CN102250936B

CN102250936B - 利用锌指核酶技术培育斑马鱼的方法及其在建立药物筛选模型中的应用

Info

Publication number: CN102250936B
Application number: CN 201110144503
Authority: CN
Inventors: 顾爱华; 周勇
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing Medical University
Priority date: 2011-05-31
Filing date: 2011-05-31
Publication date: 2013-05-22
Anticipated expiration: 2031-05-31
Also published as: CN102250936A

Abstract

利用锌指核酶技术培育斑马鱼的方法及其在建立药物筛选模型中的应用，本专利使用这一技术构建了DNA修复酶Ogg1基因突变的斑马鱼转基因系，并以此为基础建立了脑保护药筛选的动物模型。本发明首先确定了Ogg1基因特异性锌指结合位点以及锌指蛋白序列，以组装的三联体锌指蛋白表达载体为模板，体外转录锌指蛋白编码RNA，并导入斑马鱼受精卵诱变。筛选得到的阳性Ogg1突变系鱼具有明显的神经元DNA易损性，可致脑部特异性缺陷。本发明同时提供将该脑神经元易损性的模型用于脑保护药物的方法。利用本发明的新模型及方法，为脑保护药物的筛选提供了经济快捷的新途径，有助于开发治疗脑损伤的药物。

Description

利用锌指核酶技术培育斑马鱼的方法及其在建立药物筛选模型中的应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种锌指蛋白核酶诱变技术培育DNA修复酶Ogg1基因突变系斑马鱼的方法，并应用于脑保护药物筛选模型。

背景技术

基因突变技术为生物体基因组修饰提供了有效的手段，是研究基因复杂功能和相互作用的重要工具。基因突变动物模型的建立能够极大的提高我们对大量相关人类疾病的病因学理解。通过对胚胎干细胞基因组靶向突变，使用小鼠胚胎建立突变鼠的技术已经较为成熟。转基因鼠模型虽然在进化地位上与人的亲缘关系较近，但却存在生命周期长、成本代价昂贵等不足，在药物筛选方面具有很大局限性。此外，由于难以建立胚胎干细胞系，此类基因组靶向突变技术在其他脊椎动物中大多失败。锌指核酶诱导突变是新兴基因组操作技术，可以对复杂基因组目的基因序列进行直接突变。锌指核酶是个功能蛋白的融合体---Cys₂His₂锌指蛋白与FokI切割域。工程化得到的锌指能够特异性结合DNA靶序列，并由核酸酶域提供DNA双链切割活性。锌指核酶介导的DNA断裂，双链断裂后被非同源末端连接修复，这种误差倾向的修复途径可在修复位点插入或删除片段以实现突变。这一新技术可应用于动植物的基因突变中。

斑马鱼具有遗传学和发育学的巨大优势，其基因背景清晰，生命周期短，胚胎体外发育、多枚胚胎发育同步，胚体透明，便于高通量、可视化的观察研究。与细胞和小鼠相比，在药物筛选方面具有高通量、快捷、经济、显著缩短筛选周期等优势，已经成为最受重视的脊椎动物模式动物，在多学科均显示巨大的潜力。因此，构建斑马鱼突变的转基因系将对于医药的研究有重大意义。

本发明旨在运用锌指核酶技术构建Ogg1基因突变的斑马鱼系模型，并应用于脑损伤保护性药物的筛选。碱基切除修复酶Ogg1是一个多功能糖苷酶，可识别DNA发现损伤的碱基、启动碱基切除修复途径、并参与切除高频的碱基损伤8oxoG，对于基因组复制的保真性具有至关重要的意义。Ogg1定位于染色体3p26.2，这一位点一直被认为在众多疾病中发生缺失。研究发现，无Ogg1活性的细胞可能会发生高突变的表型。Ogg1的功能缺陷加速了基因转换突变，因此与很多疾病相关，如癌症，神经退行性疾病等。有些观察认为Ogg1的突变失活可能是相关疾病发生的第一步。近期的研究表明，Ogg1的功能障碍与神经退行性疾病，如帕金森综合征及阿尔兹海默征，以及神经氧化应激损伤有着密切关系。Ogg1突变斑马鱼可用作神经退行性病变和氧化损伤的模型，以实现相应的脑保护药物的高通量筛选。较之传统的基因突变小鼠的策略，具有经济快速灵敏，以及高通量的优势，将为脑损伤的保护性药物筛选提供有力的工具。

发明内容

技术问题：本发明提供一种利用锌指核酶技术培育斑马鱼的方法及其在建立药物筛选模型中的应用。

技术方案：利用锌指核酶技术培育斑马鱼的方法，制备步骤为：Ogg1特异性锌指结合序列的确定：选择Ogg1基因的第2外显子SEQ ID NO.1以确定锌指特异性结合位点，所述特异性位点序列如SEQ ID NO.2～5所示；设计构建三锌指结合域，连接装配成三联体：其中F1作为氨基端的锌指，F2作为中间锌指，F3作为羧基末端的锌指；通过Addgene的Zinc Finger Consortium ModularAssembly Kit 1.0确定Ogg1特异性结合位点对应的锌指蛋白单元质粒pc3XB-F1、pc3XB-F2、pc3XB-F3，并通过连接反应构建锌指三联体pc3XB-F1/2/3；构建锌指蛋白表达质粒：从上面构建的质粒中使用PCR技术扩增编码锌指序列的DNA片段，引物如SEQ ID NO.6～7所示；使用XbaI和BamHI双酶切PCR产物及锌指表达质粒pMLM290和pMLM292(购自Addgene Inc.，Cambridge，USA)，通过T4 DNA连接酶连接制备一对Ogg1特异性锌指表达质粒；制备锌指编码mRNA：使用PmeI线性化锌指表达质粒，通过QIA快速PCR纯化试剂盒纯化；使用mMessage mMachine T7试剂盒进行合成mRNA；再利用上述的RNA反应体系进行PolyA尾巴加合反应，37℃，反应1h，纯化后，保存于-80℃，可获得高表达效率的mRNA；胚胎注射与筛选鉴定：将所得锌指编码mRNA注射胚胎卵黄内，转移至斑马鱼孵育系统，完成构建。

所述连接装配成三联体的方法为：连接锌指单元F1和F2：使用AgeI和BamHI酶切质粒pc3XB-F1，37℃消化结束后，加入碱性磷酸酶处理；使用XmaI和BamHI于37℃酶切质粒pc3XB-F2，纯化酶切后的pc3XB-F1质粒及F2片断，通过T4连接酶15℃连接过夜；电转化1μL连接体系到100μL大肠杆菌细胞中；将转化后的细胞生长20min，37℃；将细胞均匀涂布在氨苄LB培养平板上，37℃培养过夜；使用XbaI and BamHI酶切鉴定阳性克隆；连接F1-F2和F3单元：使用AgeI和BamHI酶切质粒pc3XB-F1/F2，磷酸酶处理；使用XmaI和BamHI酶切质粒pc3XB-F3，纯化酶切后的质粒以及F3片断通过T4连接酶以2∶1/插入片段：线性化载体比例混合；15℃反应过夜；质粒的转化鉴定过程如上所述，完成质粒构建。

利用锌指核酶技术培育斑马鱼的方法在建立药物筛选模型中的应用，步骤为：突变胚胎的收集：将建立的杂合子突变成鱼生长至3个月后设置于交配缸中交配，收集鱼卵，在E3培养液中孵育过夜，温度为28.5℃；在24hpf时根据表型分离得到纯合体，用于化合物筛选；将纯合体胚胎使用E3清洗后，移入96孔培养皿中，每孔加入6个，设置复孔；同时加入体积为150μL的E3培养液；完成模型建立可供药物筛选使用；在胚胎发育的24hpf阶段，饲喂待筛选药物，通过胚胎及幼鱼脑部的吖啶橙染色的荧光信号强弱，评价脑神经元的凋亡，筛选脑损伤保护药物。

有益效果：

本发明使用锌指核酶技术实现特异性的Ogg1基因突变，而非ENU诱发的随机突变筛选，快捷准确的构建了新的Ogg1突变斑马鱼。本发明基于Ogg1^mut突变系的脑部神经元易损性模型，将其用于脑保护药物的筛选。较之传统的基因突变小鼠的策略，具有经济快速灵敏，以及高通量的优势，为脑损伤的保护性药物筛选提供了新的有力工具。

附图说明

图1DNA修复酶Ogg1基因cDNA结构外显子示意图及第2外显子基因序列

图2Zifin3.3分析软件确定第2外显子的锌指对，以及每个锌指蛋白的3个独立单元的氨基酸编码，最终优化确定有效锌指核酸酶对。

图3锌指核酸酶作用于Ogg1基因靶点的原理示意图。

图4编码三联体锌指核酸酶质粒的组装流程图。

图5成功重组后三联体锌指核酸酶特异性结合序列的PCR扩增产物(300bp片段)。

图6阳性锌指蛋白质粒克隆的筛选。星号标记指示阳性克隆质粒。

图7锌指核酸酶RNA导入胚胎后的致Ogg1突变效果。Ogg1^mut为锌指RNA注射组胚胎，其Ogg1基因已突变。Ogg1(WT)为野生型组，未注射锌指RNA，Ogg1基因正常。

图8阳性突变系纯合体的Ogg1突变后的幼鱼。脑部有明显缺陷。

图9Ogg1^mut突变系斑马鱼模型用于药物筛选时的脑部吖啶橙(AO)染色的凋亡信号。

图10Ogg1^mut突变系斑马鱼模型快捷筛选脑损伤的保护性药物的技术流程图。

具体实施方式

1，Ogg1特异性锌指编码序列的确定及组装

(1).Ogg1基因序列分析

通过Ensembl基因组浏览器查询确定Ogg1基因结构，选择第2外显子进行分析，寻找适合的锌指特异性结合序列，如图1所示。

(2).通过Zifin3.3分析软件确定锌指对，以及每个锌指蛋白的3个独立单元的氨基酸编码。

将第2外显子序列输入到Zifin3.3软件中，选择默认设置。分析结果将给出一系列潜在的锌指识别位点。如图2所示，选择间隔5，6，7bp的成对序列进行进一步分析。

我们确定了两组9碱基对的锌指蛋白识别元件，两者之间的距离分别为5bp和6bp碱基。由于间距6bp通常得到较好的突变结果，故本实例选择第二组识别元件(结合位点2)为例。结果中同时给出了对应的碱基序列。如图2所示。

(3).锌指蛋白的模块组合

通过Addgene定购“Zinc Finger Consortium Modular Assembly Kit 1.0”选择如上所述的锌指蛋白单元质粒pc3XB-F1，pc3XB-F2，pc3XB-F3。(试剂盒内包括141个基于pc3XB的锌指单元质粒，本发明以结合位点2为例，其结合序列112-104对应试剂盒内质粒编号为F1：pc3XB-ZF80，F2：pc3XB-ZF2，F3：pc3XB-ZF15；序列127-119对应质粒编号为F1：pc3XB-ZF6，F2：pc3XB-ZF63，F3：pc3XB-ZF24。质粒序列见Addgene公司网站http://www.addgene.org/)构建一个假想的三锌指结合域(图3)，F1作为氨基端的锌指，F2作为中间锌指，F3作为羧基末端的锌指。连接装配成三联体，步骤如下(图4)：

1)连接锌指单元F1和F2：使用AgeI和BamHI酶切质粒pc3XB-F1，37℃，3小时。一旦消化结束，加入0.5个单位的磷酸酶，37℃反应5分钟。

2)使用XmaI和BamHI酶切质粒pc3XB-F2，37℃，3小时。纯化酶切后的质粒以及F2片断通过T4连接酶以2∶1/插入片段：线性化载体比例混合。15℃反应过夜。

3)电转化1μL连接体系到100μL大肠杆菌细胞中。使用所有100微升细胞，在2mm电转化槽中，2.5kV，2000hms，25μF.电转。

4)电穿孔后迅速加入1mL SOC培养基，将转化后的细胞悬浮在13mL培养管中，让细胞生长20min，37℃。

5)转移1mL培养液至无菌离心管中，16,000g离心30s。保留约100-200μL上清液，重悬细胞。将细胞均匀涂布在含有100μg/mL的氨苄LB培养平板上。37℃培养过夜。

6)分离质粒DNA使用过夜的培养液，用QIA质粒小提试剂盒。

7)酶切鉴定质粒DNA，使用XbaI和BamHI在37℃3h。于1.5％的琼脂糖凝胶电泳分析条带。

8)连接F1-F2和F3单元。使用AgeI和BamHI酶切质粒pc3XB-F1/F2，37℃，3小时。一旦消化结束，加入0.5个单位的磷酸酶，37℃反应5分钟。

9)使用XmaI和BamHI酶切质粒pc3XB-F3，37℃，3小时。通过QIAquick凝胶提取试剂盒，纯化酶切后的质粒以及F3片断通过T4连接酶以2∶1/插入片段：线性化载体比例混合。15℃反应过夜。

10)质粒的转化鉴定过程如上所示，使用XbaI和BamHI在37℃3h，构建正确的质粒应产生约300bp的片段(图5)。

2，构建锌指蛋白表达质粒

(1).从上面构建的质粒中扩增编码锌指序列的DNA片段，使用PCR技术。循环参数如下：

PCR条件为

95℃5min，35个循环(解链95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃45s)，72℃3min终止反应。4℃结束。

Primer1：5′-GACGATGATGACAAATCTAGACCCG-3′

Primer2：5′-CTAGTCTCTAGTTACTACTGTGCAGAGG-3′

(2).在1％琼脂糖凝胶电泳分析10μL PCR产物进行鉴定，正确的条带应该为300bp。如图5所示

(3).消化PCR产物，使用酶DpnI，37℃1h，以清除DNA质粒模板。使用XbaI处理样品1h，37℃，然后消化样品，使用BamHI处理样品1h，37℃.1h，以产生XbaI-BamHI黏性末端。使用XbaI消化质粒pMLM290和pMLM292，37℃1h.

(4).连接纯化的PCR产物及纯化的线性质粒，在室温反应10min.

(5).转化

50μL感受态细胞，加入上述所有连接反应体系20μL。0℃静置30min，42℃，30s热激转化。迅速加入200μL SOC培养基，让细胞生长60min，37℃，200转摇床。将细胞均匀涂布在含有100μg/mL的氨苄LB培养平板上。37℃培养过夜。

分离质粒DNA使用过夜的培养液，用QIA质粒小提试剂盒。酶切鉴定质粒DNA，使用XbaI and BamHI在37℃3h，于1.5％的琼脂糖凝胶电泳分析条带。正确的锌指质粒应产生约300bp的片段(图6)，对质粒进行测序。

3，制备锌指编码mRNA

(1).使用PmeI将制备好的锌指质粒线性化，37℃，2h.纯化通过QIA快速PCR纯化试剂盒。

(2).使用mMessage mMachine T7试剂盒进行合成，步骤如下

37℃反应2小时。然后加入TURBO DNA酶去除模板DNA，37℃反应15min。

(3).PolyA尾巴加合反应

*注：E-PAP为E.coli Poly(A)Polymerase。

37℃，反应1h。

(4).反应结束后，加入50μL氯化锂沉淀RNA，混匀后-20℃静置30min。4℃，14000g离心30min。弃上清，1mL 70％乙醇清洗。晾干后，溶于20μL DEPC水中，测定浓度后，保存于-80℃.

4，胚胎注射与筛选鉴定

(1).注射溶液配制及注射

1nL注射液注射于胚胎卵黄内，第二天观察表型。成功突变的胚胎如图所示(图7)：

(2).分离提取胚胎基因组DNA并测序确定Ogg1基因组编码改变。将大约60个锌指注射胚胎转移至斑马鱼孵育系统。2-3个月后，进行筛选。杂交之后，鉴定胚胎表型，对应于成功基因突变的阳性斑马鱼(图8)，进行测序确认。结果证明，锌指蛋白酶敲除效果较好。将阳性Ogg1突变斑马鱼传代，用于进一步相关研究。

5，脑损伤保护药物筛选模型的建立

(1).突变胚胎的收集

上述建立的杂合子突变成鱼生长至3个月后设置于交配缸中交配，收集鱼卵，在E3培养液中孵育过夜，温度为28.5℃。在24hpf时根据表型分离得到纯合体，用于化合物筛选。

(2).将纯合体胚胎使用E3清洗后，移入96孔培养皿中，每孔加入6个，设置复孔。同时加入体积为150μL的E3培养液。

(3).通过人工或自动加样设备于每孔加入配制好的待筛选化合物(本实例中为脑损伤保护药，体积为50μL，终浓度10μM)。同时设立溶剂对照组。完成后的加样板移入28.5℃孵箱培养过夜。

(4).数据的收集及分析

斑马鱼于48小时后进行观察，记录每组斑马鱼情况。首先更换新的E3培养液。然后通过吖啶橙活体染色(图9)，检测脑部细胞凋亡信号。方法如下：使用含吖啶橙浓度为2μg/mL的E3溶液加入培养板，培育20min。用斑马鱼卵培养液(即E3溶液)清洗两次后，使用荧光显微镜观察脑部吖啶橙染色，记录染色与未染色斑马鱼胚胎个数。荧光激发波长488nm，发射波长543nm。

(5).复筛

对于初筛得到的对突变鱼脑部凋亡有显著抑制作用的化合物进行复筛。使用48孔培养板，每孔加入20个杂合胚胎。筛检化合物设置精细剂量(如本实例中的脑损伤保护药50μM，10μM及1μM 3个浓度)。同时设置对照。操作如初筛所示。记录基本指标后，胚胎加入4％多聚甲醛固定，用于进一步分析。对于复筛确认的有效化合物，提示具有脑损伤的保护作用，可进一步进行深入的药效研究。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京医科大学

<120> 利用锌指核酶技术培育斑马鱼的方法及其在建立药物筛选模型中的应用

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 161

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctgacttgac ctgtctgatt tgatgttgta agtaaactgt aaagcagcag aatgtcccag 60

catgctctac tctctgccag ttgtaaggca tggcggtctc tgtcgtgtcc acggtcagag 120

cttcggctgg atctcactct gggatgtggt cagaccttca g 161

<210> 2

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

taagtaaac 9

<210> 3

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tctgctgct 9

<210> 4

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtggacacg 9

<210> 5

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gccgaagct 9

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gacgatgatg acaaatctag acccg 25

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctagtctcta gttactactg tgcagagg 28

Claims

1.利用锌指核酶技术获得锌指编码mRNA的方法,其特征在于制备步骤为：

a.Ogg1特异性锌指结合序列的确定：选择Ogg1基因的第2外显子SEQ ID NO.1以确定锌指特异性结合位点，所述特异性位点序列为112-gtggacacg-104和127-gccgaagct-119；

b.设计构建三锌指结合域，连接装配成三联体：其中F1作为氨基端的锌指，F2作为中间锌指，F3作为羧基末端的锌指；通过Addgene的Zinc Finger Consortium Modular Assembly Kit 1.0确定Ogg1特异性结合位点对应的锌指蛋白单元质粒pc3XB-F1、pc3XB-F2、pc3XB-F3，并通过连接反应构建锌指三联体pc3XB-F1/2/3；连接装配成三联体的方法为: 连接锌指单元F1和F2：使用AgeI和BamHI酶切质粒pc3XB-F1， 37℃消化结束后，加入碱性磷酸酶处理；使用XmaI和BamHI于37℃酶切质粒pc3XB-F2，纯化酶切后的pc3XB-F1质粒及F2片断，通过T4连接酶15℃连接过夜；电转化1μL连接体系到100μL 大肠杆菌细胞中；将转化后的细胞生长20min，37℃；将细胞均匀涂布在氨苄LB培养平板上，37℃培养过夜；使用XbaI and BamHI酶切鉴定阳性克隆；连接F1－F2和F3单元：使用AgeI和BamHI酶切质粒pc3XB-F1/F2，磷酸酶处理；使用XmaI和BamHI酶切质粒pc3XB-F3，纯化酶切后的质粒以及F3片断通过T4连接酶以2：1/插入片段：线性化载体比例混合；15℃反应过夜；质粒的转化鉴定过程如上所述，完成质粒构建；

c.构建锌指蛋白表达质粒：从上面构建的质粒中使用PCR技术扩增编码锌指序列的DNA片段，引物如SEQ ID NO.6～7所示；使用XbaI和BamHI双酶切PCR产物及Addgene公司的锌指表达质粒pMLM290 和 pMLM292，通过T4 DNA连接酶连接制备一对Ogg1特异性锌指表达质粒；

d.制备锌指编码mRNA：使用PmeI线性化锌指表达质粒，通过QIA快速PCR纯化试剂盒纯化；使用mMessage mMachine T7试剂盒进行合成 mRNA；再利用上述的RNA反应体系进行PolyA尾巴加合反应，37℃, 反应1h，纯化后，保存于-80℃，获得锌指编码mRNA。