CN102247347A - 牛磺酸在制备预防成瘾药物引起的神经细胞损伤的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了牛磺酸在制备预防成瘾药物引起的神经细胞损伤的药物中的用途，还提供了一种药物组合物，它是以牛磺酸为活性成分，加入药学上可接受的辅料制备而成的药剂。本发明提供的牛磺酸能显著降低甲基苯丙胺、吗啡等成瘾药物对神经细胞的损伤，增强细胞内的氧化物活性，减少细胞的凋亡，可以用于制备成瘾药物引起的神经细胞损伤的保护药物。

Description

牛磺酸在制备预防成瘾药物引起的神经细胞损伤的药物中的用途

技术领域

本发明涉及牛磺酸的应用，特别涉及它在制备预防成瘾药物引起的神经细胞损伤的药物中的用途。

背景技术

药物成瘾是以失去控制地应用某种成瘾药物为特征的慢性、复发性疾病，其严重地影响人们身心健康和社会稳定，是全球关注的热点。成瘾药物主要作用于脑内特殊奖赏系统，涉及多巴胺(dopamine DA)、阿片肽、r-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid GABA)等递质系统，且作用部位集中在腹侧被盖区(ventral tegmental area VTA)、伏隔核(nucleus accumbens NAc)、扣带回等，导致这些部位出现功能和结构变化。成瘾药物的种类多，包括冰毒、摇头丸、K粉、可卡因、阿片类药物等，新近研究发现，目前我国流行的毒品中以阿片类物质和冰毒为主。

冰毒，即甲基苯丙胺(Methamphetamine，METH)，其化学式为C₁₀H₁₅N，分子量为149.2g/mol，IUPAC中文名称为N-甲基-1-苯基-丙烷-2-胺。该药小剂量时即可引起短暂的兴奋，具有抗疲劳作用，大剂量或重复则会产生中毒性脑病，出现躯体症状和精神障碍，长期滥用冰毒可造成慢性中毒(王婷等，冰毒滥用者84例脑电图分析，中国实用神经病杂志，2008年第12月第11卷，第39-41页)。该药物的滥用和成瘾与脑组织的破坏和损害存在明确的因果关系，严重者可导致大脑相关脑区，如脑岛、基底节区的病理表现(王婷等，60例冰毒依赖患者戒断过程中的脑电图分析，神经疾病与精神卫生，2008年第8卷第4期，第307-309页)。甲基苯丙胺对动物及人类大脑纹状体多巴胺能神经元的毒性作用机制主要有：多巴胺信号转导的影响、多巴胺的氧化作用、谷氨酸介导的兴奋性毒性作用、氧化应激和细胞因子的形成、线粒体功能紊乱、诱导神经细胞发生凋亡、神经胶质细胞的活化以及高热。

吗啡(Morphine)，其化学式为C₁₇H₁₉NO₃，分子量为285.4，IUPAC中文名称为7，8-二脱氢-4，5-环氮-17-甲基吗啡喃-3，6-二醇。它是海洛因的体内活性代谢产物，是临床上广泛使用的镇痛镇静药物，长期使用吗啡可导致药物成瘾与药物耐受，进而引起各系统器官中毒性损害，对神经系统损害尤为显著，已成为近年医学界所重视和关注的新病种。研究发现：吗啡的长期使用可导致大鼠脊核、前额皮质、海马及纹状体等脑区神经元细胞的凋亡(Gao et al.Neurochem Int.2007，50：386-394)；亲代如果在孕期滥用吗啡或者海洛因等阿片激动剂会导致子代大脑发育障碍并且出现子代长期的神经行为异常(YanaiJ et al.Functional changes after prenatal opiate exposure related to opiatereceptors’regulated alterations in cholinergic innervation.Int JNeuropsychopharmacol 6，253-265(2003))；吗啡对人体及大鼠神经系统的毒性作用机制包括氧化性损伤和神经细胞的程序性死亡(Calderón Guzmán etal.2009，Biomed Pharmacother 63：517-521；Guzmán et al.2006，Neurochem Res31：549-554；tici et al.2004，Int J Neurosci 114：1001-1011)。

苯丙胺(Amphetamine)，又名安非他明，其分子式为C₉H₁₃N，分子量为135.21，IUPAC命名为3-苯基-1-丙胺。苯丙胺是苯丙胺类成瘾药物的衍生物之一，是中枢兴奋药及抗抑郁药物，使用不当可导致成瘾，并且对机体造成损害。毒性反应主要是严重的食欲不振，疲劳乏力，意志消沉等。

可卡因，又称古柯碱，其分子式为C₁₇H₂₁NO₄，分子量为303.353g/mol，IUPAC命名为甲基(1R，2R，3S，5S)-3-苯甲酰-8-甲基-氮杂双环[3.2.1]辛烷-2-羧酸甲酯(methyl(1R，2R，3S，5S)-3-(benzoyloxy)-8-methyl-8-azabicyclo[3.2.1]octane-2-carboxylate)。它是常见的毒品之一，可卡因吸食会对身体造成严重损害，会阻碍脑部神经传递质多巴胺，并影响肾上腺素、血清素的正常摄取，还会严重影响神经系统、血管的收缩、眼球的扩大及导致心跳不正常。

综上，上述四种成瘾药物均会导致脑神经细胞的损伤，而对这些成瘾药物引起的脑神经损伤尚缺乏有效的防治手段。

牛磺酸是动物和人体内含量仅次于谷氨酸的一种含硫氨基酸，是动物体内唯一游离的氨基酸，在神经系统、血管平滑肌和骨骼肌等可兴奋组织中含量丰富，且代谢旺盛。近年研究发现，牛磺酸可保护神经系统细胞免受兴奋性氨基酸导致的兴奋性毒性、具有抗惊厥、增强神经细胞对缺血缺氧耐受性和细胞膜稳定性等广泛的生物学效应，是调节机体正常生理功能的重要物质。

现有文献中，尚无将牛磺酸用于制备降低甲基苯丙胺、吗啡等成瘾性药物对神经细胞的损伤的药物的相关报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种保护甲基苯丙胺和吗啡损伤的神经细胞的方法。

本发明提供了牛磺酸在制备预防成瘾药物引起的神经细胞损伤的药物中的用途。

所述的神经细胞是脑神经细胞；所述的脑神经细胞是伏隔核神经细胞或者前额皮质神经细胞。

所述的牛磺酸的含量为40-80μM，优选为60-80μM，进一步优选为80μM。

所述的成瘾药物是阿片类药物、甲基苯丙胺；所述的阿片类药物是吗啡。

本发明还提供了一种药物组合物，其特征在于：它是以牛磺酸为活性成分，加入药学上可接受的辅料制备而成的药剂。

本发明提供的牛磺酸能显著降低METH、吗啡等成瘾药物对神经细胞的损伤，增强细胞内的氧化物活性，减少细胞的凋亡，可以用于制备预防METH、吗啡等成瘾药物引起的神经细胞损伤的药物。

附图说明

图1反复的甲基苯丙胺处理实验动物的行为敏化测定结果

图2未经处理的动物的伏隔核和前额皮质¹H NMR结果，左边为伏隔区，右边为前额皮质

图3甲基苯丙胺处理的动物伏隔核和前额皮质¹H NMR结果，左边为伏隔区，右边为前额皮质

图4为PLS-DA软件分析的得分图，左边为伏隔区，右边为前额皮质

图5为PLS-DA软件分析的因子载荷图，左边为伏隔区，右边为前额皮质

图6PC12细胞对METH的剂量依赖性结果图

图7C6细胞对吗啡的剂量依赖性结果图

图8PC12细胞对可卡因的剂量依赖性结果图

图9不同浓度牛磺酸对METH损伤的PC12细胞数量的影响

图10不同浓度牛磺酸对吗啡损伤的C6细胞数量的影响

图11不同浓度牛磺酸对可卡因损伤的PC12细胞数量的影响

图12不同浓度牛磺酸对苯丙胺损伤的PC12细胞数量的影响

图13牛磺酸对METH损伤的PC12细胞的CAT及GPx酶活性的影响，其中A为CAT活力，B为GPx活性。

图14牛磺酸对吗啡损伤的C6细胞的CAT及GPx活性的影响，其中A为CAT活力，B为GPx活性。

图15牛磺酸对METH诱导的PC12细胞凋亡的影响。左上角为对照组，右上角为牛磺酸组，左下角为METH组，右下角为牛磺酸+METH组。

图16牛磺酸对吗啡诱导的C6细胞凋亡的影响。左上角为对照组，右上角为牛磺酸组，左下角为吗啡组，右下角为牛磺酸+吗啡组。

图17Hoechst 33258荧光染色检测牛磺酸保护吗啡诱导的C6细胞凋亡的实验

图18牛磺酸对吗啡诱导C6细胞Bcl-2蛋白和Caspase-3蛋白水平的表达的影响

图19牛磺酸对甲基苯丙胺处理大鼠的神经保护作用

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1METH诱导行为敏化动物模型的建立及牛磺酸含量的测定

1、实验动物：本实验所用于造模的动物为雄性Wistar大鼠，体重为180-200g，造模本实验中所有的动物操作均符合AAALAC要求，饲养适应5天后将动物随机分为实验组和对照组，每组10只，实验组动物以0.1％的给药体积皮下注射2.5mg/kg METH，对照组皮下注射生理盐水。根据文献报道，间隔10小时给药更能模拟甲基苯丙胺依赖者的给药习惯，所以每天给药两次，每天早8:00点、晚6:00点各注射一次，连续注射7天。

2、检测

(1)行为敏化的检测

在经甲基苯丙胺处理后的第0、1、3、5天第二次给药后30分钟时进行自发活动检测，将动物放入自发活动检测箱中适应1分钟后检测10分钟内动物的自发活动情况，以10分钟内的运动距离和运动轨迹来表示，采用EthoVision6.0软件(EthoVision 6.0；Noldus Information Technology，Leesburg，VA)自动跟踪动物的行为。将甲基苯丙胺组动物在10分钟内的运动距离和对照组相比以此来判定动物对甲基苯丙胺的反应。

(2)牛磺酸含量的检测

末次给药后30分钟内快速断头处死动物，然后迅速分离动物脑区，置于液氮速冻，然后置-80℃深低温冰箱冷冻。样本处理：取出冰冻伏隔核和前额皮质(30-100mg)，冰块低温条件下(4℃)采用杜恩斯玻璃匀浆器匀浆，然后加入6％(w/v)的高氯酸1ml。将匀浆后的液体在10,000g，4℃离心10分钟，取上清液加KOH (5M)调整pH值至7，再离心去掉高氯酸盐，然后取上清液，放入冷冻干燥机中，真空条件下冻干36h。取出干燥后的样品，加入450μl D₂O和0.25mM 3-三甲基甲硅烷基-2，2，3，3-四氘代丙酸钠(3-trimethylsilyl-2，2，3，3-tetradeuteriopropionate，TSP)，然后将混合液转入5mm核磁管待分析。将已配置好的装有脑样本的5mm核磁管放入核磁共振仪中进行¹H核磁扫描。采用Burker公司600MHz Bruker-Av II核磁共振仪(Bruker Co.，Germany)，所有样本的扫描温度设置为300K，采样点数32K，累加次数64次。对所有样本进行预饱和处理、核磁仪的ZGPR脉冲序列在水峰处进行重复测试等方法将水峰进行压制，取如下参数：relaxation delay＝1.3s；t1＝3μs；mixing time＝150ms；spectral width＝12ppm；time domain＝32,000data points，而获得了样本的核磁图谱。

3、结果

(1)METH处理的动物的行为敏化情况

结果如图1所示，经过5天的METH处理后，动物在检测的10分钟内的运动距离较对照组明显增加(P＜0.05)，活动频率显著提高，表现为在检测箱内动物的运动轨迹图明显较为密集。

(2)牛磺酸含量测定

¹H NMR分析结果如图2-5所示，与对照组相比，牛磺酸的化学位移为3.44，该点载荷图中远离原点，代表牛磺酸在METH成瘾组和对照组之间具有差异，通过积分得出牛磺酸的含量在METH成瘾组中含量降低。

上述实验说明METH处理实验动物可导致动物的行为敏化，同时造成脑内牛磺酸含量的降低，特别是伏隔核和前额皮质区的牛磺酸含量降低，说明牛磺酸与METH等成瘾药物引起的药物成瘾有关系，且METH的主要作用部位为伏隔核和前额皮质。

实施例2CCK-8方法检测不同浓度牛磺酸对METH、苯丙胺和可卡因损伤的PC12细胞和吗啡损伤的C6细胞的影响

1、实验材料

PC 12细胞是一种来自大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤的克隆细胞系。在正常情况下培养，PC 12细胞不仅在形态上，而且在生理及生化的许多方面都与肾上腺髓质细胞相似，加入神经生长因子(NGF)后，PC 12细胞在形态上向交感神经元分化，同时伴有生理及生化方面的变化，最终导致PC 12细胞呈现神经元样的功能。因其具有可传代培养的特点，作为神经元细胞模型，广泛用于神经生理、病理及药理方面的研究。C6细胞系，来自于神经胶质瘤，呈现出星形胶质细胞的性质，膜表面表达mu-阿片受体，而吗啡与细胞间主要通过mu-受体发挥作用，正是由于C6细胞具有这些性质，因此被广泛用于吗啡的毒理学和药理学研究。

PC12高分化细胞，用含10％胎牛血清、5％马血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM于5％CO2，37℃细胞培养箱中玻璃方瓶培养。C6细胞，大鼠神经胶质瘤细胞，用含5％马血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM于5％CO2，37℃细胞培养箱中玻璃方瓶培养。当细胞长至约80％满时将细胞转移至96孔板或六孔板用于实验，用CCK-8法检测各组的细胞存活率，在一定细胞范围内，吸光度的多少和细胞量成正比关系。

2、试验方法

(1)剂量依赖性试验

胰酶消化PC12细胞和C6细胞后制造单细胞悬液，调整PC12细胞密度为1.5×10⁴/ml，C6细胞密度为1.0×10⁴/ml，加于96孔板，200μl/孔，4个复孔。细胞孵育24h后，移除细胞培养液，分别加入200ul/孔的终浓度分别为0，0.5，1，1.5mM的METH和0，1，2，3，4mM的吗啡以及0.3125，0.65，1.25，2.5，5mM的可卡因，分别作用24h，48h和24h后，移除细胞培养液，加入100μl/孔的CCK-8，孵育1.5h后在450nm波长处测定吸光度。

(2)保护试验

根据依赖性实验的结果，按照步骤(1)所述的方法接种两块96孔板，加入200ul/孔的终浓度分别为10，20，40，60，80μM的牛磺酸和终浓度为1.5mM的METH或者终浓度分别为10，20，40，60，80μM的牛磺酸和终浓度为3mM的吗啡，分别作用24h和48h后，按照上述方法测定在450nm处的吸光度。

按照上述方法接种两块PC12细胞的96孔板，在PC12细胞板中加入200ul/孔的终浓度分别为10，20，40，60，80μM的牛磺酸或者终浓度为2mM的可卡因以及终浓度分别为10，20，40，60，80μM的牛磺酸和终浓度为1.5mM的苯丙胺，作用24h后，按照上述方法测定在450nm处的吸光度。

2、实验结果

剂量依赖实验结果如图6～8所示，在METH、吗啡和可卡因的浓度分别为1.5mM、4mM和5mM时，PC12细胞的C6细胞的损伤最为严重。以细胞数量减少50％左右为准，确定后续的实验中METH、吗啡和可卡因的浓度分别为1.5mM、3mM和2mM。

保护试验结果如图9～12以及表1-2所示，表2根据表1的结果计算得到：

表1牛磺酸对METH、吗啡、苯丙胺、可卡因损伤的神经细胞的保护率

牛磺酸(μM)	80	60	40	20	10
						METH(1.5mM)	21.38	14.76	4.91	5.28	7.40
吗啡(3mM)	23.40	18.73	10.114	5.71	5.77
						苯丙胺(1.5mM)	17.33	10.62	11.83	8.76	7.55
可卡因(2mM)	14.21	14.28	8.74	5.60	2.94

表2牛磺酸对METH、吗啡、苯丙胺、可卡因损伤的神经细胞的保护率的显著性差异(t检验)

备注：1代表METH(1.5mM)，2代表吗啡(3mM)，3代表苯丙胺(1.5mM)，4代表可卡因(2mM)，12表示METH和吗啡在相应浓度的牛磺酸保护率的比较，13表示METH和苯丙胺在相应浓度的牛磺酸保护率的比较，后面几组以此类推，其中以P＜0.05为有显著性差异。

由图9～12和表1-2可知：

1、与对照组相比，60-80μM牛磺酸可显著提高METH致损伤的PC12细胞的活细胞数量，其中，80μM的牛磺酸使METH损伤的PC12细胞的存活率升高了20％以上(P＜0.01)；与空白组相比，80μM的牛磺酸细胞存活率无明显影响，说明80μM的牛磺酸对PC12细胞无明显的伤害作用。

与对照组相比，40-80μM牛磺酸可显著提高吗啡致损伤的C6细胞的活细胞数量，80μM的牛磺酸使吗啡损伤的C6的存活率升高了22％以上(P＜0.001)；与空白组相比，80μM的牛磺酸对C6细胞的增殖无明显影响，说明80μM的牛磺酸对C6细胞无明显的伤害作用。

与对照组相比，40-80μM牛磺酸可显著提高苯丙胺致损伤的PC12细胞的活细胞数量，并且只加80μM的牛磺酸对PC12细胞的增殖无明显影响。

与对照组相比，40-80μM牛磺酸可显著提高可卡因致损伤的PC12细胞活细胞数量，并且只加80μM的牛磺酸对PC12细胞的增殖无明显影响。

综上，牛磺酸可以降低METH、吗啡、苯丙胺、可卡因等成瘾药物导致的神经细胞损伤。

2、牛磺酸对METH、吗啡致损伤的神经细胞的保护作用较强，其剂量为80μM时，保护率分别为21.38％和23.40％；80μM牛磺酸对吗啡致损伤的神经细胞的保护率与80μM牛磺酸对苯丙胺、可卡因致损伤的神经细胞的保护率有显著差异。

3、不同剂量的牛磺酸对METH、吗啡、苯丙胺、可卡因四种成瘾药物致损伤的神经细胞的保护作用不成线性关系；

4、牛磺酸对四种成瘾药物致损伤的神经细胞的保护作用与牛磺酸的剂量的关系不相同：牛磺酸对METH损伤的神经细胞的保护作用随着剂量的增加，其保护率先降低后升高；牛磺酸对吗啡损伤的神经细胞的保护作用随着牛磺酸剂量的增加，其保护率先降低后升高；牛磺酸对苯丙胺损伤的神经细胞的保护作用随着牛磺酸剂量的增加，其保护率先升高，后降低，后又升高；牛磺酸对可卡因损伤的神经细胞的保护作用随着牛磺酸剂量的增加，其保护率先升高后降低；

5、牛磺酸对四种成瘾药物致损伤的神经细胞的最佳保护剂量不同。

实验证明，牛磺酸对METH和吗啡损伤的神经细胞有保护作用，可以用于制备预防METH或吗啡引起的神经细胞损伤的药物；尽管METH、吗啡、苯丙胺以及可卡因的结构类似，但是牛磺酸对它们的作用趋势却不相同。

实施例3牛磺酸对METH损伤的PC12细胞以及吗啡损伤的C6细胞的CAT及GPx活性的影响

按照过氧化氢酶试剂盒说明书和谷胱甘肽试剂盒说明书操作对PC12细胞和C6细胞的胞内蛋白分别检测过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活力。

检测结果如图13和图14所示。由图13可知，对于METH诱导的PC12细胞，与无牛磺酸保护组相比较，牛磺酸保护的PC12细胞组的CAT的活力显著增高(P＜0.05)，GPx的活力也显著增高(P＜0.05)。同样，由图14可知，对于吗啡诱导的C6细胞，与无牛磺酸保护组相比较，牛磺酸保护的C6细胞组的CAT活力和GPx活力显著升高(P＜0.05)。

实验证明，牛磺酸可以通过氧化性损伤途径降低METH和吗啡所致的神经细胞损伤。

实施例4流式双染检测牛磺酸保护METH损伤PC12细胞和牛磺酸保护吗啡损伤C6细胞的细胞凋亡实验

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV是一种分子量为35-36kD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。碘化丙碇(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。将Annexin V与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-/PI-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FITC+/PI+)；而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC+/PI-)。

实验结果如图15和16所示。根据图15可知METH组的细胞凋亡率为35.14％，而牛磺酸+METH组的凋亡率为5.86％，根据图16可知吗啡组的细胞凋亡率为29.16％，而牛磺酸+吗啡组的凋亡率为7.91％。说明牛磺酸可降低METH对PC12细胞的凋亡损伤和吗啡对C6细胞的凋亡损伤。

实验证明牛磺酸可以保护神经细胞免受凋亡损伤。

实施例5Hoechst 33258荧光染色检测牛磺酸保护吗啡损伤C6细胞凋亡的作用实验

Hoechst染液是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。该染料能少许进入正常细胞膜，使其染上低蓝色，而凋亡细胞的膜通透性增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst染料比正常细胞的多，荧光强度要比正常细胞中要高。

用胰酶消化C6细胞，制造单细胞悬液，接种于6孔板，每孔细胞浓度为0.6×10⁵/ml，孵育24h后加入吗啡和牛磺酸，它们的终浓度分别为0mM+0μM，0mM+80μM，3mM+80μM，3mM+0μM(吗啡+牛黄酸)。作用48h后，弃去细胞培养液，用1ml/孔预冷PBS洗涤细胞一次，再用1ml/孔的70％的冰乙醇固定细胞，固定时间约为10min，弃去固定液，再用1ml/孔预冷PBS洗涤细胞一次，最后用Hoechst染液浸染细胞，500μl/孔避光染色5min，相差显微镜上观察细胞凋亡形态和荧光显微镜上观察细胞凋亡情况。

实验结果如图17所示。由图17可知，吗啡组的荧光强度比正常组、牛磺酸组和吗啡+牛磺酸组均要强，说明牛磺酸可以降低吗啡对C6细胞的损伤作用。

实验证明牛磺酸可以减少神经细胞的凋亡损伤。

实施例6牛磺酸可提高吗啡诱导C6细胞Bcl-2蛋白和Caspase-3蛋白水平的表达

按照实施例5所述的方法接种C6细胞六孔板，每孔细胞浓度为0.6×10⁵/ml，孵育24h后加入吗啡和牛磺酸，它们的终浓度分别为0mM+0μM，0mM+80μM，3mM+80μM，3mM+0μM(吗啡+牛黄酸)。48h后移除培养液，用预冷PBS洗涤细胞两次后，RIPA细胞裂解液裂解细胞5min，刮板法收集细胞，13000g/min离心收集离心悬浮液，BCA蛋白定量。用12％SDS-PAGE分离Bcl-2和Caspase-3，并按照常规操作方法做Westernblotting检测。

Western blotting检测结果如图18所示，与吗啡损伤组相比，牛磺酸保护组的Bcl-2蛋白和Caspase-3蛋白表达增高。说明牛磺酸在蛋白水平能够抑制吗啡诱导的C6细胞的凋亡损伤。

实验证明牛磺酸能在蛋白质水平保护神经细胞免受凋亡损伤。

实施例7牛磺酸对甲基苯丙胺(METH)处理大鼠的神经保护作用

1、试验动物

本实验所用于造模的动物为雄性Wistar大鼠，体重为180-200g，饲养适应5天后将动物随机分为对照、模型组和牛磺酸处理组，每组10只。

2、试验方法

模型组和牛磺酸组以0.1％的给药体积皮下注射2.5mg/kg METH，每天注射两次，每天早8:00点、晚6:00点各注射一次，连续注射7天。除此之外，牛磺酸组每天还腹腔注射20mg/kg剂量牛磺酸，对照组皮下注射生理盐水。末次给药后30分钟内快速断头处死动物，然后迅速分离动物脑区，置于液氮速冻，然后置-80℃深低温冰箱冷冻。

取出上述冰冻的伏隔核和前额皮质(30-100mg)，冰块低温条件下(4℃)采用杜恩斯玻璃匀浆器匀浆，然后10000转/分离心10分钟，收集上清，采用Bio-Rad公司蛋白检测试剂进行蛋白含量的检测。

将各样品的蛋白浓度调整相同，然后进行抗氧化酶SOD与GPx、氧化性损害产物丙二醛(MDA)检测。MDA可以反映神经细胞氧化性损害的情况。按照SOD活性检测试剂盒、GPx检测试剂盒进行SOD与GPx活性检测；按照MDA检测试剂盒的方法与说明进行MDA检测，反映氧化行损害状况。

实验结果如图19所示。由图19可知，与正常组相比，模型组SOD与GPx活性明显降低、MDA明显升高，表明METH导致动物脑组织的氧化性损害。与模型组相比，牛磺酸组动物SOD与GPx活性明显高于模型组，且MDA含量明显降低，表明牛磺酸通过抗氧化性机制发挥保护作用。

实验证明牛磺酸可以减少METH导致的大鼠神经细胞的氧化性损伤，具有神经保护作用。

综上，牛磺酸可以显著降低METH、吗啡等成瘾药物对神经细胞损伤，增强细胞内的氧化物活性，减少细胞的凋亡，证明牛磺酸可以用于制备预防METH、吗啡等成瘾药物引起的神经细胞损伤的药物。

Claims (9)

1.牛磺酸在制备预防成瘾药物引起的神经细胞损伤的保护药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的神经细胞是脑神经细胞。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的脑神经细胞是伏隔核神经细胞或者前额皮质神经细胞。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的牛磺酸的含量为40-80μM。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的牛磺酸的含量为60-80μM。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的牛磺酸的含量为80μM。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的用途，其特征在于：所述的成瘾药物是阿片类药物或者甲基苯丙胺。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的阿片类药物是吗啡。

9.一种药物组合物，其特征在于：它是以牛磺酸为活性成分，加入药学上可接受的辅料制备而成的药剂。

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