CN102256596A - 用于增强对流递送到中枢神经中心的脂质体组合物 - Google Patents

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Abstract

增强对流递送(CED)作为一种将药物制剂直接注入递送到中枢神经系统，从而绕开血液-血液屏障的方法使用。非聚乙二醇化脂质体组合物包含至少一种饱和的中性磷脂和至少一种饱和的阴离子磷脂和包封在其中的治疗剂或诊断剂，其用于克服与局部CED递送产生的高峰值药物浓度相关的毒性，同时增加用于改进持续药物释放的组织分布容积。在一个实施例中，脂质体组合物包括摩尔比为7∶2∶1的DSPC∶DSPG∶CHOL，和选自拓扑替康，芋螺毒素，钆双胺或罗丹明的治疗剂或诊断剂，并用于治疗癫痫。

Description

用于增强对流递送到中枢神经中心的脂质体组合物
技术领域
本发明涉及一种脂质体制剂，其通过增强对流递送系统递送，并用于治疗中枢神经系统疾病。
背景技术
对于脑肿瘤患者，全身性递送治疗通常伴随全身性的副作用，同时在中枢神经系统(CNS)只能达到临界治疗浓度，从而全身性治疗的效果受到限制。可观察到的缺乏疗效的原因主要是由于治疗剂穿过血脑屏障的渗透性较差。虽然血脑屏障可能在肿瘤中心被破坏，允许全身性递送化疗药物大部分地进入肿瘤的非活性中心，但屏障在最需要药物的增长肿瘤边缘通常保持完整。
绕过血脑屏障的一种方法是将治疗药物直接注入中枢神经系统。然而，直接注入脑中的药物的扩散性很差。即使从注射位点将小分子药物移动几毫米就需要高浓度梯度，而且这种浓度通常是有神经毒性的。解决这个问题的一个研发中的策略是脑内直接注射方法，被称为增强对流递送(CED)。CED采用正压在胞外空间产生分散剂，包括治疗性大分子(Bobo，R.H.，et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2076-80.；Chen，M.Y.，et al.(1999)J.Neurosurg.90：31520)的局部压力梯度。CED在给定的靶组织内可重复分布，并在整个分布容积(Vd)内产生均匀的药物浓度(Croteau et al.，2005；Lonser etal.，2002)。
通过CED局部递送的化疗药物产生了良好的治疗效果(Bruce et al.，2000；Degen et al.，2003；Kaiser et al.2000)。然而，多数直接递送到神经系统的细胞毒性药物具有损害健康细胞的能力。因此，用于CED给药进入脑肿瘤的好的候选药物必须具备与健康神经细胞相比对于肿瘤细胞最高可能的治疗指数。然而脂质体药物递送提供了避免高峰药物浓度的潜能，高峰药物浓度通常伴随明显的毒性，而且通过CED给予的脂质体包裹喜树碱药物的临床前研究已经示出了一些在药物缓释中的改善(Moog et al，2002；Saito et al，2006；Nobel et al，2006)，聚乙二醇化脂质体的使用被认为是掩盖组织结合位点相互作用必不可少的，且因此增加组织分布容积(Saito et al，2006)。
虽然聚乙二醇化脂质体成功地克服了脂质体/组织的相互作用，但最近已证明聚乙二醇化脂质体可能产生不必要的和潜在威胁生命的免疫应答(Szebeni等.(2007)J.Liposome Res.17：107-117；lshida和Kiwada(2008)lnt JPhartn 354-56-62 Epub Nov 9 2007)。当向相同实验对象给药两次时，除了加速血液清除，聚乙二醇化脂质体可能会导致非IgE介导的过敏反应，其中包括心肺窘迫症状(例如呼吸困难、呼吸急促、心跳过速、胸痛、高血压和低血压)(Ishida和Kiwada(2008)，上文，Moghimi等(2006)FASEB J 202591-3 Epub Oct 25，2006)。
因此，所需要的是一种用于增强对流递送的改进的脂质体药物制剂，其能提供增加的组织分布容积，且能避免与聚乙二醇相关的有问题的免疫原性。
发明概述
本发明人令人惊讶地发现，当阴离子脂质组分用于聚乙二醇代替物制剂中，脂质体在中枢神经系统组织中可高度对流，如本文所描述并要求的。而且，该制剂显示出相比较于本领域中使用的聚乙二醇化制剂的药代动力学特征，且同时避免与聚乙二醇相关的有问题的免疫原性。因此，本文提供了通过阴离子脂质体制剂的增强对流递送改进的组合物和将治疗药物给药到中枢神经系统的分散的组织中的方法，例如，局部CNS肿瘤。
一方面，本文描述了治疗中枢神经系统疾病的方法，中枢神经系统疾病如，在中枢神经系统中与死亡或特定神经元群功能障碍相关的疾病。这些方法包括向患有中枢神经系统疾病的病人给药治疗上有效剂量的药物组合物，其中所述药物组合物通过增强对流递送系统局部地递送到特定神经元群，且其中所述药物组合物包括至少一种包封于非聚乙二醇化脂质体的治疗剂和至少一种阴离子饱和脂质，治疗剂包括中性饱和磷脂的混合物，且其中所述药物组合物的增强对流递送治疗患有中枢神经系统疾病的病人。
本发明中发现有利的治疗剂包括，例如，抗肿瘤药、碘化合物、毒素(包括蛋白质毒素)、包括抑制细胞生长或细胞溶解性药物的细胞毒性剂、基因和病毒载体、疫苗、合成载体、生长因子、神经营养因子、抗病毒、抗生素、神经递质、细胞因子、靶向特定位点损伤的酶和药物。
通过本文提供的组合物和方法可能治疗的中枢神经系统疾病包括，例如，癌症、传染病、头部外伤、脊髓损伤、多发性硬化症、路易体痴呆、ALS、溶酶体贮积症、精神疾病、神经退行性疾病、中风、癫痫症、以及其他急性和慢性的中枢神经系统疾病。
在一个实施例中，本文提供了用于抑制中枢神经系统肿瘤生长，减少中枢神经系统肿瘤，杀死一个或多个中枢神经系统肿瘤细胞，和/或治疗患有中枢神经系统肿瘤的病人的方法。这些方法包括向患有中枢神经系统肿瘤的病人给药治疗上有效剂量的药物组合物，其中所述药物组合物通过增强对流递送系统局部地递送到中枢神经系统肿瘤，且其中所述药物组合物包括至少一种包封于非聚乙二醇化脂质体的治疗剂和至少一种阴离子饱和脂质，治疗剂包括中性饱和磷脂的混合物，且其中所述药物组合物的增强对流递送抑制中枢神经系统肿瘤生长，减少中枢神经系统肿瘤，杀死一个或多个中枢神经系统肿瘤细胞，和/或治疗患有中枢神经系统肿瘤的病人。
在另一个实施例中，本文提供了抑制或减少癫痫病人的癫痫发作次数或发作时间。这些方法包括向患有癫痫的病人给药治疗上有效剂量的药物组合物，其中所述药物组合物通过增强对流递送系统局部地递送到显示异常或过度高渗透物排放的中枢神经系统神经元的集合，且其中所述药物组合物包括至少一种包封于非聚乙二醇化脂质体的治疗剂和至少一种阴离子饱和脂质，治疗剂包括中性饱和磷脂的混合物，且其中所述药物组合物的增强对流递送抑制或减少癫痫病人的癫痫发作次数或发作时间。在一个实施例中，所述治疗剂是毒素，例如肽毒素。在一个实施例中，所述肽毒素是ω-芋螺毒素，如ω-芋螺毒素MVIIA或ω-芋螺毒素GVIA。在另一个实施例中，所述毒素是肉毒杆菌毒素，例如，A型肉毒杆菌毒素如或
Figure BDA0000069734650000041
B型肉毒杆菌毒素如
Figure BDA0000069734650000042
等。在另一个实施例中，所述毒素是μ-芋螺毒素或α-芋螺抑制肽。
在一个实施例中，所述药物组合物还包括至少一种包裹于非聚乙二醇化阴离子脂质体的诊断剂(有时称为“追踪剂”或“示踪剂”)，其允许在增强对流递送期间或之后治疗剂分布的可视化。在优选实施例中，所述包裹诊断剂的非聚乙二醇化脂质体和包裹治疗剂的非聚乙二醇化脂质体由相同的脂质组成。因此，在一个实施例中，本文中描述的方法还包括检测诊断剂的步骤。
如本文所述，非聚乙二醇化脂质体可能包括一种治疗剂。在一个实施例中，所述治疗剂是一种不可溶治疗剂。在另一个实施例中，所述治疗剂是拓扑异构酶I抑制剂(如喜树碱及其衍生物)，其包括但不限于拓扑异构酶I/II抑制剂。例如，在一个实施例中，所述治疗剂是一种喜树碱衍生物，选自以下组：9-氨基喜树碱、7-乙基喜树碱、10-羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、10，11-甲基非饱和二羟基喜树碱、9-氯-10，11-甲基非饱和二羟基喜树碱、依立替康、拓扑替康、7-(4-甲基哌嗪亚甲基)-10，11-亚乙二氧基-20(S)-喜树碱、7-(4-甲基哌嗪亚甲基)-10，11-亚甲二氧基-20(S)-喜树碱和7-(2-(N-异丙基氨基)乙基)(20S)-喜树碱。在另一实施例中，喜树碱衍生物选自以下组中：依立替康、拓扑替康、7-(4-甲基哌嗪亚甲基)-10，11-亚乙二氧基-20(S)-喜树碱、7-(4-甲基哌嗪亚甲基)-10，11-亚甲二氧基-20(S)-喜树碱和7-(2-(N-异丙基氨基)乙基)(20S)-喜树碱。在另一个实施例中，喜树碱是拓扑替康。
在另一个实施例中，拓扑异构酶抑制剂是拓扑异构酶I/II抑制剂，例如，6-[[2-(二甲氨基)-乙基]氨基]-3-羟基-7H-茚并[2，1-c]喹啉-7-单盐酸盐、偶氮毒素、或3-甲氧基-11H-吡啶并[3′，4′-4，5]吡咯并[3，2-c]喹啉-1，4-二酮。
在另一个实施例中，所述治疗药物是一种毒素，例如，一种蛋白质毒素，如ω-芋螺毒素(如，ω-芋螺毒素MVIIA或ω-芋螺毒素，GVIA)，一种肉毒杆菌毒素(例如，A型肉毒杆菌毒素如
Figure BDA0000069734650000043
或
Figure BDA0000069734650000044
B型肉毒杆菌毒素如
Figure BDA0000069734650000045
)，μ-芋螺毒素，α-芋螺抑制肽等。
在一个实施例中，初始药物浓度至少约为100μg/mL，优选至少约为200μg/mL，更优选至少约为300μg/mL。在另一个实施例中，初始药物浓度约为2～5mg/ml。在一个实施例中，治疗药物和/或诊断剂与脂质的比例约为0.1～0.5。在另一个实施例中，治疗药物和/或诊断剂与脂质的比例约为0.1。在另一个实施例中，治疗药物和/或诊断剂与脂质的比例约为0.3。在另一个实施例中，治疗药物和/或诊断剂与脂质的比例约为0.5。
在一方面，非聚乙二醇化脂质体包括诊断剂。在一个实施例中，所述诊断剂是MRI(核磁共振成像)磁体。在另一实施例中，所述诊断剂是钆螯合物。在另一个实施例，所述诊断剂选自钆双胺和罗丹明。在另一个是实施例，所述诊断剂是钆双胺。
本文所述的方法包括脂质体制剂的对流增强递送，脂质体制剂包括至少一种治疗剂和/或至少一种包封于非聚乙二醇化脂质体的诊断剂，非聚乙二醇化脂质体由至少一种中性饱和磷脂和至少一种阴离子饱和磷脂的混合物组成。在一个实施例中，所述中性饱和磷脂选自卵磷脂衍生物和其混合物，例如，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)及其混合物。还可能使用长链饱和脂肪，如C20和C22。在一个实施例中，所述阴离子饱和磷脂从包括磷脂酰甘油衍生物(如二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG))、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸及其混合物的组中选择。
本文所述的脂质体制剂还可能包括其他脂质组分，如甾醇及其衍生物(如胆固醇(CHOL))或鞘脂类(如鞘磷脂和鞘糖脂，特别是神经节糖脂)。在优选实施例中，脂质体制剂将基本上包括或包括至少一种中性饱和磷脂，至少一种阴离子饱和磷脂和稳定剂，如胆固醇。
在一个实施例中，非聚乙二醇化脂质体是由二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)的组合物组成的。在一个实施例中，非聚乙二醇化脂质体包括大约10～95摩尔百分比的DSPC。在一个实施例中，非聚乙二醇化脂质体包括大约5～90摩尔百分比的DSPG。在一个实施例中，非聚乙二醇化脂质体还包括胆固醇(CHOL)，例如大约5～45摩尔百分比的胆固醇。在一个优选实施例中，脂质体包括或主要包括大约60～90摩尔百分比的DSPC，大约5～10摩尔百分比的胆固醇和大约5～30摩尔百分比的DSPG。在一个优选实施例中，非聚乙二醇化脂质体包括或基本上由摩尔比为7∶2∶1的DSPC、DSPG和CHOL组成。在另一个实施例中，非聚乙二醇化脂质体包括或基本上由摩尔比为6∶2∶2的DSPC、DSPG和CHOL组成。在另一个实施例中，非聚乙二醇化脂质体包括或基本上由摩尔比为5∶2∶3的DSPC、DSPG和CHOL组成。
在一个实施例中，本文所述的非聚乙二醇化脂质体制剂的增强对流递送(CED)相比较于自由地给药的治疗药物的组织分布、毒性和体内半衰期，其增强了组织分布，减弱了毒性并延长了体内半衰期。
在一方面，本发明提供了套管，其包括本文所述的脂质体制剂，例如，包括至少一种包封于非聚乙二醇化脂质体的治疗剂的脂质体制剂，非聚乙二醇化脂质体由至少一种中性饱和磷脂和至少一种阴离子饱和磷脂的混合物组成，且其中所述制剂通过增强对流递送系统(CED)递送。在另一个实施例中，所述套管还包括脂质体制剂，其包括包封于非聚乙二醇化脂质体的诊断剂，非聚乙二醇化脂质体由 至少一种中性饱和磷脂和至少一种阴离子饱和磷脂的混合物组成，且其中所述制剂可能通过增强对流递送系统(CED)递送。在另一个实施例中，所述套管包括一脂质体制剂，其包括包含治疗剂的第一脂质体和包含诊断剂的第二脂质体，其中第一和第二脂质体都是非聚乙二醇化的，其中第一和第二脂质体由至少一种中性饱和磷脂和至少一种阴离子饱和磷脂的混合物组成，且其中所述制剂可能通过增强对流递送系统(CED)递送。所述套管与到中枢神经系统的增强对流递送相兼容。在一个实施例中，所述套管是免回流设计的套管。
在一方面，本发明提供了生产本文所述脂质体制剂的方法。在一方面，本发明提供了生产用于治疗患有中枢神经系统肿瘤的病人的药物的方法，该药物包括本文所述脂质体制剂。在一个实施例中，所述方法包括通过远程装载将治疗药物或诊断剂包埋于脂质体中，例如，通过硫酸铵梯度。
本文所述仪器和方法的其他目的、特征和优势将在下文的详细描述和相应的显示本发明说明性实施例的附图中变得更加清楚。
附图说明
图1A-1F比较了脂质组分、药物浓度和药物脂质比对聚乙二醇化和非聚乙二醇化脂质体制剂的拓扑替康的释放特征的影响。
图2示出了Ls-TPT制剂和正常脑组织中游离的拓扑替康的药代动力学。
图3示出了蔗糖对罗丹明脂质体对流递送能力的影响。
图4示出了向纹状体注入20μl罗丹明装载的脂质体后的分布容积(Vd)。
图5示出了通过治疗组的动物存活率。
图6示出了通过联合治疗组和组2(0.5mg/mL双剂量)的动物存活率。
图7示出了通过U87细胞装载在肿瘤移植的总存活率。
图8示出了通过联合治疗组和组2(0.5mg/mL双剂量)及低U87MG细胞负荷(6.8×103)的动物存活率。
图9示出了通过联合治疗组和组2(0.5mg/mL双剂量)及高U87MG细胞负荷(9.7×105)的动物存活率。
图10示出了在幼鼠脑组织中Ls-TPT-码头蓝色DHPE与Ls-Gd-罗丹明-PE融合的分布容积。对于每种制剂，n＝3且每个大脑半球注入20μL。
图11示出了在U87MG异种移植鼠的脑组织中Ls-TPT-码头蓝色DHPE与Ls-Gd-罗丹明-PE融合的分布容积。对于每种制剂，n＝4且每个大脑半球注入20μL。
图12示出了通过治疗组的动物存活率(未计入安乐死动物)。
图13示出了通过治疗组的动物存活率(计入安乐死动物)。
详细说明
定义
如本文中使用的，“脂质体”是指包含包埋水相体积的脂质双分子层膜。脂质体可能是具有单一的膜双分子层的单层囊泡，或具有多个通过水分子层相互分离的膜双分子层的多层囊泡。通常地，脂质体双分子层由两个脂质单分子层组成，其具有疏水性“尾巴”区域和亲水性“头部”区域。膜双分子层的结构是，脂质单分子层的疏水性(非极性)“尾巴”面向双分子层的中心，而亲水性(极性)“头部”面向包埋的水相体积或外脂质体的水环境。在一个实施例中，本发明的脂质体包括靶部分，如抗体或其他配体。
“脂质体制剂”被理解为其中的部分或全部的治疗药物和/或诊断剂被包埋于脂质体中。本文中使用的脂质体制剂是指只具有已列举的脂质组分的脂质体，其不含有其他脂质组分。
“磷脂”被理解为甘油的两亲性衍生物，其中的一个羟基被磷酸酯化，另两个羟基被长链脂肪酸酯化，其可能彼此相同或不同。
饱和磷脂是指其脂肪酸只有碳碳单键，而没有碳碳多键。
中性磷脂是指极性基团(通常为羟基或胺类)取代乙醇将另一个磷酸羟基酯化，且中性磷脂在生理pH下其净电荷为零。
阴离子磷脂是指极性基团取代乙醇将另一个磷酸羟基酯化，且中性磷脂在生理pH下其净电荷为负值。
“带电饱和磷脂”表达的意思，包括带电饱和磷脂和其他净电荷不为零的两亲化合物。这种两亲化合物包括，但不限于，极性基团(如胺类)取代的长链碳酸氢盐衍生物和脂肪酸衍生物。
本文中所使用的，“活性剂”或“治疗剂”是指以高分子量神经治疗的方式递送到中枢神经系统靶组织的任何分子，且当其被递送后，在靶中枢神经系统组织引起有利响应。治疗剂包括但不限于抗肿瘤药、碘化合物、毒素(包括蛋白质毒素)、包括抑制细胞生长或细胞溶解性药物的细胞毒性药物、基因和病毒载体、疫苗、合成载体、生长因子、神经营养因子、抗病毒、抗生素、神经递质、细胞因子、靶向特定位点损伤的酶和药物。治疗剂包括但不限于核酸(包括核酸类似物)、蛋白质(包括抗体和小分子化学组合物)。活性剂包括全身性给药时显示毒性和不良影响的制剂。
本文中所使用的，“CNS疾病”是指受体的中枢神经系统疾病。该疾病可能与中枢神经系统特定神经元群的死亡和/或功能障碍有关。该疾病可能与中枢神经系统中细胞的异常生长有关。中枢神经系统异常生长的细胞可能源于中枢神经系统也可能来源于其他组织。CNS疾病包括癌症、感染、头部外伤、脊髓损伤、多发性硬化症、路易体痴呆、ALS、溶酶体贮积症、精神疾病、神经退行性疾病、中风、癫痫症、以及其他急性和慢性的中枢神经系统疾病。
神经胶质瘤是最常见的中枢神经系统(CNS)原发瘤。多形性胶质母细胞瘤(GBM)是最频繁、最恶性的神经胶质瘤类型。成人GBM的发病率比儿童高。根据美国统计报告的中心脑肿瘤登记，在美国GBM大约占所有脑肿瘤的20％(CBTRUS，1998-2002)。其他的CNS肿瘤包括，但不限于，其他的神经胶质瘤，包括星形细胞瘤(包括纤维(扩散)星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤)和脑干胶质瘤、少突神经胶质瘤、和室管膜瘤及相关室旁肿块、神经肿瘤，低分化肿瘤(包括成神经管细胞瘤)、其他实质肿瘤(包括原发性脑淋巴瘤、生殖细胞肿瘤和松果体实质肿瘤)、脑膜瘤、转移性肿瘤，副肿瘤综合症、外周神经鞘瘤(包括神经鞘瘤、纤维神经瘤和恶性外周神经鞘瘤(恶性神经鞘瘤))。
癫痫是与中枢神经系统中特定神经元群的功能障碍有关的最常见的严重的CNS疾病(Shorvon，S，Epidemiology，classification，natural history，andgenetics of epilepsy，Lancet 1990 JuI 14，336(8707)93-6，McNamara J，Theneurobiological basis of epilepsy，Trends Neurosci 1992 October，15(10)357-9)。严格地，穿透性头部外伤与大于50％的引起癫痫的风险相关。其他癫痫的原因包括中风、感染和遗传敏感性。癫痫发作是一种由中枢神经系统神经元群的异常、过度、高渗透排放引起的神经性功能障碍。癫痫发作可在行为上体现(如果包含运动系统)或在电记录器上体现。癫痫描述的是这样一种情况，其中病人由于慢性，潜在的过程最近有癫痫发作。尽管很多癫痫综合症的临床和病理特征不同，但是其普遍潜在的病因都是神经元的超兴奋性。因此，癫痫包括中枢神经系统(CNS)超兴奋性紊乱，以神经功能的慢性，周期性，突发性变化为特征，可根据脑电图和临床表现进行分类(Dichter M.，Basic mechanisms of epilepsy：targets for therapeutic intervention，Epilepsia 1997；38 Suppl 9：S2-6)。
癫痫发作大致分为两类：病灶(部分)发作或全身性发作。病灶性癫痫发作是由于大脑皮质或皮质下区域的特定神经元群的异常活动引起的。潜在的结构异常或损伤可能由于产伤、头部创伤、肿瘤、脓肿、梗塞、血管畸形或遗传性疾病引起的(Dichter 1997，Ibid)。病灶活动的位置可通过临床癫痫发作表现识别或可能被隐藏。同样地，活性病灶可能不涉及损伤本身，但可能出现在邻近的或较远的(但相关的)神经元群，支持可塑突触重组引起病灶过度反应的假设(参见例如Prince D.A.，Epileptogenic neurons andcircuits.In：Jasper′s Basic Mechanisms of the Epilepsies，Third Edition(1999)，Delgado-Escueta A.V.，et al.，editors)，Advances in Neurology 79：665-684)。
局灶性癫痫发作如果在意识上没有明显变化，则被认为是“简单”的，否则将被认为是“复杂”的。复杂的局灶性癫痫发作牵扯到颞叶和大脑边缘系统，是最普遍的成人癫痫病症。局灶性癫痫发作时，若脑电图成像变成双向，同时出现意识丧失，伴随或不伴随肌体痉挛现象，则被称为是二次发作。原发性的癫痫发作表现为单向电图成像，意识丧失，伴随或不伴随肌体痉挛现象。局灶性癫痫能够牵扯到大脑的几乎所有部分，通常由功能异常的局部病灶引发。目前对局灶性癫痫的治疗方法是，使用EEG将由器质性脑疾病引发的异常峰值波局部化(器质性脑疾病更易诱导局灶性癫痫发作)，然后对病灶进行外科手术切除以防复发。
脂质体制剂
本文所述的脂质体制剂，例如，包括这种制剂的药物组合物，可能以多种方式形成，包括主动或被动的装载方法。例如，可能使用跨膜pH梯度装载技术包封一种或多种治疗剂和/或诊断剂。通过使用跨膜电位穿过脂质体双分子层将治疗药物装载于脂质体的常用方法在本领域是众所周知的(例如美国专利No.5,171,578；5,077,056和5,192,549)。
简短地，例如，可先将脂质体溶于有机溶剂，如乙醇、叔丁醇及其混合物等，然后温和地加热(如60℃～70℃)。用于形成非聚乙二醇化脂质体的纸质组合物可能从多种囊泡形成脂质中选择，通常包括磷脂和甾醇(例如美国专利No.5,059,421和5,100,662)。例如，来自于蛋黄、大豆或其他蔬菜或动物组织的磷脂，如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰环己六醇、磷脂酰甘油、鞘磷脂等，其混合物，如蛋黄磷脂、大豆磷脂等，其氢化物及合成磷脂，如二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油或可能使用的类似物。
如本文所述，本发明的非聚乙二醇化阴离子脂质体是两种或多种非聚乙二醇化脂质的混合物，例如，一中性磷脂和一阴离子磷脂。在一个实施例中，所述中性磷脂选自卵磷脂衍生物和其混合物组成的组中，例如二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)及其混合物。在一个实施例中，所述阴离子磷脂从由磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰环己六醇、磷脂酸的衍生物和其混合物组成的组中选择，例如，二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)和磷脂酰丝氨酸和不同饱和脂肪酸形成的酯类的混合物。为了脂质体稳定和其他目的，还可能添加固醇(如胆固醇)、α-生育酚、双十六烷基磷酸酯、硬脂胺或其类似物。
为了使脂质溶解，可能加入预热的水溶液同时剧烈混合。例如，可能添加含有150～300mM缓冲物的溶液。可能使用的缓冲物包括，但不限于，硫酸铵、柠檬酸盐、马来酸盐和谷氨酸盐。混合后，将产生的多层囊泡(MLV)加热，并通过挤压装置的挤压，将MLV转换为单层脂质体囊泡。最初使用的溶解脂质的有机溶剂和通过透析、渗滤等从脂质体制剂中移除。
一种或多种治疗药物和/或诊断剂可能使用跨膜pH梯度装载技术被包封于脂质体中。通过提高脂质体外溶液的pH，脂质体双分子层间将存在pH差异。因此，脂质体双分子层间产生了跨膜电位，而且一种或多种治疗药物和/或诊断剂通过跨膜电位被装载于脂质体中。
通常地，治疗药物和/或诊断剂与脂质的比例约为0.01至约0.5(wt/wt)。在一个实施例中，治疗药物和/或诊断剂与脂质的比例约为0.1。在另一个实施例中，治疗药物和/或诊断剂与脂质的比例约为0.3。在一个实施例中，囊泡通过跨膜离子浓度制备，且在能使治疗药物和/或诊断剂包封的条件下与弱酸或碱性的治疗药物和/或诊断剂一起培育。在另一个实施例中，囊泡在存在治疗药物和/或诊断剂时被制备，且非包封材料通过透析、离子交换色谱、凝胶过滤色谱或渗滤移除。
用于装载的优选实施例以美国专利No.5,192,549为基础，且包括将氨氮从外界环境中去除。该结果产生了跨膜氨氮浓度梯度，其引起pH梯度。将药物添加到囊泡中，并在高温培育后“远距离”装载。
在一个优选实施例中，药剂基本上是不透水的(例如，诊断剂如钆双胺)，该药剂存在于缓冲液中，其使脂质体在囊泡形成期间被动包封。这种优选方法还可应用于其他两性离子药物，如氨甲蝶呤。相反地，弱碱(和酸)可远距离装载于脂质体。
本文所述的脂质体制剂可能用于到中枢神经系统区的增强对流递送，而且CED在CNS内达到高组织分布容积。因此，该脂质体制剂可能用于治疗CNS疾病。这种CNS疾病包括但不限于CNS肿瘤，如恶性胶质瘤，及与神经细胞的功能障碍相关的疾病，如癫痫。
因此，许多用于治疗CNS疾病的药物可能以本文所述方法包埋于本文所述的脂质体制剂。这种治疗药物包括抗肿瘤药、毒素、生物制剂(如多巴胺、5-羟色胺)和神经营养性因子(如GDNF、CDNF、MANF)等。
在一个实施例中，本文所述脂质体制剂包括拓扑异构酶I抑制剂(包括但不限于拓扑异构酶I/II抑制剂)。在一个实施例中，拓扑异构酶抑制剂是喜树碱及其衍生物。例如，治疗剂是一种喜树碱衍生物，选自以下组：9-氨基喜树碱、7-乙基喜树碱、10-羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、10，11-甲基非饱和二羟基喜树碱、9-氯-10，11-甲基非饱和二羟基喜树碱、依立替康、拓扑替康、7-(4-甲基哌嗪亚甲基)-10，11-亚乙二氧基-20(S)-喜树碱、7-(4-甲基哌嗪亚甲基)-10，11-亚甲二氧基-20(S)-喜树碱和7-(2-(N-异丙基氨基)乙基)(20S)-喜树碱。在另一实施例中，喜树碱衍生物选自以下组中：依立替康、拓扑替康、7-(4-甲基哌嗪亚甲基)-10，11-亚乙二氧基-20(S)-喜树碱、7-(4-甲基哌嗪亚甲基)-10，11-亚甲二氧基-20(S)-喜树碱和7-(2-(N-异丙基氨基)乙基)(20S)-喜树碱。在另一个实施例中，喜树碱是拓扑替康。对于本领域的通用技术这将是显而易见的，虽然某些药剂被说明性描述，但还有许多其他药剂也适合于本发明的脂质体组合物。
本文还考虑使用毒素，如蛋白质毒素，包括μ-芋螺毒素(如μ-芋螺毒素GIIIA、μ-芋螺毒素GIIIB、μ-芋螺毒素GIIIC、μ-芋螺毒素PIIIA、μ-芋螺毒素SmIIIA、μ-芋螺毒素KIIIA等)、ω-芋螺毒素(如ω-芋螺毒素GVIA(本文中也称为“ω-芋螺毒素G”和“ω-CTX-G”)、ω-芋螺毒素MVIIA(本文中也称为“ω-芋螺毒素M”和“ω-CTX-M”)、肉毒杆菌毒素(如肉毒杆菌毒素A(本文中也称为“BTX-A”)、肉毒杆菌毒素B(本文中也称为“BTX-B”)、肉毒杆菌毒素C1、肉毒杆菌毒素D、肉毒杆菌毒素E、肉毒杆菌毒素F等)、芋螺抑制肽(如芋螺抑制肽G、芋螺抑制肽T、芋螺抑制肽L、芋螺抑制肽S1、芋螺抑制肽Oc、芋螺抑制肽Gm、芋螺抑制肽Ca2、芋螺抑制肽Ca1和芋螺抑制肽Qu)及其衍生物，和其药学上可接受的盐。
在一个实施例中，来源于芋螺毒液的芋螺毒素可使用实验制剂递送。毒液的活性组分是短肽毒素，通常长度为10～30个氨基酸残基，而且由于其高密度的二硫键，基本上被高度抑制。毒液组分作用于电压控制离子通道、配体控制离子通道和G-蛋白偶联受体。芋螺毒素的药物选择性至少部分由特定的二硫键构架与氨基酸在二硫键环内结合决定。由于芋螺多肽的高效能和强选择性，多种已被评估用于治疗人类疾病，且目前使用一种ω-芋螺毒素MVIIA(齐考诺肽)，一种N型钙通道阻滞剂，通过可植入的、可编程的泵与导管进入鞘内空间治疗人类患者的疼痛。
在本发明的特定实施例中，抗癫痫药物制剂包括ω-芋螺毒素(如ω-芋螺毒素GVIA、ω-芋螺毒素MVIIA和ω-芋螺毒素CVID)(参见例如Gasior etal J Pharmacol Exp Ther 323 458-68(2007))。在另一实施例中，抗癫痫药物制剂包括μ-芋螺毒素(如μ-芋螺毒素GIIIA、μ-芋螺毒素GIIIB、μ-芋螺毒素GIIIC、μ-芋螺毒素PIIIA、μ-芋螺毒素SmIIIA、μ-芋螺毒素KIIIA等)(Zhang等，J Biol Chem 282 30699-30706(2007)。其他实施例中使用本文所述芋螺毒素的衍生物或药学上可接受的盐。
本文还考虑使用来源于肉毒梭菌的肉毒杆菌毒素。已经描述了7种不同免疫性的肉毒杆菌神经毒素，这些肉毒杆菌神经毒素按血清型分类分别为A、B、C1、D、E、F和G，每种毒素通过特异性抗体的中和作用识别。肉毒杆菌毒素的不同血清类型在动物物种中变化，其影响所引起的瘫痪的严重程度和持续时间。例如，已通过计算小鼠的瘫痪率确定，A型肉毒杆菌毒素的效力比B型肉毒杆菌毒素高500倍。此外，已确定在灵长类动物中480U/kg剂量的B型肉毒杆菌毒素是无毒的，其约为灵长类动物LD50中A型肉毒杆菌毒素的12倍。因此，非A型肉毒杆菌毒素与A型肉毒杆菌毒素相比可能具有低效力和/或短持续时间。
虽然所有血清型肉毒杆菌毒素都能明显抑制神经肌肉交界处的神经递质释放，但其通过影响不同的神经分泌蛋白质和/或在不同位点使这些蛋白质分开作用。例如，A型和E型肉毒杆菌毒素都能使25千道尔顿(kD)突触相关的蛋白质(SNAP-25)分开，但他们在该蛋白质中靶定于不同的氨基酸序列。B、D、F和G型肉毒杆菌毒素作用于囊泡相关的蛋白质(VAMP，也称为小突触泡蛋白)，每种血清型使蛋白质在不同位点分开。最后，示出了C1型肉毒杆菌毒素能使突触融合蛋白和SNAP-25都分开。这些作用原理的不同可能影响各种血清型肉毒杆菌毒素的相对效力和/或持续时间。
体外研究表明，肉毒杆菌毒素抑制钾离子引起的原代细胞培养和脑突触体制备的各种神经递质释放。谷氨酸是负责脑中大量突触激发的神经递质，且已认为其在癫痫发作和蔓延中是必须的。据报道，肉毒杆菌毒素抑制脊髓神经元原代培养中谷氨酸的诱发释放，且在脑突触体制备中肉毒杆菌毒素抑制谷氨酸和其他神经递质的释放。
在本发明的一些实施例中，抗癫痫药物是A型肉毒杆菌毒素或B型肉毒杆菌毒素。在其他实施例中，毒素是A型肉毒杆菌毒素或B型肉毒杆菌毒素的片段或类似物，其具备母体肉毒杆菌毒素的生物活性。在其他实施例中，毒素被修饰以与大脑神经元的合适靶标特异性结合。在一些实施例中，使用重组技术已生产梭菌神经毒素或其片段或类似物。
本发明还考虑使用芋螺抑制肽，包括美国专利No.6,172,041和6,399,574所述的，其公开内容已纳入本文做参考。
诊断剂也可能包埋于本文所述的脂质体。合适的药剂包括用于MRI的顺磁离子，本文成为“MRI磁体”。合适的金属离子包括那些原子数为22-29(计算在内的)、42、44和58～70(计算在内的)，且氧化价态为+2或+3的离子。这种金属离子的例子为铬(III)，锰(II)，铁(II)，铁(III)，钴(II)，镍(II)，铜(II)，镨(III)，钕(III)，钐(III)，钆(III)，铽(III)，镝(III)，钬(III)，铒(III)和镱(III)。
在实施例中，X-射线成像(如CT)用于检测CED，诊断剂可能包括一种不透射线的物质。已知的合适的不透射线的物质包括碘化合物、钡化合物、镓化合物、铊化合物等。不透射线的物质的具体例子包括钡、二乙酰氨基三碘苯甲酸盐、乙碘油、柠檬酸镓、碘卡明酸、碘西他酸、碘达酸、胆影酸、碘沙酸、iogulamide、碘苯六醇，碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘丝酸、碘砜葡胺、碘琥酸、碘酞硫、碘替酸、异泛影酸、碘托西酸、碘克沙酸、羟泛影酸、碘泊酸盐、甲葡胺、甲泛葡胺、甲泛影钠、丙碘酮和氯化亚铊。
如本文所述的脂质体制剂适合于增强对流递送。
增强对流递送
增强对流递送(CED)是一种直接的颅内药物递送技术，其利用大流量原理，使大分子递送并分布到固体组织的临床重要的容积中。CED比简单扩散提供更大的分布容积，旨在治疗剂直接作用于特定靶位点(见美国专利No.5,720,720)，本文的参考文献将其公开。简言之，增强对流递送(CED)是一种能绕过血脑屏障，并使大分子量物质(如药物装载脂质体)在脑中指定区域以控制的方式均匀地被给药的方法(见USSN 11/740,548，包含于本文参考文献)。CED可用于通过组织间隙的直接对流注入将液体药剂(如脂质体制剂)给药于固体组织，且将导管直接插入组织超过预定时间，并在压力下通过导管以预定流量进入组织间隙空间使用药剂，如大约0.1至约12μL/min。
如本文详细叙述，申请人发现CED可能有效地用于治疗药物的递送，且非必须的，诊断剂包埋于非聚乙二醇化脂质体制剂中，其中该制剂包括或主要包括至少一种中性饱和磷脂和至少一种阴离子饱和磷脂的混合物。如实施例部分所述，CED组合物包括至少一种治疗药物(如拓扑替康)和/或包埋于本文所述非聚乙二醇化脂质体制剂的诊断剂，增加分布容积，并显著提高治疗药物的血清半衰期。
用于给药脂质体制剂(如药物组合物)的合适器具可能包括泵装置，其包含装满脂质体制剂的蓄水池。该泵可置于体外或植入体内。该泵连接导管，导管可植入CNS的离散组织。该泵在引起特定组织内溶解物对流的压力和流量下被激活，释放脂质体制剂。
可调整注入的持续时间和其他参数，使遍及离散组织的脂质体制剂分布于离散组织的相邻区域，如，不进入脑脊液。根据离散组织的大小和形状不同，可能需要使用多个植入注射导管或使用带有多个出液口的注射导管。
使用CED，脂质体制剂可在正压下通过细导管缓慢注入组织间隙空间扩散。可使用泵静水压力产生的大流量将脂质体制剂扩散到CNS的胞外空间。因为CED的使用运行脂质体制剂通过导管末端直接扩散到神经组织，血脑屏障被越过，且可靶定于中枢神经系统的离散组织，包括制定的离散组织，如癌组织或用于传统手术评估的切除术，及多个病灶需要治疗的不同病灶。基于大流量的性质，CED可用于脂质体制剂可靠地、安全地、均匀地分布整个体积范围(参见例子USSN 11，/740,508)。而且，CED不会引起注入组织的结构和功能损伤，且对脂质体制剂扩散提供更强的控制。此外，不论包括于脂质体制剂中的脂质体的分子量，脂质体制剂都可均匀地分布于整个分布容积内，其与注入体积是成比例的。
在一个实施例中，一个超细递送导管(由聚氨酯构成并在新“步骤”设计中与石英熔合)可被永久性地植入经皮口。新型导管设计可快速生物整合，且内部密封，过滤阻止细菌侵入，并保证进一步的安全。脂质体制剂可根据需要注入这个导管系统的端口。
在本文所述的一个实施例中，CED可适用于小直径导管，其通过输液泵永久性地植入大脑区域。给药的脂质体制剂可制备为水等渗溶液，或其他合适制剂。在给药(如注入)期间，脂质体溶液可在胞外空间流动，对脑组织损伤很小甚至不损大脑组织。
在一个实施例中，可能使用专门为经皮CED递送设计的超细(端口外径为0.2mm)、最低限度创伤的导管系统。该导管系统的一步设计可消除沿导管两侧的溶液回流。这种溶液泄露是直边导管的一个主要问题。该导管系统可能由聚氨酯构成并与石英或Peek Optima熔合，使其为高度生物相容的并不干扰MRI信号。CNS疾病的治疗可能需要在不同时间间隔重复给药脂质体制剂，如，每隔一周、每隔一月等。例如，参见USSN11/740,124，其公开内容已纳入本文做参考。经皮口在间隔期间可能保持封闭。多导管设计是可行的，对于洒遍大面积离散组织，多导管比单一导管更可行。 已发现，CED注入后脂质体的分布容积与注入的溶液体积线性相关。
特别优选的套管在以下三篇文献中有详述，Krauze等人发表于2005年11月神经外科杂志上的文章103(5)923-9，在此附上引用文献全文；发表于L.J.S，专利申请公开号US2007/0088295 A1中的文章，在此附上引用文献全文；以及发表于美国专利申请公开号US 2006/0135945 A1中的文章，在此附上引用文献全文。
在一个实施例中，CED包括约为0.1～10μL/min的注入速率。在另一个实施例中，CED包括大于0.1～0.3μL/min的注入速率，例如，约为0.2μL/min。优选为大于0.7μL/min，更优选为大于1μL/min，更优选为大于1.2μL/min，更优选为大于1.5μL/min，更优选为大于1.7μL/min，更优选为大于2μL/min，更优选为大于2.2μL/min，更优选为大于2.5μL/min，更优选为大于2.7μL/min，更优选为大于3μL/min，且优选为小于12μL/min，更优选为小于10μL/min。
在一个优选实施例中，CED包括流量的增量，指在递送期间“步进”或向上滴定。优选地，进一步包括约为0.1～10μL/min的注入速率。
在一个优选实施例中，进一步包括大于0.5μL/min的注入速率，优选为大于0.7μL/min，更优选为大于1μL/min，更优选为大于1.2μL/min，更优选为大于1.5μL/min，更优选为大于1.7μL/min，更优选为大于2μL/min，更优选为大于2.2μL/min，更优选为大于2.5μL/min，更优选为大于2.7μL/min，更优选为大于3μL/min，且优选为小于12μL/min，更优选为小于10μL/min。
本文的治疗方法还优选地包括通过诊断剂的神经影像，优选为MRI，用于目标定位并引导导管位置。优选的立体定向支架用于与诊断剂神经影像的结合，以提供引导导管位置或靶定神经元群。通过磁共振成像(MRI)或X射线计算机断层扫描的示踪剂优选为可检测的。示踪剂的扩散被监控并用于间接测量高分子量神经治疗物的扩散。这种监控用于检测注入物到非靶组织的多余递送，并证明高分子量神经治疗物到达靶组织且达到有效浓度。
在一个实施例中，诊断剂独立于治疗剂。诊断剂以与治疗剂相关的速度扩散，因此其为治疗剂扩散的间接指标。在一个优选实施例中，诊断剂和治疗剂是分开给药的，但都被相同的非聚乙二醇阴离子脂质体制剂包埋，使其具有高度相似的扩散特点。在另一个实施例中，诊断剂和治疗剂是共同给药的。
本文的治疗方法还优选地包括用于监控注入物扩散的神经影像。在一个优选实施例中，治疗方法包括MRI的使用，用于监控本发明的注入药物组合物的扩散，其中该药物组合物包括MRI磁体。
实施例
实施例1用于CED的聚乙二醇化和非聚乙二醇化脂质体制剂的比较
实施例1.1材料和方法
实施例1.1.1 DSPC/CHOL(摩尔比60/40)
称量26.1mg DSPC(MW790，lot#C3L00，实际重量26.2mg)+8.5mg胆固醇(MW387，lot#CH1S003，实际重量为8.8mg)。
溶解于0.5ml的氯仿中，在EtOH中加入75μl 5mg/ml RhPE(0.2摩尔百分比的磷脂)。
在氮气中干燥样品，同时涡流形成薄膜。在真空下完成干燥1小时。
使脂质在60℃下，在1.5ml HBS(5mM HEPES-145mM NaCl pH7.0，0.1192g HEPES[MW238.3]+0.8475g NaCl[MW58.45]，用NaOH调节pH值，补充体积至100ml)中再次水合以形成MLV。
在60℃下通过2x100nm过滤器挤出以获得LUV(靶标大小为100-120nm)。
磷酸盐测定-稀释到20mM的磷脂。
放入2.0ml的血清瓶中(预先去热源)。
实施例1.1.2：DSPC/CHOL/PEG2000DSPE(摩尔比59.5/40/0.5)
称量25.8mg DSPC(MW790，lot#C3L006，实际重量为25.6mg)+8.5mg胆固醇(MW387，lot#CH1S003，实际重量为8.7mg)+0.75mgPEG2000DSPE(MW2774，lot#PPE2011809，实际重量为50μl的15mg/ml溶解于CHCl3，制备18mg[实际17.9mg]在1.2ml CHCL3)。
溶解于0.5ml的氯仿中，加入75μl 5mg/ml RhPE(0.2摩尔％的磷脂)。
在氮气中干燥样品，同时涡流形成薄膜。在真空下完成干燥1小时。
使脂质在60℃下，在1.5ml HBS(5mM HEPES-145mM NaCl pH7.0)中再次水合以形成MLV。
在60℃下通过2x100nm过滤器挤出以获得LUV(靶标大小为100-120nm)。
磷酸盐测定-稀释到20mM的磷脂，放入2.0ml的血清瓶中(预先去热源)。
实施例1.1.3：DSPC/CHOL/PEG2000DSPE(摩尔比55/40/5)
称量23.9mg DSPC(MW790，lot#C3L006，实际重量为23.8mg)+8.5mg胆固醇(MW387，lot#CH1S003，实际重量为8.6mg)+7.5mgPEG2000DSPE(MW2774，lot#PPE2011809，实际重量为500μl的15mg/ml溶于CHCl3)。
溶解于0.5ml的氯仿中，加入75μl RhPE(0.2摩尔％的磷脂)。
在氮气中干燥样品，同时涡流形成薄膜。在真空下完成干燥1小时。
使脂质在60℃下，在2.0ml HBS(5mM HEPES-145mM NaCl pH7.0)中再次水合以形成MLV。
在60℃下通过2x100nm过滤器挤出以获得LUV(靶标大小为100-120nm)。
磷酸盐测定-稀释到20mM的磷脂。
放入2.0ml的血清瓶中(预先去热源)。
实施例1.1.4：DSPC/CHOL/NG-DOPE(摩尔比55/40/5)
称量23.9mg DSPC(MW790，lot#C3L006，实际重量为24.2mg)+8.5mg胆固醇(MW387，lot#CH1S003，实际重量为8.9mg)+2.4mgNG-DOPE(MW880.13，lot#050328L，实际重量为2.4mg)
溶解于0.5ml的氯仿中，加入75μl RhPE(0.2摩尔％的磷脂)。
在氮气中干燥样品，同时涡流形成薄膜。在真空下完成干燥1小时。
使脂质在60℃下，在2.0ml HBS(5mM HEPES-145mM NaCl pH7.0)中再次水合以形成MLV。
在60℃下通过2x100nm过滤器挤出以获得LUV(靶标大小为100-120nm)。
磷酸盐测定-稀释到20mM的磷脂。
放入2.0ml的血清瓶中(预先去热源)。
实施例1.1.5：DSPC/PEG2000DSPE(99/1摩尔比)
称量25.8mg DSPC(MW790；lot#C3L006；实际重量为26.1mg)+0.9mg PEG2000DSPE(MW2774；lot#PPE2011809；实际重量为60μl的15mg/ml溶于CHCl3)。
溶解于0.5ml的氯仿中；加入75μl RhPE(0.2摩尔％的磷脂)。
在氮气中干燥样品，同时涡流形成薄膜。在真空下完成干燥1小时。
使脂质在60℃下，在1.5ml HBS(5mM HEPES-145mM NaCl pH7.0)中再次水合以形成MLV。
在60℃下通过2x100nm过滤器挤出以获得LUV(靶标大小为100-120nm)。
磷酸盐测定-稀释到20mM的磷脂。
放入2.0ml的血清瓶中(预先去热源)。
实施例1.1.6：DSPC/PEG2000DSPE(摩尔比95/5)
称量24.8mg DSPC(MW790；lot#C3L006；实际重量为24.6mg)+4.6mg PEG2000DSPE(MW2774；lot#PPE2011809；实际重量为307μl的15mg/ml溶于CHCl3)。
溶解于0.5ml的氯仿中；加入75μl RhPE(0.2摩尔％的磷脂)。
在氮气中干燥样品，同时涡流形成薄膜。在真空下完成干燥1小时。
使脂质在60℃下，在1.5ml HBS(5mMHEPES-145mM NaCl pH7.0)中再次水合以形成MLV。
在60℃下通过2x100nm过滤器挤出以获得LUV(靶标大小为100-120nm)。
磷酸盐测定-稀释到20mM的磷脂。
放入2.0ml的血清瓶中(预先去热源)。
实施例1.1.7：DSPC/DSPG(摩尔比70/30)
称量18.2mg DSPC(MW790；lot#C3L006；实际重量为18.1mg)+7.4mg DSPG(MW745；lot#G3L006；实际重量为7.6mg)
溶解于0.5ml的氯仿/MeOH(9/1，v/v)中；加入75μl RhPE(0.2摩尔％的磷脂)。
在氮气中干燥样品，同时涡流形成薄膜。在真空下完成干燥1小时。
使脂质在60℃下，在2.0ml HBS(5mM HEPES-145mM NaCl pH6.5)中再次水合以形成MLV。
在60℃下通过2x100nm过滤器挤出以获得LUV(靶标大小为100-120nm)。
磷酸盐测定-稀释到20mM的磷脂。
放入2.0ml的血清瓶中(预先去热源)。
实施例1.1.8磷酸盐测定
用水将样品稀释50倍(20μl至1.0ml)，使浓度为0.4mM
将每份稀释的样品等分为3x200μl
根据ACM-010测定磷酸盐。
实施例1.2结果
参见图1A-1F
实施例2脑内递送到啮齿类动物大脑的纳米脂质体化合物的药物学评估
实施例2.1材料和方法
实施例2.1.1试验用品
在该实施例中的实验，使用的是研究级材料-脂质体-拓扑替康(Ls-TPT)和脂质体钆双胺(Ls-GD)。用于游离拓扑替康制剂和Ls-TPT制备的拓扑替康(TPT)是从海正药业(中国浙江泰州)获得的。Ls-TPT由北脂公司提供(Burnaby，BC，Canada)。简言之，脂质体由二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)和胆固醇以7∶2∶1的摩尔比组成，具有75～90nm的靶尺寸。使用内部和外部缓冲液将拓扑替康远距离载入(主动封装)到脂质体中，以响应跨膜pH梯度，所述缓冲液由250mM pH5.5的硫酸铵和5mM的组氨酸，145mM pH6.0的NaCl组成。假设药物包封率为90-95％，浓度为2.0mg/mL和0.67mg/mL的拓扑替康分别对应的药物脂质比例为0.1和0.3(w/w)。在两个制剂中维持恒定的总脂质浓度6.7mg/mL。制作过程如实施例2.1.2详细描述。
用于Ls-GD制剂的钆双胺(GD)从北京SHLHT科学贸易(中国，北京)获得。Ls-GD与Ls-TPT的制备类似，除了钆双胺是被动封装在脂质体中。内部缓冲溶液由520mM pH3.5的钆双胺代替250mM pH5.5的硫酸铵。假设4-6％的包封率，以钆双胺与脂质的比例为0.3(w/w)并且粒经为75～120nm为靶标。最终脂质体制剂和钆双胺的浓度分别为51.1mg/mL和17.0mg/mL。
除非另有说明，Ls-TPT试验用品被冷冻保存(-20～-30℃)。给药溶液给药时新鲜制备并在室温保存。用5mM组氨酸，145mM pH6.0 NaCI，300mM的蔗糖贮备液(Ls-TPT和游离拓扑替康)进行适当稀释，以达到所需浓度。每天给药时使用新鲜瓶子储存试验用品溶液。
实施例212脂质体的制作过程
计算用于批量所需的脂质的量并且将脂质粉末在称量船上称重。以叔丁醇，乙醇和水(45∶45∶10vol/vol)的比例制备溶剂溶液并加热到70℃。同时搅拌，将脂质粉末加入到溶剂溶液中。溶剂维持在70℃并且搅拌直到脂质溶解(1小时)。在这点上，溶液中脂质的浓度为320mg/mL。制备250mM硫酸铵溶液(体积为脂质溶液的9倍)并加热到70℃。当硫酸铵达到所述温度时，将脂质溶液倾倒入硫酸铵溶液中，同时搅拌产生多层囊泡(MLV)。多层囊泡维持在70℃并且通过具有80nm孔径的4层聚碳酸酯叠过滤器挤出。需要两个通道产生所需尺寸(平均直径75～90nm)的大单层囊泡(LUV)。通过QELS测量脂质体的尺寸，接着每个通道通过挤压机。将LUV维持在70℃直到其减少到所需尺寸，然后用pH6.0的组氨酸盐缓冲液将其稀释到浓度为5％的溶剂，因为LUV在低于相变温度-55℃，浓度为10％的溶剂中不稳定。然后通过超过滤作用使LUV重新浓缩到总脂质为50mg/mL，随后用10倍洗涤体积的10mM组氨酸，145mM Nacl缓冲液渗滤以除去溶剂并使外部的缓冲液从硫酸铵更换为pH6.0的组氨酸缓冲液。这种缓冲液的更换导致跨膜pH梯度的产生，其用于将拓扑替康载入到制备好的脂质体中。然后通过磷酸分析测定总脂质浓度。在测定脂质总量后，要求拓扑替康的量达到药物脂质比例为0∶1∶1或0∶3∶1(w/w)，通过分别乘以0.1和0.3计算脂质总量。为了达到最终的药物脂质比0∶1∶1或0∶3∶1(w/w)，假定装载效率为90％。计算所需的拓扑替康的总量后，将粉末称重加入到一个干净的瓶子中。将LUV悬浮液加热到60℃并加入拓扑替康粉末。拓扑替康装载60分钟后添加药物以确保脂质体中的最佳装载。在随后的药物装载中，未胶囊化的拓扑替康通过使用5倍洗涤体积的5mM组氨酸，300mM pH6.0的蔗糖缓冲液渗滤移除。该步骤也用于将外部缓冲液从NaCl溶液更换为蔗糖溶液，所述蔗糖溶液作为冷冻保护剂使用并允许制剂在不改变物理性质的情况下将其冷冻。该阶段估计的脂质含量为8.3mg/mL(药物脂质比为0.3∶1)。将制剂加热到50℃，用0.2μm注射器过滤后，将产物装瓶。最后将产物冷冻，完成该制作过程。
实施例2.1.3动物与分组
使用重250～350克的成年雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan，Indianapolis，IN)(批次120806和120806)。
用于制剂筛选组分，此实施例根据Ls-TPT制剂或游离拓扑替康将实验动物分成四组，如表1所列。
表1制剂筛选的分组和剂量
Figure BDA0000069734650000221
Figure BDA0000069734650000231
F1：DSPC/Chol 0.1药物脂质比，浓度为0.5mg/mL Ls-TPT+浓度为1.15mg/mL Ls-GD的混合液
F2：DSPC/DSPG/Chol 0.3药物脂质比，浓度为0.5mg/mL Ls-TPT+浓度为1.15mg/mL Ls-GD的混合液
F3：DSPC/DSPG/Chol 0.1药物脂质比，浓度为0.5mg/mL Ls-TPT+浓度为1.15mg/mL Ls-GD的混合液
F4：浓度为0.5mg/mL的游离拓扑替康
DSPC/DSPG＝二硬脂酰磷脂酰胆碱/二硬脂酰磷脂酰甘油
Chol＝胆固醇
DL比＝药物脂质比(w/w)
Ls-TPT＝脂质体拓扑替康
Ls-GD＝脂质体钆双胺
将大鼠根据体重分配到各组，在某种意义上能够达到对照组平均体重和标准变差的目的。然后将各组随机分配进行处理和时间点。
实施例2.1.4手术步骤
使大鼠吸入异氟烷(先用5％诱导，在手术过程中再用2.5～3％维持)或腹膜内注射克他命(60mg/kg)与甲苯噻嗪(8mg/kg)的组合物进行麻醉。削去其颅骨上皮，将其置入一个立体定位框架中，用耳棒和门牙棒将其头部固定。手术全程使用无菌技术。先后用70％的酒精和聚烯吡酮磺溶液对皮肤进行消毒。将颅骨顶部皮肤纵切，使用钝切将遍布在颅骨上的结缔组织移除。使用具有直径1-mm的毛刺孔，前部0.5mm距前囟左右各3mm的小型电牙钻进行颅骨切除手术。将一个与自动泵(BASi，lnc，West Lafayette，IN)连结的熔融二氧化硅套管(外径168μm，内径102μm)(PolyMicroTechnologies，Phoenix，AZ)用于CED，并将其降至适当的背腹坐标位置(-4.5～-5mm，齿列-3.3mm)。背腹坐标根据软膜表面来估算。将套管插入27号针头中，该针头与10-μL汉密尔顿注射器相连，并用强力胶固定在管壁上。将试验用品从一侧双向注入到每个纹状体中。在此过程中逐步增加输液速度，依次为0.2μL/分钟(15mm)、0.5μL/分钟(10mm)和0.8μL/分钟(15mm)，最终使每个大脑半球的输入剂量为20μL。输液完毕后，将套管保持原位5分钟，尽可能减少输液外流，之后再缓慢拔出。
程序完成后，接下来使大鼠处于不通风的环境中，并通过加热灯或水袋或其它合适的保温方法进行保温并在麻醉恢复期进行监视。根据需要皮下给药丁丙诺啡。允许大鼠在将其送回它们的笼子之前在程序室里进行恢复。
实施例2.1.5组织收集和处理
在指定的时间点，使用异氟烷(2.5％)麻醉动物，接着心内灌注0.9％的生理盐水。
在尸体和肌肉/骨骼系统进行研究期间，对发现的死亡或处死(预期和非预期的)的动物进行完整的总体尸检，所有的外表面和开口，大脑的颅腔和外表面，与颈部相关的器官和组织，胸部、腹部和盆腔及其相关的器官和组织。
将大脑除去，置于冰上，使用背部途径解剖纹状体，并且将组织在液氮中冷冻。随后将组织用等体积的水(1∶1v/v)均匀化，然后用甲醇提取并在-70℃下储存，直到收集运送到受体的尾静脉血(1.0mL)，其用于该实施例的配方组织和血浆动力学组分。
实施例2.1.6高效液相色谱法
Northern Lipids公司(Burnaby，BC，Canada)使用等强度反相HPLC/UV方法在大脑组织和血浆中进行总拓扑替康(游离的和脂质体包封的)的高效液相色谱(HPLC)。方法的详细说明如下所述。简言之，将动物(n＝3)分别在1和6小时，2、4和7天进行处死。将大脑除去，置于冰上，使用背部途径解剖纹状体，并且将组织在液氮中冷冻。随后加入等体积冰水(1∶1 v/v)，并使解冻的组织机械地均匀化(Biospec)2分钟并冷冻。将冷冻的匀浆运入NLI中用于分析。将200μL解冻的样品转移到含有800μL冷甲醇的Eppendorf管中，以12,000rpm离心2～5分钟。将200μL上清液置于自动进样瓶中，用于即时分析(或直到分析前储存在-70℃，至多3个月)，NorthernLipids公司(Burnaby，BC，Canada)通过使用通过验证的反相HPLC方法用于高效液相色谱(HPLC)分析。对于TPT，标样利用甲醇∶水∶三氟乙酸(40∶60∶0.02)的比例新鲜制备内酯形式，20mM硼酸盐缓冲液∶甲醇(60∶40)的比例新鲜制备羧化物形式。在Waters2690/5分离模块和授权软件的HPLC系统上使用C18反相硅胶柱[Phenomenex公司Luna C-18(2)柱，内径为250mmx4.6mm，粒径为5μm，室温下]，在C18保护管外管(Phenomenex公司，4x3.0mm)下进行分析。在5±3℃下将样品置于自动进样托盘中，使用的样品注射体积为30～50μL，用移动相以1.0mL/min的流速洗脱柱体，所述移动相包括移动相A：3％三乙酸乙胺缓冲溶液，pH5.5，(TEAA)和移动相B：乙腈：3％TEAA(50∶50)。梯度洗脱最初在5分钟内78∶22 A∶B到50∶50A∶B，维持在分钟，在0.5分钟内返回初始，总运行时间为15分钟。通过Waters 2475多λ荧光检测仪(380nm处激发，520nm处发射)测定拓扑替康。拓扑替康羧化物形式和内酯形式的典型保留时间分别为5.5和7.5分钟。这个方法在0.8～240ng/mL范围内具有很好的灵敏性和线性。TPT提取方法的回收系数为0.9。
实施例2.1.7早期死亡/非预期处死
如果动物在研究中死亡，尽可能准确地估计其死亡时间并记录，且尽快进行尸检。如果不能立即进行尸检，将动物冷藏(不是冷冻)以减少组织自溶。尸检应在死亡后12小时内进行。
如果动物出现不良健康状况或在濒死之际，将其进行安乐死。如果情况允许，可收集血液或其他样本进行适当研究(如临床病理学参数)来找出不适/病态的原因。
实施例2.1.8统计方法
用于连续数据(氮，均值和标准差)和分类数据(N，％)的描述性统计数字，在适当情况下同时以表格和图表示出。利用WinNonlin5.0(PharsightCorporation，Mountain View，CA，USA)通过不间断的药物动力学数据测定药物动力学(PK)参数，所述参数包括组织药物的半衰期(t1/2)、清除率(CL)、脑中平均滞留时间(MRT)以及浓度-时间曲线下面积(AUC)。
实施例2.1.9动物护理
每只动物通过编号的耳标和笼卡进行分辨。一旦到达试验装置后，在进行研究过程之前使研究动物适应它们的屋舍最少3天。在整个研究中，每天至少对在笼子中，由饲养员常规饲养的动物观察一次。观察每只动物一般外观健康的改变。任何疾病迹象要立即向主治兽医和研究负责人报告。
在注入药物和在第2、4、7和10天计划处死之前称量体重。
饲养员对每只动物每日的进食量进行评估，从手术进行之前的那天开始直到处死。进食量通过每日食物剩余量进行目测评估。将断食或脱水的迹象报告给主治兽医和研究人员，并采取适当的行动。
实施例2.2结果
实施例2.2.1偏差
使用两个批次的动物(批次120806和010507)进行研究。执行6小时、2天、4天和7天时间点后动物被处死，在一些不同时间点处死的动物中，在心内灌注时的总体尸检观察到心脏扩大症。为了确定观察到的心脏扩大是与试验用品还是与动物批次/品系有关，在1小时的时间点上，使用不同批次(批次010507)的动物，并且将来自最初批次(批次120806)的15只动物用作对照。对照组不进行任何手术或者不接受任何试验用品。
实施例2.2.2制剂筛选药物动力学
将用于该研究组分的计划数量(60)的动物检测。在基线和处死时间点之间没有观察到显著的重量减轻(≥10％)，其中在处死之前(第2天、第4天和第7天)进行重量评估。在1小时时间点上的4只动物被替换，两只死于麻醉，一只在试验药品灌注(制剂3)过程中苏醒且必须使其安乐死，一只动物在毛刺钻孔期间呼吸停止。在进行总体尸检时，没有动物显示了结果。在6小时时间点没有动物被替换。一只动物在第2天的时间点上死于麻醉且必须使其安乐死。一只动物在第4天的时间点上被替换，因为其被作为对照动物被错误地处死(注入制剂3后3天)。在第7天的时间点上有3只动物被替换，因为他们被注入了没有正确制备的制剂1并且因此不能包含在分析中。除了在1小时时间点上接受制剂4注入的一只动物外，注入无重大事故，在这次注入中，观察到注入系统在27分到40分钟期间泄露。如实施例2.2.1所描述，总共15只动物作为对照，并且其不经受任何实验。在表3中可以找到动物的处置概况。
表3动物的处置概况
Figure BDA0000069734650000271
F1：DSPC/Chol 0.1药物脂质比，浓度为0.5mg/mL Ls-TPT+浓度为1.15mg/mL Ls-GD的混合液
F2：DSPC/DSPG/Chol 0.3药物脂质比，浓度为0.5mg/mL Ls-TPT+浓度为1.15mg/mL Ls-GD的混合液
F3：DSPC/DSPG/Chol 0.1药物脂质比，浓度为0.5mg/mL Ls-TPT+浓度为1.15mg/mL Ls-GD的混合液
F4：浓度为0.5mg/mL的游离拓扑替康
DSPC/DSPG＝二硬脂酰磷脂酰胆碱/二硬脂酰磷脂酰甘油
Chol＝胆固醇
DL比＝药物脂质比(w/w)
Ls-TPT＝脂质体拓扑替康
Ls-GD＝脂质体钆双胺
()表示被替换动物的数量
实施例2.2.3脑组织浓度
仅在游离拓扑替康的组中(制剂4)，在第1和第6小时测定拓扑替康脑组织浓度。相反地，在Ls-TPT组中，通过48小时(制剂1)甚至96小时(制剂2和3)才能发现可测量的脑组织浓度。在第7天时，没有制剂具有可检测的水平。在所有的时间点上，制剂2具有最高的组织浓度，除了第96小时以外，在该点上，制剂2和3具有非常低和相似的浓度。可检测的拓扑替康水平被认为反映了用于脂质体制剂1、2和3中的包封的拓扑替康，特别是超过6小时，考虑到游离的拓扑替康的短半衰期。表4总结了通过制剂和时间点的拓扑替康的脑组织浓度。
表4通过制剂和时间点的拓扑替康的脑组织浓度。
Figure BDA0000069734650000272
Figure BDA0000069734650000281
F1：DSPC/Chol 0.1药物脂质比，浓度为0.5mg/mL Ls-TPT+浓度为1.15mg/mL Ls-GD的混合液
F2：DSPC/DSPG/Chol 0.3药物脂质比，浓度为0.5mg/mL Ls-TPT+浓度为1.15mg/mL Ls-GD的混合液
F3：DSPC/DSPG/Chol 0.1药物脂质比，浓度为0.5mg/mL Ls-TPT+浓度为1.15mg/mL Ls-GD的混合液
F4：浓度为0.5mg/mL的游离拓扑替康
DSPC/DSPG＝二硬脂酰磷脂酰胆碱/二硬脂酰磷脂酰甘油
Chol＝胆固醇
DL比＝药物脂质比(w/w)
Ls-TPT＝脂质体拓扑替康
Ls-GD＝脂质体钆双胺
实施例2.2.4浓度时间的变量
如图2所示，DSPC/DSPG/Chol0.3药物脂质比的拓扑替康的纳米脂质体制剂达到了最高的脑组织浓度，而另外的两种制剂与游离的拓扑替康类似。在起初96小时内，DSPC/DSPG/Chol0.3药物脂质比的拓扑替康的纳米脂质体制剂的脑组织浓度测定为1.24-146.4μM。在表5中列出了药物动力学(PK)参数，包括组织中用于每种制剂的药物半衰期、CL、脑中的MRT和AUC。谨慎地对PK参数进行解释，因为没有足够的浓度点(至少3个浓度在终端)来充分计算回归(WinNonlin分析，单独的附件)。由于数量有限的数据点(每个数据点需要处死3只动物)，除了AUC以外，无法计算有意义的PK变量。与DSPC/Chol 0.1和DSPC/DSPG/Chol 0.1(分别为38.27和68.21μg·天/g)以及游离的拓扑替康(5.5μg·天/g)相比，DSPC/DSPG/Chol0.3药物脂质比制剂的AUC(0-末端)明显较大。所有的纳米脂质体制剂在一天的时间范围内出现半衰期，而游离拓扑替康的半衰期更短。基于这些结果，选择Ls-TPT制剂2(DSPC/DSPG/Chol 0.3 D.L比)用于进一步研究。
表5在正常的脑组织中Ls-TPT制剂和游离拓扑替康的药物动力学。
实施例2.3：讨论
在实施例2中的研究评估了在大鼠正常大脑组织中的药物动力学特征，组合药物递送方法比较了通过脑内CED的3种新型的Ls-TPT制剂和游离拓扑替康。在评估的3种纳米脂质体制剂中，制剂2，具有药物脂质比0.3的DSPC/DSPG/Chol和0.5mg/mL浓度的拓扑替康，被测定为具有最佳的脑内药物动力学特征，其AUC(0-末端)为153.8μg·天/g，并且半衰期大约为1天。
Ls-TPT制剂2(具有药物脂质比0.3的DSPC/DSPG/Chol)的AUC和半衰期远远超过了游离的拓扑替康，这表明脂质体具有更长的药物释放动力学，所述释放动力学是CED递送中必要的特征。Ls-TPT制剂2中观察到的更好的药物动力学特征可能同样与更好的药物释放特征与从脂质体中缓慢释放活性药物有关。
为了使Ls-TPT制剂2的药物动力学特征可见，将本实验中发现的拓扑替康浓度与之前体外研究的数据进行比较。在第6、48和96小时(分别为108.8、31.25和1.24μM)的浓度远高于50％的抑菌浓度(IC50)(各种恶性胶质瘤细胞系，暴露超过1、24、72和120小时，浓度分别为2.4、0.038、0.28、0.02μM)(Marchesini 1996，Pollina 1998，Schmidt 2001)。因此，有坚实的基础认为Ls-TPT制剂2在体内超过至少96小时提供了足够的拓扑替康细胞组织浓度。
实施例2.4：结论
具有药物脂质比0.3的DSPC/DSPG/Chol和0.5mg/mL浓度的拓扑替康的制剂2被测定为具有最佳的脑内药物动力学特征。
实施例3：通过CED递送到裸鼠纹状体的罗丹明脂质体的对流能力
实施例3.1：材料和方法
在该研究中使用了9只大鼠。通过CED注入将罗丹明脂质体(DSPC/DSPG/Chol，摩尔比70∶20∶10)和0.5摩尔百分比的罗丹明PE双向递送到大鼠纹状体中。使用组氨酸/生理盐水缓冲液制备罗丹明脂质体的稀释液并加入蔗糖以使最终蔗糖浓度达到根据表7的3mM、15mM和75mM。
表7
Figure BDA0000069734650000301
对于CED，硅胶管连接到用于CED的自动泵上，并低于恰当的腹坐标(AP＝+0.5mm；ML＝3.0mm；DV＝-4.5至-5mm具有在-3.3mm的牙齿棒)。试验用品被双侧注入到每个纹状体的一个位点。在该研究中使用的注入速率达到20μL剂量每半球，0.2μL/min(15min)+0.5μL/min(10min)+0.8μL/min(15min)。在CED递送后，立即处死大鼠。移除大脑并且将大脑分成左半球和右半球。大脑右半球冷冻在-60℃的干冰/异戊烷中并且在进行组织学分析之前储存在-80℃，24小时。将每只动物的大脑左半球储存在-80℃用于接下来由Northern Lipids公司进行的分析。
每只大鼠的大脑右半球被切成20微米的切片，并且每10个通过纹状体的切片都放到载玻片上。对切片进行拍照并且使用NIH图像计算在纹状体中的分布容积。在纹状体外侧出现的罗丹明荧光不包含在本次分析中。将组织学切片送到加州大学旧金山分校用于Vd分析。从每只大鼠大脑左半球获得的组织将被送到Northern Lipids以测定提取效率。
实施例3.2：结果
在所有接受CED注入的大鼠中都检测到罗丹明荧光。在所有的大鼠中，标记分布在纹状体中。一些大鼠在脑胼胝体和内囊纤维痕迹中显示了强烈的标记(数据未示出)。表8示出了在蔗糖浓度为3mM，15mM和75mM时，对于每只大鼠的分布容积(Vd)。由于CED管材的技术问题，三只大鼠被双侧注入40uL的罗丹明脂质体到每个纹状体中(阴影面积)而不是注入20uL到每个纹状体中。这些大鼠不包含在分析中。在75mM组中的一只动物死于手术中(在第5分钟)且也不包含在分析中。该动物进行连续注入，然而脂质体从位点挤出，接着动物死亡，而且脂质体没有分布在实质中。
表8
无论在40uL还是20uL注入体积的蔗糖浓度(表9)，在所有接受CED的大鼠中都检测到罗丹明荧光。在所有组中的平均分布体积是12.6～24.9mm3.
表9
Figure BDA0000069734650000312
相比于3mM的最终蔗糖浓度(图3)，15mM最终蔗糖浓度示出了大于其2倍的分布容积。由于组的规模小，在本实验中并没有确定蔗糖浓度的统计学对照组。
数据表明在脂质体制剂中改变蔗糖浓度不影响CED使脂质体分布在大鼠实质中的能力。在本研究中样品的数量并没有充分进行不同蔗糖浓度对分布容积，随着罗丹明脂质体的CED递送到大鼠纹状体的统计学分析。
使用不同的脂质体组合物的罗丹明装载的脂质体的以前的数据(图4)表明分布容积类似于本研究中所获得的范围。
在本研究中，在所有蔗糖浓度下，每个半球接受20μL脂质体的大鼠中分布容积的范围是11.7～26.6mm3。在图4中示出的数据表明制剂1～6的分布容积在相似的范围内。尽管在图4中没有脂质体制剂与本研究使用的制剂一致的，但是数据表明，在该过程中的高度的变异性可能与注入过程中的技术方面有关。此外，脂质体分布到大鼠中的临近结构和接近于纹状体的纤维束，可能解释在两个研究中出现的群组差异，因为在纹状体区域外的脂质体分布并不包含在Vd计算中。
表10各种制剂的分布容积(见图4)
  制剂   1   2   3   4   5   6   7
  左   右   左   右   左   右   左
  #1   23.5   19.7   #2   na   21.3  #8   na   11.6  #7   na
  #3   16.4   31.7   #4   23.9   25.6  #10   na   43.5  #9   na
  #5   26.1   29.6   #6   36.8   37.9  #12   28.2   31.2  #11   16.8
  平均值   22.0   27.0   30.3   28.3   28.2   28.8   16.8
  Sd   5.0   6.5   9.1   8.6   na   16.1   na
  Sem   3.6   4.6   6.5   6.1   na   11.5   na
这些数据在图4中示出。在顶行的数字分别对应于图4中的棒1-7。每个的动物用“#1-12”表示。用不同的制剂获得分布容积的实际值。
实施例4纳米脂质体复合物脑内递送到幼鼠大脑的药物评估和纳米脂质体复合物脑内递送到成年无胸腺鼠的移植肿瘤的效率
实施例4.1材料
实施例4.1.1试验用品
如实施例1.1和1.2所示制备Ls-TPT和Ls-GD动物实验规范级材料。
实施例4.1.2动物与分组
使用6-8周、200-275g的成年雄性无胸腺鼠rnu/rnu((Charles RiverLaboratories，Wilmington，MA，批次5226156/032607)。动物如表11所列分为4组。
表11：分组与剂量
Figure BDA0000069734650000331
在研究开始时，根据体重将大鼠分配到制剂组和组织组，从而得到对照组的平均体重和标准偏差。然后组随机地分配治疗方案。在肿瘤移植后第8天进行单倍处理并在肿瘤移植后的8和12天进行双倍处理。
实施例4.1.3：手术步骤和治疗
实施例4.1.3.1颅内移植异种肿瘤
使用标准的立体定位程序在右侧纹状体单方面地移植U87MG肿瘤细胞(人脑胶质瘤细胞；Perry Scientific Inc，San Diego，CA，lotW5051507U87MC)。使用立体定位技术和异氟烷(2.5％)麻醉。大鼠被置入一个立体定位框架中，使用耳棒和门牙棒将其头部固定。手术全程使用无菌技术。使用聚烯吡酮磺溶液对皮肤进行消毒。将颅骨顶部皮肤纵切，使用钝切将遍布在颅骨上的结缔组织移除。钻打了距离前顶前段0.5mm，两侧30mm的毛刺孔。使用30规格25μL Hamilton注射器将U87MG细胞立体定位地注入纹状体，使用适当的背腹坐标位置(-4.5～-5mm，齿列-3.3mm)。在10分钟内将含有大约5.0X105个细胞总量的总体积10μL注入到动物的右侧纹状体中。在不同的2天内完成肿瘤移植，因为计划的动物数量不允许在单独一天完成所有的实验。因此，制备2个单独的肿瘤悬浮液。
接种后，皮肤被固定。大鼠在麻醉恢复期间被监控。丁丙诺啡在程序结束前被皮下(SC)给药，然后根据需要皮下给药丁丙诺啡。肿瘤细胞移植后，每日监测大鼠两次。期望的移植后的存活期为0～60天，其中动物被麻醉并获得大脑。
实施例4.1.3.2治疗
用异氟烷(2.5％)进行麻醉。使用带有钝耳棒的立体定位框架通过之前进行的钻孔完成CED。只有血液凝块被移除。通过CED使用位于右侧纹状体中的肿瘤移植位点的套管进行给药。将一个与自动泵(BASi，lnc，WestLafayette，IN)连结的熔融二氧化硅套管(外径168μm，内径102μm)(PolyMicro Technologies，Phoenix，AZ)用于CED，并将其降至适当的背腹坐标位置(-4.5～-5mm，齿列-3.3mm)。根据软膜表面来估算背腹坐标。将套管插入27号针头中，并用强力胶固定在管壁上。使用逐步增加的输液速度注射。本研究中使用的输液速度为0.2μL/分钟(15mm)，05μL/分钟(10mm)，08μL/分钟(15mm)，每次治疗达到20μL的总输液量(Vi)。输液完成后，将套管原位保持5分钟以减少输液流出，然后再缓慢拔出。
程序完成后，接下来使大鼠处于不通风的环境中，并通过加热灯或水袋或其它合适的保温方法进行保温并在麻醉恢复期进行监视。根据需要皮下给药丁丙诺啡。允许大鼠在将其送回它们的笼子之前在程序室里进行恢复。
实施例4.1.4第60天之前的安乐死标准
如果观察到下列症状(鼻/眼周出血、麻痹、驼背、迟钝或不进食或修饰或重量减轻＞15％基线体重)的任何一个或其组合则将动物进行安乐死。除了丁丙诺啡，同样给出了例如美洛昔康或者酮咯酸的非甾体抗炎药。如果在48小时内动物并没有显示出改善的迹象，则它们将按照实施例4.1.5所述进行安乐死。
实施例4.1.5组织收集和处理
在各自的存活期末端或在第60天，使动物吸入异氟烷(2.5％)麻醉，然后心脏内灌注PBS，接着灌注4％仲甲醛。
在尸体和肌肉/骨骼系统进行研究期间，对发现的死亡或处死(预期和非预期的)动物进行完整的总体尸检，所有的外表面和开口，大脑的颅腔和外表面，与颈部相关的器官和组织，胸部、腹部和盆腔及其相关的器官和组织。
主要的器官收集并储存在10％的福尔马林中。移除大脑并置于4％仲甲醛中过夜然后在30％的蔗糖中使相平衡。然后将大脑冷冻并保存在-70℃。
实施例4.1.6生命周期观察和测量
在整个驯化和研究期间，每天至少进行一次临床观察和测量。临床观察结果如表12所示。
表12 临床观察与测量
Figure BDA0000069734650000351
实施例4.1.7早期死亡/非预期处死
如果动物在研究中死亡，尽可能准确地估计其死亡时间并记录，且尽快进行尸检。如果不能立即进行尸检，将动物冷藏(不是冷冻)以减少组织自溶。尸检应在死亡后12小时内进行。
如果动物出现不良健康状况或在濒死之际，将其进行安乐死。如果情况允许，可收集血液或其他样本进行适当研究(如临床病理学参数)来找出不适/病态的原因。
实施例4.1.8统计方法
用于存活率分析的目的，动物通过治疗臂进行分组。此外，在最高拓扑替康总剂量组(组2)中的动物比较于所有其它治疗臂的组，包括对照组。如下所述，后者的分组过程同样在近似U87MG细胞装载的组内进行。由于实验动物在不同的两天内被分别注入两种肿瘤细胞悬浮液，但并未在植入手术前进行细胞计数，因此植入的U87MG细胞量可能存在潜在变化。考虑到这一点，应对治疗组进行肿瘤细胞悬浮液分析，从而根据植入手术后的细胞量，间接估算出手术时U87MG细胞装载量的近似值(参见实施例4.2.1)。在不同的组中使用数阶测试比较存活率。
实施例4.1.9动物护理
每只动物都通过耳标编号确定。每个，每只动物的笼子都通过一个卡片确定，卡片上列有动物识别号码、研究号码、组、来源、到达日期、品种/品系、动物的出生日期和性别。
这些动物被单独安置在隔离笼中以使它们不干扰彼此的伤口。在研究报告中记录动物所在房间。在相同的房间内没有其它的物种。房间用100％的新鲜空气(没有再循环的空气)良好通风(每小时大于10次空气交换)。保持12小时光照/12小时黑暗的光照周期，除了必须打开房灯在暗周期采集血液样本或进行其它程序。房间的温度维持在18～26℃。
除了禁食阶段，动物可随意地获得Prolab RMH 2500。已知在饮食水平上没有污染能够干扰本研究的结果。通过水瓶，每只动物可以随意的获得氯化的市政自来水。每年的水质量检测报告保存在PSI档案中。在开始研究过程之前使所有研究动物适应它们指定的房间至少3天。
实施例4.2结果
实施例4.2.1协议偏差
植入后细胞计数显示，植入的U87MG肿瘤细胞的实际数量明显高于协议规定的。此外，制备的两种悬浮液中的肿瘤细胞密度差异明显。具体地，两种悬浮液中的植入后细胞计数为每10μL中6.8X105和9.7X105个细胞，相较于协议规定的5.0X105个。所观察到的差异大概是由于悬浮液制备和细胞计数间的细胞增长。可以想象，各自的植入后计数可能因此被降低且差异变小，但似乎不太可能更接近协议规定的数字。为了解释结果分析中的差异，通过近似的植入肿瘤的U87MG细胞负荷分析治疗组，基于如实施例4.1.8所述的植入后细胞计数。
当被发现死于笼中时，4个肿瘤植入动物之有部分尸检或无全部尸检。其中3只动物只进行大脑检查，而一只动物不进行任何器官检查。
实施例4.2.2临床观察和测量
4只动物，2个分配到组1，一只分配到组3，另一只分配到组4，在肿瘤植入前死亡可能与程序中进行的麻醉有关。在肿瘤植入组中(29只动物)，发现4只动物在研究期间死于笼中。一只动物分配到组1，一只分配到组2，两只分配到组4。分配到组4的两只动物具有高植入的肿瘤细胞负荷，而其他动物具有低肿瘤细胞负荷。另外使25只动物安乐死因为其出现不良健康状况，最常见的症状是绝大多数动物体重下降＞15％、嗜睡、驼背姿势、运动障碍、颤抖和呼吸困难。
实施例4.2.3疗效
每组有8只动物被治疗，除了对照组只有5只动物被治疗，因为4只动物死于麻醉，其余的动物被重新分配到各治疗组以使每个活性治疗组有8只动物。表13列出了每只动物的个体存活期和每个治疗组的平均存活率。
表13  个体、治疗组和总存活期
Figure BDA0000069734650000371
图5示出了治疗组的存活期，显示了第2组(0.5mg/mL双剂量剂量)治疗的动物存活期较长，虽然统计学上的Log-rank检验(0.5mg/mL双剂量剂量与对照组，p＝0.0724；0.5mg/mL双剂量与0.1mg/mL双剂量，p＝0.0593；0.5mg/mL双剂量与0.5mg/mL单剂量，p＝0.0742)不明显。第2组的平均存活期是21天。
图6示出了与组2(0.5mg/mL双剂量)相比较，组合治疗组(1，3，4)的存活期。观察到与组合组相比，组2治疗的动物在最高的Ls-TPT拓扑替康总剂量的存活期更长，其统计学上的Log-rank检验(p＝0.0112)明显。观察到组2与组合组1、3和4的存活期分别为21天和17天。
表14示出了低U87MG细胞负荷(6.8 X 105个细胞)和高U87MG细胞负荷(9.7X105个细胞)的存活期(所有治疗组的组合)，如每只动物的个体存活期和植入细胞负荷组的平均存活期，及图7中的总存活期。受到肿瘤植入高细胞负荷的动物存活期较短，为16天，而受到低细胞负荷的动物存活期为19天，尽管存活曲线趋向存活期末端(可能由于数字较小)。
表14 肿瘤植入U87MG细胞负荷的存活期
Figure BDA0000069734650000382
Figure BDA0000069734650000391
图8示出了在低U87MG细胞负荷(6.8X105个细胞)的动物中组合组(1，3，4)与组2(0.5mg/mL双剂量)相比较的存活期。观察到与组合组相比，组2治疗的动物在最高的Ls-TPT拓扑替康总剂量的存活期更长，虽然统计学上的Log-rank检验(p＝0.0646)不明显。
图9示出在高U87MG细胞负荷(9.7X105个细胞)的动物中组合组(1，3，4)与组2(0.5mg/mL双剂量)相比较的存活期。同样，观察到与组合组相比，组2治疗的动物在最高的Ls-TPT拓扑替康总剂量的存活期更长，虽然统计学上的Log-rank检验(p＝0.1176)不明显。
实施例4.3讨论
实施例4中公开的研究评估了使用新型Ls-TPT制剂的组合药物递送方法的疗效，Ls-TPT制剂通过脑内CED递送到无胸腺大鼠的颅内胶质瘤移植瘤模型。该实施例使用2个剂量水平，一个之前通过另一组被报道为是安全的，0.5mg/mL(Saito 2006)，另一个较低的为0.1mg/mL。此外，对两种给药方式进行评估，由于目前只对单向给药研究过，因此采取先单向给药0.5mg/mL，再双向给药，4天后，分别对两种给药剂量水平比较研究。
观察到，与其他组相比较，在最高的Ls-TPT拓扑替康总剂量的总存活期和平均存活期更长，单独地(统计学上不明显)或组合地(统计学上明显)。当比较总剂量占剂量水平和剂量数的比例时还观察到剂量依赖效应。
实施例4.4结论
在使用U87MG的大鼠脑胶质瘤模型中的探素性疗效研究的结果说明，通过CED给药的Ls-TPT在评估的最高剂量水平(0.5mg/mL双剂量)产生存活优势。
实施例5拓扑替康和脂质体拓扑替康对U87MG细胞的毒性
实施例5.1材料和方法
实施例5.1.1试验用品
从葛兰素史克(Research Triangle Park，NC)和海正药业(Taizhou City，Zhejiang，China)获得游离的拓扑替康制剂。
从海正药业(Taizhou City，Zhejiang，China)获得用于制备GLP级Ls-TPT制剂的拓扑替康。简言之，脂质体由摩尔比例为7∶2∶1的二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)和胆固醇组成，靶标大小为75～90nm。拓扑替康被远距离装载(主动包封)于脂质体中，以通过内部和外部缓冲溶液响应跨膜pH梯度，缓冲溶液由pH5.5的250mM硫酸铵和pH6.0的10mM组氨酸/145mM氯化钠组成。假设药物包封率为90～95％，靶定了浓度为2.0mg/mL的拓扑替康和0.3(w/w)的药物脂质比例。
用于Ls-GD制备的钆双胺从Estech Pharma，Ansan-Si，Gyeonggi-Do，Korea获得。GLP级Ls-GD与topoCED制备方法相似，除了GD是被动包封于纳米脂质体通过渗滤移除非包封GD和溶剂后，GD的最终包封率大于90％。目标GD含量为5.0mg/mL±10％且粒径为75～120nm。
Ls-TPT和的Ls-GD的试验用品分别被冷冻保存(-20～-30℃)和冷藏保存(2～8℃)，且避光保存。在给药当天现制备给药溶液，并在室温下保存。用5mM组氨酸、pH6.0 145mM NaCl、300mM蔗糖或0.9％的生理盐水将试验用品的贮备液进行适当稀释以使试验溶液在所需的试验体积下获得适当浓度。
实施例5.1.2细胞系与培养
所有实验都使用U87MG人脑胶质瘤细胞系(UCSF culture facility，SanFrancisco，CA)。细胞被置于T175 Falcon培养瓶(BD Bioscience，San Jose，CA)。细胞被保存在完全基本成分培养基(CMEM)，由伊格尔氏基本成分培养基，并增补添加10％胎牛血清、非必需氨基酸和抗生素(100μg/mL链霉素，100U/mL青霉素)组成。所有培养基组分都来自于UCSF细胞培养设施。在37℃温室及5％CO2进行培养。一旦完成95％的融合，细胞简单地受0.05％胰蛋白酶-0.02％乙二胺四甲叉膦酸-乙酸(UCSF culture facility，SanFrancisco，CA)的胰蛋白酶作用，并将细胞500Xg离心10分钟。吸出上清液后，将细胞在5ml完全细胞生长培养基(具有抗生素和10％胎牛血清)中重悬浮。在血细胞(Hausser Scientific，Horsham，PA)中使用锥虫蓝进行细胞计数。加入合适数量的完全细胞生长培养基以使细胞的最终浓度达到100μL中含有10,000细胞，用于96-孔板的每孔中转移，96-孔板被设计用于荧光细胞活性检测(CellTiter-GloTM，Promega，Madison，Wl)。在未暴露于试验用品前，允许细胞连接24小时。使用12管多通道移液器向96孔板加入100μL试验用品前，移除培养基。在暴露于试验用品后，在24、48和72小时进行细胞毒性试验。每个试验用品和对照组的所有时间点都试验重复3次。
实施例5.1.3实验设计
表15列出了根据对照组评估的不同试验用品和浓度。
表15 试验用品和实验设计
Figure BDA0000069734650000411
所有试验用品的计算和稀释都通过二次检测被证实。试验用品稀释液与用于U87MG培养的培养基一起执行本试验。
实施例5.1.4存活力分析
该分析基于存在的ATP的量化，使用荧光素酶的耐热形式作为细胞代谢活跃细胞的指示物。荧光素酶使用荧光素、氧和ATP作为反应底物，产生氧化荧光素，并以光的形式释放能量。产生的光量与存在的ATP量成比例，反应了存活细胞数。在预定的时间点前，在每孔加入20μL的CellTiter-Glo发光的细胞活力检测试剂(Promega，Madison，Wl)以用于该时间点。在温和搅拌平板后，将其放回培养箱中一小时。然后使用FLx800多重检测微酶标仪(Biotek，Winooski，VT)读出平板的荧光数。基于标准曲线，将从每孔中获得的相对荧光单位(RLU)将换成活细胞数。细胞存活分数和IC50值来自于图形推断(Gen 5 Data Analysis Software，Biotek，Winooski，VT)。
实施例5.1.5统计方法
所有的细胞毒性试验都进行三次，并在所有的浓度和时间点剂量平均值。不使用其他统计量。
实施例5.2结果
细胞毒性和不同来源的效力及游离拓扑替康制剂(GlaxoSmithKlineand Hisun Pharmaceutical)和脂质体拓扑替康在可比较的浓度(0.01，0.1，1.0和10μM)和时间点(24、48和72小时)表现相似，证实Ls-TPT制剂的潜在药效。即使200μM高浓度的Ls-GD单独注入或与Ls-TPT共同注入未导致细胞毒性，因此其可能为Ls-TPT成像示踪剂的良好替代物(数据未示出)。本研究中游离拓扑替康和脂质体拓扑替康间的差异普遍缺乏的原因可能是体外环境特征使拓扑替康从脂质体中快速释放，且体内脂质体制剂的药物动力学优势更明显。
实施例6：通过脑内对流增强递送将脂质体拓扑替康和脂质体钆双胺的不同制剂给药到成年无胸腺鼠的正常脑肿瘤和U87MG移植瘤中的对流特征和组织分布
实施例6.1
实施例6.1.1试验用品
如实施例2.1.1和2.1.2所述制备GLP级材料Ls-TPT和Ls-Gd。用于制备Ls-GD的钆双胺取自Estech Pharma，Ansan-Si，Gyeonggi-Do，Korea。Ls-GD与topoCED制备方法相似，除了GD被动地包封于纳米脂质体。通过渗滤移除非包封GD和溶剂后，GD的最终包封率大于90％。目标GD含量为5.0mg/mL±10％且粒径为75～120nm。
使用不同荧光标记Ls-TPT和Ls-GD以区别显微荧光/发光：用码头蓝色-DHPE(1，2-去十六酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺)(Invitrogen，Carlsbad，CA)标记Ls-TPT，罗丹明-PE(磷酸乙醇胺)(Invitrogen，Carlsbad，CA)标记Ls-GD。码头蓝色-DHPE和罗丹明-PE标记的脂质体与Ls-TPT和Ls-GD的制备方法相似，在溶剂溶液基于DSPC∶DSPG∶胆固醇∶荧光基团的摩尔比例为69.7∶20∶10∶0.3时向脂质粉末中加入各自的荧光基团。
Ls-TPT和的Ls-GD的试验用品分别被冷冻保存(-20～-30℃)和冷藏保存(2～8℃)，且避光保存。在给药当天现制备给药溶液，并在室温下保存。用0.9％的生理盐水将试验用品的贮备液进行适当稀释以达到所需的浓度。每天给药时使用新鲜瓶子储存试验用品溶液。这项研究没有使用对照药品。
实施例6.1.2动物与分组
使用6-8周、200～275g的成年雄性无胸腺鼠rnu/rnu(Taconic，Germantown，NY)(批071007和073107)。动物如表16所列分为4组。
表16分组与剂量
Figure BDA0000069734650000431
Figure BDA0000069734650000441
在研究开始时，根据体重将大鼠分配到制剂组和组织组，从而得到对照组的平均体重和标准偏差。制剂组中的动物如果其被分配在幼脑组织组则在第1天接受CED注入，如果其被分配在肿瘤组织组则在第10天接受CED注入。
实施例6.1.3手术步骤和治疗
实施例6.1.3.1颅内移植异种肿瘤
分配到肿瘤组织组的鼠执行这个步骤。人脑胶质瘤细胞(U87MG)在预定接种前两周取自冷冻的细胞储备库(Perry Scientific Inc，San Diego，CA)。在肿瘤接种手术当天收集细胞并将其密度调整到50,000-100,000细胞/μL。在接种当天(第0天)，使用5～10μL悬浮液将总数为500,000的U87MG肿瘤细胞单边地移植到每只大鼠的右侧纹状体。使用立体定位技术和异氟烷(2.5％)麻醉。大鼠被置入一个立体定位框架中，使用耳棒和门牙棒将其头部固定。手术全程使用无菌技术。先后用70％的酒精和聚烯吡酮磺溶液对皮肤进行消毒。将颅骨顶部皮肤纵切，使用钝切将遍布在颅骨上的结缔组织移除。钻打了距离前顶前段0.5mm，两侧3.0mm的毛刺孔。使用30规格25μL Hamilton注射器将U87MG细胞立体定位地注入纹状体，使用适当的背腹坐标位置(-4.5～-5mm，齿列-3.3mm)。根据U87MG悬浮液的最终细胞浓度，将注射体积调整到5-10μL，以确保总数为500,000±25,000的细胞能在10min内被递送。
接种后，皮肤被固定。大鼠在麻醉恢复期间被监控。丁丙诺啡在程序结束前被皮下(SC)给药，然后根据需要皮下给药丁丙诺啡。
实施例6.1.3.2治疗
在研究第1天通过CED注入将试验用品给药于分配到幼脑组织组的大鼠，在第10天给药于分配到肿瘤组织组的大鼠。药剂通过CED双向地给药于幼脑组织组大鼠的背侧纹状体，且使用相同的用于肿瘤移植的坐标位置瘤内给药于肿瘤组织组的大鼠。大鼠被全身性地给药以使所有组的给药时间相似。通过腹膜内注射异氟烷(2.5％)或克他命(90mg/kg)与甲苯噻嗪(12mg/kg)的组合物完成麻醉。使用带有钝耳棒的立体定位框架完成CED。在分配到幼脑组织组的大鼠中，根据5.3.1部分所述制作双边毛刺孔。在分配到肿瘤组织组的大鼠中，头皮切口重新打开以使之前制备的毛刺孔可见。只有血液凝块被移除。将一个与自动泵(BASi，lnc，West Lafayette，IN)连结的熔融二氧化硅套管(OD 168μm，ID 102μm)(PolyMicro Technologies，Phoenix，AZ)用于CED，并将其降至适当的背腹坐标位置(-4.5～-5mm，齿列-3.3mm)。根据软膜表面来估算背腹坐标。将套管插入27号针头中，并用强力胶固定在管壁上。使用逐步增加的输液速度注射。本研究中使用的输液速度为0.2μL/分钟(15mm)，05μL/分钟(10mm)，08μL/分钟(15mm)，每次治疗达到20μL的总输液量(Vi)。输液完成后，将套管原位保持5分钟以减少输液流出，然后再缓慢拔出。程序完成后，使大鼠处于不通风的环境中，并通过加热灯或水袋或其它合适的保温方法进行保温，并在麻醉恢复期进行监视。根据需要皮下给药丁丙诺啡。
实施例6.1.3.3安乐死
所有组的大鼠在第一天(幼脑组织组)或第10天(肿瘤组织组)试验用品CED注射后1小时，全部被安乐死并移除大脑用于组织学分析。至于安乐死，动物被异氟烷(2.5％)深度麻醉，然后心脏内灌注0.9％生理盐水，接着灌注4％仲甲醛(300mL)。
实施例6.1.3.4组织收集和处理
在尸体和肌肉/骨骼系统进行研究期间，对发现的死亡或处死(预期和非预期的)动物进行完整的总体尸检，所有的外表面和开口，大脑的颅腔和外表面，与颈部相关的器官和组织，胸部、腹部和盆腔及其相关的器官和组织。
移除大脑，将其在4％仲甲醛中培养24小时，然后使其在30％蔗糖中平衡。在蔗糖平衡后，组织在-60℃ 下干冰和异戊烷混合物中冷冻，并保存于-70℃用于后续处理。如存在心、肺、肝、肾、脾(或部分)，也将其收集并保存。这些组织被固定于10％福尔马林中性缓冲液中。如果需要，福尔马林固定的组织将用石蜡密封处理用于后续组织病理分析。
实施例6.1.3.5组织病理学分析和分布容积估算
大脑在20微米下被冷冻切片，且每4个切片收集在玻璃载片上，并覆盖Fluoromount-G。Ls-TPT和Ls-GD的对流特征和组织分布都通过荧光显微镜测定，通过Macintosh图像分析系统获得SPOT照相、SPOT软件和Macintosh G4电脑获得的图像，及码头蓝色-DHPE和罗丹明-PE荧光基团的分布容积(Vd)[ImageJ，National Institute of Health(NIH)，Bethesda，MD]。使用NIH图像软件绘制目标区域(ROI)并将分布数据转移到一个Excel电子表格。通过将ROI平均面积(mm2)和分布距离(mm)相乘计算分布容积(mm3)。余下的切片保存在4℃，可能用于其它免疫组织化学分析。
实施例6.1.3.6生命观察和测量
在整个驯化和研究期间，每天至少进行一次临床观察和测量。至少在给药前3天开始笼边观察记录并持续到终止。通常观察每只动物的外观和行为变化。
实施例6.1.3.7早期死亡/非预期处死
受到脑内注射U87MG肿瘤细胞的大鼠的寿命通常为17-25天，且直到死亡前都保持无症状。虽然在本研究的第10天不可能进行早期处死，但如果观察到下列症状(鼻/眼周出血、麻痹、驼背、迟钝或不进食或修饰或重量减轻＞15％基线体重)的任何一个和其组合能将动物进行安乐死。如果可能，收集血液或其他标本并进行适当分析(如用于临床病理参数)以帮助显示不适/病态的原因。
如果动物在研究中死亡，尽可能准确地估计其死亡时间并记录，且尽快进行尸检。如果不能立即进行尸检，将动物冷藏(不是冷冻)以减少组织自溶。尸检应在死亡后12小时内进行。
实施例6.1.3.8统计方法
使用描述性统计(均值和标准偏差)汇总数据并用图表体现。
实施例6.1.4动物护理
每只动物都通过耳标编号确定。每个，每只动物的笼子都通过一个笼子卡片确定，卡片上列有动物识别号码、研究号码、组、来源、到达日期、品种/品系、动物的出生日期和性别。
这些动物被单独安置在隔离笼中。床具材料是修剪的硬木片(Sanichips，Harlan，CA)且每周更换。室温保持在18～26℃(64-79°F)，且相对湿度为30-70％。连续监控温度和湿度并每天记录最低值和最高值。保持12小时光照/12小时黑暗的光照周期，除了必须打开房灯(在暗周期)以调节研究程序。
在研究期间，大鼠可随意地获得照射的Teklad Global 18％蛋白质啮齿动物饮食(Harlan，San Diego，CA，USA)和市政自来水。目前在饮食和水中还未发现对研究结果有不利影响的污染物。每年的水质量检测报告保存在PSI档案中。
到达指定住处后，所有收到初步健康检查合格的大鼠被允许在居住环境(原始围墙和房间)中至少驯化3天，在开始任何动物相关的研究程序之前。在驯化期间，每天监控大鼠的一般健康。只有视觉评价处于良好临床条件(如体重)大鼠才能参与本研究。任何显示异常或不健康迹象(如起皱的表皮、显著低体重)的大鼠都被排除在本研究外。
实施例6.2结果
实施例6.2.1协议偏差
虽然分配到肿瘤组织组的动物具有单边肿瘤移植，但双边(左半球的幼脑组织和右半球的肿瘤组织)进行试验用品的CED。对于所有动物，大脑标本切片厚度更改为20-30μm，每5个切片收集代替了每4个切片收集以增强荧光信号。
实施例6.2.2临床观察和测量
没有动物在本研究中被取代。未发现动物死亡且所有动物都被预期处死。幼脑组织组和肿瘤组织组的所有动物的颅处死检查均正常。
实施例6.2.3对流特征和组织分布
在每组中对治疗时间和计划治疗动物数目一致的14只动物进行治疗。
对于组1和组2(幼脑组织)的各自的分布容积(Vd)及均值和标准偏差，以及Ls-TPT-码头蓝色DHPE和Ls-Gd-罗丹明-PE的Vd的相关系数在表17中示出并在图10中以图表显示，组3和组4(肿瘤组织)的在表18中示出并在图11中以图表显示。使用统计分析系统(SAS)中的CORR程序计算Pearson相关系数。
表17幼脑组织中Ls-TPT-码头蓝色DHPE和Ls-Gd-罗丹明-PE的分布容积
Figure BDA0000069734650000481
#对于动物7643的右脑半球，Ls-TPT和Ls-Gd都未看到荧光信号或荧光信号很弱，可能由于注入障碍或操作错误。
组1：幼脑组织-DSPC/DSPG/Chol D∶L 0.1 0.38mg/mL的Ls-TPT+1.15mg/mL的Ls-GD
组2：幼脑组织-DSPC/DSPG/Chol D∶L 0.3 1.02mg/mL的Ls-TPT+1.15mg/mL的Ls-GD
表18肿瘤组织中Ls-TPT-码头蓝色DHPE和Ls-Gd-罗丹明-PE的分布容积
Figure BDA0000069734650000482
在幼脑组织组中对于两种制剂的Ls-TPT-码头蓝色DHPE的Vd值窄幅波动(对于D∶L 0.1∶1和0.3∶1的各自的均值为39.0±3.0和38.5±5.6mm3)，相应的Vd∶Vi比例为1.9-2.0。相反地，在肿瘤组织组中Vd值明显变小且变化更大，在幼脑组织中两种Ls-TPT制剂的均值为25.8±10.6和21.4±11.9mm3，在肿瘤组织中均值为26.8±2.5和31.2±8.0mm3。相应的Vd∶Vi比例在幼脑组织中为1.1～1.3，在肿瘤组织中为1.3～1.6。虽然在肿瘤组织组中，两种Ls-TPT制剂差别较小，但这些不一致(在幼脑组织中D∶L 0.1∶1的Vd值表面上高于D∶L 0.3∶1，但在肿瘤组织中较低)且统计学上不明显。
Ls-Gd-罗丹明-PE的结果与Ls-TPT-码头蓝色DHPE的结果显著一致。具体地，在幼脑组织组中Vd值均值为39.0±4.2和39.3±5.3mm3，相应的Vd∶Vi比例为1.9-2.0。在肿瘤组织组中，Vd值均值为在幼脑组织中24.0±11.2和22.3±9.2mm3和在肿瘤组织中241±45和322±81mm3。相应的Vd∶Vi比例在幼脑组织为1.1-1.2，在肿瘤组织为1.2-1.6。
与各自的分布结果相一致，在所有治疗组中Ls-TPT-码头蓝色DHPE和Ls-Gd-罗丹明-PE的Vd值均值具有良好相关性(范围为0.95-0.99)，且组织类型(幼脑组织和肿瘤组织)间的相关性无明显差异。
在都接受DSPC/DSPG/Chol D∶L 0.1制剂的三只动物中，在一个脑半球中Ls-TPT-码头蓝色DHPE和Ls-Gd-罗丹明-PE都观察到较弱的荧光信号或无信号。一只动物为幼脑组织组(大鼠#7643)，另外两只动物植入U87移植瘤(肿瘤组织组)，且一个实例发生在移植瘤侧(大鼠#7607)，然而另一个实例发生在非移植侧(大鼠#7633)。所有的实例都可能有注射障碍或操作错误。
实施例6.3讨论
实施例6估算了治疗性纳米脂质体复合物的两种制剂的对流特征和分布容积。
该实施例6评估了两种治疗纳米级脂质体复合物制剂、Ls-TPT和用于Ls-TPT，Ls-Gd的成像显示剂的对流特征和分布容积，该实施例使用不同的荧光基团去共同标记这些脂质体以显示出任何不同的组织分布。
包埋于非聚乙二醇化DSPC/DSPG/Chol脂质体(摩尔比例为7∶2∶1)的拓扑替康和钆双胺在大鼠幼脑组织中可靠地并一致地对流。观察到的Vd∶Vi比例为1.9-2.0，与基于先前公布的聚乙二醇化脂质体制剂的数据的预期相一致(Saito 2004)。重要地，Ls-TPT和Ls-Gd的分布密切相关，而且受Ls-TPT脂质体中药物脂质的比例的影响不明显。这似乎表明，脂质体载体独立于其装载药物，决定复合物的分布特征。
Ls-TPT和Ls-Gd在肿瘤组织中与在幼脑组织中的分布密切相关，但是在肿瘤组织中的实际分布容积和相应的Vd∶Vi比例明显较小。这可能通过CED动力学的改变部分地解释，CED动力学的改变是由于瘤内压力和肿瘤组织的显微解剖。然而，与无肿瘤动物相比，负荷肿瘤大鼠的非移植脑半球的幼脑组织中的Ls-TPT和Ls-GD的分布也被损害。因此，有人提出，由于肿瘤过度生长引起的颅内压增加和组织压缩可能是肿瘤移植动物的肿瘤组织和幼脑组织中降低药物分布的最重要因子。在前面的实验中，由于伴随同侧半球扩大到肿瘤移植和肿瘤凸出通过套管轨道伴随质量效应的大量肿瘤生长这一点得到证明(参见实施例4)。
通常地，在肿瘤组织组中的药物分布比在幼脑组织组中更具变化性。同样，这可通过变化的流体动力学和增加的颅内压解释。在肿瘤移植动物中两种Ls-TPT制剂间的微小分布差异是不一致的(在幼脑组织中D∶L 0.1∶1的Vd值表面上高于D∶L 0.3∶1，但在肿瘤组织中较低)且通过两个肿瘤组织组间Ls-GD观察到的相似差异反映。值是的差异与脂质体制剂不可能相关。
3只动物的幼脑组织或肿瘤组织中无荧光或极少荧光可能由于泵故障或通过导管的次优位置进入蛛网膜下隙的输液渗漏。
实施例6.4结论
本发明证明了在大鼠幼脑组织和肿瘤组织中Ls-TPT和Ls-GD的CED能引起可靠的和一致的药物分布。CED流体动力学被颅内压影响，由于肿瘤过度生长引起的高颅内压导致药物分布受损。Ls-TPT试验的两种制剂(D∶L 0.1∶1和D∶L 0.3∶1)间无相关差异，且两种制剂通过共同给药的Ls-GD良好地共对流，确定Ls-GD作为CED后Ls-TPT药物分布的脂质体示踪剂的适合性。
实施例7通过脑内增强对流递送对成年无胸腺鼠给药的脂质体拓扑替康和脂质体钆双胺的试验性毒理学评价
实施例7.1材料和方法
实施例7.1.1试验用品
如实施例6.1.1所述制备GLP级Ls-TPT和Ls-GD材料。
实施例7.1.2动物和分组
使用体重200～270g的成年无胸腺鼠(rnu/rnu)(Taconic，Germantown，NY)(batch 061207)。基于表19所列的纳米脂质体拓扑替康浓度将动物分为两组。
表19 组的分配和剂量
Figure BDA0000069734650000511
根据体重将大鼠分配到各组，从而得到对照组的平均体重和标准偏差。
实施例7.1.3手术步骤
在本研究的第1天和第4天使用CED将试验用品立体定位地给药于大鼠的每个脑半球的纹状体。在重复给药方案中两个治疗使用相同的坐标位置。大鼠被全身性地给药以使两组的给药时间相似。通过腹膜内注射异氟烷(2.5％)或克他命(90mg/kg)与甲苯噻嗪(12mg/kg)的组合物完成麻醉。削去颅骨上皮，将动物置入一个立体定位框架中，用耳棒和门牙棒将其头部固定。手术全程使用无菌技术。先后用70％的酒精和聚烯吡酮磺溶液对皮肤进行消毒。将颅骨顶部皮肤纵切，使用钝切将遍布在颅骨上的结缔组织移除。使用具有1mm直径的毛刺孔，前部0.5mm距前囟左右各3.0mm的小型电牙钻进行颅骨切除手术。将一个与自动泵(BASi，lnc，West Lafayette，IN)连结的熔融二氧化硅套管(OD 168μm，ID 102μm)(PolyMicro Technologies，Phoenix，AZ)用于CED，并将其降至适当的背腹坐标位置(-4.5～-5mm，齿列-3.3mm)。根据软膜表面来估算背腹坐标。将套管插入27号针头中，并用强力胶固定在管壁上。使用逐步增加的输液速度注射。本研究中使用的输液速度为0.2μL/分钟(15mm)，05μL/分钟(10 mm)，08μL/分钟(15mm)，每次治疗达到20μL的总输液量(Vi)。输液完成后，将套管原位保持5分钟以减少输液流出，然后再缓慢拔出。
程序完成后，使大鼠处于不通风的环境中，并通过加热灯或水袋或其它合适的保温方法进行保温，并在麻醉恢复期进行监视。根据需要皮下给药丁丙诺啡。允许大鼠在将其送回它们的笼子之前在程序室里进行恢复。
实施例7.1.4组织收集和处理
在第11天采取安乐死。动物通过异氟烷(25％)或吸入CO2麻醉。动物将被采集跨心脏血液样品用于拓扑替康血浆水平的测定和其他合适的试验。接着，动物被跨心脏灌注100ml肝素化生理盐水，然后灌注300ml 4％仲甲醛，并立即进行尸检。
在尸体和肌肉/骨骼系统进行试验期间，对发现的死亡或处死(预期和非预期的)动物进行完整的总体尸检，所有的外表面和开口，大脑的颅腔和外表面，与颈部相关的器官和组织，胸部、腹部和盆腔及其相关的器官和组织。
移除大脑，将其在30％蔗糖中平衡。在蔗糖平衡后，组织在-60℃下干冰和异戊烷混合物中冷冻。大脑被保存于-70℃用于后续处理。如存在任何死亡或被处死的动物的心、肺、肝、肾、脾(或部分)，也将其收集并保存。这些组织被固定于10％福尔马林中性缓冲液中。
如果需要，福尔马林固定的组织将用石蜡密封处理用于后续组织病理分析。本研究中两组的所有大脑被切成30μm厚，并在磷酸盐缓冲液(PBS)和0.2％叠氮化钠溶液中收集悬浮切片。每4个切片收集在玻璃载片上，固定在4％仲甲醛中，并进行苏木精/伊红染色。余下的切片保存在4℃，可能用于其它免疫组织化学分析。
将用于拓扑替康和钆双胺血浆提前与测量的血液样本进行离心以分离血浆。每只动物获取400μl血浆。将具有1.6ml冷甲醇的2.0ml的Eppendorf管于冰上保存，并向管中加入血浆，然后涡旋。样品一直在冰上保存，直到所有动物都被处理完成。管被石蜡膜密封以防止顶部意外打开，并冷冻保存。用干冰将样品运到Northern Lipids公司(Burbany，BC，Canada)。通过高效液相色谱(HPLC)和荧光检测测定拓扑替康血浆水平，通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定钆双胺血浆水平。
实施例7.1.5早期死亡/非预期处死
如果动物在研究中死亡，尽可能准确地估计其死亡时间并记录，且尽快进行尸检。如果不能立即进行尸检，将动物冷藏(不是冷冻)以减少组织自溶。尸检应在死亡后12小时内进行。
如果动物出现不良健康状况或在濒死之际，将其进行安乐死。酌情进行血液或其他标本的采集并进行适当分析(如临床病理参数)，有助于揭示不适/病态的原因。
实施例7.1.6动物护理
每只动物都通过耳标编号和笼子卡片确定，卡片上列有动物识别号码、研究号码、品种/品系、性别、出生日期、来源和到达日期。
这些动物被单独安置在隔离笼中。床具材料是修剪的硬木片(Sanichips，Harlan，CA)且每周更换。室温保持在18～26℃(64-79°F)，且相对湿度为30-70％。连续监控温度和湿度并每天记录最低值和最高值。保持12小时光照/12小时黑暗的光照周期，除了必须打开房灯(在暗周期)以调节研究程序。在研究期间，大鼠可随意地获得照射的Teklad Global 18％蛋白质啮齿动物饮食(Harlan，San Diego，CA，USA)和市政自来水。目前在饮食和水中还未发现对研究结果有不利影响的污染物。每年的水质量检测报告保存在PSI档案中。
到达指定住处后，所有收到初步健康检查合格的大鼠被允许在居住环境(原始围墙和房间)中至少驯化3天，在开始任何动物相关的研究程序之前。在驯化期间，每天监控大鼠的一般健康。只有视觉评价处于良好临床条件(如体重)大鼠才能参与本研究。任何显示异常或不健康迹象(如起皱的表皮、显著低体重)的大鼠都被排除在本研究外。
在整个驯化和研究期间，每天至少进行一次临床观察和测量。至少在给药前3天开始笼边观察记录并持续到终止。通常观察每只动物的外观和行为变化。在大鼠到达后、给药试验用品前和尸检当天进行称重并记录体重。
实施例7.2结果
实施例7.2.1临床观察和测量
没有动物在本研究中被取代。未发现动物死亡且所有动物都被预期处死。所有动物的预处死检查均正常。
实施例7.2.2拓扑替康血浆水平测量
第11天(最后一次治疗的7天后)的血浆提取物测量发现了拓扑替康(只检测内酯形式)和钆双胺水平都不存在或低于量化的下限，如表20所示。为观察到拓扑替康羧化物形式或其很低，与血浆的干扰峰重叠。每个样品都可观察到拓扑替康内酯形式的保留时间的峰，且在编号7214动物发现最高峰。这个峰是拓扑替康还是血浆空白还未确定。
表20在血浆中物中的提取拓扑替康与钆双胺
 动物研究数 治疗分配 拓扑替康(g/mL) 钆双胺(μg/mL)
 7201 组1 ＜0.0007 ＜0.04
 7203 组1 ＜0.0007 ＜0.04
 7205 组1 ＜0.0007 ＜0.04
 7207 组2 ＜0.0007 ＜0.04
 7211 组2 ＜0.0007 ＜0.04
 7214 组2 ＜0.0007 ＜0 04
实施例7.3讨论
本研究评估了通过脑内CED递送的大鼠正常脑组织中两个浓度的Ls-TPT与固定浓度的Ls-GD共注入的安全性和毒性。浓度为1.0和1.6mg/mL的Ls-TPT介于之前证实的Ls-TPT的安全浓度(0.5mg/mL)和毒性浓度(5.0mg/mL)之间。
两个浓度显示同样安全，无试验用品引起的显著的或微小的变化。急性出血区域大多位于沿导管道，且据推测与实验过程和药物运输系统相关。之前已描述与递送技术相关的严重的的微小的变化，递送技术包括导管插入和CED，且本研究中观察到的变化与采用的递送技术相一致(Lieberman1995，Lonser 2002)。一个不明显的不利作用水平在本研究中未证实，因为无评价浓度引起试验用品导致的毒性。
最后一次治疗的7天后的血浆提取物测量发现了拓扑替康和钆双胺水平都不存在或低于量化的下限。所有样品都存在的拓扑替康内酯形式的保留时间的小峰还不能清楚地归于拓扑替康或血浆。然而，考虑到区域递送方法绕过血脑屏障且在最后一次处理和样品收集期间，可能意外地出现显著的血浆水平。本研究中未测量大脑组织浓度，因为大脑被切片用于组织病理学分析。因此，无法断定血浆中的上面的峰与脑实质水平是否呈正相关。在另一项研究中，在两个脑半球在拓扑替康浓度为0.5μg/mL下Ls-TPT单独处理的7天后，未检测到脑内拓扑替康(实施例2)。
实施例7.4结论
在大鼠幼脑组织中共同注入1.0和1.6mg/mL浓度的Ls-TPT及Ls-GD显示是安全的，且无试验用品导致变化的证据。拓扑替康和钆双胺血浆水平都低于用于分析量化的下限，与递送方法和药物性质相一致。
实施例8：脂质体拓扑替康和脂质体钆双胺对成年无胸腺鼠内的颅内异种移植U87MG肿瘤的增强对流递送
实施例8.1：材料和方法
实施例8.1.1：试验用品
制备如实施例6.1.1所述的脂质体GLP级材料脂质体拓扑替康和脂质体钆双胺。
实施例8.1.2：动物和分组
使用6～8周、体重200～275g的成年无胸腺雄鼠rnu/rnu(泰克尼克，日耳曼敦，纽约，批次04/30/2007-150501)。将实验动物按表21所示分成三组。
表21：分组与剂量
Figure BDA0000069734650000561
肿瘤接种手术要进行两天以上(n＝15只/每天)。在连续几天内，对每个治疗组中的五只大鼠进行U87MG肿瘤细胞接种手术。真正的治疗任务是在肿瘤植入手术后两天中的任意一天，目的是比较各组大鼠的平均体重和标准偏差。
实施例8.1.3：手术步骤与治疗
实施例8.1.3.1：颅骨内肿瘤异种移植手术
将人体成胶质细胞瘤细胞(U87MG)从冷冻细胞库(佩里科学公司，圣地亚哥，加拿大)中取出2周后，再按计划进行接种。细胞在肿瘤接种手术当天获得并调成50,000～100,000细胞/μL的浓度水平。在接种手术当天(第0天)，使用5-10μL悬浮液，对每只大鼠的右脑纹状体单方面植入总量为500,000的U87MG肿瘤细胞。采用立体定位技术和2.5％浓度的异氟烷麻醉措施。将大鼠置入一个立体定位框架中，用耳棒和门牙棒将其头部固定。手术全程使用无菌技术。先后用70％的酒精和聚烯吡酮磺溶液对皮肤进行消毒。将颅骨顶部皮肤纵切，使用钝切将遍布在颅骨上的结缔组织移除。从前囱钻一个前部0.5mm侧面3.0mm毛刺孔。使用30号容量25μL的汉密尔顿注射器，将U87MG肿瘤细胞用适当的背腹坐标立体定位技术注入大脑纹状体中，背腹坐标根据软膜表面来计算(-4.5～-5mm，齿列-3.3mm)。根据U87MG细胞悬浮液的最终细胞浓度，将注射剂量在5～10μL范围内调整，以确保在10分钟内对实验动物注入总量为500,000±25,000的肿瘤细胞。
在接种手术中，将皮肤固定。监测在麻醉恢复期的大鼠状态。根据需要对其进行皮下给药丁丙诺啡。在肿瘤细胞植入手术后每天监测大鼠两次。植入手术后的存活期预计为0～60天左右，在此期间大鼠被实施安乐死，而其大脑被保存。
实施例8.1.3.2：治疗
在第5天和第8天，积极治疗的大鼠(第1组和第2组)将接受通过CED递送到脑内肿瘤的实验用品，该CED与大脑纹状体内的肿瘤植入具有相同的坐标。对照组的大鼠维持在不治疗状态，不对其进行假手术。将大鼠按各组相同的注射时间排列的系统化顺序进行给药。通过腹膜内注射2.5％浓度的异氟烷或克他命(90mg/kg)与甲苯噻嗪(12mg/kg)的混合物进行麻醉。使用带有钝耳棒的立体框架通过先前钻打的毛刺孔来进行CED。仅将凝固血块移除。将一个与自动泵(BASi，lnc，West Lafayette，IN)连结的熔融二氧化硅套管(外径168μm，内径102μm)(PolyMicro Technologies，Phoenix，AZ)用于CED，并将其降至合适的背腹坐标位置(-4.5～-5mm，齿列-3.3mm)。背腹坐标根据软膜表面来计算。将套管插入27号针头中，并将其用强力胶固定在管壁上。在此过程中逐步增加输液速度，依次为0.2μL/分钟持续15分钟，0.5μL/分钟持续10分钟，0.8μL/分钟持续15分钟，0.5μL/分钟(10mm)，最终使每个大脑半球输入20μL剂量液体。输液完毕后，将套管保持原位5分钟，尽可能减少输液外流，之后再缓慢拔出。
程序完成后，接下来使大鼠处于自由通风的环境中，并通过加热灯或水瓶或其它合适的保温方法进行保温并在麻醉恢复期进行监视。根据需要对其进行皮下给药丁丙诺啡。允许大鼠在将其送回它们的笼子之前在程序室里进行恢复。
实施例8.1.3.3：第60天之前的安乐死标准
如果观察到下列症状(鼻/眼周出血、麻痹、驼背、迟钝或不进食或修饰或重量减轻＞15％基线体重)的任何一个或其组合则将动物进行安乐死。如果情况允许，可收集血液或其他样本进行适当研究(如临床病理学参数)来找出不适或病态的原因。实施安乐死：将实验动物用2.5％浓度的异氟醚深度麻醉，然后先后用0.9％浓度的盐溶液(100mL)和4％浓度的仲甲醛溶液(300mL)进行心内灌流。
实施例8.1.3.4：组织收集和处理
在尸体和肌肉/骨骼系统进行研究期间，对发现的死亡或处死(预期和非预期的)的动物进行完整的总体尸检，所有的外表面和开口，大脑的颅腔和外表面，与颈部相关的器官和组织，胸部、腹部和盆腔及其相关的器官和组织。
将尸检动物大脑移除，置入4％浓度的仲甲醛溶液中培养24小时，然后放入30％的蔗糖溶液中平衡。在蔗糖平衡后，将组织放入-70℃环境中冷冻储存，而后冻干切片。如有心脏，肺，肝，肾，脾(整体或部分)等器官，也一并收集并储存。将这些器官的组织与10％浓度的福尔马林溶液混合。而后将混有福尔马林溶液的器官处理成石蜡块以便日后有需要时做组织病理研究分析。
实施例8.1.3.5：组织病理学分析
在60天，从三个治疗组中分别随机选取至少三只存活动物和死亡动物的大脑，进行20μm厚的切片取样，将每四个切片收集到玻璃片上，与4％浓度的仲甲醛溶液混合，经过苏木精/曙红处理，来评估肿块的大小和组织。剩余切片保存在4℃环境下，用于其它免疫组织化学研究分析。
实施例8.1.3.6：生命周期观察和测量
在适应环境和实验研究期间，每日至少进行一次临床观察和测量。至少要连续三天对笼边观察作记录后，才能给动物首次注射药剂，直到死亡。观察每只动物整体外观和行为的变化。临床观察和测量数据在表22中列出。
表22：临床观察和监测参数
Figure BDA0000069734650000591
实施例8.1.3.7：早期死亡/非预期处死
如果动物在研究中死亡，尽可能准确地估计其死亡时间并记录，且尽快进行尸检。如果不能立即进行尸检，将动物冷藏(不是冷冻)以减少组织自溶。尸检应在死亡后12小时内进行。
如果动物出现不良健康状况或在濒死之际，将其进行安乐死。如果情况允许，可收集血液或其他样本进行适当研究(如临床病理学参数)来找出不适/病态的原因。
实施例8.1.3.8：统计方法
将动物分成不同治疗组以便进行存活期分析。通过使用对数秩统计的Kaplan-Meier存活期分析方法来进行各组比较研究。从凯普兰-迈耶曲线中可以看出各组的平均存活期。将实施安乐死的动物看成未通过审查的(死亡)和通过审查的(存活)两部分来对存活期进行单独分析。
实施例8.1.4动物护理
将有编号的耳标套在每只动物身上以便识别。此外，每只动物的笼子也挂有笼卡，列明动物识别编号，研究编号，组别，出处，到达日期，物种/品种，出生日期和性别以便识别。
将大鼠分别放置在单独的笼子中。用削好的硬木片(撒尼片，哈伦，加拿大)铺床并每周更换。室温控制在18～26℃(64-79°F)，相对湿度在30～70％范围内。连续监控温度和湿度，每天记录最大值和最小值。保持12小时亮/12小时暗的周期光照时间，必要时在暗周期时段打开室灯以配合研究过程。
将大鼠置入明亮的特克莱德实验室里，允许自由出入，在研究过程中为其提供总共占啮齿类动物饮食18％的蛋白质(哈伦，圣地亚哥，加拿大，美国)和城市自来水。饮食和水都没有任何程度的污染，也不会对研究结果产生任何有害影响。每年的水质量检测记录保存在保罗谢勒研究所的档案中。
到达指定居室后，让所有即将接受最初健康检查的大鼠用至少三天的时间适应室内环境(主要外部围场和房间)，然后再开始其他与动物相关的研究步骤。在适应期间，每天监测大鼠的总体健康状况。只有在目测评断中具有良好临床状况(比如体重规格)的大鼠才能进行实验研究。任何在目测评断中出现不健康异常现象(比如皮毛皱起，体重骤减)的大鼠都将被排除。
实施例8.2结果
实施例8.2.1：临床观察和测量
不必替换任何实验大鼠。8只大鼠在笼子里死亡(第一组5只，第二组1只，第三组3只)。20只大鼠由于健康状况差而被实施安乐死(第一组5只，第二组9只，第三组7只)，健康状况差的大鼠最普遍的现象是体重下降≥45％，倦怠，驼背，丧失运动功能(比如出现变形的正位反射，向一侧躺倒的现象)。
实施例8.2.2效果
按计划对每组十只大鼠进行治疗。主要效果分析将实施安乐死的大鼠看成是未通过审查(死亡)的实验对象。结果，示出的存活期表明直到死亡的时间。治疗组中每只大鼠的个体存活期、中间值存活期及平均值存活期在表23中显示。治疗组的存活曲线在图12中显示。
表23：实施安乐死被看成是未经审查的大鼠的个体，治疗组，整体存活*数据
Figure BDA0000069734650000611
由数据可知，与对照组(第三组)相比较，使用总剂量和高浓度的拓扑替康来治疗大鼠的第二组以及使用总剂量和低浓度的拓扑替康来治疗大鼠中的第一组都具有较长的存活期，他们的平均值存活期分别为第二组：33.0天(95％CL，31-40)，第一组：29.5天(95％CL，27-33)，第三组：20.0天(95％CL，19-21)。与对照组相比较，这种差别都是统计上显著的(1.0mg/mLvs对照组，p＜0.0001；0.5mg/mL vs对照组，p＜0.0001)。
积极的混合治疗组(第一组和第二组)的中间值存活期为31.5天(95％CL，30-36)，与对照组相比较也是统计上显著的，p＜0.0001。尽管从剂量/浓度反应曲线能观察到一个危险的比例0.567(95％CL，0.23-1.38)，但两个积极的治疗组的差别并没有达到统计上显著水平(0.5mg/mL vs 1.0mg/mL，p＝0.215)
第二效果分析则是将实施安乐死的大鼠看成是通过审查的实验对象。治疗组的中间值存活期在表24中显示，而存活期曲线在图13中显示。
表24：实施安乐死被看成是审查过的大鼠的治疗组和整体存活数据
Figure BDA0000069734650000621
此项分析结论与将实施安乐死被看成是未通过审查的大鼠的效果分析结论一致，并成为其有力依据。结论表明，与对照组(第三组)相比较，使用总剂量和高浓度的拓扑替康来治疗大鼠的第二组以及使用总剂量和低浓度的拓扑替康来治疗大鼠中的第一组都具有较长的存活期，他们的平均值存活期分别为第一组：48.0天(95％CL，未确定)，第二组：33.0天(95％CL，30.0-48.0)，第三组：23.0天(95％Cl，20.0-23.0)。与对照组相比较，这种差别也是统计上显著的(1.0mg/mL vs对照组，p＜0.0014；0.5mg/mL vs对照组，p＜0.0014)。积极的混合治疗组(第一组和第二组)的中间值存活期为48.0天(95％Cl，36.0-48.0)，与对照组相比较也是统计上显著的，p＜0.0001。
此项验证效果研究是对一种混合药物递送方法进行评估，此方法为将两种浓度的新型拓扑替康制剂，通过脑内CED，递送入无胸腺大鼠的颅内神经胶质瘤异种移植模型中。装载钆双胺的脂质体作为脂质体拓扑替康的潜在成像示踪替代物共同给药。此项研究所选拓扑替康的浓度有：0.5mg/mL，在之前的探索效果研究(实施例4)中进行测试；和1.0mg/mL，在之前的毒理学试验研究(实施例7)中被确定为无毒范围。根据实施例4的发现，在此研究中使用双剂量策略，而且在肿瘤异种移植术后第5天(实施例4为第8天)开始进行治疗，以避免肿瘤负担过度，因此优化肿瘤覆盖的分布容积。而且，在异种移植手术中，U87MG肿瘤细胞装载量5X105在所有实验组中都相同，以使得所有实验大鼠都具有相同的肿瘤负担(实施例4中所示，肿瘤细胞装载量变动范围是6.8～9.7X105)。
结论显示，两个积极的治疗组中大鼠具有较长的整体存活期和中间值存活期。与对照组相比较，高浓度的脂质体拓扑替康(1.0mg/mL)在整体存活期上统计显著水平大幅增加(p＜0.0001)，而在中间值存活期和平均值存活期上，统计显著水平分别增加65％和76％。与对照组相比较，低浓度的脂质体拓扑替康(0.5mg/mL)在整体存活期上统计显著水平也同样大幅增加(p＜0.0001)，但其作用效果略低于高浓度的脂质体拓扑替康，因此暗示存在剂量/浓度依赖效应。另外，低浓度的脂质体拓扑替康在中间值存活期和平均值存活期上，统计显著水平分别增加48％和56％。此项分析结论与将实施安乐死被看成是通过审查的大鼠的存活期效果分析结论相同。而后者采用较为保守的评估方法，避免对脂质体拓扑替康的真实作用效果出现任何潜在的过度评估，但另一方面也可能低估这种效果。第二效果分析结论仍然是统计上显著的，并强有力的证实了最初的效果分析结论，即将实施安乐死被看成是未通过审查的大鼠的效果分析。
在此项验证效果研究中所得出的整体实验结论与实施例4的研究报告结论不同。接受浓度为0.5或1.0mg/mL的脂质体拓扑替康的大鼠具有较长的中间值存活期和整体存活期，这与在肿瘤异种移植手术中使用较低量，但数量相同的肿瘤细胞装载方法，并采取术后早期和双向治疗(术后第5天和术后第8天)所得出的结论一致。此项研究中，实验大鼠的平均值存活期(20天)较长暗示肿瘤细胞装载对大鼠存活的重要性，这与赛托等人于2006年发表的报告结论非常相似，而且该平均值存活期(20天)比实施例4研究报告得出的17天还长。
实施例8.4：结论
在用U87MG肿瘤细胞形成一只大鼠神经胶质瘤模型中，使用通过CED所获得的脂质体拓扑替康，其作用效果与未经治疗的对照组相比，具有清楚一致的存活优势和缬氨酸优势。
实施例9：脂质体ω-芋螺毒素到点燃大鼠的增强对流递送
从西格玛奥德里奇公司(密苏里州圣路易斯)获得合成的ω-芋螺毒素-G(27氨基酸；MW，3037)，ω-芋螺毒素-M(25氨基酸；MW，2639)，和卡马西平。每种都装载入由二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)和胆固醇(见实施例2.1.2)组成的脂质体中。脂质体ω芋螺毒素-G，脂质体ω-芋螺毒素-M，天然ω-芋螺毒素-G，天然ω-芋螺毒素-M，以及天然卡马西平在点燃大鼠上的作用效果通过使用增强对流递送和与Gasior等人发表于2007年的第323期《药理学和实验性治疗学》杂志第458-68页中所述实质相同的原理来测定。
简而言之，将套管-两极的刺激电极装配组件缓慢地植入每只大鼠中，将电极尖端置于右扁桃体的基底核中。右扁桃体位于从前囟测算的立体定位坐标上(AP：-2.8mm；ML：5.0mm；DV：-8.7mm)，此测算方法由帕克西诺斯·G和沃森·C于1998年在悉尼学术刊物第四版的《立体定位坐标中的大鼠脑部》中发表。使用牙科用丙烯酸胶合剂(Lang齿，车轮状，第三代)和可固定的不锈钢螺丝(塑料一号)将套管电极组件固定在颅骨上，术后至少要有十天恢复期。点燃实验包括三个阶段：(1)点燃前对AD临界值的测算(2)点燃过程(3)点燃后对AD临界值的重新测算(参见皮内尔·JP等人发表于1976年的第17期《癫痫》第197～206页；弗里曼·FG和贾维斯·MF发表于1981年的第7期《脑部研究文集》第629-33页，Gasior等人发表于2007年的第323期《药理学和实验性治疗学》第458-68页)。点燃过程中，将大鼠置入与定制刺激器相连的直径为29cm的有机玻璃缸中单独受激(国家研究院健康研究服务分部，贝塞斯达，马里兰州)。这种玻璃缸带有一个可旋转附件，使得大鼠能在缸室里自由活动。
增强对流递送系统是由Gasior等人于2007年提出(如前所述)。为测定增强对流递送系统，将每只大鼠固定，将输液套管通过引导套管缓慢植入大脑中。输液套管尖端在刺激电极导线尖端上方伸出0.5mm的深度，并通过套管顶上的塑料制动装置将其维持在合适的深度上。释放大鼠将其置入一个塑料圆筒内以便进行完全输液。输液全程是在有意识的，没有行动限制的大鼠身上进行。输液套管植入后，让大脑组织把套管整个包上几分钟，然后再进行输液。输液采用逐步增加输液速度的方法进行。输液速度依次为0.2μl/分钟持续15分钟，0.5μl/分钟持续10分钟，0.8μl/分钟持续15分钟，最终使得每个大脑半球达到20μL剂量。输液完毕后，将套管保持原位5分钟，尽可能减少输液外流，之后再缓慢拔出。通过确定AD临界值，以及测定AD持续时间，癫痫发作阶段，和行为性癫痫发作持续时间，来评估对完全点燃大鼠体内癫痫敏感性的试验物质效果。随后，通过CED注入试验物质，刺激大鼠并在20分钟的注入后阶段以及之后的24小时，48小时，72小时，96小时，一周，二周，四周和八周的时间段里进行点燃数据测算。分别在试验物质注入过程中，注入后至少一小时内，每次后续的刺激阶段开始前这三个时间段里，观察大鼠出现颤抖(四肢，头部和身体有节奏的振动行为)或其他神经性症状的行为。
在通过点燃测算特征性毒素作用的研究实验最后，随机选择几只完全点燃大鼠，将其置入连续波长酶标仪监控系统中(热金属探测仪，哥伦布型，俄亥俄州)进行自主活动测试。简而言之，将每只大鼠置入自主活动室内(Gasior等人于2007年提出，如上所述)60分钟，连续五天进行这种测试，以使其适应环境。连续5天后，横向和纵向活动线趋向于一个平稳的基线，将在最后两天的适应期测试时段统计的活动平均值作为输液研究的基线。在5天适应期结束的后一天，给每只大鼠注入试验物质。输液参数和其他包括动物处理和外部线索的因子，与从进行点燃癫痫发作实验的大鼠身上获得的一致。在20分钟输液后阶段以及之后的24小时，48小时，72小时，96小时，一周，二周，四周和八周时间段里进行横向和纵向光线干扰，持续60分钟。
测试结束后，选择几只大鼠，用4％的仲甲醛进行心内灌注，将大脑移除用于切片，用甲酚紫和银染来测算套管放置位置和神经损伤程度。将每种药物治疗的效果描述成基线的变化(以百分比计)，用以下公式计算：100X[(治疗前数值)-(治疗后数值)]/(治疗前数值)。单独计算每只大鼠基线的治疗效果，然后取一组的平均值。在使用反正弦根变换的数据变化百分比变换后，运用单线(一组中)和双线(不同组之间)重复测量方差分析，对点燃试验和自主活动试验的数据进行统计。运用邓尼特试验或图基试验进行适当的事后分析。将颤抖行为的数据描述成由费舍的精确可能性试验分析的频率。
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所有的文献在此都整体纳入本文以供参考。

Claims (20)

1.一种改进的非聚乙二醇化脂质体递送载体，其用于通过增强对流递送将药剂给药到中枢神经系统，所述载体包含包封于脂质体制剂的治疗剂或诊断剂，所述脂质体制剂包含至少一种饱和的中性磷脂和至少一种饱和的阴离子磷脂。
2.根据权利要求1所述的非聚乙二醇化脂质体递送载体，其中，所述载体基本上由至少一种饱和的中性磷脂和至少一种饱和的阴离子磷脂组成。
3.根据权利要求1所述的非聚乙二醇化脂质体递送载体，还包含甾醇。
4.根据权利要求3所述的非聚乙二醇化脂质体递送载体，其中，所述脂质体制剂包括或基本上由DSPC、DSPG和CHOL组成。
5.根据权利要求4所述的非聚乙二醇化脂质体递送载体，其中，所述脂质体递送载体基本上由摩尔比为7∶2∶1的DSPC、DSPG和CHOL组成。
6.一种包括根据权利要求1到5任一项所述的非聚乙二醇化脂质体递送载体的治疗组合物，其中，所述脂质体递送载体包封拓扑异构酶抑制剂。
7.根据权利要求6所述的治疗组合物，其中，拓扑异构酶抑制剂是拓扑替康。
8.根据权利要求6所述的治疗组合物，其中，所述拓扑异构酶抑制剂初始药物浓度至少约为500μg/mL。
9.一种包括根据权利要求1到5任一项所述的非聚乙二醇化脂质体递送载体的治疗组合物，其中，所述脂质体递送载体包封毒素。
10.根据权利要求9所述的治疗组合物，其中，所述毒素选自以下物质组成的组：ω-芋螺毒素、肉毒杆菌毒素、μ-芋螺毒素和σ-芋螺抑制肽。
11.根据权利要求10所述的治疗组合物，其中，所述蛋白质毒素是芋螺毒素。
12.一种改进的治疗中枢神经系统疾病的方法，包括向所需病人给药根据权利要求1到5中任一项所述的非聚乙二醇化脂质体递送载体或者根据权利要求6到11中任一项所述的治疗组合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述中枢神经系统疾病是中枢神经系统肿瘤，并且其中所述治疗剂是拓扑异构酶抑制剂。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述中枢神经系统疾病是癫痫，并且其中所述治疗剂是毒素。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述毒素是芋螺毒素。
16.根据权利要求12所述的方法，还包括共同给药至少一种包封于脂质体的诊断剂，所述脂质体包括或基本上由饱和的中性磷脂和饱和的阴离子磷脂组成。
17.一种根据权利要求6到8中任一项所述的治疗组合物，其具有治疗需要患者中的中枢神经系统肿瘤的用途。
18.一种根据权利要求9到11中任一项所述的治疗组合物，其具有治疗需要患者中的癫痫的用途。
19.一种包括根据权利要求1到5任一项所述的非聚乙二醇化脂质体递送载体的诊断组合物，其中，所述脂质体递送载体包封磁共振成像磁体。
20.根据权利要求19所述的诊断组合物，其中，所述磁共振成像磁体选自钆双胺和罗丹明。
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