CN103497255B - 作为疟疾疫苗的恶性疟原虫表面蛋白的偶联物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了作为疟疾疫苗的恶性疟原虫表面蛋白的偶联物。本发明提供了动合子表面蛋白Pfs25的偶联物，该动合子表面蛋白Pfs25的偶联物作为抵抗最严重形式的疟疾——恶性疟原虫的疫苗是有效的。本发明还提供了用作抵抗间日疟原虫的疫苗的动合子表面蛋白Pvs25的偶联物。并提供了制备所述偶联物的方法，该偶联物含有通过连接基团结合到自身或者结合到其它蛋白质上的动合子表面蛋白。

Description

作为疟疾疫苗的恶性疟原虫表面蛋白的偶联物
本申请是原申请的申请日为2007年10月15日，申请号为200780042474.0，发明名称为《作为疟疾疫苗的恶性疟原虫表面蛋白的偶联物》的中国专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2006年10月16日递交的美国临时申请No.60/851,961的利益，该申请以其整体而将其公开的内容明确地结合于此。
技术领域
本发明提供了动合子表面蛋白Pfs25的偶联物，该动合子表面蛋白Pfs25的偶联物作为抵抗引发最严重形式的疟疾的恶性疟原虫（Plasmodiumfalciparum）的疫苗是有效的。本发明还提供了用作抵抗间日疟原虫（Plasmodiumvivax）的疫苗的动合子表面蛋白Pvs25的偶联物。并提供了制备偶联物的方法，该偶联物含有通过连接基团（linkinggroup）结合到自身或者结合到其它蛋白质上的动合子表面蛋白。
背景技术
疫苗抵抗疟疾的一种途径就是阻断寄生虫从蚊向人类的传播。当抵抗有性的蚊阶段特异性的表面抗原的抗体被蚊从血餐（bloodmeal）中摄入时，所述抗体能阻断寄生虫在该媒介中的发育（卡特,R.等人2000自然医学6:241-244（Carter,R.etal.2000NatMed6:241-244））。已经确定了四种蛋白质作为传播阻断抗体（transmission-blockingantibodies）的潜在诱导物（威廉姆森,KC.等人1993生虫学杂志58:355-358（Williamson,KC.etal.1993MolBiochemParasitol58:355-358）；卡特,R.等人1990寄生虫免疫学12:587-603（Carter,R.etal.1990ParasiteImmmunol12:587-603）；卡斯罗,DC.等人1998自然333:74-76（Kaslow,DC.etal.1998Nature333:74-76）；达菲,PE.等人1993实验医学177:505-510（Duffy,PE.etal.1993JExpMed177:505-510））。上述中的两种在配子表面上和胞内配子母细胞内表达。另外两种是在蚊阶段的感染过程中专有地表达于接合子和动合子表面的表观分子量为25kDa的恶性疟原虫表面蛋白（Pfs25）和表观分子量为28kDa的恶性疟原虫表面蛋白（Pfs28）。感染了疟疾并生活在地方性疾病国家（endemiccountries）的人中没有显示出对这两种蛋白质的进行应答的抗体（卡特,R.等人1989实验医学169:135-147（Carter,R.etal.1989JExpMed169:135-147））。世界各地的Pfs25的氨基酸序列中表现出极小的变化（卡斯罗,DC.等人1989生虫学杂志32:101-104（Kaslow,DC.etal.1989MoIBiochemParasitol32:101-104））。这种很可能是由于在人宿主中内没有遭受免疫压力（immunepressure）而导致的相对的同次性（homogeneity），使得Pfs25成为用于疟疾传播阻断疫苗的具有吸引力的候选（巴尔,PJ.等人1991实验医学174:1203-1208（Barr,PJ.etal.1991JExpMed174:1203-1208））。然而，即使施用了佐剂，Pfs25在小鼠和人内的免疫原性也很差（科万,C.等人2004感染与免疫72:584-588（Coban,C.etal.2004InfectImmum72:584-588）；卡斯罗,DC.等人2002化学免疫学80:287-307（Kaslow,DC.2002ChemImmunol80:287-307））。通过其它蛋白获得了蛋白质-蛋白质偶联物的免疫原性的增加。细胞色素c的聚合物制剂在动物中的免疫原性比在相应的单体蛋白质中更高（赖希林,M.等人1970生物化学杂志245:947-954（Reichlin,M.etal.1970JBiolChem245:947-954）），并且流感病毒血凝素-白喉类毒素（influenzahemagglutinin-diphtheriatoxoid）偶联物疫苗比单独的血凝素对流感病毒感染更具有抵抗性（格拉文施泰因,S.等人1994美国老年医学杂志42:245-251（Gravenstein,S.etal.1994JAmGeriatSoc42:245-251））。也已经对含有金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）型的偶联物（5个和8个荚膜多糖通过己二酸二酰肼（adipicaciddihydrazide）或N-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫代基)丙酸酯（N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate）和其它的连接基团而结合到载体蛋白上）进行了研究（法桐,A.等人1992感染与免疫60:584-589（Fattom,A.etal.1992InfectImmun60:584-589）；科萨克兹卡,Z.等人1999感染与免疫67:5806-5810（Kossaczka,Z.etal.1999InfectImmun67:5806-5810）；斯奇尔松等人实验医学1980152:361-76（SchneersonetalJExpMed1980,152:361-76））。已经用昆虫媒介（insectvector）证实了对人病原体的抗体介导的转播阻断。由螺旋体外膜蛋白A（OspA）疫苗诱导的对包柔式伯氏疏螺旋体（Borreliaburgdorferi）的抗体在硬蜱属蜱（Ixodesticks）的肠内被活化（德席尔瓦,AM.等人1997感染与免疫65:3146-3150（DeSilva,AM.etal.1997InfectImmun65:3146-3150））。显示所述OspA蛋白在寄生虫的载体阶段得到最大的表达，这意味着该疫苗诱导了传播阻断活性。
发明内容
特别需要一种抵抗疟疾的有效疫苗。结合到自身上的或结合到其它蛋白质上的Pfs25诱导了高水平的传播阻断抗体，表现出其作为抵抗恶性疟原虫（最严重的疾病形式）的疫苗的功效。还提供了抵抗间日疟原虫的疫苗包括结合到自身上的或结合到其它蛋白质上的Pvs25。
因此，第一个方面，提供了含有恶性疟原虫表面蛋白Pfs25的结合物，所述Pfs25通过选自由酰胺键、腙键和硫醚键所组成的组中的至少一种键而结合到其它蛋白质上，其中，所述结合物适合用作疟疾疫苗。
在第一个方面的一种实施方式中，所述其它蛋白质为恶性疟原虫（Plasmodiumfalciparum）表面蛋白Pfs25。
在第一个方面的一种实施方式中，所述其它蛋白质为绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa）重组外蛋白A（recombinantexoproteinA）。
在第一个方面的一种实施方式中，所述键为酰胺键。
在第一个方面的一种实施方式中，所述结合物为下式：
其中，n为3-5的整数，X1为恶性疟原虫表面蛋白Pfs25，且X2选自由绿脓杆菌重组外蛋白A、卵白蛋白、恶性疟原虫表面蛋白Pfs25、破伤风类毒素（tetanustoxoid）、白喉类毒素、霍乱毒素、难辨梭状芽孢杆菌毒素A（ClostridiumdifficiletoxinA）和难辨梭状芽孢杆菌毒素B所组成的组中。在另一种实施方式中，n为4且X2为绿脓杆菌重组外蛋白A。在另一种实施方式中，n为4且X2为恶性疟原虫表面蛋白Pfs25。
在第一个方面的一种实施方式中，所述键为腙键。
在第一个方面的一种实施方式中，所述偶联物为下式：
或
其中，n为3-5的整数，X1为恶性疟原虫表面蛋白Pfs25，X2选自由绿脓杆菌重组外蛋白A、卵白蛋白、恶性疟原虫表面蛋白Pfs25、破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱毒素、难辨梭状芽孢杆菌毒素A和难辨梭状芽孢杆菌毒素B所组成的组中，并且其中Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7和Z8中的每一个独立地选自由氢、卤素和C1-6的烷基所组成的组中。在另一种实施方式中，n为4，X2为绿脓杆菌重组外蛋白A，并且其中Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7和Z8中的每一个为氢。在另一种实施方式中，n为4且X2为恶性疟原虫表面蛋白Pfs25。
在第一个方面的一种实施方式中，所述键为硫醚键。
在第一个方面的一种实施方式中，所述偶联物为下式：
或
其中，p为1-3的整数，q为1-3的整数，r为1-2，X1为恶性疟原虫表面蛋白Pfs25，并且X2选自由绿脓杆菌重组外蛋白A、卵白蛋白、恶性疟原虫表面蛋白Pfs25、破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱毒素、难辨梭状芽孢杆菌毒素A和难辨梭状芽孢杆菌毒素B所组成的组中。在另一种实施方式中，p为2，q为2，r为1，且X2为绿脓杆菌重组外蛋白A。在另一种实施方式中，p为2，q为2，r为1，且X2为恶性疟原虫表面蛋白Pfs25。
在第二个方面中，提供了一种用于诱发针对宿主内恶性疟原虫的抗体的传播阻断活性的方法，该方法包括给宿主给药第一方面的偶联物。
在第二个方面的一种实施方式中，所述宿主为人。
在第三方面中，提供了一种用于诱发针对宿主内恶性疟原虫的抗体的传播阻断活性的药用组合物，该组合物含有偶联物和药学上可接受的赋形剂，所述偶联物含有通过选自由酰胺键、腙键和硫醚键所组成的组中的至少一种键而结合到其它蛋白质上的恶性疟原虫表面蛋白Pfs25。
在第三个方面的一种实施方式中，所述组合物还含有佐剂，例如氢氧化铝。
在第四方面中，提供了含有间日疟原虫表面蛋白Pvs25的偶联物，所述Pvs25通过选自由酰胺键、腙键和硫醚键所组成的组中的至少一种键而结合到其它蛋白质上，其中，所述偶联物适合用作疟疾疫苗。
在第四个方面的一种实施方式中，所述其它蛋白质为间日疟原虫表面蛋白Pvs25。
在第四个方面的一种实施方式中，所述其它蛋白质为绿脓杆菌重组外蛋白A。
在第四个方面的一种实施方式中，所述键为酰胺键。
在第四个方面的一种实施方式中，所述偶联物为下式：
其中，n为3-5的整数，X1为间日疟原虫表面蛋白Pvs25，且X2选自由绿脓杆菌重组外蛋白A、卵白蛋白、间日疟原虫表面蛋白Pvs25、恶性疟原虫表面蛋白Pfs25、破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱毒素、难辨梭状芽孢杆菌毒素A和难辨梭状芽孢杆菌毒素B所组成的组中。在另一种实施方式中，n为24且X2为绿脓杆菌重组外蛋白A。在另一种实施方式中，n为24且X2为间日疟原虫表面蛋白Pvs25。
在第四个方面的一种实施方式中，所述键为腙键。
在第四个方面的一种实施方式中，所述偶联物为下式：
或
其中，n为3-5的整数，X1为间日疟原虫表面蛋白Pvs25，且X2选自由绿脓杆菌重组外蛋白A、卵白蛋白、间日疟原虫表面蛋白Pvs25、恶性疟原虫表面蛋白Pfs25、破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱毒素、难辨梭状芽孢杆菌毒素A和难辨梭状芽孢杆菌毒素B所组成的组中，并且其中Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7和Z8中的每一个独立地为选自由氢、卤素和C1-6的烷基所组成的组中。在另一种实施方式中，n为4，X2为绿脓杆菌重组外蛋白A，并且其中Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7和Z8中的每一个为氢。在另一种实施方式中，n为4且X2为间日疟原虫表面蛋白Pvs25。
在第四个方面的一种实施方式中，所述键为硫醚键。
在第四个方面的一种实施方式中，所述偶联物为下式：
或
其中，p为1-3的整数，q为1-3的整数，r为1-2，X1为恶性疟原虫表面蛋白Pfs25，并且X2选自由绿脓杆菌重组外蛋白A、卵白蛋白、间日疟原虫表面蛋白Pvs25、恶性疟原虫表面蛋白Pfs25、破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱毒素、难辨梭状芽孢杆菌毒素A和难辨梭状芽孢杆菌毒素B所组成的组中。在另一种实施方式中，p为2，q为2，r为1，且X2为绿脓杆菌重组外蛋白A。在另一种实施方式中，p为2，q为2，r为1，且X2为间日疟原虫表面蛋白Pvs25。
在第五方面中，提供了一种用于诱发针对宿主内间日疟原虫的抗体的传播阻断活性的方法，该方法包括给宿主给药第四方面的偶联物。
在第五个方面的一种实施方式中，所述宿主为人。
在第五个方面的一种实施方式中，组合物还含有佐剂，例如氢氧化铝。
在第六个方面中，提供了一种用于诱发针对宿主内间日疟原虫的抗体的传播阻断活性的药用组合物，该组合物含有偶联物和药学上可接受的赋形剂，所述偶联物含有通过选自由酰胺键、腙键和硫醚键所组成的组中的至少一种键而结合到其它蛋白质上的间日疟原虫表面蛋白Pvs25。
在第七个方面中，提供了第一个方面或第四个方面的偶联物在产生作为试剂或用于被动免疫的血清中的应用。
附图说明
图1为Pfs25通过酰胺键（A）、腙键（B）或硫醚键（C）到蛋白质的结合。
图2为作为IgG抗Pfs25浓度（μg/mL）的函数的合子囊的数目的抑制百分率，反映了以分析中特定的IgG浓度进行校准的偶联物诱导的传播阻断活性。将两组小鼠用铝胶（Alhydrogel）（实心圆）上的Pfs25-AH/Pfs25F1或铝胶（空心圆）上的rEPA/AH-Pfs25HF1在第0天和第28天进行免疫。在第二次免疫后2周获得抗血清，并用初始人血清库（naivehumanserumpool）稀释达到需要的抗体浓度。用稀释的抗血清和寄生虫饲喂蚊，并计数蚊的中肠内的合子囊的数目作为感染性的表征。
具体实施方式
疟疾是发病和死亡的重要原因，据估计每年导致>1000000的儿童死亡。恶性疟原虫导致了这种疾病的最严重的形式。虽然已经进行了超过半个世纪的研究，现在仍没有针对这种疾病的获得许可的疫苗。
本发明提供了有效地作为疟疾传播阻断疫苗的动合子表面蛋白Pfs25的偶联物。在叮咬中摄入的对Pfs25的抗体能阻断寄生虫在蚊的中肠内的发育、防止寄生虫向其它个体传播。Pfs25是低分子量蛋白，其自身是非免疫原性的。为了增加其免疫原性，可以将Pfs25与其自身或与其它蛋白质（例如，重组绿脓杆菌外蛋白A和卵白蛋白）通过酰胺键、腙键或硫醚键进行偶联。所有这些偶联物都具免疫原性，并且诱导了小鼠体内更快速的应答。虽然其它的偶联物也是有效的免疫原性的试剂，但是这种通过利用己二酸二酰肼（adipicaciddihydrazide）作为连接子来形成酰胺键的方法产生了最具有免疫原性的偶联物。偶联物在氢氧化铝上的吸附进一步地增加了抗体水平。令人惊讶地，最后一次注射后3个月或7个月的抗体水平显著地高于该注射后一周的抗体水平。所观察到的免疫血清的传播阻断活性与通过酶联免疫吸附测定（ELISA）来测量的抗体水平相关。
除非另有规定，本文中所使用的技术术语和科技术语具有本发明所属领域技术人员所知晓的普通含义。例如说，参见辛格统P和塞恩斯伯里D，微生 物和分子生物学第三版，约翰威利出版社，奇切斯特，纽约，2001（SingletonPandSainsburyD.,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology3rded.,J.Wiley&Sons,Chichester,NewYork,2001）。另外，除非本文另有要求，单数形式的术语应当包括多个并且复数形式的术语应当包括单个。
过渡是术语“包括（comprising）”与“包含（including）”、“含有（containing）”类似或“其特征在于（characterizedby）”，是包含性或开放式的，并不排除另外的、未被列举的要素或方法步骤。
过渡表述“由……组成（consistingof）”排除了任何权利要求中没有限定的要素、步骤或成分，但是并不排除其它的与本发明无关的组成或步骤，例如通常与此相关的杂质。
过渡表述“基本上含有（consistingessentiallyof）”将权利要求的范围限定在特定的物质或步骤上，并且这些特定的物质和步骤不会显著地影响所要求的本发明的基础和新颖性特点。
Pfs25和Pvs25抗原
恶性疟原虫蚊阶段抗原Pfs25及其在间日疟原虫中的同系物Pvs25是富含半胱氨酸的25kDa的抗原的P25族（family）的成员（参见卡斯罗等人，用于含有表皮生长因子样结构域（EGF-likeDomains）的人疟疾的有性阶段的候选疫苗，（1998）自然333：74-76（Kaslowetal,AvaccineCandidatefromtheSexualStageofHumanMalariathatContainsEGF-likeDomains,(1988)Nature333:74-76）；玛尔金等人，Pvs25H的I相疫苗试验：用于间日疟原虫疟疾的转播阻断疫苗，（2005）疫苗23:3131-3138（Phase1vaccinetrialofPvs25H:atransmissionblockingvaccineforPlasmodiumvivaxmalaria,(2005)Vaccine23:3131-3138））。它们含有四个串联的表皮生长因子样结构域并在蚊内的寄生虫的受精卵和成熟的动合子阶段进行表达。由于P25仅在蚊的中肠内进行表达，并不在脊椎动物宿主中表达，这些蛋白质不受到宿主免疫系统的选择压力（selectionpressure），并且P25的抗原性变异（antigenicvariation）比大多数存在于红细胞前期（pre-erythrocyticstage）和无性血阶段（asexualbloodstage）的候选疫苗表现出受到更大的限制。
连接基团
Pfs25抗原或Pvs25抗原能通过合适的连接基团与自身结合或结合到其它的蛋白质上。特别优选的连接基团包括己二酸二酰肼（ADH）、N-琥珀酰亚胺-4-甲酰苯甲酸酯（N-succinimidyl-4-formylbenzoate，SFB）、N-琥珀酰亚胺-3-溴代乙酸胺丙酸酯（N-succinimidyl-3-bromoacetamidopropionate，SBAP）、和N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯（N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionate，SPDP）：
己二酸二酰肼
N-琥珀酰亚胺-4-甲酰苯甲酸酯
N-琥珀酰亚胺-3-溴代乙酸胺丙酸酯
N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯
酰胺连接的偶联物
能使用己二酸二酰肼或合适的类似物作为产生Pfs25（或Pvs25）的连接剂（linkingagent），所述Pfs25（或Pvs25）与到自身连接或连接到其它蛋白质上，例如说，所述己二酸二酰肼或合适的类似物为具有下式的化合物组中的成员：
其中，n为3-5，最优选为4。Pfs25（或Pvs25）的羧酸部分与连接剂的酰肼基反应以产生酰胺键。图1A提供的示意图描述了己二酸二酰肼与Pfs25的反应以产生含有多个共价连接在一起的Pfs25部分的偶联物。如图1所详细描述地，该反应能有利地通过两步进行，第一步涉及用二酰肼对Pfs25进行的衍生作用，接下来的第二步涉及用另外的未反应的Pfs25或者其它的蛋白质（例如，绿脓杆菌重组外蛋白A（rEPA）、卵白蛋白、Pvs25、破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱毒素、难辨梭状芽孢杆菌毒素A或难辨梭状芽孢杆菌毒素B，或其它本领域公知的蛋白质载体）与衍生的Pfs25进一步进行反应。可替换地，所述第一步可以包括对其它的蛋白质进行衍生作用，接着将所衍生的蛋白质与未反应的Pfs25进一步反应。可以根据斯奇尔松等人（1980）实验医学152:361-376（Schneersonetal.(1980)JExpMed152:361-376）中描述的方法有利地进行与Pfs25（或Pvs25）的偶联反应，下述实施例的方法或其它适当的方法将被本领域技术人员所理解。所得到的偶联物具有下式：
其中，n为以上所定义的，其中X1为Pfs25或Pvs25，并且其中X2为例如Pfs25、Pvs25、rEPA、卵白蛋白等的蛋白质。特别优选的组合物中n为4，并且其中X1和X2均为Pfs25，或其中X1和X2均为Pvs25，或其中X1为Pfs25且X2为Pvs25。
腙连接的偶联物
能使用己二酸二酰肼或在前述部分中描述的合适的类似物，以及N-琥珀酰亚胺-4-甲酰苯甲酸酯或合适的类似物：
作为产生Pfs25（或Pvs25）的连结剂，所述Pfs25（或Pvs25）通过腙键与自身连接或连接到其它的蛋白质上，其中每一个Z独立地为氢、卤素（例如，F、Cl、Br、I），或低碳烷基（loweralkyl）（例如，诸如甲基、乙基等的C1-6烷基），优选每一个Z为氢。优选以两步进行反应，如图1B中所阐述地，第一步涉及两个部分。在所述第一步的第一个部分中，Pfs25（或Pvs25）的氨基部分与N-琥珀酰亚胺-4-甲酰苯甲酸酯或它的类似物反应以产生衍生的Pfs25（或Pvs25）。在所述第一步的第二部分中，Pfs25（或Pvs25或其它的蛋白质）的羧酸部分与己二酸二酰肼或它的类似物反应以产生衍生的Pfs25（或Pvs25或其它的蛋白质）。可替换地，Pfs25（或Pvs25）能与己二酸二酰肼（或类似物）反应，并且其它的蛋白质（或分别为另外的Pfs25或Pvs25）能与N-琥珀酰亚胺-4-甲酰苯甲酸酯（或类似物）反应。能根据下述实施例的方法，或者其它适当的方法有利地进行Pfs25（或Pvs25）与N-琥珀酰亚胺-4-甲酰苯甲酸酯的反应，这将是本领域技术人员所能理解的。在第二步中，使所述两种衍生物反应以产生含有腙连接基团的偶联物。该偶联物可以具有下式：
或具有下式：
其中，根据哪种蛋白质与N-琥珀酰亚胺-4-甲酰苯甲酸酯（或类似物）反应和根据哪种蛋白质与己二酸二酰肼（或类似物）反应的情况，n、Z1、Z2、Z3、Z4、X1和X2为以上所定义。特别优选的组合物为，其中Z1、Z2、Z3、Z4中的每一个为氢，其中n为4并且其中X1和X2均为Pfs25，或其中X1和X2均为Pvs25，或其中X1为Pfs25且X2为Pvs25，或者其中X1为Pvs25且X2为Pfs25。
可替换地，Pfs25（或Pvs25）的N-琥珀酰亚胺-4-甲酰苯甲酸酯（或类似物）衍生物中的一种能与己二酸二酰肼（或类似物）反应，并且随后能将得到的衍生物与其它的蛋白质的N-琥珀酰亚胺-4-甲酰苯甲酸酯（或类似物）衍生物，或者多个Pfs25（或Pvs25）的N-琥珀酰亚胺-4-甲酰苯甲酸酯（或类似物）衍生物进行反应。所得到的偶联物具有下式：
其中，Z5、Z6、Z7和Z8中的每一个为独立的氢、卤素（例如，F、Cl、Br、I），或低碳烷基（例如，诸如甲基、乙基等的C1-6烷基），优选为氢，并且其中其余的可变物（variables）如以上所定义的。特别优选的偶联物为，其中Z为氢，其中n并且其中X1和X2均为Pfs25，或其中X1和X2均为Pvs25，或其中X1为Pfs25且X2为Pvs25。
硫醚连接的偶联物
能使用N-琥珀酰亚胺-3-溴代乙酸胺丙酸酯或合适的类似物：
其中，p为1-3，最优选为2，其中r为1-3，最优选为1，以及N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯或合适的类似物：
其中，q为1-3，最优选为2，作为产生Pfs25（或Pvs25）的连结剂，所述Pfs25（或Pvs25）通过硫醚键与自身连接或连接到其它的蛋白质上。优选以两步进行反应，如图1C中所阐述地，第一步涉及两个部分。在所述第一步的第一个部分中，Pfs25（或Pvs25）的氨基部分与N-琥珀酰亚胺-3-溴代乙酸胺丙酸酯或它的类似物反应以产生衍生的Pfs25（或Pvs25）。在所述第一步的第二部分中，Pfs25（或Pvs25或其它的蛋白质）的氨基部分与N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯或它的类似物反应以产生衍生的Pfs25（或Pvs25或其它的蛋白质）。可替换地，Pfs25（或Pvs25）能与N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯（或类似物）反应，并且其它的蛋白质（或分别为另外的Pfs25或Pvs25）能与N-琥珀酰亚胺-3-溴代乙酸胺丙酸酯（或类似物）反应。
能根据下述实施例的方法，或者其它适当的方法有利地进行Pfs25（或Pvs25）与N-琥珀酰亚胺-3-溴代乙酸胺丙酸酯和N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯的反应，这将是本领域技术人员所能理解的。在第二步中，将两种衍生物反应以产生含有硫醚连接基团的偶联物。得到的偶联物具有下式：
或具有下式：
其中，根据蛋白质与N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯（或它的衍生物）和根据蛋白质与N-琥珀酰亚胺-3-溴代乙酸胺丙酸酯（或它的衍生物）反应的情况，p、q、r、X1和X2为以上所定义的。特别优选的组合物为，其中，p和q各个为2，其中r为1并且其中X1和X2均为Pfs25，或其中X1和X2均为Pvs25，或其中X1为Pfs25且X2为Pvs25，或其中X1Pvs25为且X2为Pfs25。
特定的结合剂
可以使用能结合到Pfs25或Pvs25上的特定的结合剂（bindingagent）来形成在此所公开的偶联物。能使用所述结合剂来对Pfs25或Pvs25进行提纯和检测。结合剂的例子为多克隆抗体或单克隆抗体（包括人化单克隆抗体（humanizedmonoclonalantibody））及其片段，该片段能与Pfs25或Pvs25结合。
能培养单克隆抗体或多克隆抗体以识别Pfs25或Pvs25偶联物或它们的类似物或衍生物。能按以上所描述的制备合适用作免疫原的基本上纯净的偶联物。然后能制备连接到所述偶联物上的单克隆抗体和多克隆抗体。
根据科勒和米尔斯坦的经典方法（自然1975256:495-97（classicmethodofKohler&Milstein（Nature1975256:495-97））或其衍生方法，能从鼠杂交瘤制备连接到多肽上的单克隆抗体。简短地说，在数周的期间内用数微克的所筛选的免疫原（例如，Pfs25或Pvs25偶联物）对小鼠进行重复接种。然后处死小鼠，并将产生抗体的脾细胞分离出来。通过聚乙二醇将脾细胞与小鼠的骨髓瘤细胞融合，并通过在含有氨基嘌呤的选择性培养基（HAT培养基）上的体系的生长来破坏过量的未融合的细胞。将成功融合的细胞进行稀释，并将等分的稀释液置于微量滴定板的孔内，培养物在其中继续生长。如最初由恩格瓦尔（酶学方法1980,70:419-39）（Engvall（Meth.Enzymol.1980,70:419-39））中所描述的，通过免疫测定步骤，例如酶联免疫吸附测定（ELISA），或其衍生的方法检测孔内上清液中的抗体来对产生抗体的克隆进行确认。能对筛选的阳性克隆进行扩增并收集它们的单克隆抗体产品待用。用于生产单克隆抗体的详细的过程已经在哈洛和莱恩，抗体的使用：实验手册，美国冷泉港实验室，纽约，1999（HarlowandLane,UsingAntibodies:ALaboratoryManual,CSHL,NewYork,1999）中进行了描述。能够通过对合适的动物用含有Pfs25或Pvs25偶联物的免疫原进行免疫接种而制备含有抗体的多克隆抗病血清。
有效的抗体产生（不管是单克隆或多克隆）受到许多因素的影响，这些因素与抗原和寄主的种（hostspecies）二者相关。例如说，小分子量比其它倾向于具有较低的免疫原性，并可能需要利用载体和佐剂。而且，具有导致低滴定量抗血清的不足剂量的抗体或者过量抗体的宿主动物对接种位点和剂量的应答不同。皮内位点多次给药小剂量（ng水平）的抗原表现出最为可靠。在瓦图凯蒂思等人（临床内分泌与代谢杂志。1971，33:988-91（J.Clin.Endocrinol.Metab.,1971,33:988-91））中记载了对兔子有效的免疫接种方案。
以定期的间隔给予加强注射（boosterinjections），并且当根据半定量法检测（例如，通过在琼脂内对已知抗原浓度的免疫扩散加倍）的滴定量开始降低时，开始收集抗病血清。例如说，参见奥克特洛尼等人，试验免疫学手册，威尔，D.（编辑），第19章，布伦克威尔，1973（Ouchterlonyetal.,HandbookofExperimentalImmunology,Wier,D.(ed.),Chapter19,Blackwell,1973）。抗体的坪浓度（plateauconcentration）通常为0.1-0.2mg/ml范围的血清（约12μM）。抗血清对这些抗原的亲和力通过制备竞争性结合曲线，例如由费希尔（临床免疫学手册，1980，Ch.42）（Fisher（ManualofClinicalImmunology,1980,Ch.42））进行了描述。
适于使用的抗体可以包含在血浆、血清、杂交瘤上清液等中。可替换地，能通过本领域公知技术（例如，离子交换色谱、筛选色谱（sizingchromatography）或亲和色谱）将抗体分离到所期望的程度。可以讲抗体提纯从而获得特定类或亚类的抗体，例如IgM、IgG、IgA、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4等。IgG类的抗体用于进行被动防保护目的（passiveprotection）。
能用抗体片段代替整个抗体来使用，并且可以在原核宿主细胞内稳定表达。制造并使用单克隆抗体的有效的免疫部分（也被称为“抗体片段”）的方法是公知的，并且包括那些在贝特和霍洛维兹，酶学方法1989178:476-96（Better&Horowitz,MethodsEnzymol.1989178:476-96）；格洛克夏伯等人，生物化学1990，29:1362-67（Glockshuberetal,Biochemistry1990,29:1362-67），以及美国专利No.5,648,237、4,946,778和5,455,030中所描述的。凭以能够形成多肽/结合剂复合物的条件以及用来检测多肽/结合剂复合物的形成以及结合剂和多肽的结合的定量的结合亲合力的分析是本领域通用的。这种分析可以包括但不限于，免疫印迹（Westernblotting）、免疫沉淀（immunoprecipitation）、免疫荧光法（immunofluorescence）、免疫细胞化学（immunocytochemistry）、免疫组织化学（immunohistochemistry）、荧光激活细胞分类（fluorescenceactivatedcellsorting）、荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization）、免疫磁珠测定、酶联免疫吸附测定ELISA、酶联免疫斑点测定（ELISPOT）（科里干等人，免疫学试验指南，韦利，纽约，1995（Coliganetal.,CurrentProtocolsinImmunology,Wiley,N.Y.,1995））、凝集法（agglutinationassays）、絮凝法（flocculationassays）和细胞淘选（cellpanning）等，为本领域技术人员所公知。
适于使用的抗体或抗体片段有许多诊断用途和治疗用途。比如说，抗体或抗体片段能用于被动免疫疗法（passiveimmunotherapy），例如通过给受治者给药在治疗上有效量的抗体或抗体片段。在另一种实例中，所述抗体或抗体片段能用作各种免疫测定中的体外诊断剂以测试生物学（例如，临床样本）样本中表达Pfs25或Pvs25多肽的微生物的存在。有用的免疫测定包括但不限于凝集法、放射免疫测定、ELISA、荧光测定、免疫印迹等。举例来说，在一种这样的测定中，生物学样本首先与结合Pfs25或Pvs25多肽的抗体接触，并然后与标记的第二抗体接触以检测其上结合有第一抗体的微生物的存在。比如说，这种测定可以为直接形式（其中标记的第一抗体能与Pfs25或Pvs25多肽反应）、间接形式（其中标记的第二抗体能与第一抗体反应）、竞争形式（例如标记的Pfs25或Pvs25多肽的加入）或夹心形式（sandwichformat）（标记的和未标记的抗体都被使用），以及其它本领域技术人员公知的形式。
本公开的结合剂可以与基底（例如，小珠、管、载玻片、板、硝化纤维片等）结合，或与可检测的部分偶联，或者同时结合和偶联。本公开所指的所述可检测的部分可以包括但不限于免疫荧光部分（例如，荧光素、罗丹明）、放射性部分（例如，P32、I125、S35）、酶部分（例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶）、胶体金部分以及生物素部分。所述偶联技术为本领域所通用的（例如，参见哈洛和莱恩，抗体的使用：实验手册，美国冷泉港实验室，纽约，1999（HarlowandLane,UsingAntibodies:ALaboratoryManual,CSHL,NewYork,1999）；杨等人，自然1996382：319-24（Yangetal,Nature1996382:319-24））。
偶联物产品
特别优选仅包括pfs25抗原的偶联物、仅包括Pvs25抗原的偶联物，或包括pfs25和pvs25抗原的混合物的偶联物。然而，Pfs25或Pvs25与其它的蛋白质的偶联物也能用于疟疾疫苗的制备。合适的蛋白质包括但不限于，如在本文其它处所涉及的绿脓杆菌重组外蛋白A和其它本领域已知的蛋白质。优选Pfs25或Pvs25的偶联物。
通常对具有Pfs25或Pvs25部分与其它蛋白质（也可以分别为Pfs25或Pvs25）的摩尔比大于1的偶联物获得最高抗体水平。制备在此所描述的偶联物的方法产生具有分子量分布的反应产物。得到的反应混合物能被分为（fractionate）为具有不同分子量的部分。通常优选使用由十二烷基硫酸钠——聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测得50-250kDa或更高的分子量的偶联物。
可以使用单一类型的偶联物，或两个或更多偶联物的混合物。
Pfs25（或Pvs25）偶联物能用于产生作为试剂或用于被动免疫或用于其它本领域技术人员已知应用的血清。
药用组合物
在一些实施方式中，优选实施方式的偶联物与药学上可接受载体联合。在此公开的组合物能被非经肠地（parenterally）给药，或通过本领域已知的其它的合适的给药疫苗的方法来给药。当进行全身给药时，这种治疗组合物是无菌的、无致热原（pyrogen-free）的并且在肠胃外可接受溶液中，该肠胃外可接受溶液具有适当考虑的pH、等渗性和稳定性。这些条件是本领域技术人员已知的。具体来说，制备在此进行描述的化合物的制剂成溶液用以保存或通过将具有期望纯度的的化合物与具有生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂混合而进行给药。这些物质所用的剂量和浓度对接受者是无毒的，并包括缓冲液，例如三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（TRISHCl）、磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和其它有机酸盐；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂例如乙二胺四乙酸（EDTA）；糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；例如钠的反荷离子和/或非离子型表面活性剂，例如吐温（TWEEN）、普朗尼克（PLURONICS）或聚乙二醇。
可以根据常规的药理学实践，例如在雷明顿：药剂科学与实践（20版，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司（2003）（Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy（20thed,LippincottWilliams&WilkensPublishers（2003）））中描述的来配制用于注射的无菌组合物。
当通过肠胃外注射或其它的注射给药所述偶联物时，优选偶联物为无致热原、肠胃外可接受的水性溶液形式。可以根据本领域公知的方法，使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配置悬浮液。这种具有合适的pH、等渗性、稳定性等的可接受水性溶液的制备是术语本领域技术。优选的用语注射的药用组合物优选含有等渗赋形剂（isotonicvehicle），例如氯化钠或缓冲氯化钠溶液。所述药用组合物可以还含有稳定剂、防腐剂、缓冲液或其它本领域技术人员已知的添加剂。
所述偶联物可以通过液体或凝胶体或作为装置（例如，经皮贴（transdermalpatch））而进行全身给药或局部给药。
优选实施方式的偶联物可以额外地使用在常规的药用组合物中发现的佐剂，所述佐剂为本领域所知的形式并且为本领域所公知的水平。因此，例如说，所述组合物可以含有在实际配制各种剂量形式的优选实施方式中有用的物质。通常佐剂与疫苗结合以实现提高免疫应答的目的。合适的佐剂包括氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、单磷酸类脂A（monophosphenyllipidA）、胞壁酰二肽（muramyldipeptide）、葡聚糖和QuilA。当使用氢氧化铝（Alum）或磷酸铝时，所使用的量优选符合联邦法规汇编（CodeofFederalRegulation，CFR），并且每剂量含有不超过0.84mg的铝。
所述偶联物可以以试剂盒的形式提供给管理医师或者其它健康照护专业人员。这种试剂盒是具有一个或多个其中含有合适形式的偶联物的容器的和向受治者给药这种药用组合物的说明书的成套产品。所述试剂盒可以任选地还含有一个或多个额外的治疗剂或佐剂。所述试剂盒和任选地含有一个或多个诊断工具和使用说明，例如，辨别疟疾感染的诊断说明。举例来说，可以提供含有单一组合物的试剂盒，该试剂盒含有与一个或多个额外的治疗剂结合的偶联物，或者可以提供独立的药用组合物，该药用组合物含有偶联物和额外的治疗剂。所述试剂盒还可以含有以用于连续给药或顺次给药的不同剂量的偶联物。所述试剂盒可以含有合适的供给装置（例如，注射器等），并随附给药偶联物和任何其它治疗剂的说明。所述试剂盒可以任选地含有对储存、重建（reconstitution）（如果可以应用）以及含有的任何或所有治疗剂的给药的说明。所述试剂盒可以包括反映了向受治者给药数的多个容器。
实施例
试验步骤
分析方法
在用6N的HCl在150℃下水解1小时并向七氟丁酰异丁基酯（heptafluorobutyrylisobutylester）进行衍生作用后通过气液色谱-质谱联用仪（GLC-MS）进行氨基酸分析，该分析通过用具有HP-50.32×30mm的玻璃毛细管柱的惠普设备（型号HP6890；安捷伦科技，威明顿，特拉华州（ModelHP6890;AgilentTechnologies,Wilmington,DE）），在电子电离（106eV）模式下（麦肯齐，SL1987分析化学协会杂志70：151-160（MacKenzie,SL.1987JAssocAnalChem70:151-160））从125℃，以8℃/分钟程序升温至250℃而进行。通过劳瑞的方法（劳瑞，JO等人1951生物化学杂志193：265-275（Lowry,JO.etal.1951JBiolChem193:265-275））测定蛋白质的浓度；Pfs25与载体蛋白质的比例是建立在对偶联物的蛋白质分析的基础上，并且根据已描述的（舒勒，KR等人1992免疫学方法156：137-149（Shuler,KR.etal.1992JImmunolMethods156:137-149））进行计算。通过费得斯测定（费得斯，R1971生物化学杂志124：581-590（Fields,R.1971BiochemJ124:581-590）测定自由氨基；通过2-吡啶硫代基（2-pyridylthiogroups）（A343）的释放对硫醇进行测定（卡尔森，J等人1978生物化学杂志173：723-737（Carlsson,J.etal.1978BiochemJ173:723-737））；通过与2-肼基吡啶（2-hydrazinopyridine）的反应测定苯甲醛基团的引入（库伯勒-科尔伯，J等人2006感染与免疫74：4744-4749（Kubler-Kielb,J.etal.2006InfectImmun74:4744—4749））；并通过三硝基苯磺酸（TNBS）测定对肼酰进行测量（斯奇尔松，R等人1984实验医学152：361-376（Schneerson,R.etal.1980JExpMed152:361-376））。根据生产说明使用14%的凝胶进行SDS。用磷酸盐缓冲溶液（PBS）中的1.0%的琼脂糖胶内进行双向免疫扩散。
蛋白质
制备在毕式酵母（Pichiapastoris）中表达的重组的Pfs25和来自绿脓杆菌的rEPA，并且以已有的描述（蔡，C等人2005生物工程杂志121:458:470（Tsai,C.etal.2005JBiotechnol121:458:470）；约翰逊，H等人1996生物工程杂志48:9-14（Johansson,H.etal.1996JBiotechnol48:9-14））为特征。卵白蛋白（OVA）购自西格玛，圣路易斯，密苏里州（Sigma,St.Louis,MO）
免疫接种
10只NIH（美国国家卫生研究所）通用目的的5-6周大小的雌鼠组，以2周的间隔2-3次皮下注射（s.c.）2.5μg的Pfs25（仅Pfs25或者作为0.1ml的PBS中的偶联物）。最后一次注射过后一周或1-9个月后，将小鼠放血（泰勒，DN等人1993感染与免疫61:3678-3687（Taylor,DN.etal.1993InfectImmun61:3678-3687））。给对照组注射PBS。为了进行传播阻断测定，10只BALB/c雌鼠组以4周为间隔进行两次皮下注射2.5μg的Pfs25（作为与氢氧化铝（铝胶）配制的偶联物）。在第二次注射的两周后，将鼠放血。
抗体
对血清IgG抗体进行测量（参见，例如泰勒等人，1993感染与免疫61:3678-3687（Tayloretal.,1993,Infect.AndImmun.61:3678-87）。将96孔板（能肯，麦克斯索伯，罗切斯特，纽约（NuncMaxisorb,Rochester,NY））涂敷4μg的Pfs25/ml的磷酸缓冲液（PBS）（由棋盘滴定（checkerboardtitration）确定）。将板用PBS中的0.5%的BSA（牛血清白蛋白）在室温下阻断1个小时，并用测试血清培养过夜，随后用磷酸酶标记的亲和纯化的羊抗鼠IgG（KPL，盖士堡，马里兰州（KPL,Gaithersburg,MD））处理4小时。使用MRX酶标仪（戴拿科技，尚特莉，弗吉尼亚州（Dynatech,Chantilly,VA）记录光密度。相对于标准血清计算抗体水平，所述标准血清为由偶联物1诱导的含有最高抗体水平的含有287μg/ml的抗体的血清池（pool）。该浓度通过与所测浓度的亲和纯化的IgG抗-Pfs25的比较而进行分配。将结果用ELISA数据处理系统进行计算机处理，该ELISA数据处理系统由生物统计学和信息管理机构，疾病控制中心，亚特兰大，乔治亚州（皮来凯提斯，BD&卡尔仑，GM.2005Windows 用户操作ELISA程序（疾病控制和预防中心，亚特兰大）第二版）（Plikaytis,BD&Carlone,GM.2005ProgramELISAforWindowsUser'sManual(CentersforDiseaseControlandPrevention,Atlanta,)Version2）提供。将由配制有蒙太德ISA720（MontanideISA720）佐剂（赛比克，巴黎，法国（SEPPIC,Paris,France））的Pfs25对兔子进行免疫接种获得的多克隆抗血清用于免疫扩散测定中。
Pfs25通过酰胺键与蛋白质偶联
Pfs25-AH/Pfs25，两步法
如已描述的（斯奇尔松，R等人1980实验医学152:361-376（Schneerson,R.etal.1980JExpMed152:361-376））用ADH对Pfs25进行衍生作用。产物Pfs25-AH含有4.2-5.2%的酰肼。接着，将等量的Pfs25-AH和Pfs25各自以7.5mg/ml进行混合，并与0.05M的盐酸1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺（l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride，EDC）在pH5.8下在室温下反应4小时，在4-8℃下振荡过夜，并向PBS渗析。该反应产物通过在0.2M的NaCl中的1×90cm的琼脂糖凝胶CL-6B柱（安发玛西亚，匹兹堡，宾夕法尼亚州（AmershamPharmacia,Pittsburgh,PA））。基于柱色谱和SDS/PAGE曲线，根据通过免疫扩散而与抗Pfs25反应的馏分的分子量，将其分成两池。产物：偶联物1和11以相同的方法在不同时间被制得，并含有分子量较高的馏分（F1）；偶联物2含有比偶联物1中分子量较低的馏分（F2）
Pfs25-AH-Pfs25，一步法
在0.1M的EDC存在时，将Pfs25（15mg/ml）与0.006M的ADH（6%重量/重量）在pH5.1下在室温下反应4小时，并在4-8℃下振荡过夜。随后按以上相同地处理反应混合物。产物：偶联物12和13。
Pfs25-AH/rEPA
使用分别为10mg/ml的Pfs25-AH和rEPA，按以上的两步法制备偶联物。产物：偶联物14和15。
Pfs25通过腙键与蛋白质偶联
Pfs25-AH/CHO-Pfs25
如已描述的（库伯勒-科尔伯，J等人2006感染与免疫74：4744-4749（Kubler-Kielb,J.etal.2006InfectImmun74:4744—4749））用N-琥珀酰亚胺-4-甲酰苯甲酸酯对Pfs25进行衍生作用（Pfs25-CHO），并分析蛋白质、苯甲醛和抗原性。将Pfs25-AH和Pfs25-CHO（各10ml）置于2ml的缓冲液A中（PBS/0.1%的甘油/0.005M的EDTA，pH7.4），在pH7.4下反应2小时，并随后在室温下振荡过夜。随后将样品经过缓冲液A中的1×90cm的琼脂糖凝胶CL-6B柱，并通过SDS/PAGE分析与抗Pfs25反应的馏分的蛋白质浓度和分子量。产物：偶联物6和8，以相同的方法在不同的时间制备。
Pfs25-CHO/AH-OVA
按以上同样地，进行卵白蛋白（OVA）到OVA-AH和Pfs25到Pfs25-CHO的衍生作用以及这些蛋白质的偶联作用。产物：偶联物5、9和10。
Pfs25-AH-CHO-AH-Pfs25
与以上制备Pfs25-CHO相同地，将Pfs25-AH与N-琥珀酰亚胺-4-甲酰苯甲酸酯反应，以将醛基引入酰肼基。Pfs25-AH-CHO和Pfs25-AH（各10mg/ml）在缓冲液A中在pH7.4下混合，在4-8℃下振荡过夜，并经过上述的琼脂糖凝胶CL-6B柱。产物：偶联物7。
Pfs25通过硫醚键与蛋白质偶联
Pfs25-Br/SH-Pfs25
如已描述的（斯奇尔松，R等人2003美国科学院院刊100:8945-8950（Schneerson,R.etal.2003PNASUSA100:8945-8950））用N-琥珀酰亚胺-3-溴代乙酸胺丙酸酯与Pfs25进行衍生作用（Pfs25-Br），并测定蛋白质和抗原性。等量的另一份Pfs25用N-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫代基)丙酸酯进行衍生作用，并分析蛋白质、硫醇化作用（thiolation）和抗原性（Pfs25-SH）。将Pfs25-Br和Pfs25-SH（各10mg）置于2ml的缓冲液A中并在pH7.4下反应2小时，随后在室温下振荡过夜。然后按以上同样地处理样品。产物：偶联物3。
Pfs25-SH/Br-OVA
按以上同样地，进行OVA到OVA-Br和Pfs25到Pfs25-SH的衍生作用以及这些蛋白质的偶联作用。产物：偶联物4。
传播阻断测定
如已描述的（夸奇，I等人1987免疫学杂质（Quakyi,I.etal.1987JImmunol139:4213-4217））进行膜饲养测定（Membranefeedingassay）以评估由偶联物诱导的抗血清的传播阻断活性。简短地说，来自免疫接种了用铝胶（Alhydrogel）配制的偶联物11（Pfs25-AH/Pfs25）和14（Pfs25-AH/rEPA）的鼠的具有最高抗Pfs25水平的血清各自混合，并在56℃下热失活15分钟。随后用初始人血清池对该血清进行连续稀释，以使鼠血清的非特异性效果最小化。对于测试的每池，用与免疫血清同等稀释的免疫前血清作为配子母细胞的定量基础。将稀释的血清与恶性疟原虫配子母细胞培养物（NF54系）混合，并通过膜饲喂设备饲喂给斯氏按蚊（AnophelesStephensi）（奈梅根株（Nijmegenstrain））。饲养蚊8天以使寄生虫发育为成熟的合子囊。对每个血清样本至少20只蚊进行解剖，用红汞（西格玛（sigma））对中肠染色，并计算每个中肠的合子囊数目以测定传染性。为了计算抑制百分率，使用以下的公司：
100×（合子囊#阴性对照-合子囊#测试）/合子囊#阴性对照，其中，测试血清和对照血清以连续稀释倍数成对匹配。
偶联物的特征
表1提供了关于为了各种组合物的偶联物而诱导出的血清IgG抗Pfs25，包括通过形成酰胺键（AH）、腙键（AH/CHO、CHO/AH/CHO或CHO/AH）或硫醚键（SH）而结合到自身的Pfs25、结合到绿脓杆菌重组外蛋白A（rEPA）的Pfs25或结合到卵白蛋白（OVA）的Pfs25。Pfs25对载体的分子量比例大于1的偶联物具有较高的抗体水平（比较，例如实施例14对实施例15、实施例16对实施例17，以及实施例5、9和10对彼此）。由柱流出曲线并通过SDS/PAGE显示，所有的偶联方法增加了Pfs25的分子量，总结于表1。Pfs25-AH/Pfs25偶联物（偶联物1和2）、Pfs25-AH/rEPA（偶联物14和15）和Pfs25-CHO/AH-OVA（偶联物9和10）在它们的分子量上为不同，并且分为两种部分重叠的馏分（F1和F2）。分子量推测大于300kDa的偶联物仅在一种馏分中收集。
具有己二酸二酰肼（ADH）的蛋白质的衍生作用以两种方式进行：（i）在蛋白质的碳二亚胺活化的天冬氨酸和谷氨酸的羧基和ADH酰肼之间形成酰胺键（偶联物1、2和11-15；图1A）；（ii）在苯甲醛和蛋白质的酰胺衍生物之间形成腙键（偶联物5-10；图1B）。还制备了含有ADH分子的较长的连接子（linker），所述ADH分子位于两个苯甲醛分子之间（偶联物7）。也对含有位于两个蛋白质之间的硫醚键的偶联物3和4进行了测试（图1C）。通过用Pfs25和具有确定株系的载体抗体的双向免疫扩散使所有的偶联物发生沉淀，以确认两个蛋白质的共价键以及它们抗原性的保持。按照与偶联物11相同的方式来制备实施例11a-c，不同的是在不同的时间确定来确定可再现性。由于在偶联物11或偶联物11a-c之间不存在统计差异，结果是可再现的。按照与偶联物15相同的方式来制备偶联物16和17，不同的是制备的时间不同；按照与共物12相同的方式制备偶联物18和19，不同的是制备的时间不同；按照与偶联物8相同的方式来制备偶联物20和21。
表1：由偶联物得到的组合物和血清IgG抗Pfs25，所述偶联物通过将Pfs25结合到其自身、结合到rEPA以及结合到OVA上而被制备。
以两周为间隔对5-6周大小的NIH通用目的的小鼠（n=10）皮下注射2.5μg的作为偶联物的Pfs25，并在第二次注射或第三次注射后第七天进行放血。数据：1对（vs.）2，P=0.002；1对12，P=0.008；11对2，P=0.03；12对13，P=0.003；3对4，P=0.05；8对7，P=0.02；1对3，P=0.02；1对8，P=0.001。na，未采用；nd，未进行。
偶联物的免疫原性
三次注射后，由所有的偶联物诱导的抗体水平显著地高于那些仅由Pfs25诱导的抗体水平（表1；P<0.001）。最具有免疫原性的偶联物为在两步反应中Pfs25通过ADH结合到自身上的偶联物（几何平均数（GM）439μg/ml），或者通过ADH结合到rEPA上的偶联物（GM593μg/ml）。在统计上用ADH制备的偶联物比用硫醚键（352μg/ml对88μg/ml；P=0.02）或腙键（352μg/ml对71μg/ml；P=0.001）制备的相似的偶联物诱导了更高的抗体水平。通过两步法而结合到自身上的Pfs25比通过一步法（P=0.008）而结合到自身上的Pfs25更具有免疫原性。含有较长的连接子的偶联物（偶联物7），其中ADH通过苯甲醛环而从蛋白质分离，产生的抗体水平显著地低于由偶联物1和12诱导的抗体水平，所述偶联物1和12中仅ADH用作连接子。当对该方法进行调整以避免发生过多的交联时能获得相似的水平，例如，在偶联物20的情况下329μg/ml，其中仅ADH用作连接子。
载体效应
通过ADH连接到rEPA的Pfs25的偶联物诱导的抗体水平与那些以相同方法连接到其自身的Pfs25的偶联物所诱导的抗体水平。通过硫醚键将Pfs25连接到OVA而制备的偶联物诱导的抗体水平显著地低于以相同的方式结合到自身的Pfs25所诱导抗体水平（24μg/ml对88μg/ml；P=0.05）。通过腙键结合到自身的Pfs25的偶联物（偶联物3）和结合到OVA上的Pfs25的偶联物（偶联物4）产生相同水平的抗Pfs25，但是显著低于那些由ADH制备的偶联物（71μg/ml对352μg/ml；P=0.001）。
尺寸效应（SizeEffect）
偶联物的抗原性不是直接与它们的尺寸有关的。为了具有免疫原性，在自身上合其它蛋白质上的Pfs25的偶联物具有至少2个Pfs25的等价物。分子量为100-300kDa（偶联物14）和分子量＞300的以相同的方法制备的偶联物（偶联物15）诱导的抗体水平相似（表1）。
剂量效应
用两剂量的各种Pfs25偶联物对鼠进行试验（表2）。在2.5μg和10μg每鼠每次注射剂量的抗体水平之间在统计上没有显著差异。
表2：结合到其自身或OVA的Pfs25的偶联物的剂量/免疫原性关系
以两周为间隔对5-6周大小的NIH通用目的的鼠（n=10）皮下注射2.5μg或10μg的作为偶联物的Pfs25，并在第二次注射或第三次注射后第七天进行放血。nd，未进行。
Pfs25偶联物诱导的抗体的病程（Duration）
让人注意的是，在最后一次注射3或7个月之后放血的小鼠的抗体的水平显著地高于在最后一次注射1周后得到的抗体水平（表3；96μg/ml对5μg/ml；P=0.0005；142μg/ml对36μg/ml；P=0.03；247μg/ml对5μg/ml；P=0.002）。
表3：用2.5μg的偶联物每小鼠进行免疫接种后不同时期得到的血清IgG抗Pfs25
以两周为间隔对5-6周大小的NIH通用目的的小鼠（n=10）皮下注射2.5μg或10μg的作为偶联物的Pfs25，并在第二次注射或第三次注射后第七天、3个月或7个月进行放血。nd，未进行。数据：5对96，P=0.0005；36对142，P=0.03；5对247，P=0.002。
由于如表4中数据所示地，抗体水平随着时间的流逝而增加，基于Pfs25的疫苗具有不同寻常的性质。本实验中，在3个月时达到抗体最高水平。
表4：Pfs25疫苗的抗体水平对时间
偶联物诱导的鼠抗-Pfs25发挥传播阻断活性的作用
通过使用注射有用铝胶（Alhydrogel）的偶联物11（Pfs25-AH/Pfs25Fl）和偶联物14（rEPA/AH-Pfs25Fl）的鼠的混合血清进行传播阻断测定。用来自天然鼠（naivemice）的血清来计算抑制的合子囊数的百分数。蚊的中肠内的合子囊的减少证实了这两种混合血液表现出显著的传播阻断活性（图2）。该活性与由ELISA测定的血清抗体水平有关。
到氢氧化铝上的吸附增强了偶联物的免疫原性
在第三次注射后，与诱导了1,445μg/ml（P<0.001）的GM的吸附的偶联物14相比，偶联物14诱导了284μg/ml的GM。相似地，偶联物11单独地诱导了296μg/ml的GM，而吸附的偶联物11诱导了2,125μg/ml的GM（P<0.001）。
结论
恶性疟原虫表面蛋白Pfs25仅在蚊媒介的中肠内的动合子上进行表达。甚至在地方病区域，这也不会遭到人宿主的抵抗，并因此不期望会对其产生的人抗体应答。通过用Pfs25加佐剂对实验动物进行免疫接种而得到的抗体抑制了疟原虫在蚊内的发育（巴尔，PJ.等人1991实验医学174:1203-1208（Barr,PJ.etal.1991JExpMed174:1203-1208））。单独或吸附到氢氧化铝上的Pfs25在实验动物和人体中几乎不具有免疫原性（科万，C.等人2004感染与免疫72:584-588（Coban,C.etal.2004InfectImmum72:584-588）；卡斯罗，DC.2002化学免疫学80:287-307（Kaslow,DC.2002ChemImmunol80:287-307））。因此，提供了一种通过偶联作用来增加Pfs25的免疫原性的方法。优选实施方式的方法可再现，并能用于临床，包括婴儿。特别优选的结合剂是ADH，它提供了最具有免疫原性的Pfs25偶联物。
测试了用ADH连接子制备的Pfs25偶联物的偶联方法和偶联组合物这两个变量。首先，两步法，用ADH对Pfs25进行衍生作用，随后将Pfs25-AH结合到未衍生的Pfs25上，产生比一步法更具有免疫原性的偶联物。其次，用rEPA制备的Pfs25的偶联物或连接到自身的Pfs25的偶联物的免疫原性相似。然而，进行生产和标准化的最简便的流程使连接到自身的Pfs25为特别优选的。
含有2-10个分子的Pfs25的偶联物（如分子量为50-250kDa）是特别优选的免疫原。Pfs25偶联物的剂量从2.5μg到10.0μg每注射的增加不影响抗体水平；因此，较低的剂量水平可以赋予可接受的抗体水平。Pfs25到氢氧化铝的媳妇吸附了它们的免疫原性。偶联物诱导的传播阻断活性与由ELISA测量的抗体水平相关，这表示偶联物食欲用作疟疾疫苗。
令人惊讶的是，在第二次和第三次注射后3个月和7个月获得的Pfs25抗体的水平比一周后获得的抗体水平是升高不是降低。在第二个研究中（参见表4中的数据），抗体水平在注射后的3个月达到了最高，伴随着在最后一次注射9个月时有缓慢的降低。结合到其自身或其它蛋白质的作为偶联物Pfs25比单独的Pfs25表现出显著增加的抗原性。
当吸附到氢氧化铝上时，发现间日疟原虫动合子表面蛋白Pvs25（Pfs25的直系同源系）是安全的并具有免疫原性，并且在成人类体内产生传播阻断抗体（马尔金，EM.等人2005疫苗23:3131-3138（Malkin,EM.etal.2005Vaccine23:3131-3138））；然而，人们相信疫苗诱导的抗Pvs25H作为有效的疫苗的水平过低，并且由于抗原不在其人宿主类的寄生虫上进行表达，也不期望会发生这种水平的自然提高。在此公开的偶联方法能用于Pvs25以提高其免疫原性从而产生适于用作对间日疟原虫的疫苗。
应该理解的是，在此描述的实施例和实施方式仅用于阐述目的，在此基础上做出的各种替换和改变对本领域技术人员具有启示作用，并且应该包括在本申请的实质和范围以及随附任何一条权利要求的范围内。为了全部目的，通过引用所有的附图、表格和附注，以及所应用的出版物、专利和专利申请的整体而将其结合于此。

Claims (10)

1.一种偶联物，该偶联物含有结合到第二蛋白质上的第一蛋白质，所述第一蛋白质通过选自由酰胺键、腙键和硫醚键所组成的组中的至少一种键而结合到第二蛋白质上，所述第一蛋白质是间日疟原虫表面蛋白Pvs25，所述第二蛋白质是间日疟原虫表面蛋白Pvs25。
2.根据权利要求1所述的偶联物，其中，该偶联物为下式：
其中，n为3-5的整数，X1为间日疟原虫表面蛋白Pvs25，且X2为间日疟原虫表面蛋白Pvs25。
3.根据权利要求2所述的偶联物，其中，n为4。
4.根据权利要求1所述的偶联物，其中，该偶联物为下式：
其中，p为1-3的整数，q为1-3的整数，r为1-2，X1为间日疟原虫表面蛋白Pvs25，并且X2为间日疟原虫表面蛋白Pvs25。
5.根据权利要求4所述的偶联物，其中，p为2，q为2，且r为1。
6.一种用于治疗或预防疟疾的药用组合物，该药用组合物含有：
至少一种权利要求1-5中任意一项所述的偶联物；和
药学上可接受赋形剂。
7.根据权利要求6所述的药用组合物，该药用组合物还含有佐剂。
8.根据权利要求7所述的药用组合物，其中，所述佐剂为氢氧化铝。
9.权利要求1-5中任意一项所述的偶联物在制备血清中的应用，其中所述血清是用作试剂或用于被动免疫的血清。
10.权利要求1-5中任意一项所述的偶联物在制备用于治疗或预防疟疾的药物中的应用。
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