CN102251394B

CN102251394B - 松材线虫体壁表被层或sc在防护紫外辐射产品中的应用

Info

Publication number: CN102251394B
Application number: CN 201110115428
Authority: CN
Inventors: 赵博光; 李荣贵; 郭道森; 刘秀华
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2011-05-05
Filing date: 2011-05-05
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2031-05-05
Also published as: CN102251394A

Abstract

本发明涉及松材线虫体壁表被层或其提取物SC的用途，尤其是在防护紫外辐射产品中的应用。SC具有强抗紫外活性的特性，对紫外线具有极强的吸收作用，高达98%的紫外线可以被吸收，较常见防晒用品中添加的芦丁相比，具有更强的紫外吸光度，其抗紫外性能更优。可广泛用于防护紫外辐射产品如防晒化妆品和纺织品等，可产生巨大的经济效益。本发明涉及的松材线虫体壁表被层或其提取物SC可以用于化妆品原料等。

Description

松材线虫体壁表被层或SC在防护紫外辐射产品中的应用

技术领域

本发明涉及松材线虫体壁表被层或其提取物SC(surface coat，以下简称SC)的用途，尤其是在防护紫外辐射产品中的应用。

背景技术

许多线虫的表皮被一层物质所覆盖，在电子显微镜下观察到是一层松软的包被即“a fuzzy coat”，fuzzy coating被早期的研究者命名为多糖-蛋白质复合物(细胞被膜糖萼)(glyco-calyx)。多糖-蛋白质复合物糖萼(glycocalyx)这个术语被用来描述大部分真核细胞表面的富含碳水化合物的区域。Wright(1987)没有将glycocalyx命名为细胞被膜糖萼，而是命名为‘surface coat’，因为Foley et al.(1986)发现其两者之间的生物行为并不相同。到目前为止线虫SC的化学性质了解很少，对其作用的研究主要是集中在寄主免疫方面，对其起源的研究更是存在许多的争议。

Surface coat(SC)是一层富含碳水化合物的多糖-蛋白质复合物，多存在于线虫体壁的表被层，可被提取、分离出来。线虫的SC是聚阴离子的(可能由于含有硫酸根或磷酸基)，带有很强的负电荷，易与阳离子染剂如钌红和阳离子化铁蛋白相结合（Page et al,1992）。并且包含糖类蛋白或粘蛋白(Zuckerman et al,1987)。通过电子显微镜能够直接观察到SC，用背景染色法或者用钌红或阳离子表面活性剂染色后也能观察的到，这在对大多数线虫种类的实验中已经被验证(Alan et al,1991)。

在种间和在同一物种的不同生命阶段，SC在厚度上都有很大的变化。SC在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis.elegans)中有大约5nm厚，并在所有的生长阶段都可见(Zuckerman,1987)，在犬弓首线虫(T. canis)中大约有10nm厚。在松材线虫(B xylophilus)体表的SC在松材线虫发育的不同阶段其碳水化合物和蛋白的成分会发生变化(Ryoji SHINYA et al,2009)。在线虫不间断合成的表皮组分中，SC是动态的(Page,1992)，并且SC中的物质在环境或抗体刺激中易流失。

线虫的幼虫体内的两个主要腺体(食道腺和分泌腺)被认为是分泌SC中的粘蛋白的器官，Premachandran等认为线虫的排泄腺、侧器和尾感器能够分泌SC蛋白(Premachandran,1988;Politz,1992)。犬弓首线虫(T.canis)幼虫的SC在咽腺和排泄腺分泌合成，也通过口和排泄孔流失。分泌腺又被称为排泄细胞，在分泌孔通过管口直接与角质层相连。从南方根结线虫(Meloidogyne.incognita)成虫的排泄腺上提取的特异性互补脱氧核糖核酸(cDNA)经编码粘液样蛋白，发现有可能是SC的一部分。排泄系统与其它分泌器官的分泌物构成了SC的组分，包含蛋白，脂类和碳水化合物，它们作为单独的组分或作为糖蛋白，糖脂或脂蛋白复合物存在。

对于自由生活线虫来说，SC的作用主要是润滑作用，以及保护其免受磨损、失水和掠夺(Blaxer,1992)。对于动物线虫来说，SC已经进化了一些其他的功能，比如和寄主免疫防卫相互作用的功能(Cookson,1992)。SC是所有寄生类线虫和自由生活的线虫生物体的共同特征(Premachandran,1988)。当寄生类线虫被寄主粒细胞或抗体束缚时，SC会自由脱落，所以其在线虫逃避寄主的免疫中起了主要作用。因此这种非常直接的对寄主的免疫逃避可能是一种简单的对寄生生活的适应。

秀丽隐杆线虫(C. elegans)的野生品种的表皮角质层只结合了很少的外源凝集素(雄虫尾部结合了数量不多的麦胚凝集素WGA和大豆凝集素SBA)，在雌雄同体的线虫阴门处也很少(McClure,1982)。一些食线虫真菌的附着孢子只能在线虫的感觉器官的孔口和阴道中被发现(Johnssone,1994)。这种限制性反映了线虫可以通过降低表皮的信息含量而获得一种相对成功的生存策略，同时表现了线虫在生物化学上的对食肉动物和寄生动物的感觉器官或粘着产物的相对隐形。动物寄生类线虫SC的有效脱落被认为是一种适应性的防御措施以抵制免疫系统的攻击(Blaxer,1992)。自由生活的线虫种类为了避免被粘着和真菌细菌孢子的攻击，也会有相同的反应。可有可无的SC会连带着附着的分子(细胞，粘着物)脱落，并充当酶的效应机制的场所。接着，脱落的物质可能充当诱饵把注意力从线虫体身上转移。

相反，在特定的时间和空间模式下，植物寄生类线虫(根结线虫种类)表面常常结合了一系列的外缘凝集素。爪哇根结线虫(M.javanica)的表皮L2s上表达了一种能够结合碳水化合物，类似于凝集素的活性(Spiegel,1995)。在入侵寄主和迁移的阶段或者在寄主中寄生时，许多植物寄生类线虫成功避免了寄主对其的防御和伤害反应，很有可能的原因是：SC模拟了寄主的自我识别，例如南方根结线虫(M.incognita)通过表皮下的抗体与寄主韧皮部细胞发生特殊的交叉反应来模拟，大多数犬弓首线虫(T.canis)的SC聚糖与寄主LewisX决定物相类似(Khoo,1991)。格氏斯氏线虫属(Steinernematidae)和异小杆线虫属(Heterorh-abditidae)中的食虫类线虫正在引起广大生物控制工作者的广泛关注(McClure,1982)。这类线虫的侵染期幼虫生活在有合适昆虫寄主的土壤中。在经由自然侵入孔(消化道，气门)进入寄主的血管体腔后，线虫释放共生细菌并在48小时内杀死寄主。Wang等(Johnssone,1994)还从格氏斯氏线虫(Steinernema. Glaseri)的SC中提取出了至少SCP3a一种蛋白可以抑制寄主的免疫反应。昆虫防御多细胞动物寄生的重要机制之一是包围作用。包膜是由血细胞多层沉积或黑色素膜形成，吞噬入侵者。而寄生者用以对抗寄主免疫系统的对应机制是抑制作用。寄生者所携带的病毒，毒素或其它抗免疫因子能够抑制寄主体液或细胞的免疫反应。食虫类线虫在寄主血管体腔中释放共生菌以抑制寄主免疫系统，接种试验已证明了格氏线虫(S.glaseri)所携带的嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus. poinarii)对日本金龟(P.japonica)的毒性。然而，线虫在进入寄主血淋巴4至6小时后才会释放细菌为了确保细菌的释放，格氏线虫(S.glaseri)会尽力逃脱或抵抗寄主的包围(Johnssone,1994)。但这段免疫保护机制还不甚清楚。

Aumann and Wyss(1987)和McClure et al.(1973)分别用甜菜胞囊线(Heterodera.schachtii)和南方根结线虫(M. incognita)产的新鲜的被隔离纯化的卵孵化得到二龄幼虫，它们与寄主植物没有直接的接触，相对来说对寄主没有依赖性。这些土生种类线虫的雌虫与寄主组织发生直接的接触，因此有更多的机会获取寄主的营养。将马铃薯金线虫(Globodera rostoc-hiensis)的二龄幼虫置于寄主根部渗出液中，会发现线虫化感器的分泌物(Forrest et al.,1989)和其头部结合的外源凝集素(Forrest et al.,1988)都有所增加。同样，寄主根部的渗出液能提高线虫SC的一些组分的产量。相比较寄生前的甜菜胞囊线虫(H.schachtii)的二龄幼虫，寄生后的二龄幼虫(甚至只将其头部放入土中)(Aumann et al.,1991)的表皮组分发生了显著的变化。Bird and Zuckerman (1989)发现蛋白在某些细菌与线虫的附着上起了非常重要的作用。

松材线虫在分类学上属线形动物门Nemathelminthes，线虫纲Nematoda，垫刃目Tylenchida，滑刃科Aphelenchoididae，线虫由卵发育为成虫，其间要经过4龄幼虫期。雌、雄虫交尾后产卵，雌虫可保持30天左右的产卵期，1条雌虫产卵约100粒。在生长最适温度（25℃）条件下约4天l代。由卵孵化的幼虫在卵内即蜕皮1次，孵出的幼虫为2龄幼虫。秋末冬初，病死树内的松材线虫已逐渐停止增殖，并有自然死亡，同时开始出现另一种类型的3龄幼虫，称为分散型3龄虫，进人休眠阶段，翌年春季，当媒介昆虫松墨天牛将羽化时，分散型3龄虫蜕皮后形成分散型4龄虫，特称为dauerlarvae（DL），即休眠幼虫（耐久型幼虫）。这个阶段的幼虫即分散型3龄、分散型4龄幼虫在形态上及生物学特性上都与繁殖阶段不同，其抵抗不良环境能力加强，休眠幼虫适宜昆虫携带传播。

松材线虫是引起松材线虫病（Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Buhrer) Nickle，又称松树萎蔫病，是松树的一种毁灭性流行病）的病原。松材线虫主要靠松墨天牛（Monochamus alternatus Hope，又称松天牛或松褐天牛）进行传播。松材线虫通过松墨天牛补充营养的伤口进入松树的木质部，并寄生在树脂道中。松材线虫在大量繁殖的同时移动，逐渐遍及全株，并导致树脂道薄壁细胞和上皮细胞的破坏和死亡，造成植株失水，蒸腾作用降低，树脂分泌急剧减少和停止。所表现出来的外部症状是针叶陆续变为黄褐色乃至红褐色，萎蔫，最后整株枯死。该病致病力强，寄主死亡速度快；传播快，且常常猝不及防；一旦发生，治理难度大。

自1895年，W·C·伦琴发现X射线后不久,人们就观察到它引起机体组织损伤和细胞死亡的现象。还发现用它可以根除恶性肿瘤，从而诞生了放射治疗。1902年后，人们认识到电离辐射还可以引起癌症。于是，辐射生物物理作为生物物理学最早的一支问世了。

1935年，H·B·季莫费耶夫—列索夫斯基和K·G·齐默尔创立了“靶理论”，并用数学和统计学的方法，第一次建立了剂量——存活曲线的数学描述，第一次把量子物理与生物过程联系起来。

剂量存活曲线(dose survival curve)是反映照射剂量与细胞死亡率之间的关系，分析受照射细胞群体辐射效应的一种模式。在培养皿上培养有增殖能力的哺乳类细胞，观察细胞集落形成率，以每一集落代表1个存活细胞。其集落形成率随照射剂量增加而减少。以集落形成率代表细胞存活率与照射剂量在半对数座标纸上作图即构成剂量存活曲线。

通常用D37、D0、Dq和n等参数来表示剂量存活曲线的特征。D37是指存活曲线上存活率由1降至0.37所需的剂量。D0称平均致死剂量(mean lethal dose)，是指存活曲线指数部分，即直线部分存活率每降低至0.37所需的剂量。D0是该直线斜率的倒数。D0的大小反映了细胞的辐射敏感性，哺乳类细胞的D0值多在1～2Gy之间。(e为自然对数的底，等于2.718，1/e≈0.37)。Dq称拟阈剂量(quasithreshold dose)，是在剂量存活曲线上存活率为1处划一横坐标的平行线，与B线直线部分延长线相交，其所对应的剂量即为Dq。在A线上Dq＝0，故D37＝D0。n称外推值(extrapolation number)是剂量存活曲线B的直线部分的延长线与纵座标的交点。Dq和n值都反映曲线“肩”部的大小，在放射生物学和放射治疗学中常用D0、Dq和n等参数比较各类的细胞辐射敏感性和修复能力。

按辐射生物学效应的发生和照射剂量的关系可以分为确定性效应(deterministic effect)和随机性效应(stochastic effect)。确定性效应(deterministic effect)又旧称非随机性效应(no-nstochastic effect)。指效应的严重程度(不是发生率)与照射剂量的大小有关，效应的严重程度取决于细胞群中受损细胞的数量或百分率。此种效应存在阈剂量。照射后的白细胞减少、白内障、皮肤红斑脱毛等均属于确定性效应。随机性效应(stochastic effect)：指效应的发生率(不是严重程度)与照射剂量的大小有关，这种效应在个别细胞损伤(主要是突变)时即可出现。不存在阈剂量。遗传效应和辐射诱发癌变等属于随机性效应。

影响辐射生物学效应对的因素主要有：

1．辐射类型：高LET(传能线密度)辐射在组织内能量分布密集，生物学效应相对较强。故在一定范围内，LET愈高，RBE(相对生物学效应)愈大。

2．剂量和剂量率：照射剂量大小是决定辐射生物效应强弱的首要因素，剂量越大，效应越强。但有些生物学效应当剂量增大到一定程度后，效应不再增强。另外，在一定剂量范围内，同等剂量照射时，剂量率高者效应强。

3．照射方式：同等剂量照射，一次照射(single dose)比分次照射(fractionated dose)效应强；同样，全身照射比局部照射效应强。

机体各类细胞对辐射的敏感性不一致。Bergonie 和Tribondeau提出细胞的辐射敏感性同细胞的分化的程度成反比，同细胞的增殖能力成正比。

辐射对生物系统的原初作用，主要指对各种生物大分子（核酸、蛋白质、酶和酯）的直接作用和间接作用。生物分子直接吸收辐射能而被电离和激发，进而发生结构的变化，叫做直接作用。辐射能被生物分子周围的水分子吸收并引起水的分解，产生羟自由基、水合电子和氢原子等反应性很高的自由基。它们通过扩散与生物分子发生化学反应并引起后者结构的改变；这种作用叫做间接作用。直接作用和间接作用的相对比例，取决于辐射能量损失的空间分布和生物系统的化学成分，也和生物系统的空间结构有关。

辐射处理后细胞的死亡类型主要有间期死亡（intermitotic death）和增殖死亡（repodu-ctive death）。间期死亡是细胞受照射后不经分裂，在几小时内就开始死亡，称间期死亡，又称即刻死亡。体内发生间期死亡的细胞分为二类：一类是不分裂或分裂能力有限的细胞，如淋巴细胞和胸腺细胞，受几百Gy照射后即发生死亡；另一类是不分裂和可逆性分裂的细胞，如成熟神经细胞、肌细胞和肝、肾细胞等，需要照射几十至几百Gy才发生死亡。细胞间期死亡发生率随照射剂量增加而增加，但达到一定峰值后，再增加照射剂量，死亡率也不再增加。间期死亡的原因是核细胞的破坏，其机理主要是由于DNA分子损伤和核酸、蛋白质水解酶被活化，导致染色质降解，组蛋白外溢，发生细胞核固缩、裂解。照射后膜结构的破坏、细胞能量代谢障碍，也是促成间期死亡的因素。增殖死亡是细胞受照射后经过1个或几个分裂周期以后，丧失了继续增殖的能力而死亡，称增殖死亡，也称延迟死亡。体内快速分裂的细胞，如骨髓细胞受数Gy射线照射后数小时至数天内即发生增殖死亡。分裂细胞在受到很大剂量照射后也可发生间期死亡。增殖死亡的机理主要是由于DNA分子损伤后错误修复和染色体畸变等原因导致有丝分裂的障碍。

细胞损伤后有自我修复的功能，细胞损伤有潜在致死损伤和亚致死损伤。潜在致死损伤是指照射后细胞暂未死亡，但如不进行干预，细胞将会发生死亡。假如改变受照射细胞所处状态。例如置于不利于细胞分裂的环境中，则受损伤细胞可得到修复而免于死亡，称潜在致死损伤修复（potentially lethal damage repair，PLDR）。亚致死损伤是指细胞接受辐射能量后所引起的损伤不足以使细胞致死，如果损伤积累起来，就可以引起细胞死亡。但若给予足够的时间，则细胞有可能对这种损伤进行修复，称亚致死损伤修复（sublethal damage repair，SLDR）。所以将一定剂量进行分次照射，每次照射中间给予一定间隔，细胞的死亡率比同等剂量一次照射明显减少（夏寿萱,2001）。

紫外辐射的波长范围为10纳米至400纳米。由于只有波长大于等于200纳米的紫外辐射，才能在空气中传播，所以人们通常讨论的紫外辐射效应及其应用，只涉及200纳米至400纳米范围内的紫外辐射。紫外辐射量可以物理单位或生物单位来表示，就其物理单位而论，其瞬间量为W/m2，还有采用mW/m2、μW/cm2。

1W/m2= 1000mW/m2= 100μW/cm2。

紫外辐射通常分为UV-A(400nm-320nm)、UV-B（320nm-280nm）和UV-C(280nm-100nm)三部分（祝青林，于贵瑞，蔡福等，2005）。UV-C基本被完全吸收；UV-B大部分被吸收，但此段辐射即使到达地面数量少，也可以导致明显的环境生态效应并影响人体健康。UV-A的相当一部分直接到达地面，它能晒黑皮肤，产生维生素D，对植物光合作用也有影响。

地表接受的紫外辐射量受多种因子的影响，太阳紫外辐射在大气中要经历复杂的过程传输，到达地面的紫外线辐射量会受到包括太阳运动、大气本身的物理、化学状态以及地表特征等在内的一系列因子的影响（刁丽军，顾松山，王普才，2003）。通常认为，影响到达地面的太阳紫外辐射影响因子主要有：太阳高度、臭氧含量、云量、气溶胶变化、地理纬度、海拔高度、地表反照率等。南京属亚热带季风气候，雨量充沛，年降水1200毫米，四季分明，年平均温度15.4°C，年极端气温最高39.7°C，最低-13.1°C.年平均降水量1106毫米，南京地区的海拔较低，平均海拔高度8.6m。

紫外辐射本身作为总辐射的一个光谱段，其量值正午大于等于早晚的日变化规律大体与总辐射是一致的。紫外辐射变化量与总辐射变化规律相当的吻合，成正相关（刘晶淼,丁裕国,黄裕德,等;2003）。江瀞等人研究也发现，紫外辐射的日总量与总辐射量呈线性关系，臭氧对太阳辐射有吸收、反射、散射等作用，对太阳辐射的吸收只要集中在紫外波段，在紫外波段中，UV-C的波长最短，容易被臭氧层吸收，UV-A、UV-B可穿透大气层到达地面，其对波长在230nm～320nm之间的波段吸收率到达90%以上。由于太阳高度角的变化，紫外辐射也有日变化和年变化。对北半球中纬度的地区来说，一年中，太阳高度角夏季大于等于冬季，太阳倾角亦然。一日之中，太阳高度角正午大于等于早晚，紫外辐射在夜间为零，天亮后随着太阳高度角的变化而逐渐变大，正午达到最大，午后又逐渐减小。所以，总辐射和紫外辐射均为夏季大于等于冬季，正午大于等于早晚(景怀玺,杨文科,郭忠祥,2004)。

在太阳高度角一定的情况下，大气透明度和云的变化是决定紫外辐射强度的主要因子（Frederick J E,E C Weatherhead.,1992）云对直接辐射的影响主要通过云的反射、吸收作用而使其受到强烈的削弱，其程度又与云的状态有关。在阴天时，由于云层的覆盖，紫外辐射的衰弱更明显，正午时刻与晴天相比减少将近一半左右，同时研究发现，当总云量在4成以下时，云量对紫外辐射基本上无明显的影响；当云量增加到6成以上时，紫外线的减弱速度就会加快。

近地层紫外辐射量的变化是受多因素作用影响的，在不同的空间尺度上，各因子的影响程度存在差异和变化。此外，紫外辐射还与湿度、气温、地面净红外辐射、相对湿度、地温、反射辐射、净辐射、光和作用有效辐射、空气污染等因素有关。

紫外线的生物学效应也与波长有关。紫外线按其生物学作用分为三类：波长320～400nm的紫外线A（UV-A），其生物学作用较弱，主要会晒黑皮肤并形成皱纹，大量照射可引起日光性皮炎、眼炎。波长275～320nm的紫外线B（UV-B），有较强的皮肤效应和抗佝偻病作用，大量照射会引起皮炎、使皮肤老化、形成皱纹和老年斑，并可诱发白内障和皮肤癌。波长200～275nm的紫外线C（UV-C），其生物学作用较为强烈，能杀灭一般的细菌和病毒，在生物实验和医学中用来消毒。太阳辐射中的UV-C和大部分UV-B被臭氧层吸收，到达地面的紫外线波长多为大于等于290nm的UV-A。

紫外线生物学效应的机制主要有以下三方面：①诱发基因突变。UV-B能使细胞DNA结构中的胸腺嘧啶转变为环丁烷型二聚体，造成DNA损伤。DNA损伤超出机体正常修复范围时，往往会发生基因突变。抑癌基因（如p53，此基因由于其表达产生的蛋白质分子量为53kDa而得名）的突变是癌症的起始信号，50%以上的皮肤癌患者中存在p53基因突变。②产生自由基。紫外线照射可诱使细胞中产生各种自由基，进一步损伤DNA、RNA、蛋白质等生物大分子。③抑制免疫系统。UV-B可损伤表皮组织的郎格罕氏细胞（Langer-hans’cells），这种细胞是一种不成熟的树突状细胞，胞浆中包含大量柱状或球拍状颗粒，称为伯贝克颗粒（Birbeck granules）。当一块皮肤受到感染时，本地郎格罕氏细胞将识别、捕捉和处理微生物抗原，然后迁移到引流淋巴结皮质的T细胞区域，并成熟为专职性抗原提呈细胞。如果郎格罕氏细胞被UV-B损伤，就降低了免疫递呈作用、使T淋巴细胞减少，从而减弱了机体正常的抗肿瘤免疫反应，增加癌症的发生几率。另外，除UV-C的杀菌作用外，生物学上还利用紫外线的诱变作用进行微生物的诱导突变和植物育种。大部分昆虫对365nm的紫外线十分敏感，因此紫外灯被广泛用来诱捕昆虫（高原,于玥,2008）。紫外光能提高植物对线虫的抗性，同时也能直接杀伤线虫。蛋白酶是与根结线虫（Meloid-ogyne.spp）发育有关的一类酶，据报道，未受紫外线照射的根结线虫，体内的蛋白酶活性比受紫外光照射的活性提高30%～40%（冯志新,2001）。

随着全球日光紫外线辐射强度(ＵＶＲ)的不断增加,人们对日光过度照射的危害认识亦逐步提高,紫外线不仅能引起皮肤红斑、晒黑、污斑、皱纹等,还可引起ＤＮＡ损伤等慢性危害。（苏瑾，上海预防医学杂志2001年第13卷第5期，防晒化妆品防护效果评定方法研究进展）为此，人们找出了许多防止紫外线伤害皮肤的防晒剂。按照防晒剂的性质及化学结构的不同分成化学防晒剂及天然防晒剂。其中化学防晒剂按照作用机理又分成紫外线吸收剂及物理阻挡剂。天然防晒剂又分成植物防晒剂及生物工程类防晒剂。其中，生物工程类包括：表皮生长因子(EGF)、超氧化物歧化酶(SOD)、透明质酸(HA)、胶原蛋白(Collagen)、神经酰胺(Ceramide)、金属硫蛋白(MT)、辅酶QIO(CoQ₁₀)、壳聚糖(Chitin)（杨纯瑜,防晒剂的种类及其研究进展[J].北京日化,2007,(2):1-9）。

至今尚未有松材线虫体壁表被层及其提取物SC在抗紫外辐射方面的报道，未见松材线虫体壁表被层及其提取物SC在防护紫外辐射产品中的应用的报道，也未见糖蛋白在生物工程类防晒剂方面的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供已知松材线虫体壁表被层或其提取物SC的新用途。

在经过对有关问题进行的大量研究之后，现在本申请人刚刚发现，松材线虫体壁表被层及其提取物SC具有强抗紫外活性。

实际上，本发明涉及松材线虫体壁表被层或其提取物SC或含有SC的组合物在防护紫外辐射产品中的应用，尤其是在防晒化妆品和纺织品中的应用。

含有上述松材线虫体壁表被层或其提取物SC或含有SC的组合物在防护紫外辐射产品中的应用。

尤其是在防晒化妆品和纺织品中的应用。

上述组合物中含有有效量的松材线虫体壁表被层或其提取物SC和载体。

上述应用中是将含有有效量的的松材线虫体壁表被层或其提取物SC或含有SC的组合物均匀分布于防护紫外辐射产品中，应用后防护紫外辐射产品中所含有SC的浓度大于等于0.1mg/ml。

实际上，应用后防护紫外辐射产品中所含有SC的浓度浓度越大，防护紫外辐射效果越好。综合成本考虑，大于等于0.1-1.0mg/ml为实际应用中常用的浓度。

当应用后防护紫外辐射产品中所含有SC的浓度大于等于1.0 mg/ml时，防护紫外辐射效果更好。综合成本考虑，1.0-10 mg/ml，为实际应用中常用的效果更好的浓度。

含有松材线虫体壁表被层或其提取物SC的组合物可为下组的剂型：可湿粉剂，可乳化浓缩物，水溶液，乳液，可喷洒溶液，油性或水性分散系，悬浮剂，粉剂，颗粒剂。

此外，上述含有松材线虫体壁表被层或其提取物SC的组合物还可以含有其它合适的化学杀菌剂、增效剂、微量元素、稳定剂、粘合剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、渗透剂、溶剂、充填剂等常用成分之一或任意组合。上述成份如8一聚赖氨酸、山梨酸、GW-540[亚磷酸三(1,2,2,6,6-五甲基哌啶醇)酯]、UVP-327[2-（2’-羟基-3’，5’-二叔苯基）-5-氯化苯并三唑]、水杨酸甲脂、二苯甲酮、水、乙醇、明质酸、水性氨基硅油等。当然，不限于以上所列举的物质。

上述含有松材线虫体壁表被层或其提取物SC的组合物可由松材线虫体壁表被层或其提取物SC和载体采用一般方法均匀混合而成。

为了更好地理解本发明的实质，下面将实验来说明通过松材线虫体壁表被层或其提取物SC对其在防护紫外辐射产品中的新用途。

实验１、繁殖性松材线虫与持久性四龄幼虫的365nm紫外线辐射死亡率。

1.1　试验材料

供试线虫：分离自江苏省南京市铁心桥黑松病木的松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、分离自寄生在黑松(P. thunbergii)体内的松墨天牛（Monochamus alternatus）体表的松材线虫4龄持久性幼虫

仪器：经济型高强度紫外灯（型号：SB-100P/F,北京博朗特科技有限公司），UV-A型自动换档紫外辐射照度计一台（北京师范大学光学仪器厂），CX21 Olympus光学显微镜（型号：CX21FS1），无菌操作台，LRH-250-G光照培养箱,内径3cm培养皿，内径7.5cm培养皿，800型离心沉淀器，等

培养基：马铃薯蔗糖琼脂培养基PDA。

1.2试验方法。

1.2.１、制备马铃薯蔗糖琼脂培养基PDA：将马铃薯蔗糖琼脂培养基PDA(马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂9～10g，水1000ml) 去皮洗净的马铃薯按量称取，切成小块，放在水中煮沸并维持20～30min用双层纱布过滤得马铃薯汁，补足到定量的水，于121℃、1.05kg/cm2下灭菌30min后倒平板备用

1.2.２、灰葡萄孢的培养：在无菌条件下将试管斜面纯化好的灰葡萄孢菌种(Botryis cinerea)挑取一些菌丝接种于PDA培养基平板上，放于23℃温箱中，湿度50%～60%，培养5～7天待菌丝长满斜面即可

1.2.３、松材线虫的培养：在马铃薯蔗糖琼脂培养基PDA平板上培养灰葡萄孢菌(Botryis cinerea)，待灰葡萄孢菌(B. cinerea)长满整个平板后，将已鉴定的松材线虫接到平板上，置于26℃的恒温箱中培养4～7d，将其移入4℃冰箱中待用。分离松材线虫采用贝尔曼漏斗法，使用时取定量的培养好的松材线虫用两层纱布包好、置于贝曼漏斗中、加适量的水，在常温下分离6～24h，用离心管收集线虫液约10ml/皿后镜检待用

1.2.４、松材线虫液的获得：将分离好的线虫液在2000转/min下转5分钟，松材线虫液分别一次用蒸馏水、无菌水洗生理盐水离心清洗一遍待用

1.2.５、松材线虫4龄持久性幼虫的获得：秋后末将感染松萎蔫病的黑松木断（有很多松墨天牛侵入空的）置于铁纱笼网中过冬，待翌年春季约5月份的时候松墨天牛羽化为成虫，捕获松墨天牛成虫，将其触角和腿部等附肢剪除，其它身体用解剖剪剪成小段用贝尔曼漏斗法常温下分离4龄持久性幼虫6～24h，用离心管收集线虫液约10ml/皿，后镜检待用

1.2.６、365nm紫外线辐射下的繁殖型松材线虫死亡率

（1）将分离好的松材线虫用配置成500条/ml的线虫浓度的0.9%生理盐水溶液；

（2）分别取1ml线虫液放入内径3cm的培养皿中，松材线虫液厚度为3mm；

（3）用紫外辐射照度计选取高强度的365nm紫外线区域,强度12680μw/cm2，在下列辐射时间30min，42min，48min，45min，50min下辐射松材线虫液；

（4）辐射能量的计算公式：1KJ/m2=1W/m2×秒/1000,1W/m2=100μw/cm2；

（5）辐射之后的松材线虫置于28℃温箱中24小时，后在显微镜下计数线虫死亡率和LC50

1.2.７、365nm紫外线辐射下松材线虫4龄持久性幼虫的死亡率：

（1）将分离好的松材线虫4龄持久性幼虫配置成500条/ml的线虫浓度的0.9%生理盐水溶液；

（3）用紫外辐射照度计选取高强度的365nm紫外线区域,强度12680μw/cm2,在下列辐射时间20min，30min，40min，45min，50min，53min下辐射松材线虫液；

（4）辐射能量的计算：1KJ/m²=1W/m²×秒/1000,1W/m²=100μw/cm2；

1.2.８、松材线虫死亡率的计算方法

（1）线虫存活率(survival rate，SR)按下列公式计算：

SR（%）=（Sx／S0）×100%

（2）线虫死亡率（mortality rate,MR）

MR(%)= 100%－SR（%）

式中Sx代表受紫外辐照松材线虫，S0代表对照松材线虫成活数。最后获取的SR值为三组平行样品的平均值x±s（standard diviation）。应用EXCEL进行毒力回归分析、计算LC50（median lethal concentration）,a ,b ,相关系数。

1.3　结果与分析

表1.1繁殖型松材线虫的紫外辐射死亡率（%）

紫外辐射能量值（KJ/m²）	重复数	线虫死亡率（%）	Y=a+bx	LC50 (KJ/m²)
					145	6	16±2.50
217	6	32±2.34
					290	6	42±2.32	Y=-11.7928+6.8671x	278.86
326	6	51±1.94
					362	6	79±3.25
384	6	92±1.94

表1.2松材线虫持久性四龄幼虫的紫外辐射死亡率（%）

紫外辐射能量值（KJ/m²）	重复数	线虫死亡率（%）	Y=a+bx	LC50(KJ/m²)
					217	6	10±2.16
290	6	35±3.35
					304	6	42±1.87	Y=-48.1634+21.383x	306.36
326	6	64±6.08
					348	6	86±2.94
362	6	96±2.58

图1.1为繁殖型松材线虫与松材线虫持久型4龄幼虫的紫外辐射死亡率对比图。

从表1.1和1.2中可以看出实验室培养的繁殖型松材线虫的365nm的紫外辐射LC50(KJ/m²)为278.86；而从松墨天牛体表分离的持久型4龄松材线虫的365nm紫外辐射的LC50(KJ/m²)为306.36，两者相差27.5KJ/m²，持久型4龄松材线虫LC50略高于繁殖性松材线虫。两者均具有较高的抵抗365nm紫外线辐射的能力。

本试验通过利用高强度365nm紫外线灯对繁殖型松材线虫和持久型4龄幼虫的辐射死亡率曲线的测定，结果表明，两者的死亡率随着紫外线能量值的升高而增长，其死亡率与紫外线的能量值基本成正相关的线性关系，在紫外线能量值约300KJ/m²以上时其死亡量增长加快，其中持久型4龄幼虫的抵抗力略高于繁殖型松材线虫。总而言之，松材线虫具有很高的抗UVA(长波紫外线)辐射的能力。

实验2、松材线虫体表细菌耐365nm紫外辐射的研究。

试验材料。

供试线虫:分离自江苏省南京市铁心桥黑松病木的松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)

仪器:经济型高强度紫外灯（型号：SB-100P/F,北京博朗特科技有限公司），UV-A型自动换档紫外辐射照度计一台（北京师范大学光学仪器厂），CX21 Olympus光学显微镜（型号：CX21FS1），无菌操作台，LRH-250-G光照培养箱，800型离心沉淀器，1ml玻璃匀浆器，自制P形管，离心管，移液枪，胶头滴管，等

培养基:马铃薯蔗糖琼脂培养基PDA，营养琼脂培养基（NA）（上海盛思生化科技有限公司）。

试验方法

按实验1中的方法制备马铃薯蔗糖琼脂培养基PDA

按实验1中的方法制备培养灰葡萄孢

按实验1中的方法培养松材线虫

松材线虫体表细菌悬液的获得：将分离好的松材线虫水溶液在显微镜下鉴定并计数线虫条数，总数约两万左右的线虫，用10mL无菌水离心2次，最后用10mL0.9%的生理盐水溶液再离心一次，后留下2mL上清液，吸取其中1mL的上清液，将此上清液用0.9%的生理盐水溶液稀释成10^-1～10^-4系列梯度备用。

松材线虫体表细菌悬液辐射后的细菌死亡率

（1）将松材线虫体表细菌悬液用生理盐水稀释成10^-1～10^-4系列梯度浓度后，每个梯度浓度的菌液分别接种20μL于NA培养基上，用P形管涂布均匀后，置于28℃温箱中培养48小时后检测细菌生长个数并计数；

（2）选取细菌生长个数最佳（细菌生长个数在100-300之间）的稀释梯度；

（3）最佳的稀释倍数选好之后，将其倍数下的线虫体表细菌悬液分装1mL于内径3cm的培养皿中，高度约为3mm,用紫外辐射照度计选取1000μW/cm2强度的365nm紫外辐射强度，辐射一系列的时间：60min，90min，120min，150min，200min，其紫外能量值分别为：36KJ/m²，54KJ/m²，72KJ/m²，90KJ/m²，120KJ/m²。后对线虫体表细菌悬液进行辐照；

（4）辐照结束后分别取20μL菌液于NA培养基上，用P形管涂布均匀后在28℃温箱中培养48小时后选取细菌生长个数适当的稀释倍数，记录细菌生长个数并计算其死亡率。

松材线虫辐射后其体表细菌的死亡率

（1）取分离好的松材线虫水溶液在显微镜下鉴定，并用浓度稀释法将其配成100μL /100条浓度的线虫0.8%生理盐水溶液；

（2）取100μL的松材线虫生理盐水溶液+0.8%900mL的生理盐水装于内径3cm的培养皿中，高度约3mm，用紫外辐射照度计选取8000μW/cm2强度的365nm紫外辐射强度,辐射一系列的时间：10min，15min，20min，30min，40min，其紫外能量值分别为：48KJ/m²，72KJ/m²，96KJ/m²，144KJ/m²，192KJ/m²。后松材线虫生理盐水溶液进行辐照；

（3）辐照之后的松材线虫生理盐水溶液用1mL玻璃匀浆器研磨，研磨后的液体用无菌水稀释成10^-1～10^-3系列的梯度浓度，每个梯度分别接种20μL于NA培养基上，在28℃温箱中培养48小时，后选取细菌生长个数适当的稀释倍数，记录细菌生长个数并计算其死亡率。

细菌死亡率的计算方法

（1）细菌存活率(survival rate，SR)按下列公式计算：

SR（%）=（Sx／S₀）×100%

（2）细菌死亡率（mortality rate,MR）

MR(%)= 100%－SR（%）

式中Sx代表受紫外辐照细菌，S₀代表对照细菌成活数。最后获取的SR值为三组平行样品的平均值x±s（standard diviation）。应用EXCEL进行毒力回归分析、计算LC₅₀（median lethal concentration）,a，b，相关系数。

结果与分析

表2.3.1松材线虫体表细菌悬液辐射后的细菌死亡率KJ/m²

365nm紫外能量值（KJ/m²）	死亡率	方程式	LC50（KJ/m²）
				36	34±1.0
54	50±1.2
				72	63±5.0	Y=-0.5044+3.2095x	51.88
90	77±0.9
				120	90±0.2

表2.3.2松材线虫辐射后其体表细菌的死亡率

365nm紫外能量值（KJ/m²）	死亡率	方程式	LC50（KJ/m²）
				48	9±2.7
72	17±4.2
				96	50±6.4	Y=-4.5266+4.7493x	101.37
144	63±6.2
				192	95±4.1

图2.3.3为两种处理的体表细菌死亡率对照图。

本试验通过对松材线虫的体表细菌进行365nm的高强度紫外辐射发现，单独体表细菌悬液进行紫外辐射时其体表细菌的死亡率随着紫外线能量值的增大其也逐渐的增大，两者为正相关的线性函数关系；当细菌位于线虫体表进行辐射时其体表细菌的紫外辐射死亡率也同紫外线的能量值成正相关的函数关系，但是前者的LC50和后者的相差较大，前者的LC50为51.88KJ/m²，后者的为101.37KJ/m²，两者相差较大，差距为49.49KJ/m²。

本试验通过对松材线虫保护细菌耐高强度365nm紫外辐射的研究，结果表明细菌位于线虫的体表物质保护下时，其抵抗紫外辐射的能力显著增强。

实验3、SC糖蛋白对松材线虫体表细菌Gc5-1A耐UVA紫外辐射的作用研究。

试验材料。

供试材料：

南京林业大学生物技术大楼60403实验室分离自松材线虫体表的荧光假单胞菌GcM5-1A，南京林业大学化学工程学院2043实验室提取的松材线虫体表外被层surface coat。

试验仪器：

经济型高强度紫外灯（型号：SB-100P/F,北京博朗特科技有限公司），UV-A型自动换档紫外辐射照度计一台（北京师范大学光学仪器厂），CX21 Olympus光学显微镜（型号：CX21FS1），无菌操作台，LRH-250-G光照培养箱，TGL-16M高速台式冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，SHZ-D(Ⅲ)循环式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)，水浴恒温震荡锅，物理称量台，超滤杯，蛋白质电泳仪(Amersham biosciences EP301)，电泳槽，电泳板，摇床，微量移液器，普通移液器，滤纸，0.45μm滤器，真空干燥器，0.45μm的微孔滤膜，烧杯，小药匙，滴管，指形管，离心管，玻棒，转子，加热震荡器，培养皿，三角漏斗，自制P形管，离心管，移液枪，胶头滴管，妙洁海绵百洁布等。

试验试剂

CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，C₁₉H₄₂NBr)，aprotinin(蛋白酶抑制剂)，Iodoacetami-

de(碘代乙酰胺，C₂H₄INO₅S)，PMSF(苯甲基磺酰氟，C₇H₇FO₂S)，Soybean trypsin inhinitor(大豆胰蛋白酶抑制剂)，异丙醇，丙酮，乙醚，SDS(十二烷基磺酸钠)，(NH₄)₂S₂O₈(过硫酸铵)，C₃H₅ON(丙烯酰胺)，甲基双丙烯酰胺，Tris碱(三羟甲基氨基甲烷)，浓HCl，甘油(丙三醇)，2-巯基乙醇，溴酚蓝，C₂H₅NO₂(甘氨酸)，TEMED(Tetramethylethylenediamine，四甲基乙二胺，C₆H₁₆N₂)，考马斯亮蓝R250 (Coomassie brilliant blue R250)，甲醇，冰醋酸，蛋白Marker5只(50ul装)等。

培养基

海绵泡沫法马铃薯蔗糖琼脂培养基PDA。

试验方法。

海绵泡沫法马铃薯蔗糖琼脂培养基PDA培养松材线虫

3.2.1.1海绵泡沫的制备

将海绵剪成1.5cm左右的小立方体，用0.3%～0.4%的高锰酸钾溶液浸泡10～15分钟，取出海绵水洗数次直至高锰酸钾残留清除干净，再用3%～5%的过氧化氢浸泡10分钟后用开水沸煮10分钟，取出海绵晾干后备用

3.2.1.2按实验1中的方法制备马铃薯蔗糖琼脂培养基PDA

3.2.1.3海绵泡沫法马铃薯蔗糖琼脂培养基PDA的制备

将制备好的海绵泡沫装入耐高温的塑料袋中，马铃薯蔗糖琼脂培养基PDA，若干三角瓶于121℃、1.05kg/cm2下灭菌30min，后在无菌室中将PDA倒入装有海绵泡沫的塑料袋中，并尽量使PDA均匀分布于海绵的表面，待其凝固后分装于三角瓶中备用

3.2.1.4按实验1中的方法培养灰葡萄孢

3.2.1.5松材线虫的培养与分离按实验1中的方法。

松材线虫体表外被层SC糖蛋白的提取：

（1）对收集的松材线虫液在显微镜下进行计数，每毫升样品的线虫总数=同一稀释度的三次重复得线虫平均数×稀释倍数，随机测量30条线虫的体长L和最大体宽；高速离心3min(10000r/min)，去除上清液，留底部线虫沉淀，再加蒸馏水后高速离心，反复多次，得到线虫沉淀；

（2）配制400mL，0.25%的CTAB溶液(包含蛋白酶抑制剂)：称量CTAB1g，aprotinin 2mg，Iodoacetamide800mg，PMSF80mg(需用4.6mL的异丙醇溶解)，Soybean trypsin inhinitor20mg，加约400mL蒸馏水溶于烧杯中，加热，搅拌，直至CTAB溶解；

（3）将粒化线虫倒入400mL，0.25%的CTAB溶液(包含蛋白酶抑制剂)中，置于37℃水浴锅中处理4h，每30min用玻棒搅拌一次；

（4）4h后，将溶液高速离心3min(10000r/min)，留上清液，去除沉淀，再用真空泵抽滤，上清液过0.45μm的微孔滤膜后置于4℃冰箱中静置12h，使CTAB结晶析出，再抽滤；

（5）用分子量为10kDa的滤膜超滤浓缩；

（6）配制100mL，0.5M的Tris-HCl(包含2%的SDS)，pH=6.8：称量242.4g的Tris碱溶于800mL蒸馏水中，定容至1L，于1.034×10⁵Pa灭菌20min，得到2mol/L的Tris碱；500mL，2mol/L的Tris碱，90mL浓盐酸，调pH=6.8，定容至1L，得到1mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH=6.8)；将1mol/L的Tris-HCl缓冲液稀释到原来的2倍，即得到0.5mol/L的Tris-HCl缓冲液；

（7）再浓缩：加入30mL，PH=6.8，0.5M的Tris-HCl(包含2%的SDS)至2mL酶液；

（8）将丙酮置于-20℃冰箱中24h后取出加入酶液中(按2:1的比例)，静置2h，离心5min(8000r/min)，去上层液，留下层沉淀；

（9）去除丙酮：在沉淀中加入乙醚，离心5min(8000r/min)，留下层沉淀；

（10）去除乙醚：真空泵连接真空干燥器抽提2h～6h，70℃；

（11）将沉淀用0.5MTris-HCl溶解，离心取上清液，即得到线虫surface coat糖蛋白，于-70℃保存。

松材线虫SC糖蛋白的SDS-PAGE电泳试验。

3.2.3.1储存液的配制

（1）2MTris-HCl(pH8.8)100mL：称取24.2g Tris碱，加50mL蒸馏水，缓慢的加浓盐酸调节pH为8.8(约加4mL)，让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100mL；

（2）1MTris-HCl(pH6.8)100mL：称取12.1gTris碱，加50mL蒸馏水，缓慢的加浓盐酸调节pH为6.8(约加8mL)，让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100mL；

（3）10%(w/v)SDS100mL：称取10gSDS，加入70mL蒸馏水在60℃搅拌溶解，待泡沫消失后，定容至100mL，室温保存；

（4）50%(w/v)甘油100mL：取50mL100%甘油，加入50mL蒸馏水，混匀即可；

（5）1%(w/v)溴酚兰10mL：称取100mg溴酚兰，蒸馏水定容至10mL，搅拌直到完全溶解，过滤除去聚合的染料。

3.2.3.2工作液的配制

（1）A液(丙烯酰胺储存液)：29.2g的丙烯酰胺和0.8g的甲叉双丙烯酰胺，加去离子水在37℃溶解，定容到100mL，pH≤7.0，0.45μm滤器过滤除菌，棕色瓶保存；

（2）B液(4×分离胶缓冲液100mL)：75mL2mol/L Tris-HCl(pH8.8)，4mL10% SDS，21mL蒸馏水，可在4℃存放数月；

（3）C液(4×堆积胶缓冲液 100mL)：50mL1mol/L Tris-HCl(pH6.8)，4mL10% SDS，46mL蒸馏水，可在4℃存放数月；

（4）10%的过硫酸铵 5mL：0.5g过硫酸铵，5mL蒸馏水，0.1mL分装；

（5）电极缓冲液1L：4g Tris，18.76g甘氨酸，1g SDS，定容到1L；

（6）5×样品缓冲液10mL：0.6mL1mol/L Tris-HCl(pH6.8)，5mL50%甘油，2mL10% SDS，0.5mL2-巯基乙醇，1mL1%溴酚蓝，0.9mL蒸馏水，可在4℃保存数周。

3.2.3.3考马斯亮蓝染色

（1）考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250 1.0g，甲醇450mL，冰醋酸100mL，蒸馏水450mL，定容到1L；

（2）考马斯亮蓝脱色液：甲醇100mL，冰醋酸100mL，蒸馏水800mL，定容到1L。

3.2.3.4组装模具

用海绵蘸取少量清洁剂，擦洗干净两块玻璃板，自来水冲洗3-5遍，再用无水乙醇冲洗2遍，晾干待用。将已清洗干净的两块玻璃板用封条封严，组装在电泳架上，浅玻璃板朝外(靠近操作者一侧)，固定结实(清洗玻璃板时动作要轻柔，切勿划破玻璃面；清洗干净之后，不要用手碰玻璃面)。

3.2.3.5制胶

（1）20%分离胶：吸取3mLA液，1mLB液，1mL蒸馏水，50μL 10%SDS，100μL D液，在小烧杯中摇匀，再加入E液2.5μL，立即混匀并用注射器吸取混合溶液，沿着玻璃板之间缝隙左上处，缓慢灌胶，一直到距前玻璃板上沿1.5cm处为止(当凝胶完全浸没玻璃板底的时候，留意观察是否漏胶。若漏胶，则立即停止灌胶，重新固定模具之后再继续。灌胶应缓慢进行，避免有气泡产生)；

（2）水膜封闭空气：在分离胶上面小心加入一层蒸馏水，以隔绝空气，促进凝胶聚合。等待约20～30min，交界面有明显的折光线，且倾斜模具，交界面不随之改变，为凝胶凝固良好。用滤纸小心吸干水分；

（3）5%分离胶：吸取0.17mLA液，0.13mLB液，0.69 mL蒸馏水，50μL10%SDS，20μLD液，在小烧杯中摇匀，再加入E液2.5μL，立即混匀，灌胶，到前玻璃板上沿即可；

（4）插上齿梳，确保无气泡。等待凝胶完全聚合，约需30分钟；

（5）小心拔出梳子，卸下封条，将玻璃板颠倒放置，使浅玻璃板朝内，固定在电泳架上。将整个电泳架放入电泳槽，在内外槽中倒入电泳缓冲液，内槽液面应在前后玻璃板之间。

3.2.3.6点样

（1）样品的预处理：20μL样品+10μL样品缓冲液，在沸水中煮沸10min，再在12000r/min条件下离心5min；

（2）上样：取离心后的上清液25μL上样，小心不要使样品漂散，同时吸取蛋白Marker10～20μL点样；

（3）电泳：连接好正负极导线，稳压100V，至溴酚兰到达分离胶底部，约需2h；

（4）染色：卸下胶板，剥离胶小心放入考马斯亮蓝染色液中浸泡，45℃摇床摇1h；

（5）脱色：将凝胶浸泡入考马斯亮蓝脱色液中，放入一小块海绵，45℃摇床摇4～8h，其间更换脱色液3～4次，至完全脱净。

比浊法测松材线虫体表细菌GcM5-1A生长曲线

（1）预先将GCM5-1A菌接种到牛肉膏蛋白胨（ＮＢ）培养液中，37℃振荡培养18h，备用；

（2）把分光光度计的波长调至420nm，开机预热10～15分钟；

（3）以未接种的牛肉膏蛋白胨（NB）培养液校正分光光度计的零点（以后每次测定都要重新校正零点）；

（4）取盛有50mL的无菌牛肉膏蛋白胨（NB）培养液的250mL锥形瓶3个，编号1、2、3号。各瓶中依次加入18h的GCM5-1A菌培养液1mL，37℃下振荡培养；

（5）于培养第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26h,分别用无菌移液器从各瓶中吸取培养液2mL，在分光光度计上测定OD₄₂₀值。若菌液太浓时，做适当的稀释，使OD₄₂₀值控制在0.0～0.4之间较好。经稀释后测得OD₄₂₀值要乘以稀释倍数，才是实际的OD₄₂₀值。

松材线虫体表细菌GcM5-1A的辐射死亡曲线的测定与松材线虫体壁表被层糖蛋白对体表细菌GcM5-1A的辐射死亡率的影响

（1）接种GCM5-1A细菌于牛肉膏蛋白胨（NB）培养液中，37℃振荡培养18h活化，之后将活化好的细菌液按接种量（1：50）接种于牛肉膏蛋白胨（NB）培养液中，37℃振荡培养至对数生长期；

（2）取对数生长期的GCM5-1A菌液20μL，稀释成10^-1～10^-4一系列的倍数，每个稀释倍数下的菌液分别接种20μL于NB培养基上在28℃温箱中培养48小时后检测细菌生长个数并计数；

（3）选取适当的稀释倍数（细菌生长量在100～300个左右）；

（4）将适当的稀释倍数的菌液取250μL再加100μL0.5MTris-HCl的菌液加放入内径3cm的培养皿中，处理取250μL菌液再加100μL线虫surface coat溶液（相当于10万条线虫的SC），用紫外辐射照度计选取1000μw/cm2强度的365nm紫外辐射强度, 辐射一系列的时间：20min，50min，110min，140min，200min，其紫外能量值分别为：12KJ/m²，30KJ/m²，66KJ/m²，84KJ/m²，120KJ/m²，后进行辐照；

（5）辐射之后的菌液接种20μL于NB培养基上在28℃温箱中培养48小时后检测细菌生长个数并计数；

（6）按实验1中的方法计算细菌死亡率。

松材线虫体壁表被层对体表细菌GcM5-1A的繁殖的影响

（1）接种GCM5-1A细菌于牛肉膏蛋白胨（NB）培养液中，37℃振荡培养１８h活化，之后将活化好的细菌液按接种量（1：50）接种于牛肉膏蛋白胨（NB）培养液中，37℃振荡培养至对数生长期；

（2）取对数生长期的GCM5-1A菌液20μL，稀释成适当的倍数（细菌生长量在100～300个左右）；

（3）取20μL菌液于1mL无菌离心管中，编号1、2、3、4、5、6号，分别加入100、80、60、40、20、0μLSC溶液，再加入0、20、40、60、80、100μL无营养水（无营养水为通过0.22μm滤膜的无菌水）；

（4）在28°C温箱中培养48小时后稀释成10^-1～10^-3系列的无菌水溶液，每个稀释倍数的无菌水溶液分别接种20μL于NB培养基上在28℃温箱中培养48小时后检测细菌生长个数并计数；

（5）选择合适生常量的稀释倍数计菌落数。

结果与分析。

图3.3.1松材线虫体表细菌GcM5-1A的生长曲线。

从图中可以看出，GcM5-1A的生长曲线的各个阶段，0-5h约为其延滞期，5～10h约为其指数期，10～20h约为稳定时期，20h后约为衰亡期。

图3.3.2为松材线虫体壁表被层电泳图。

其中， 2—松材线虫surface coat提取液,

3—蛋白分子量，单位是dalton(道尔顿) ,

4,5,6—蛋白谱带。

从图3.3.2的电泳图谱中可以看出至少有3条较清楚的蛋白谱带。在分子量94.0kDa-66.2kDa区间内有一条，接近66.2kDa有一条，接近35.0kDa有一条。

量尺度求其值:4:88.44kDa

5:60.14kDa

6:37.86kDa

平均：62147Da。

中SC的浓度与实际线虫体表SC总量的比值

（1）显微镜下测量30条线虫的体长L和最大体宽见下表：

随机测量30条线虫的体长和体宽数据表

计算求得平均体长：555.8μm

平均体宽：21.9μm

电镜测试线虫体表SC厚度约为：0.8μm

（2）10万条线虫SC的体积V₁=平均体长(CM)×平均体宽(CM)×SC厚度(CM)×线虫总数

=0.05558

Figure DEST_PATH_512477DEST_PATH_IMAGE002

0.00219×0.8×10^-4×10⁵

=0.0009738cm³

Figure DEST_PATH_242535DEST_PATH_IMAGE003

0.001cm³

（3）V₂=250μL菌液+100μL10万条线虫surface coat溶液

=350μL=0.35mL=0.35cm³

（4）V₁/V₂=0.001cm³/0.35cm³

=1/350

即处理GcM5-1A+SC中SC的浓度相当于线虫体表SC总量的1/350。

的死亡曲线及SC对其死亡率的影响曲线

表3.3.4.1 GcM5-1A的紫外辐射死亡曲线

365nm紫外能量值（KJ/m²）	死亡率	方程式	LC50（KJ/m²）
				12	28±4.625
30	45±2.75
				66	75±2.75	Y=2.1037+2.0029x	27.81
84	81±0.75
				120	90±0.5

表3.3.4.2 GcM5-1A+SC(350/1)的紫外辐射死亡曲线

365nm紫外能量值（KJ/m²）	死亡率	方程式	LC50（KJ/m²）
				12	14±2.675
30	40±1.875
				66	68±1.25	Y=1.6195+2.1288x	38.73
84	79±2.375
				120	84±2.125

图3.3.4.3为GcM5-1A与GcM5-1A+SC的死亡曲线比较图。

结论

通过对松材线虫Surface coat 对松材线虫体表致病细菌GcM5-1A耐UVA紫外辐射的作用研究表明：单独GcM5-1A的365nm紫外辐射曲线与紫外线的能量值成正相关的函数关系，其LC50（KJ/m²）为27.81；GcM5-1A+SC的365nm紫外辐射曲线与紫外线的能量值也成正相关的函数关系，其LC50（KJ/m²）为38.73。两者相差10.92KJ/m²。从中可以看出SC对GcM5-1A具有保护其耐紫外辐射的作用。

上述试验表明

[0071] 1.实验室培养的繁殖型松材线虫的365nm的紫外辐射曲线与紫外线的能量值成正相关的函数关系，LC₅₀(KJ/m²)为278.86；松墨天牛体表分离的持久型4龄松材线虫的365nm紫外辐射曲线与紫外线的能量值成正相关的函数关系， LC₅₀(KJ/m²)为306.36。

2．单独体表细菌悬液365nm的紫外辐射曲线与紫外线的能量值成正相关的函数关系，LC₅₀(KJ/m²)为51.88；位于线虫体表时的细菌紫外辐射曲线与紫外线的能量值成正相关的函数关系，LC₅₀(KJ/m²)为101.37。

3.单独GcM5-1A的365nm紫外辐射曲线与紫外线的能量值成正相关的函数关系，其LC₅₀（KJ/m²）为27.81；GcM5-1A+SC的365nm紫外辐射曲线与紫外线的能量值也成正相关的函数关系，其LC₅₀（KJ/m²）为38.73。

4.从SC对GcM5-1A的繁殖的作用研究得出，SC对GcM5-1A具有保护其耐紫外辐射的作用,随着SC的含量的增加，细菌繁殖的量逐渐增加，SC有效的促进了细菌GcM5-1A的繁殖。

本发明中的线虫表被层提取物SC具有强抗紫外活性，可以用于防护紫外辐射产品中，尤其是应用在纺织品和防晒化妆品中，可使其具有强抗紫外性，并可产生了巨大经济效益。

实验4　SC与芦丁的抗紫外性能比较

芦丁是天然的防晒剂，对紫外线具有极强的吸收作用。普通防晒用品添加10%的芦丁后，高达98%的紫外线可以被吸收。具有较好的防晒、防紫外线效果的防晒用品大多含有芦丁的成分。

试验方法如下：

（1）显微镜下测量30条线虫的体长L和最大体宽，根据实验３中的体长和体宽数据表

计算求得平均体长：555.8μm

平均体宽：21.9μm

电镜测试线虫体表SC厚度约为：0.8μm

（2）10万条线虫SC的体积V₁= 平均体长(CM)×平均体宽(CM)×SC厚度(CM)×线虫总数= 0.05558

Figure DEST_PATH_911414DEST_PATH_IMAGE004

0.00219 ×0.8×10^-4×10⁵= 0.0009738cm³

Figure DEST_PATH_435936DEST_PATH_IMAGE005

0.001cm³

（3）V₂=250μL菌液+100μL10万条线虫surface coat溶液=350μL=0.35mL=0.35cm³

（4）V₁/V₂=0.001cm³/0.35cm³=1/350

即处理GcM5-1A+SC中SC的浓度相当于线虫体表SC总量的1/350。

1g水=1cm³水在室温下的重量。

分别将中药材提取液用50%乙醇稀释成每毫升相当于生药0.5mg，以50% 乙醇为空白，在200～400nm 波长范围内进行扫描，确定各波长下的透光率。

分别计算各提取液

UV-C 区的200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm；

UV-B区的280nm、290nm、300nm、310nm、320nm

UV-A区的320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm

的平均透光率并换算成平均紫外线吸收率。

平均紫外线吸收率（%）=100% －平均透光率

10万条线虫SC的体积=0.001cm³ ≈0.001g水，相当于水体积是1.

线虫的量为：43万即0.0043g，SC的分子量为：62147Da

即摩尔浓度为：0.69*10^-7mol/L

同时配置芦丁相同的摩尔浓度。

芦丁（芸香叶苷·三水）的分子量为664.

称取：0.0115稀释500即可。

试验步骤：配好后的溶液测取T，

处理1，SC和CK 0.1mmoL/L的hris-Hcl,

处理2，芦丁溶于2mL的95%乙醇，溶解后用蒸馏水定容至500,

分别取2 mL试验样品于吸收池中即可测取数据。

试验仪器：UNICO-UV-2102C型紫外可见分光光度计，石英杯。

试验结果：图4.1，SC与芦丁在不同波长紫外光下的吸光度对照图。

上述试验表明：SC与芦丁相比，具有更强的紫外吸光度，其抗紫外性能更优。

实验5　松材线虫表被层提取物SC浓度与细菌GcM5-1菌存活率间关系。

试验材料、试验方法同实验3中相关内容，试验条件为温度：25℃；365nm的紫外辐射，能量值为5.0 KJ/m2，试验结果见图5.1：细菌存活率与表被层提取物SC浓度关系图，

该图中，横坐标为表被层提取物SC浓度，纵坐标为细菌存活率。

上述试验表明：细菌存活率随SC浓度增大而增大。当SC的浓度等于0.1mg/ml时，细菌即有60%的存活率，说明此浓度具有有效的防护紫外线性能。当SC的浓度等于1.0mg/ml时，细菌即有80%的存活率，说明此浓度防护紫外线性能更佳。当SC的浓度等于2.0mg/ml时，细菌存活率大于90%，说明此浓度下防护紫外线性能进一步提高。

附图说明

图1.1为繁殖型松材线虫与松材线虫持久型4龄幼虫的紫外辐射死亡率对比图，其中，横座标为365nm紫外线的能量值(KJ/m²)，纵座标为松材线虫死亡率(%)，—为繁殖型松材线虫死亡率(%)，---为持久型4龄幼虫的死亡率(%)

图2.3.3为两种处理的体表细菌死亡率对照图，其中，横座标为紫外辐射能量值(KJ/m²)，纵座标为线虫体表细菌死亡率(%)，—为松材线虫辐射后体表细菌的死亡率(%)，---为松材线虫体表细菌悬液辐射后的死亡率(%)

图3.3.1为松材线虫体表细菌GcM5-1A的生长曲线，其中，横座标为0D420测试时间，纵座标为0D420测试值，—为0D420值

图3.3.2为松材线虫体壁表被层电泳图

图3.3.4.3为GcM5-1A与GcM5-1A+SC的死亡曲线比较图，其中，横座标为365nm紫外线能量值（μw/cm²），纵座标为死亡率，—为GcM5-1A的死亡率(%)，---为GcM5-1A+SC的死亡率(%)

图4.1为SC与芦丁在不同波长紫外光下的吸光度对照图，其中，横座标为紫外波长（nm），纵座标为吸光度(%)，深灰色为SC吸光度(%)，浅灰色为芦丁吸光度(%)

图5.1 细菌存活率与表被层提取物SC浓度关系图，其中，横座标为SC浓度(mg/ml)，纵座标为细菌存活率(%)。

具体实施方式

实施例1，将含有微量元素、稳定剂的SC水溶液均匀分布于化妆品原料中，使得制成后的化妆品中SC浓度等于0.1 mg/ml，制成防晒化妆品。

实施例2，将含有微量元素、润湿剂、稳定剂的SC水溶液均匀分布于化妆品原料中，使得制成后的化妆品中SC浓度等于0.8 mg/ml，制成防晒化妆品。

实施例3，将松材线虫体壁表被层冻干，粉碎至100目，加入溶剂水、稳定剂二苯甲酮、防腐剂8一聚赖氨酸、增效剂（GW-540[亚磷酸三(1,2,2,6,6-五甲基哌啶醇)酯、配成SC浓度为5.0 mg/ml的溶液，防晒服装布料浸入溶液浸泡10分钟，取出晾干，制成防晒服装。

实施例4，将SC浓度等于0.5 mg/ml的水溶液均匀分布于化妆品原料中，使得制成后的化妆品中SC浓度等于0.5 mg/ml，制成防晒化妆品。

实施例5，将含有微量元素、润湿剂及SC的组合物添加化妆品原料中，使之均匀分布，使得制成后的化妆品中SC浓度为1.8 mg/ml，制成防晒化妆品。

实施例6，将遮阳伞面料浸入含有稳定剂二苯甲酮、山梨酸、增效剂UVP-327[2-（2’-羟基-3’，5’-二叔苯基）-5-氯化苯并三唑的SC浓度等于10mg/ml的SC水溶液中，浸泡10分钟，取出晾干，制成抗紫外线遮阳伞。

实施例7，将含有微量元素、润湿剂、稳定剂、及SC的组合物添加化妆品原料中，使之均匀分布，使得制成后的化妆品中SC浓度为100 mg/ml，制成防晒化妆品。

实施例8，将含有微量元素、润湿剂、增效剂GW-540[亚磷酸三(1,2,2,6,6-五甲基哌啶醇)酯、稳定剂水杨酸甲脂、充填剂亲水性氨基硅油的SC水溶液均匀分布于化妆品原料中，使得制成后的化妆品中SC浓度等于1.0 mg/ml，制成防晒化妆品。

当然，本发明有多种实施形式，只要将松材线虫体壁表被层或其提取物SC或含有松材线虫体壁表被层或其提取物SC的组合物应用于防护紫外辐射产品中即可。这对本领域技术人员而言，阅读本说明书后毋需付出创造性劳动即可再现出，在此就不详述了。

Claims

1.松材线虫体壁表被层在防护紫外辐射产品中的应用。

2.松材线虫体壁表被层的提取物SC在防护紫外辐射产品中的应用。

3.含有松材线虫体壁表被层提取物SC的组合物在防护紫外辐射产品中的应用。

4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：是在纺织品和防晒化妆品中的应用。

5.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：将含有松材线虫体壁表被层或其提取物SC或含有SC的组合物均匀分布于防护紫外辐射产品中，应用后防护紫外辐射产品中所含有SC的浓度大于等于0.1mg/ml。

6.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：将含有松材线虫体壁表被层或其提取物SC或含有SC的组合物均匀分布于防护紫外辐射产品中，应用后防护紫外辐射产品中所含有SC的浓度大于等于1.0mg/ml。

7.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：将含有松材线虫体壁表被层或其提取物SC或含有SC的组合物均匀分布于防护紫外辐射产品中，应用后防护紫外辐射产品中所含有SC的浓度为0.1-1.0mg/ml。

8.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：将含有松材线虫体壁表被层或其提取物SC或含有SC的组合物均匀分布于防护紫外辐射产品中，应用后防护紫外辐射产品中所含有SC的浓度为1.0-10 mg/ml。

9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述组合物含有稳定剂，并或含有其它合适的化学杀菌剂、增效剂、微量元素、粘合剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、渗透剂、溶剂之一或任意组合。