP蛋白的等价序列。

本文提供了免疫原性缀合物，所述免疫原性缀合物包含与至少一个疟原虫CSP或其免疫原性部分共价连接的至少一个疟原虫有性阶段表面蛋白(例如，P25、P28、P48/45或P230)，其中所述缀合物可在受试者中激发对所述有性阶段表面蛋白和CSP的免疫应答。在一些实施方案中，所述免疫原性缀合物包含与至少一个CSP(如1、2、3、4或5个CSP)共价连接的至少一个有性阶段表面蛋白(如1、2、3、4、5或更多个有性阶段表面蛋白)。在一个具体的非限制性实例中，所述免疫原性缀合物包含与1个CSP共价连接的2个P25蛋白(如Pfs25或Pvs25)(如与CSP连接的Pfs25-AH-Pfs25)。在另一个实例中，所述免疫原性缀合物包含与1个CSP共价连接的1个P25蛋白(如Pfs25或Pvs25)(如Pfs25-CSP)。

本文所公开的免疫原性缀合物还包括具有与至少一个CSP NANP重复或其变体(如至少一个NANP(SEQ ID NO：1)重复、至少一个NPNA(SEQ ID NO：2)重复、至少一个PNAN(SEQ ID NO：3)重复、至少一个ANPN(SEQ ID NO：4)重复或它们中两者或两者以上的结合物)共价连接的至少一个疟原虫有性阶段表面蛋白(如P25、P28、P48/45或P230)的缀合物。在一些实例中，所述缀合物包含2至10个NANP重复或其变体(如2、3、4、5、6、7、8、9或10个重复)。在具体实例中，所述缀合物包含3至6个NANP重复或其变体。

在一些实例中，所述缀合物包含与(NANP)_x、(NPNA)_x、(PNAN)_x或(ANPN)_x共价连接的2个有性阶段表面蛋白(如2个Pfs25蛋白)，其中x是1或更大(例如，1-10，如2-8或3-6，例如4或5)。在具体的非限制性实例中，所述缀合物包含与(NANP)₄(SEQ ID NO：16)或(NANP)₅(SEQ ID NO：17)共价连接的2个P25蛋白(如Pfs25或Pvs25)、与(NPNA)₄(SEQ ID NO：18)或(NPNA)₅(SEQ ID NO：19)共价连接的2个P25蛋白(如Pfs25或Pvs25)、与(PNAN)₄(SEQ IDNO：20)或(PNAN)₅(SEQ ID NO：21)共价连接的2个P25蛋白(如Pfs25或Pvs25)或者与(ANPN)₄(SEQ ID NO：22)或(ANPN)₅(SEQID NO：23)共价连接的2个P25蛋白(如Pfs25或Pvs25)。

本文还提供了包含与至少一种其他免疫原性蛋白共价连接的至少一个来自恶性疟原虫CSP的NANP(SEQ ID NO：1)重复或其变体的免疫原性缀合物，其中所述缀合物可在受试者中激发针对所述重复的免疫应答。在一些实例中，所述缀合物包含2至10个NANP重复或其变体(如2、3、4、5、6、7、8、9或10个重复)。在一些实例中，来自CSP的重复选自NPNA(SEQ ID NO：2)、PNAN(SEQ ID NO：3)和ANPN(SEQ ID NO：4)。在具体的实例中，所述免疫原性缀合物包含(NANP)_x、(NPNA)_x、(PNAN)_x或(ANPN)_x，其中x是1或更大(例如，1-10，如2-8或3-6，例如4或5)，例如，与至少一个其他免疫原性蛋白共价连接的(NANP)₄(SEQ ID NO：16)或(NANP)₅(SEQ ID NO：17)、(NPNA)₄(SEQ ID NO：18)或(NPNA)₅(SEQ ID NO：19)、(PNAN)₄(SEQ ID NO：20)或(PNAN)₅(SEQ ID NO：21)、或者(ANPN)₄(SEQ ID NO：22)或(ANPN)₅(SEQ ID NO：23)。

所述其他免疫原性蛋白(有时称为“载体”蛋白)理论上本身具有免疫原性的特性，可用于受试者，具有容易纯化的大小并且连接于至少一种其他蛋白或肽。所述载体蛋白可以是来自疟原虫的免疫原性蛋白，如CSP或Pfs25；或非疟原虫蛋白的免疫原性蛋白，如人病原体蛋白或可激发免疫应答的其他蛋白。合适的载体蛋白是本领域技术人员已知的。在具体的实例中，所述其他免疫原性蛋白(载体蛋白)是牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白、破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱毒素、艰难梭菌(Clostridium difficile)毒素A、艰难梭菌毒素B或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)重组体胞外蛋白(exoprotein)A。在具体实例中，所述1个或多个NANP(SEQ ID NO：1)重复或其变体与BSA共价连接。在另一具体实例中，所述免疫原性缀合物是与CSP共价连接的(NPNA)₅(SEQ ID NO：19)。在另一具体实例中，所述免疫原性缀合物是与白喉类毒素共价连接的(PNAN)₅(SEQ IDNO：21)。在另一具体实例中，所述免疫原性缀合物是与破伤风类毒素共价连接的(NANP)₄(SEQ ID NO：16)。

本发明还提供了包含肽的免疫原性缀合物，所述肽包含至少1个疟原虫T细胞表位以及与至少一个其他免疫原性蛋白共价连接的至少4个NANP重复。在一些实例中，所述疟原虫T细胞表位来自CSP，如恶性疟原虫CSP肽EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQ ID NO：14)或(DPNANPNV)₂(SEQ ID NO：15)。在具体实例中，所述缀合物还包含与疟原虫T细胞表位连接的4、5或6个NANP重复，如(NANP)₄(SEQ ID NO：16)、(NANP)₅(SEQ ID NO：17)或(NANP)₆(SEQ IDNO：24)。

本发明还提供了包含疟原虫T细胞表位以及与至少1个其他免疫原性蛋白共价连接的至少1个NANP(SEQ ID NO：1)重复、至少1个PNAN(SEQ ID NO：2)重复、至少1个NPNA(SEQ ID NO：3)重复或至少1个ANPN(SEQ ID NO：4)重复的免疫原性缀合物。在一些实例中，所述疟原虫T细胞表位来自CSP，如恶性疟原虫CSP肽EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQ ID NO：14)或(DPNANPNV)₂(SEQ ID NO：15)。在一些实例中，所述缀合物包含3、4、5或6个重复或其结合。在具体的实例中，所述缀合物包含至少一个恶性疟原虫T细胞表位以及与至少一个其他免疫原性蛋白共价连接的(NANP)₄(SEQ ID NO：16)或(NANP)₅(SEQ ID NO：17)、(NPNA)₄(SEQ IDNO：18)或(NPNA)₅(SEQ ID NO：19)、(PNAN)₄(SEQ ID NO：20)或(PNAN)₅(SEQ ID NO：21)、或者(ANPN)₄(SEQ ID NO：22)或(ANPN)₅(SEQ ID NO：23)。所述其他免疫原性蛋白可以是来自疟原虫的免疫原性蛋白，如CSP或Pfs25；或者是非疟原虫蛋白的免疫原性蛋白，如人病原体蛋白或可激发免疫应答的其他蛋白。在具体的实例中，所述其他免疫原性蛋白是牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白、破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱毒素、艰难梭菌毒素A、艰难梭菌毒素B或铜绿假单胞菌重组体胞外蛋白A。在一个具体实例中，所述缀合物包含与BSA共价连接的(NANP)₄-EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQ ID NO：25)。

本领域技术人员应认识到，在所公开的免疫原性缀合物中使用的蛋白和肽的变体也可用于产生免疫应答。这样的变体包括一种或多种自然存在或重组方法引入的核苷酸或氨基酸置换，如与所述蛋白或多肽具有至少约80％序列同一性(例如至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或甚至约99％序列同一性)的蛋白和多肽。引入核苷酸或氨基酸置换的方法是本领域技术人员熟知的。例如，在Sambrook et al.(ed.)，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2^nd ed.，vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中提供了方案。

最简单的修饰涉及以1个或多个氨基酸置换具有相似物理化学和/或结构性质的氨基酸。这些所谓的保守性置换对所得蛋白的活性和/或结构(如免疫原性)可能有很小的影响。保守性置换一般可保持(a)所述置换区域中多肽主链的结构，例如作为片层或螺旋构象，(b)所述分子在靶位点的处电荷或疏水性或(c)所述侧链的大小。

所公开的蛋白或肽的变体还可包括经修饰的蛋白或肽(如缺失可降低或干扰免疫原性的序列或者添加有利于蛋白克隆或纯化的序列)。在具体的实例中，所述有性阶段表面蛋白和/或CSP包含额外的序列以有利于重组表达蛋白的纯化(如6×His标签)。在其他实例中，可将所述CSP的GPI-锚定基序除去以增强免疫原性(参见，例如Bruna-Romero et al.，Vaccine 22：3575-3584，2004)，并且/或者可将所述CSP氨基末端的8个氨基酸除去。经修饰的CSP的一个具体非限制性实例分别具有SEQ ID NO：5和6的核酸和氨基酸序列，它们缺乏所述GPI锚定基序并且包含6个末端组氨酸残基。在其他实施方案中，所述CSP蛋白包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，但无所述6个组氨酸残基。

有性阶段表面蛋白(如P25、P28、P48/45或P230)和CSP的缀合物的最高抗体水平一般可由这样的缀合物获得：即其有性阶段表面蛋白(例如Pfs25或Pvs25)与所述其他蛋白或肽(如CSP或其免疫原性部分，例如NANP(SEQ ID NO：1)重复或其变体)摩尔比例超过1∶1，例如约1.1∶1至约5∶1(例如，约1.2∶1至约4∶1，约1.3∶1至约3∶1，或约1.4∶1至约2.5∶1)。在一些实例中，所述缀合物的有性阶段表面蛋白与所述其他蛋白或肽的比例为约2∶1。在一个具体的实例中，Pfs25与CSP重复序列的比例是约2∶1。制备本文所述的缀合物的方法可产生具有分子量分布的反应产物。可将所得到的反应混合物分级为具有不同分子量的级分。在具体的实例中，所述缀合物具有由经SDS-PAGE测定为约50-250 kDa的分子量。

在一些实例中，所描述的免疫原性缀合物包含与其他免疫原性蛋白(例如P25、CSP、BSA或其他载体蛋白)共价连接的NANP(SEQID NO：1)、NPNA(SEQ ID NO：2)、PNAN(SEQ ID NO：3)或ANPN(SEQ ID NO：4)重复链。与所述第二蛋白连接的重复链的数目可因例如连接反应中重复链和其他蛋白的起始量或者所述蛋白上的官能团的数目而变化。链的数目(例如，每个BSA的NANP(或其变体)重复链数目或者每个P25的NANP(或其变体)重复链数目)一般是约5至约30，如约10至20。最佳链数目对于每个蛋白来说均不同并且可由本领域技术人员确定。

IV.连接基团和缀合反应

本文描述的蛋白或肽可通过合适的键相互共价连接。所述共价键可以是非肽接头(如酰胺键、腙键或硫醚键)或肽接头。

在一些实例中，本文描述的缀合物包括通过非肽共价键连接的蛋白或肽。可用于本文所述缀合物的非肽键的具体实例在美国专利公开文本No.2005/0271675；国际公开文本No.WO 2008/048945；Schneerson et al.，J.Exp.Med.152：361-376，1980；Schneerson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：8945-8950，2003；Kubler-Kielb et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104：293-298，2007中有描述。在一些实例中，所述共价键是酰胺键、腙键或硫醚键，特别是酰胺键或硫醚键。具体的连接基团包括己二酸二酰肼(ADH)、N-琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酸酯(SFB)、N-琥珀酰亚胺基-3-溴乙酰胺丙酸酯(SBAP)和N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)。

ADH或合适的类似物，如具有下式的化合物组的成员：

其中n是1、2、3、4或5，可被于用作连接剂以产生酰胺键。蛋白或多肽(如P25、CSP或其部分，或其他免疫原性蛋白)的羧酸部分与所述连接剂的酰肼基团反应以产生酰胺键。在一些实例中，所述反应可分两步进行，第一步涉及用二酰肼衍生化所述蛋白或多肽，然后第二步涉及所述衍生化的蛋白与另一种蛋白或多肽进一步反应。

ADH或合适的类似物(如上文所述)以及具有下式的SFB(或合适的类似物)可用作连接剂以产生腙键，所述式为：

其中Z独立地是氢、卤素(例如氟、氯、溴或碘)或低级烷基(例如C₁-C₆烷基)。所述反应优选分两步进行。在第一步中，使蛋白或多肽(如P25、CSP或其部分，或其他免疫原性蛋白)的胺部分与SFB反应以产生衍生化的蛋白或多肽，并且独立地使另一种蛋白或多肽的羧酸部分与ADH反应以产生衍生化的蛋白。在第二步中，所述两种衍生物进行反应以产生包含腙连接基团的缀合物。

具有下式的SBAP(或合适的类似物)：

其中p是1、2、3、4、5、6、7或8，r是1、2、3、4、5、6、7或8，以及具有下式的SPDP(或合适的类似物)：

其中q是1、2、3、4、5、6、7或8，可用作连接剂以产生硫醚键。所述反应优选分两步进行。第一步涉及使蛋白或多肽(如P25、CSP或其部分，或其他免疫原性蛋白)的胺部分与SBAP反应以产生衍生化的蛋白或多肽，并且独立地使另一种蛋白或多肽的胺部分与SPDP反应以产生衍生化的蛋白。在第二步中，所述两种衍生物进行反应以产生包含硫醚连接基团的缀合物。

在一些缀合物中可使用单一键型，或可使用两种或多种键型的混合。在具体的实例中，所述免疫原性缀合物包含由酰胺连接基团共价连接的两个Pfs25蛋白，其中所述酰胺连接基团又通过硫醚键与NANP重复(或其变体)连接。

在具体的实例中，所述缀合反应(如连接至少两个疟原虫有性阶段表面蛋白的反应，或将两个或多个疟原虫有性阶段表面蛋白连接至CSP或其一部分的反应)分两步进行。在其他实例中，所述缀合反应可在单独一个步骤中进行。对于一种具体的缀合物，本领域技术人员可以确定两步或一步缀合反应是否有利，例如产生更高产量的缀合物。

在一些实例中，本文描述的缀合物是由肽键连接。可用于本发明的连接物可以例如仅仅是肽键，或者可包含氨基酸，包括能够形成二硫键的氨基酸。在具体的实例中，接头的长度是1至10个肽键(如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个肽键)、1至12个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸)，或者是它们的结合。在一些实例中，所述接头是1、2、3、4或5个氨基酸(例如，精氨酸或赖氨酸)。需要使用在宿主中不产生免疫反应(或仅产生很小免疫反应)的接头。本领域技术人员可确定一种具体的接头是否会在宿主中产生免疫反应。

V.激发免疫应答的方法

本发明提供了通过给予宿主一种或多种本文描述的免疫原性缀合物而在所述宿主中激发免疫应答的方法。在具体的实例中，所述宿主是人。本文公开的免疫原性缀合物可用于产生防止疟原虫寄生物感染的免疫应答，并且还可用于治疗或抑制疟原虫寄生物的感染。

在一些实例中，所述方法还包括选择需要增强针对疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和诺氏疟原虫)的免疫性的宿主。需要增强针对疟原虫的免疫性的宿主包括有被疟原虫感染的风险的受试者、已经暴露于疟原虫寄生物的受试者和被疟原虫寄生物感染的受试者。其中疟疾是地方病的国家或区域(如非洲、中美洲和南美洲、伊斯帕尼奥拉岛(海地和多米尼加共和国)、亚洲(包括印度次大陆、东南亚和中亚)、东部欧洲和南太平洋)的居民或旅行者有接触疟疾的风险，所述疟疾如由感染疟原虫而引起的疟疾。有助于感染疟原虫的风险的其他因素包括：地区的特征、时节、所述区域疟疾的存在情况、暴露于蚊虫叮咬和缺乏预防性措施(如抗疟疾药物和/或驱虫剂)。疟疾的风险通常在农村和低海拔温暖地区中较高。疟疾的风险还在降雨较多和温度较暖的季节里增加，但是传播可在一年的任何时间发生。暴露于蚊虫叮咬，例如在夜晚外出或不用蚊帐睡觉会增加疟疾感染的风险。

所公开的肽缀合物或其免疫原性组合物可通过任何通常用于将组合物引入受试者体内的途径给予受试者。给药的方法包括但不限于皮内、肌肉、腹膜内、肠胃外、静脉内、皮下、阴道、直肠、鼻内、吸入或口服。肠胃外给药(如皮下、静脉或肌肉给药)一般通过注射进行。注射剂可制备为常规形式--液体溶液或悬液、适于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式或者乳液。注射溶液或悬液可用之前描述的无菌粉末、颗粒和片剂种类制备。给药可以是全身的或局部的。

免疫原性组合物可以任何合适的方式给药，如与可药用载体一起给药。可药用载体部分地取决于待给予的具体组合物以及用于给予所述组合物的具体方法。因此，存在多种本公开内容的药用组合物的合适制剂。

肠胃外给药的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬液和乳液。非水性溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、乙醇/水性溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外运载体包括氯化钠溶液、林格葡萄糖(Ringer’sdextrose)、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格或不挥发性油。静脉内运载体包括流体和营养补充物、电解液补充物(如基于林格葡萄糖的那些)等。还可存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

一些组合物可潜在地作为可药用酸加成盐或碱加成盐给药，所述可药用酸加成盐或碱加成盐是通过与无机酸和有机酸反应形成，或通过与无机碱和有机碱反应形成，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸，所述有机酸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和反丁烯二酸，所述无机碱如氢氧化钠、氢氧化铵和氢氧化钾，所述有机碱如单、二、三烷基和芳基胺以及经取代的乙醇胺。

可通过单次或多次剂量完成给药。在本公开内容的上下文中，给予受试者的剂量应足以在受试者中随时间诱导有益的治疗性应答，或足以抑制或防止疟原虫感染。所需要的剂量会因受试者不同而不同，取决于受试者的物种、年龄、体重和总体状况、待治疗感染的严重程度、所使用的具体免疫原性组合物及其给药方式。合适的剂量可由本领域普通技术人员仅使用常规实验确定。重复的免疫接种可能是在受试者中产生免疫应答所必需的。免疫方案(如免疫原的量、剂量的数目和给药的时间选择)可通过实验确定，例如通过使用动物模型(如非人灵长类)，并随后通过在人中进行临床测试。

本文提供了药物组合物(还称作免疫原性组合物)，所述药物组合物包含治疗有效量的所公开免疫原性缀合物，所述免疫原性缀合物是单独的或是与可药用载体结合的。可药用载体包括但不限于盐水、缓冲的盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和它们的结合物。所述载体和组合物可以是无菌的，并且所述制剂适于所述给药方式。所述组合物还可包含微量润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。所述组合物可以是液体溶液、悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末。所述组合物能够被以常规粘合剂和载体(如甘油三酯)配制为栓剂形式。口服制剂可包含标准载体，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。可使用任何普通药物载体，如无菌盐溶液或芝麻油。所述介质还可包含常规药物辅助材料，例如调节渗透压的可药用盐、缓冲剂和防腐剂等。可与本文提供的所述组合物和方法一块使用的其他介质有常规盐水和芝麻油。

本文公开的药物组合物还可以本领域公认的方式及本领域公认的水平使用通常存在于药物组合物中的佐剂。因此，例如，所述组合物可包含用于以物理方法配制优选实施例的多种剂型的材料。佐剂一般与免疫原性组合物(疫苗)结合，用于改善免疫应答的目的。合适的佐剂包含氢氧化铝、磷酸铝、氧化铝、单磷酰脂质A(monophosphenyllipid A)、胞壁酰二肽、葡聚糖、Quil A、弗氏不完全佐剂或弗氏完全佐剂。如果使用氢氧化铝(alum)或磷酸铝，用量优选不超过每剂量0.84mg铝。

已知在体外和体内用于诱导细胞应答的多种方法。已经鉴定了脂质可作为能够协助在体内引发针对多种抗原的CTL的试剂。例如，如美国专利No.5,662,907所述，棕榈酸残基可连接在赖氨酸残基的α和ε氨基基团上，并且随后连接至(例如通过一个或多个连接残基，如甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸、丝氨酸、丝氨酸-丝氨酸等)免疫原性肽。然后，可将所述脂质化的肽以微团的形式直接注射，整合在脂质体中或者乳化在佐剂中。再例如，大肠杆菌(E.coli)脂蛋白(如三棕榈酰-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinylseryl-serine))当与合适的肽共价连接时可用于引发肿瘤特异性CTL(参见，Deres et al.，Nature 342：561，1989)。此外，由于中和抗体的诱导还可用与可展示合适表位的肽连接的相同分子引发，可将两种组合物结合以在认为需要时同时引发体液和细胞介导的应答。

VI.评估免疫原性应答的方法

本文公开的组合物和方法可用于在宿主或受试者中产生免疫原性应答。评估对组合物的免疫应答的方法是本领域技术人员熟知的。

在一些实例中，对组合物(如所述公开的免疫原性缀合物)的免疫应答，可通过评估针对所述组合物的抗体产生来确定。检测样本中针对所公开组合物的抗体的方法可通过例如如下方式进行：将来自以所述组合物免疫的受试者的体液或组织样本与所述组合物的多肽接触，并且检测所述多肽与所述抗体的结合情况。该方法的体液样本可包括任何生物学体液(所述生物学体液中可包含所述抗体)，如脑脊髓液、血液、胆汁、血清、唾液和尿液。体液的其他可能的实例包括痰、粘液等。

酶免疫测定法例如IFA、ELISA和免疫印迹可被容易地修改以适于完成对根据本公开方法的抗体的检测。可有效地用于检测所述抗体的ELISA法可以是例如以下：1)使所述多肽与底物结合；2)使所述结合的多肽与含有所述抗体的体液或组织样本接触；3)使上述物质与结合至可检测部分(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的第二抗体接触，所述第二抗体可与所述结合的抗体反应；4)使上述物质与所述酶的底物接触；5)使上述物质与显色试剂接触；并且6)观察/测量颜色变化或出现。

可用于抗体检测的另一种免疫学技术使用单克隆抗体(mAb)，用于在竞争抑制测定法中检测与所公开的组合物特异性反应的抗体。简而言之，使样本与结合于底物(例如，96孔板)的本公开内容的多肽接触。将多余的样本完全洗掉。然后，使经标记的(例如，酶联的、荧光的和放射性的)mAb与任何之前形成的多肽-抗体复合物接触，并且测量mAb结合的量。相对于对照(无抗体)，测量对mAb结合的抑制量，使得可检测并测量所述样本中的抗体。

又例如，可使用微凝集试验来检测样本中针对所公开组合物的抗体的存在情况。简而言之，用本公开内容的多肽包被胶乳珠、红细胞或其他可凝集颗粒并与样本混合，使得所述样本中可与所述抗原特异性反应的抗体与所述抗原交联，导致凝集。所述凝集的多肽-抗体复合物形成肉眼可见或分光光度计可测量的沉淀物。

在再一实例中，可使用基于微球的免疫测定法来检测样本中抗体的存在情况。简而言之，用本公开内容的组合物的组分(如Pfs25、Pvs25、CSP或它们的免疫原性部分)包被微球珠并与样本混合，使得所述样本中可与所述抗原特异性反应的抗体与所述抗原结合。使所述与珠结合的多肽-抗体复合物与经荧光染料标记的抗物种的抗体(anti-species antibody)(如FITC标记的山羊抗人IgM)反应，并使用检测器(如

设备)进行测量。

在一些实例中，对组合物(例如所公开的免疫原性缀合物)的免疫应答可通过评估阻断疟疾传播的抗体(如针对有性阶段表面蛋白--例如P25、P28、P48/45或P230--的抗体)的产生来确定。传播-阻断测定法是本领域技术人员熟知的(参见，例如Quakyi et al.，J.Immunol. 139：4213-4217，1987)。简而言之，将含有潜在阻断传播的抗体的血清与疟原虫配子母细胞培养物混合，并且通过膜喂食装置喂食给按蚊属(Anopheles)蚊子。培养蚊子足够长的时间以使成熟囊合子形成。通过对蚊子中肠进行染色检测囊合子(例如，用红汞染色)并且对每个中肠的囊合子进行计数来评估感染性。对传播的抑制百分数通过如下公式计算：100×(囊合子#阴性对照-囊合子#测试)/囊合子#阴性对照，其中在所述测定法中，所述测试血清和阴性对照的血清稀释倍数是匹配的。

在其他实例中，对组合物(例如所公开的免疫原性缀合物)的免疫应答可通过评估以所公开的组合物免疫接种所产生抵御感染的保护效应来确定。简而言之，用一种或多种所公开的免疫原性组合物免疫宿主(如非人灵长类，例如恒河猴或猩猩)。在足以使免疫应答形成的足够长的时间后，用活的疟原虫寄生物激发所述宿主。通过血液涂片检查血液中寄生物的存在情况来监测感染。经免疫的宿主中与对照宿主相比寄生物数目减少表明针对所述组合物形成了免疫应答。

在另外的实例中，对组合物(例如所公开的免疫原性缀合物)的免疫应答可通过评估T细胞细胞因子产生来确定。例如，含有T细胞的样本(如血液，例如外周血单核细胞)可获自己经给予一种或多种本文描述的免疫原性缀合物的受试者。用所述免疫原性缀合物或其一部分(例如，疟原虫有性阶段表面抗原、CSP或CSP重复)刺激所述T细胞，并测量细胞因子生产(如γ干扰素、白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-6、白细胞介素-10、白细胞介素-12、白细胞介素-13、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子或肿瘤坏死因子-α)。测量细胞因子的方法是本领域技术人员熟知的，包括但不限于ELISA、ELISPOT或流式细胞术(如FASTIMMUNE^TM细胞因子系统，BectonDickinson)。

通过以下非限制性实施例举例说明本公开内容。

实施例1

恶性疟原虫蛋白缀合物的制备

如Kubler-Kiehl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 104：293-298，2007所述(以引用方式纳入本文说明书)，通过酰胺键连接Pfs25-Pfs25缀合物。

通过用己二酸二酰肼(ADH)在重组恶性疟原虫动合子表面蛋白Pfs25的经碳二亚胺活化的天冬氨酸和谷氨酸的羧基之间形成酰胺键将所述蛋白衍生化。在一些实例中，所述Pfs25-AH-Pfs25缀合物通过一步方法制备(图1A)。使衍生化的Pfs25(15mg/ml)与0.006M ADH(6％w/w)在存在0.1M 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺氢氯化物(EDC)的情况下在pH 5.1和室温下反应4小时，并且在4-8℃下翻转过夜。将所述反应混合物用磷酸盐缓冲液(PBS)透析，然后在0.2M NaCl中通过1×90cm Sepharose CL-6B柱(AmershamPharmacia，Pittsburgh，PA)。基于柱色谱和SDS-PAGE谱，将通过免疫扩散与抗Pfs25的抗体反应的级分根据它们的分子量分为两集合物(F1级分，较高分子量级分；F2级分，较低分子量级分)。

在其他实例中，所述Pfs25-AH-Pfs25缀合物通过2步方法制备(图1B)。如Schneerson et al.，J.Exp.Med.152：361-376，1980中所述，用ADH衍生化Pfs25。将等量的均为7.5mg/ml的Pfs25-AH和Pfs25混合，并与0.05M EDC在pH 5.8和室温下下反应4小时，并且在4-8℃下翻转过夜。然后，如上所述处理所述反应混合物。

通过将蛋白溴乙酰化并如Schneerson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：8945-8950，2003和Kubler-Kielb et al.，Infect.Immun.74：4744-4749，2006(以引用方式纳入本文)中所述通过形成硫醚键将经末端半胱氨酸缀合第二个蛋白，制备了Pfs25-AH-Pfs25与另一种蛋白的缀合物或其他蛋白的缀合物。图2显示了将蛋白(如Pfs25-Pfs25或BSA)缀合至NANP重复的方法的示意图。使用琥珀酰亚胺基-3-(溴乙酰胺)丙酸酯(SBAP，11mg溶于50μl二甲亚砜中)将蛋白(如Pfs25-Pfs25缀合物、BSA或其他蛋白)溴乙酰化，加入10μl等分试样。60分钟后，在0.01M磷酸盐/0.2M NaCl/0.05％甘油(pH 7.2)中，使所述反应混合物通过1×90cm Sepharose CL-6B柱，。收集含有溴乙酰胺丙酰基-ε-Lys-NH-蛋白(bromoacetoamidopropionyl-ε-Lys-NH-protein，Br-蛋白)的级分并测定蛋白、游离NH₂、抗原性和分子量。以1M NaOH将待与所述溴乙酰化的蛋白经羧基末端半胱氨酸残基缀合的蛋白或肽(如CSP或NANP、NPNA、ANPN或PNAN重复)调节至pH 7.6，并且加入溶于1.5ml的PBS/3％甘油/0.005M EDTA(pH 7.6)的Br-蛋白(25mg)。在1小时后，将所述反应混合物转移至小瓶中，加盖并在室温下翻转过夜。加入2-巯基乙醇(1μl)以猝灭Br-蛋白中残余的溴乙酰基基团。30分钟后，在0.01M磷酸盐/0.2M NaCl/0.05％甘油(pH 7.2)中，使所述反应混合物通过1×90cm Sepharose CL-6B柱。收集合有蛋白缀合物的级分并测定蛋白浓度、抗原性和分子量。

实施例2

Pfs25-NANP缀合物的免疫原性

方法

如实施例1所述，制备了与NANP肽缀合的Pfs25-Pfs25。对5-6周龄NIH一般用途小鼠(n＝10)两周一次皮下注射缀合物形式的2.5μgNANP。在第二或第三次注射7天后对小鼠抽血，并测量IgG水平。

通过ELISA测量血清IgG抗体。用10μg抗体/ml PBS包被96孔板。用0.5％BSA将板在室温下封闭1小时，并以测试血清孵育过夜，然后与经磷酸酶标记的亲和纯化的山羊抗小鼠IgG(KPL，Gaithersburg，MD)孵育4小时。使用MRX读数仪(Dynatech，Chantilly，VA)来记录光密度。

如Kubler-Kielb et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 104：293-298，2007中所描述，确定了阻断传播的活性。将来自用Pfs25/NANP缀合物(用AI-水凝胶配制)免疫的小鼠的血清合并并且在56℃下加热失活15分钟。然后，用未处理的人血清集合物(

human serum pool)系列稀释所述血清，以使小鼠血清的非特异抑制效应最小。对于每个测试集合体，将与所述免疫血清平行稀释的预免疫血清用于配子母细胞的基线定量。将所稀释的血清与恶性疟原虫配子母细胞培养物(NF54系)混合并通过膜喂食装置喂食斑须按蚊(Anopheles stephensi，Nijmegen株)。培养蚊子8天以使寄生物形成成熟的囊合子。通过解剖每份血清样本中至少20只蚊子，用红汞(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)染色中肠，并且对每个中肠的囊合子进行计数来测量感染性。为了计算囊合子的减少百分数，使用下面公式：100×(囊合子#阴性对照一囊合子#测试)/囊合子#阴性对照，其中在所述测定中，所述测试血清和阴性对照血清的稀释倍数是匹配的。

结果

一些带有Pfs25-Pfs25/NANP缀合物的构建体对它们的两个组分都诱导了长效抗体应答(表1)。使用佐剂氢氧化铝(alum)提高了对Pfs25和CSP的免疫应答。此外，在将Pfs25-AH-Pfs25/NANP5缀合物和佐剂氢氧化铝注射至小鼠中的第二次注射3个月后，Pfs25和CSP抗体的水平升高。吸附在alum上的(NPNA)₅-Pfs25单体是弱免疫原并且不是CSP肽的有效载体。这表明Pfs25缀合物(如Pfs25-AH-Pfs25)是更有效的CSP肽的载体。

表1.以Pfs-25/NANP缀合物注射的小鼠中抗Pfs25的抗体和抗CSP IgG的水平

抗Pfs25的抗体水平表示为mg/ml；抗CSP的抗体水平表示为EU/ml。NA＝不适用

还对所述缀合物测试了抗CSP的抗体的抗体效价以及抗Pfs25的抗体阻断恶性疟原虫传播的能力。在所述传播阻断测定法中，所有Pfs25-AH-Pfs25/NANP缀合物都产生抗CSP的抗体和抗Pfs25的抗体并且减少了囊合子的百分数(表2)。吸附在alum上的Pfs25-AH-Pfs25/(NANP)₅提供了对CSP和Pfs25的最高免疫应答以及最大的囊合子减少。此外，在将Pfs25-AH-Pfs25/(NANP)₅缀合物和佐剂氢氧化铝注射至小鼠中的第二次注射3个月后，Pfs25和CSP抗体的水平都升高，并且提供了完全的传播阻断活性。与所述Pfs25-AH-Pfs25缀合物相比，该构建体提供了更多的抗Pfs25的抗体和更高的传播阻断活性。

表2.Pfs-25/NANP缀合物的抗体产生和传播阻断活性

实施例3

CSP和NANP缀合物的免疫原性

如实施例1所述，制备了CSP和NANP缀合物。对5-6周龄NIH一般用途小鼠(n＝10)每2周一次皮下注射缀合物形式的2.5μgNANP。在第二或第三次注射7天或3个月后对小鼠抽血，并测量IgG水平。如实施例2所述，通过ELISA测量血清IgG抗体。缀合物包括缀合至CSP自身的CSP、与Pfs25缀合的CSP、与CSP缀合的(NANP)₄，以及以不同末端氨基酸与BSA载体蛋白缀合的NANP重复。

所有CSP缀合物在小鼠中都是免疫原性的(表3)。还将CSP重复结合至不同的载体蛋白，以测试免疫原性(表4)。当(NANP)₅结合至Pfs25缀合物时，抗CSP的抗体水平随着时间升高(测试最长达3个月)。但是，当(NANP)₄与BSA结合时，抗CSP的抗体水平不随时间升高，而当(NANP)₄结合至破伤风类毒素时，抗CSP的抗体水平随时间下降。(NPNA)₅结合至Pfs25缀合物未生成CSP抗体，甚至当吸附至alum上时也未生成CSP抗体。

表3.以CSP缀合物注射的小鼠中CSP IgG水平

制品	剂量/小鼠(μg)	IgG 2^ndinj.	IgG 3^rdinj.
				CSP	5	23	109
CSP在福尔马林中	5		47
				CSP在alum上	5	26	289
CSP在福尔马林+alum中	5	39	137
				CSP-AH-CSP(1步)	2.5		72
CSP-AH-CSP(2步)	2.5		26
				CSP-AH-CSP(2步)在alum上	2.5		27
Pfs25-AH-CSP F1	2.5		39
				Pfs25-AH-CSP F2	2.5		10
(NANP)₄-CSP F1	2.5	30	216
				(NANP)₄-CSP F2	2.5	9	69

抗CSP的抗体表示为EU/ml；NA＝不适用

表4.与不同载体蛋白结合的CSP重复肽的长时程抗体应答。

alum ads.，吸附在alum上

缀合至BSA的NANP重复变体和重复数目影响了免疫应答，(NANP)₅和(NPNA)₅缀合物是最好的免疫原(表5)。此外，末端氨基酸似乎会影响免疫原性，以Asn为末端的缀合物产生了最高水平的抗CSP的抗体。NANP重复变体还结合至Pfs25缀合物并且吸附在alum上。所述末端氨基酸影响了免疫原性，NANP是具有最强免疫原性的CSP重复-Pfs25缀合物(表6)。

表5.以NANP或变体重复缀合物注射的小鼠中的抗CSP IgG水平

^＊构建体中NANP(或其他重复)的近似量(当时得不到实际浓度)

^＊＊NANP(或构建体中其他重复)的量

表6.与Pfs25缀合物结合的CSP重复的末端氨基酸的作用

实施例4

疟疾T细胞表位/NANP重复缀合物的免疫原性

如实施例1所述，将恶性疟原虫CSP通用T细胞表位/NANP4重复与BSA缀合。可与BSA缀合的其他通用T细胞表位/NANP重复或变体序列在表7中示出。用具有序列(DPNANPNV)₂(SEQ ID NO：13)的CSP T细胞表位制备了类似的缀合物。

表7.与BSA缀合的T细胞表位/NANP重复或变体肽

T细胞表位/NANP重复肽序列
	(NANP)₄-EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQ ID NO：25)
(NANP)₅-EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQ ID NO：26)
	(ANPN)₄-EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQ ID NO：27)
(ANPN)₅-EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQ ID NO：28)
	(NPNA)₄-EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQ ID NO：29)
(NPNA)₅-EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQ ID NO：30)
	(PNAN)₄-EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQ ID NO：31)
(PNAN)₅-EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQ ID NO：32)

将与BSA缀合的CSP通用T细胞表位/NANP₄重复每两周一次皮下注射至5-6周龄NIH一般用途小鼠。在第二或第三次注射7天或3个月后对小鼠抽血，并且如实施例2所述通过ELISA测量IgG水平。

(NANP)₄-BSA缀合物中包括T细胞表位的作用在表8中显示。3次注射后，由包含所述T细胞表位的缀合物诱导的GM IgG抗CSP水平比无T细胞表位时低(71对152)，并且该抗体水平比无T细胞表位时降低更快(12对109，3个月后)。

表8.小鼠中T细胞表位对长期免疫应答的作用

实施例5

候选疫苗在人受试者中的安全性和有效性

候选疟疾疫苗的安全性和有效性可通过本领域已知方法在人志愿者中证明。一般而言，人自愿者选自处于感染疟疾风险之中的人，如其中疟疾是地方病的地区的居民或在所述地区旅行的旅行者。对所有志愿者进行筛查以确保他们健康情况良好。在进行疫苗免疫前得到每位志愿者的知情同意。

在该实施例中，以合适的剂量对人志愿者皮下或肌内注射候选疫苗。合适的剂量可从在人免疫接种试验之前进行的合适动物研究确定。其他的给药途径也是可以的，包括肌内和静脉内。可将所述疫苗以单一剂量给药，或以多剂量(如2、3或4个剂量)给药。当以多剂量给药时，加强剂量可以以多种时间间隔给予，如数月至数年。可得到血清样本以确定抗体效价并且鉴定对所述疫苗应答者和不应答者。

鼓励免疫接种后的志愿者返回并报告局部或全身反应。通过对接种位点和/或腋窝淋巴结处的疼痛和压痛分级以及测量所述位点处的红斑和硬结来评估局部反应。全身反应参数包括发热、寒战、头痛、不适、肌痛、关节痛、喉咙痛、胃部不适、头晕、畏光和皮疹。可获得其他实验室样本用于检测寄生物，包括全血细胞计数、化学谱、尿分析和血液样本。

作为有效候选疫苗的免疫原性组合物将导致产生针对包含在所述组合物中的蛋白(如疟原虫有性阶段蛋白、CSP或其免疫原性部分)的抗体，并且与模拟接种的对照相比，还能减少或防止寄生物出现于经免疫接种的志愿者中。

考虑到本发明的原理可适用的很多可能的实施方案，应理解所举例说明的实施方案仅是示例性，而不应认为是限制本发明的范围。相反，本发明的范围应由以下的权利要求限定。因此，本发明人要求落在这些权利要求的范围和精神之内的所有发明。

Claims

1.一种免疫原性缀合物，包含与至少一种疟原虫(Plasmodium)环子孢子蛋白或环子孢子蛋白的免疫原性部分共价连接的至少一种疟原虫有性阶段表面蛋白，其中所述缀合物可在受试者中激发针对所述有性阶段表面蛋白和所述环子孢子蛋白的免疫应答，优选地其中所述免疫原性缀合物包含与所述环子孢子蛋白的免疫原性部分共价连接的至少一种疟原虫有性阶段表面蛋白Pfs25，其中所述免疫原性部分选自(NANP)_x、(NPNA)_x、(PNAN)_x和(ANPN)_x，其中x是3至6。

2.权利要求1的免疫原性缀合物，其中所述有性阶段表面蛋白包括P25、P28、P48/45或P230蛋白。

3.权利要求2的免疫原性缀合物，其中所述P25蛋白包括Pfs25或Pvs25。

4.权利要求1至3中任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合物包含比例高于1.0∶1.0的所述有性阶段表面蛋白与所述环子孢子蛋白或其免疫原性部分。

5.权利要求1至4中任一项的免疫原性缀合物，其中所述共价键包括非肽键。

6.权利要求5的免疫原性缀合物，其中所述非肽键包含至少一种选自如下的键：酰胺键、腙键、硫醚键或它们的两种或多种的结合。

7.权利要求1至6中任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合物包含与所述环子孢子蛋白或其免疫原性部分共价连接的2个有性阶段表面蛋白。

8.权利要求7的免疫原性缀合物，其中所述缀合物包含2个P25蛋白。

9.权利要求8的免疫原性缀合物，其中所述2个P25蛋白都是Pfs25。

10.权利要求1的免疫原性缀合物，其中所述环子孢子蛋白的免疫原性部分包含至少1个Asn-Ala-Asn-Pro(NANP)重复。

11.权利要求10的免疫原性缀合物，其中所述NANP重复包括(NANP)₄或(NANP)₅。

12.权利要求1的免疫原性缀合物，其中所述环子孢子蛋白的免疫原性部分包含至少1个Asn-Pro-Asn-Ala(NPNA)重复。

13.权利要求12的免疫原性缀合物，其中所述NPNA重复包括(NPNA)₄或(NPNA)₅。

14.一种在宿主中激发针对疟原虫有性阶段和无性阶段的免疫应答的方法，包括向所述宿主给予权利要求1至13中任一项的免疫原性缀合物。

15.权利要求14的方法，其中所述疟原虫包括恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)、三日疟原虫(P.malariae)和诺氏疟原虫(P.knowlesi)中的一种或多种。

16.权利要求14或15的方法，其中所述宿主是人。

17.权利要求14至16中任一项的方法，还包括选择需要增强针对疟原虫的免疫性的宿主。

18.一种用于在宿主中激发针对疟原虫的有性阶段和无性阶段的免疫应答的药用组合物，所述组合物包含权利要求1至13中任一项的免疫原性缀合物和可药用载体。

19.权利要求18的药物组合物，还包含佐剂。

20.权利要求18的药物组合物，其中所述佐剂是氢氧化铝。

21.一种免疫原性缀合物，包含：

一种肽，包含来自疟原虫环子孢子蛋白的至少一个重复，其中所述重复选自：(NPNA)_x、(PNAN)_x和(ANPN)_x，其中x是1至6；

共价连接至至少一种其他免疫原性蛋白，其中所述缀合物在受试者中激发针对所述环子孢子蛋白的免疫应答。

22.权利要求21的免疫原性缀合物，其中所述疟原虫环子孢子蛋白包括来自恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫或诺氏疟原虫的环子孢子蛋白。

23.权利要求21或22的免疫原性缀合物，其中所述共价键包括非肽键。

24.权利要求23的免疫原性缀合物，其中所述非肽键包括至少一种选自如下的键：酰胺键、腙键、硫醚键或它们的两种或多种的结合。

25.权利要求21至24中任一项的免疫原性缀合物，其中所述至少一个重复包括(NPNA)₄或(NPNA)₅。

26.权利要求21至24中任一项的免疫原性缀合物，其中所述至少一个重复包括(PNAN)₄或(PNAN)₅。

27.权利要求21至24中任一项的免疫原性缀合物，其中所述至少一个重复包括(ANPN)₄或(ANPN)₅。

28.权利要求21至27中任一项的免疫原性缀合物，其中所述至少一种其他免疫原性蛋白包括非疟原虫蛋白的免疫原性蛋白。

29.权利要求28的免疫原性缀合物，其中所述至少一种其他免疫原性蛋白包括激发免疫应答的人病原体蛋白。

30.权利要求28的免疫原性缀合物，其中所述至少一种其他免疫原性蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱毒素、艰难梭菌(Clostridium difficile)毒素A、艰难梭菌毒素B和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)重组体胞外蛋白A。

31.权利要求21至27中任一项的免疫原性缀合物，其中所述至少一种其他免疫原性蛋白包括疟原虫环子孢子蛋白。

32.一种在宿主中激发针对疟原虫环子孢子蛋白的免疫应答的方法，包括向所述宿主给予权利要求21至31中任一项的免疫原性缀合物。

33.权利要求32的方法，其中所述疟原虫包括恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和诺氏疟原虫中的一种或多种。

34.权利要求32或33的方法，其中所述宿主是人。

35.权利要求32至34中任一项的方法，还包括选择需要增强针对疟原虫的免疫性的宿主。

36.一种用于在宿主中激发针对疟原虫环子孢子蛋白的免疫应答的药物组合物，所述组合物包含权利要求21至31中任一项的免疫原性缀合物和可药用载体。

37.权利要求36的药物组合物，还包含佐剂。

38.权利要求37的药物组合物，其中所述佐剂是氢氧化铝。