CN103919787A - 牛磺熊脱氧胆酸及其可接受的盐的制药用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛磺熊脱氧胆酸及其可接受的盐的制药用途。牛磺熊脱氧胆酸可以降低癌基因Yap的表达和活性，抑制UPR信号通路元件的活性，并在两种具有Yap激活和UPR信号通路激活的肝癌模型中验证了牛磺熊脱氧胆酸具有预防和治疗肝癌的效果，表明牛磺熊脱氧胆酸在制备肝癌防治药物，特别是制备Yap激活或UPR信号通路激活引起的肝癌的防治药物中具有一定的应用前景。

Description

牛磺熊脱氧胆酸及其可接受的盐的制药用途

技术领域

本发明涉及一种牛磺熊脱氧胆酸及其可接受的盐的制药用途。

背景技术

肝癌是全球常见的恶性肿瘤之一，是一种恶性程度高、预后差的疾病。中国每年肝癌发病率居世界之首，肝癌是我国第二位、世界第三位的肿瘤死亡原因。目前肝癌仍缺少真正行之有效的治疗方法，临床上主要采取手术切除辅以术后干扰素、维甲酸类药物化疗的疗法，但这种方法往往难以完全清除癌细胞、肿瘤易复发转移，同时治疗费用高昂，毒副反应严重，给患者及其家庭带来极大的经济和精神压力。因此有必要进一步开发更为经济有效、毒副作用更低的肝癌治疗药物。

研究表明，Hippo信号通路是维持肝脏稳态的关键信号通路，癌基因Yap（Yes-associated protein,Yes相关蛋白）作为Hippo通路的中心底物，在调控细胞增殖中发挥关键作用。Yap激活（如Yap蛋白表达量升高、Yap磷酸化水平下降、Yap活性升高）后，能引起肝细胞迅速增殖、肝脏肿大，并在三个月左右100%诱发肝细胞肝癌或肝胆管癌。Hippo通路的核心激酶Mst1（macrophage stimulating1，巨噬细胞刺激因子1）和Mst2（macrophage stimulating2，巨噬细胞刺激因子2）发生缺失后，也会引起其下游共转录激活子Yap的激活，从而诱发肝癌。因此Mst1/2基因敲除（Mst1/2DKO）小鼠与Yap转基因小鼠具有相同的表型，已成为常用的小鼠肝癌模型。在Mst1/2DKO小鼠上，由于Mst1/2基因敲除引起的Yap激活，能诱发Mst1/2DKO小鼠在4周时即开始出现肝肿大，在12周左右100%的小鼠会发生肝癌，最终所有的Mst1/2DKO小鼠均会死于肝癌。临床研究数据也表明，约有30%欧洲肝癌病人的肝癌组织表现Yap磷酸化水平下降、活性升高（Cancer Cell,2009.16(5):p.425-38.），而80%以上的中国肝癌病人的癌组织中Yap蛋白表达量升高（Cell Rep,2013.3(5):p.1663-77）。这都充分说明Yap在肝癌发生发展过程中具有重要作用。

此外，有研究表明，未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response,UPR）信号转导通路的失调与人类的Ⅱ型糖尿病，神经退行性疾病，病毒感染及癌症等若干疾病的发生发展有关。细胞受到各种有害因素影响时，会造成未折叠或是错误折叠的蛋白质在内质网腔中堆积，激活UPR通路，活化的UPR信号通路通过若干促细胞存活调节机制来降低未折叠蛋白的量，并特异性提高一些在蛋白质折叠和质控过程中起关键性作用的蛋白质合成等，缓解有害因素的影响，促进细胞存活；UPR信号通路还可通过启动细胞凋亡信号通路除去受伤害的细胞，而最终维持机体的整体健康。但当外界有害因素大量持续作用时，UPR信号通路持续激活也难以清除有害物质的影响。UPR信号通路的持续激活往往是细胞存在异常的标志之一。有文献报道，在一些变异细胞中，UPR信号通路失调，不能成功的清除受伤害的细胞，导致了癌症的产生（Acta Oncol,2012.51(7):p.822-30,18；Curr Mol Med,2006.6(1):p.55-69.）。说明癌症的发生发展与UPR信号通路的激活有一定的相关性。

UPR信号通路主要包括PERK-eIF2　　（PKR-like eukaryotic initiation factor2kinase-eukaryotic translation initiation factor2subunit1,RNA依赖的蛋白激酶样激酶-真核生物翻译起始因子2亚单位1）、IRE1　-XBP1（Inositol requiringenzyme1-box binding protein1，肌醇依赖酶1-X盒结合蛋白1）和ATF6-ERSE（activating transcription factor6-ER stress-response element，活化转录因子6-内质网压力反应元件）三条主要通路，均可受到Bip（immunoglobulin heavy chainbinding protein，免疫球蛋白重链结合蛋白）的调节。

牛磺熊脱氧胆酸（tauroursodeoxycholic acid，TUDCA，3α，7β二羟基胆烷酰-N-牛磺酸3α,7β-Dihydroxy-5β-cholan-24-oic Acid N-(2-Sulfoethyl)amide）,化学式为C₂₆H₄₅NO₆S，分子量为463.70，其结构式为：

TUDCA于1902年自熊胆中发现，由熊去氧胆酸（UDCA）的羧基与牛磺酸的氨基之间缩水而成，该化合物可以从熊胆汁中分离获得，也可以采用化学合成。目前作为药物具有解痉、抗惊厥、溶胆石等作用。如牛磺熊脱氧胆酸胶囊，2007年以商品名滔罗特（taurolite）获准在中国销售，临床主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎和慢性丙型病毒性肝炎等，但未有文献报道其有预防和治疗肝癌的生理作用，也未有文献报道其对癌基因Yap和UPR信号通路有调控作用。

发明内容

本发明的目的在于提供了牛磺熊脱氧胆酸及其可接受的盐在制备药物，特别是制备Yap激活或UPR信号通路激活引起的肝癌的防治药物中的用途。

本发明提供了牛磺熊脱氧胆酸及其可接受的盐在制备抑制癌基因Yap激活的抑制剂中的应用。

本发明提供了牛磺熊脱氧胆酸及其可接受的盐在制备抑制UPR信号通路激活的抑制剂中的应用。

本发明提供了牛磺熊脱氧胆酸及其可接受的盐在制备肝癌预防或治疗药物中的应用。

本发明提供了牛磺熊脱氧胆酸及其可接受的盐在制备癌基因Yap激活引起的肝癌预防或治疗药物中的应用。

本发明提供了牛磺熊脱氧胆酸及其可接受的盐在制备UPR信号通路激活引起的肝癌预防或治疗药物中的应用。

本发明提供了包含牛磺熊脱氧胆酸或其可接受的盐的抑制癌基因Yap激活的抑制剂。

本发明提供了包含牛磺熊脱氧胆酸或其可接受的盐的抑制UPR信号通路激活的抑制剂。

本发明提供了包含牛磺熊脱氧胆酸或其可接受的盐的肝癌预防或治疗药物。

本发明提供了包含牛磺熊脱氧胆酸或其可接受的盐的由癌基因Yap激活引起的肝癌的预防或治疗药物。

本发明提供了包含牛磺熊脱氧胆酸或其可接受的盐的由UPR信号通路激活引起的肝癌的预防或治疗药物。

本发明所述的牛磺熊脱氧胆酸，可以从熊胆汁中分离提取获得，也可通过化学合成途径获得。

本发明所指的药理或生理上可接受的盐意指那些保留生物学有效性和母体化合物性质的盐，包括牛磺熊脱氧胆酸与无机酸或有机酸形成的酸加成盐。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

1.本发明所述的牛磺熊脱氧胆酸，在体外实验中发现其对肝癌细胞中的癌基因Yap具有明显的抑制作用；在多种小鼠肝癌模型中也发现其有抑制Yap和UPR通路从而抑制肿瘤发生发展的效果。TUDCA抑制Yap的作用和防治肝癌的效果得到了充分说明和有效验证，有望在肝癌防治药物的研究和制备中发挥重要作用。

2.本发明所述牛磺熊脱氧胆酸化合物，可以从熊胆汁中分离提取，也可通过化学合成得到，来源广泛，获取容易，有利于今后肝癌防治药物的大规模制备。

3.本发明所采用的牛磺熊脱氧胆酸目前已作为胆囊结石等疾病的治疗药物应用多年，其安全性、有效性、稳定性均已得到充分验证，安全使用有保障，有望用于制备新一代高效低毒的肝癌治疗药物。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1所示为TUDCA对Yap表达和活性的影响。

图2所示为TUDCA处理后对Mst1/2DKO小鼠肝脏肿大和肝癌产生的影响。

图3所示为TUDCA对Yap的表达和UPR通路元件的影响。

图4所示为Yap对UPR信号通路的影响。

图5所示为TUDCA对DEN诱导的小鼠肝癌模型的影响。

图6所示为人类肝癌样品中Yap的表达水平及Bip、PERK、p-elF2　的蛋白表达水平，及其与Yap表达的相关性。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容：

实施例1

将1-2x10⁵HepG2细胞（购于上海生博医学生物工程科技有限公司）铺于6孔板的一个孔，第二天分别用对照溶剂DMSO（二甲基亚砜）和250μM TUDCA处理HepG2细胞，24h后收取样品，分别进行如下实验：

1）实时定量荧光PCR：提取RNA，使用BioRad公司的iQ SYBR GreenSupermix试剂盒和iCycler iQ系统（BioRad,Hercules,CA,USA）进行实时定量荧光PCR实验，用Gapdh基因作为内参，每个样品设3个重复，使用δ-δ法分析各样品的Yap与转录因子TEAD的下游靶基因CTGF（Connection tissue growthfactor，结缔组织生长因子）的mRNA水平，从而确定TUDCA对Yap转录共激活活性的影响；

2）免疫印迹：提取蛋白质样品，PAGE胶（聚丙烯酰胺凝胶）100V电泳，溴酚蓝跑到底部时候，100V电压下PVDF膜（聚偏氟乙烯膜）转膜90分钟。5%BSA（牛血清白蛋白）封闭一小时，按照所需敷一抗1小时，TBST缓冲液洗3次，每次5分钟，二抗孵育1小时，TBST缓冲液洗3次，曝光，检测Yap、CTGF和p-Yap，确定TUDCA对Yap表达和活性的影响；

3）免疫荧光：将细胞接入铺有22×22mm盖玻片的六孔板中，待细胞汇合度达到70％左右用新鲜配制的2％多聚甲醛固定细胞10分钟，PBS洗三遍，每次5分钟，用0.2-0.5％triton X-100（PBS配制）对细胞透化处理10分钟，PBS洗三遍，每次5分钟，2％BSA封闭30分钟，PBS洗两遍，加入1抗，室温孵育1小时，PBS洗三遍，每次5分钟，加入二抗，室温孵育30-45分钟，PBS洗四遍，每次5分钟，加入0.5μg/ml DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）（PBS配制）染色10分钟，用PBS洗三遍，去除多余的DAPI，加入20μl封片剂封片，通过共聚焦显微镜观察信号强度，确定TUDCA对Yap细胞定位的影响。

结果显示：在HepG2细胞中，实时定量荧光PCR结果显示TUDCA的处理可降低CTGF的mRNA水平（图1A），即降低了Yap的转录共激活作用；免疫印迹表明TUDCA可降低Yap的表达，并促进Yap的磷酸化（图1B）；免疫荧光显示TUDCA的处理可促进Yap出核，从而引起Yap失活（图1C）。

本实施例表明TUDCA可有效抑制肝癌细胞中Yap的表达和活性。

实施例2

取野生型小鼠（来源于厦门大学实验动物中心）和Mst1/2基因敲除（Mst1/2DKO）小鼠(来源于美国哈佛医学院)，分别分成TUDCA组与对照组，TUDCA组每周两次定期腹腔注射TUDCA（250mg/kg），对照组每周两次定期腹腔注射PBS；取不同处理时间小鼠，分批解剖，观察和比较肝脏总体积和产生肿瘤的数目及大小，并取野生型和Mst1/2DKO小鼠中各一部分小鼠，持续注射TUDCA或PBS，以研究TUDCA处理对Mst1/2DKO小鼠成活率和寿命的影响。

结果显示：在TUDCA处理的Mst1/2DKO小鼠中，年轻小鼠的肝脏/体重比（图2A），年老小鼠肿瘤的大小和数量都显著降低（图2B），而用对照溶剂处理的小鼠则无类似的结果。同时，TUDCA的处理也会显著提高Mst1/2DKO小鼠的成活率（图2C）

本实施例说明了TUDCA可有效抑制Mst1/2DKO肝癌模型小鼠中肿瘤的发生发展，提高Mst1/2DKO小鼠的成活率。

实施例3

小鼠处理方法同实施例2。通过免疫印迹法比较野生型小鼠和Mst1/2DKO小鼠、以及Mst1/2DKO小鼠在有无TUDCA（250mg/kg）处理下，其肝脏组织样品中Yap及UPR通路元件的表达和活性。

结果显示：Mst1/2DKO小鼠肝脏组织样品与对照野生型小鼠比较，Bip，PERK，p-PERK，p-eIF2α，剪切的ATF6与对照组相比均有显著上调（图3A），说明UPR通路中PERK-eIF2　和ATF6-XBP1两条支路被激活。而当TUDCA处理Mst1/2DKO小鼠后，与未经TUDCA处理的Mst1/2DKO小鼠相比，Bip、PERK、p-eIF2　的水平降低，同时p-Yap上升，CTGF下降（图3B），说明Mst1/2DKO小鼠中Yap的活性和激活的UPR通路均得到了TUDCA的抑制。

本实施例说明了TUDCA可有效抑制Mst1/2DKO肝癌模型小鼠中Yap的活性和UPR通路的激活。

实施例4

取野生型小鼠（来源于厦门大学实验动物中心）、Yap单倍体缺失的Mst1/2DKO小鼠（来源于哈佛医学院）、Yap单倍体缺失（Yap+/-）小鼠（来源于哈佛医学院）和Yap敲除（Yap-/-）小鼠（来源于哈佛医学院），分别分成TUDCA组与对照组，TUDCA组每周两次定期腹腔注射TUDCA（250mg/kg），对照组每周两次定期腹腔注射PBS。采用免疫印迹法检测了在Yap单倍体缺失的Mst1/2DKO小鼠中UPR元件活性，以及野生型小鼠，Yap单倍体缺失（Yap+/-）小鼠和Yap敲除（Yap-/-）小鼠的肝脏组织蛋白样品中UPR通路元件的表达水平。

结果显示：在Mst1/2DKO背景下，单倍体Yap的缺失可以抑制肝脏的肿大，同时使得UPR通路活性下降（图4A）。WT，Yap+/-，Yap-/-样品免疫印迹显示，随着Yap表达量的降低，UPR通路元件Bip、PERK、p-eIF2　及p-IRE1　水平也随之降低，表明Yap与UPR通路元件活性正相关（图4B）。

本实施例表明癌基因Yap的激活与UPR通路的激活具有正相关性。

实施例5

本实施例通过制备DEN（二乙基亚硝胺）诱导肝癌小鼠模型，验证TUDCA对该模型小鼠中Yap及UPR信号通路的影响，并验证TUDCA治疗该模型肝癌的效果。具体制备方法如下：

1）制备DEN诱导肝癌小鼠模型：选取SPF级的C57BL/6野生型小鼠进行腹腔注射DEN，注射剂量为25ug/kg，收集注射4、8、10天的小鼠的肝脏，研磨裂解获取全细胞裂解液后进行蛋白免疫印迹的实验。检测UPR通路元件表达水平及体内肝组织中Yap的表达和活性。

2）免疫组化：取上述1）小鼠小片肝脏放入固定液中固定，蒸馏水洗净经梯度酒精脱水等步骤后包埋，切片，脱蜡，抗原修复后封闭，一抗4度过夜，二抗30分钟，经显色，脱水等步骤后封片，观察拍照。并检测Bip，p-eIF2　及Yap的表达水平。

3）野生型C57BL/6小鼠被分为两组，一组只接受DEN腹腔注射（25ug/kg），另一组接受DEN腹腔注射的同时也注射TUDCA（250mg/kg）。根据DEN诱导肝癌模型的预实验，在一定时间后处死小鼠，观察和比较肝脏总体积和产生肿瘤的数目及大小并进行统计分析，并利用免疫印迹法检测确定TUDCA处理对UPR通路元件表达水平及体内肝组织中Yap表达和活性的影响。

结果显示：注射DEN4天，8天，10天后小鼠肝脏组织样品中内质网分子伴侣Yap、Bip，p-PERK，p-eIF2α和对照组相比都显著上调，证明在药物诱导小鼠肝癌模型中UPR信号通路被激活，Yap蛋白水平升高。而DEN和TUDCA共同处理的小鼠中Yap、Bip、p-PERK及p-eIF2α水平下降（图5A）。免疫组化结果也显示DEN的处理会增强UPR通路元件Bip和p-eIF2α的表达，同时Yap的表达水平也上升（图5B）。TUDCA的处理降低DEN诱导肝脏的肿大并减少DEN的成瘤数量（图5C、5D）。证明在DEN诱导模型小鼠中，TUDCA治疗能抑制Yap蛋白水平和UPR信号通路，从而降低DEN诱导的模型小鼠肝肿瘤数量和大小，发挥治疗肿瘤的作用。

本实施例说明DEN肝癌小鼠模型中，Yap和UPR信号通路均被激活，而TUDCA的处理可有效抑制Yap和UPR信号通路，从而抑制DEN引起的肝癌的发生发展。

实施例6

本实施例具体制备方法如下：

1）Bip，PERK，磷酸化eIF2α及Yap检测：

收集66例肝外科进行肝细胞癌（HCC）根治性切除手术患者的肿瘤和癌旁肝组织标本，患者术前没有接受过放化疗以及其他治疗手段，所有标本均已经在病理科通过组织病理学确诊为肝细胞癌。通过研磨裂解获取全细胞裂解液后进行蛋白免疫印迹的实验，免疫印迹检测这66对肝癌样品的肿瘤组织（T）和对应的癌旁相对正常的组织（N）。

2）Yap，Bip，PERK和p-eIF2　的T/N统计分析：

利用灰度扫描软件对66例肝癌样品的免疫印迹检测结果进行相对定量，并计算T/N比值，以蛋白质的T/N比作散点图分析Bip、PERK和p-eIF2　的表达与Yap表达的相关性。

结果显示：免疫印迹结果统计分析表明，大多数人类肝癌样品中Yap和UPR通路相关分子Bip，PERK，p-eIF2α水平和对照癌旁组织相比显著上调（图6A）。用灰度分析软件分析并进行统计表明，UPR信号通路元件在肝癌样品中的高表达与Yap的高表达具有正相关性（图6B）。

本实施例表明在人类肝癌中，Yap的激活与UPR信号通路的激活具有正相关性，进一步证明Yap与UPR在肝癌的发生发展中起着重要作用，提示了具有Yap和UPR抑制作用的TUDCA在今后制备肝癌防治药物上的应用前景。

实施例1-6表明了TUDCA可以有效地抑制Yap与UPR信号通路，且Yap的激活与UPR信号通路的激活有正相关性；并在两种具有Yap激活和UPR信号通路激活的小鼠肝癌模型中证明了TUDCA具有预防和治疗肝癌的效果，提供了TUDCA在制备肝癌防治药物、尤其是Yap激活或UPR信号通路激活引起的肝癌的防治药物上的应用前景。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种牛磺熊脱氧胆酸及其可接受的盐在制备抑制癌基因Yap激活的抑制剂中的应用，所述牛磺熊脱氧胆酸结构式为：

2.权利要求1所述的应用，其特征在于：所述牛磺熊脱氧胆酸及其可接受的盐应用于制备抑制UPR信号通路激活的抑制剂。

3.权利要求1所述的应用，其特征在于：所述牛磺熊脱氧胆酸及其可接受的盐应用于制备肝癌预防或治疗药物。

4.权利要求3所述的应用，其特征在于：所述肝癌为癌基因Yap激活引起的肝癌。

5.权利要求3所述的应用，其特征在于：所述肝癌为UPR信号通路激活引起的肝癌。

6.一种包含牛磺熊脱氧胆酸或其可接受的盐的抑制癌基因Yap激活的抑制剂。

7.权利要求6所述的一种包含牛磺熊脱氧胆酸或其可接受的盐的抑制癌基因Yap激活的抑制剂，其特征在于：所述抑制剂为抑制UPR信号通路激活的抑制剂。

8.一种包含牛磺熊脱氧胆酸或其可接受的盐的肝癌预防或治疗药物。

9.权利要求8所述的一种包含牛磺熊脱氧胆酸或其可接受的盐的肝癌预防或治疗药物，其特征在于：所述肝癌为癌基因Yap激活引起的肝癌。

10.权利要求8所述的一种包含牛磺熊脱氧胆酸或其可接受的盐的肝癌预防或治疗药物，其特征在于：所述肝癌为UPR信号通路激活引起的肝癌。