CN102236003A - 一种毛细管固相微反应器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生化分析技术领域，涉及一种用于微量蛋白荧光标记的毛细管固相微反应器及其制备方法。本发明采用溶胶凝胶法制备毛细管柱塞，用匀浆法将固相载体填充于毛细管内，蛋白溶液在流经固相载体时被捕集并经荧光衍生试剂标记，随后荧光标记产物从固相载体上洗脱，进行液相色谱分离和激光诱导荧光检测。本发明实现了对小体积和低浓度蛋白样品的荧光标记，能显著减少样品的消耗量，提高微量蛋白检测的灵敏度，同时具有体积小巧、制作简便、成本低廉，可根据分析需要更换固相载体等优点。
Description
技术领域
本发明属于生化分析领域，涉及一种毛细管固相微反应器。尤其涉及一种用于微量蛋白荧光标记的毛细管固相微反应器及其制备方法。本发明还涉及该固相微反应器的使用方法。
背景技术
蛋白质是生命的物质基础，各种生命现象都要通过蛋白质的生物功能来体现，因此蛋白质的分析越来越为人重视。然而，取得可供常规分析所需量的蛋白质样品一直是一个难题。这一方面受生物样品来源稀少的影响(珍贵样品或微区分析)；另一方面，对于控制一些重要生理过程的关键蛋白，其本身浓度就比较低。
毛细管高效液相色谱和毛细管电泳是上世纪末以来发展起来的分析技术，已被广泛应用于化学、生命科学、环境科学和医学等领域，具有高灵敏度，低进样量，分析速度快，节约试剂，成本低廉等优点，是微量蛋白分析的有力工具。柱上光度检测法经常用于毛细管柱的分离检测。然而，作为常规高效液相色谱通用检测器的紫外(UV)检测器由于受毛细管柱上光程的限制，其蛋白检测限一般限制在10-6M内。与紫外检测相较，采用激光诱导荧光技术(LIF)一般可把信噪比提高百倍以上，对可激发出天然荧光的蛋白的检测限可降至10-10M，对其他蛋白却无法检测。
针对上述不足，许多蛋白荧光衍生方法被开发出来，通过衍生反应为蛋白标记上荧光标签，使不能被激发出天然荧光的蛋白也能得到检测。通常这种衍生反应需要mM级的高浓度蛋白，10-6M以下低浓度蛋白很难被衍生；通过超滤或凝胶柱除去过量荧光标记试剂的常规方法也很难应用于微升级的样品，相应产生的高荧光背景一般会掩盖目标蛋白的信号。以上问题制约了微量蛋白样品的荧光检测技术的发展和应用。
发明内容
本发明的目的在于现有技术的不足，提供一种制备简单，成本低廉的用于微量蛋白荧光标记的毛细管固相微反应器及其制备方法。
本发明的基本思想是：通过固定在毛细管内的固相载体捕集流经毛细管的微量蛋白，经荧光衍生试剂标记后，将荧光标记产物从固相载体上洗脱，进行液相色谱分离和激光诱导荧光检测。
本发明采用溶胶凝胶法制备毛细管柱塞，用匀浆法将固相载体填充于毛细管内，蛋白溶液在流经固相载体时被捕集并经荧光衍生试剂标记，随后荧光标记产物从固相载体上洗脱，进行液相色谱分离和激光诱导荧光检测。
本发明提出的毛细管固相微反应器，其结构如图1所示，它包括：毛细管微通道(1)，毛细管内柱塞(2)和固相载体填充床(3)。
所述的毛细管微通道(1)，一端用于进样，与注射泵相连；
所述的柱塞(2)位于毛细管微通道(1)另一端，采用溶胶凝胶法制备；
所述的固相载体填充床(3)紧密填充于柱塞(2)后，采用匀浆法填制。
本发明中，毛细管微通道内径10～1000μm，固相载体填充床的长度为1～20mm。
本发明中，柱塞材料一般采用对蛋白及荧光标记试剂惰性的材料，如硅胶填料。
本发明中，固相载体的材料可以是各种色谱填料(包括气相色谱或液相色谱的填料)，也可以是一切具有捕集能力的固体材料，包括为多孔高分子聚合物颗粒以及高分子聚合物整体多孔床材料，以及为有机-无机材料杂和的颗粒或整体床材料。固相载体可以是单一均相的，也可以是多相的。
本发明提出的毛细管固相微反应器，其制备方法如下：
(1)挑选合适内径的毛细管，内壁清洗干净后用氮气吹干；
(2)采用溶胶凝胶法在毛细管一端制备柱塞；
(3)采用匀浆法向毛细管内填制所需固相载体的填充床。
本发明中，所述的固相载体可以更换，其方法是用缓冲溶液从柱塞端灌入，将废弃的固相载体冲出，然后从毛细管另一端用匀浆法重新灌入所需的固相载体。
本发明进一步提供该固相微反应器的使用方法，可以方便地处理小体积和低浓度蛋白样品。
本发明提出的毛细管固相微反应器可用于微量蛋白的荧光衍生，特别是小体积和低浓度蛋白样品。其步骤如下：
1～100μL蛋白样品以1～10μL/min的流速流经固相载体，其中所用的分析样品为含微量蛋白的样品溶液，蛋白含量10fmol～10nmol。微量蛋白被捕集到固相载体上之后，上样1～10μL荧光衍生试剂，其浓度为0.01～1mM，在一定条件下反应后，先用洗脱液【1】将过量衍生试剂除去，而后用1-20μL洗脱液【2】将荧光标记产物从固相载体上洗脱并收集起来，用于后续分析。
上述方法中，所用的洗脱剂可以是有机溶剂与缓冲溶液的混合液，也可以是针对固相载体吸附-洗脱特性的任何无机缓冲溶液。洗脱液中，可以根据需要加入添加剂，如表面活性剂和手性选择试剂等。
本发明提出的用于微量蛋白荧光衍生的毛细管固相微反应器，可以实现对小体积和低浓度蛋白样品的荧光标记，能减少样品的消耗量，显著提高微量蛋白检测的灵敏度，同时具有体积小巧、制作简便、成本低廉，可根据分析需要更换固相载体等优点。
本发明十分适用于微量蛋白的荧光标记，在应用芯片实验室、微柱高效液相色谱等手段对微量生物样品进行蛋白质及多肽的研究领域具有良好的实用价值和应用前景。
附图说明：
图1是本发明实施例构建的毛细管固相微反应器结构示意图，
图中标号，1为毛细管微通道，2为毛细管内柱塞，3固相载体填充床。
图2是毛细管固相微反应器用于荧光素异硫氰酸酯(FITC)荧光标记85pmol牛血清蛋白(BSA)的色谱分析图，
图中箭头指向的峰为BSA-FITC荧光标记产物。
具体实施方式：
下面通过实施例进一步具体描述本发明，但不限于该实施例。
实施例1：
1、制备毛细管固相微反应器：
(1)选取一段熔融石英毛细管(河北永年光导纤维厂)，外径375μm，内径250μm，长1m，内壁依次用0.1M的HCl清洗10分钟，0.1M的NaOH清洗10分钟，去离子水清洗5分钟，二氯甲烷清洗5分钟，用氮气吹干，之后截成10cm长数小段。
(2)配置柱塞溶胶液：向冰水浴中的1mL EP管内，依次加入25μL三氟乙酸，20μL甲基三乙氧基硅烷，2.5μL去离子水及50μL二氯甲烷，再加入0.0379g 5μm硅胶填料(Eka Nobel)，振摇均匀。该溶胶液可供数百根毛细管柱塞的制作。
(3)将干洁的毛细管一端浸入匀浆液，在毛细作用下吸入1mm左右迅速取出，平置，室温下反应30min，移入烘箱100℃烘5小时，得柱塞2。
(4)用乙腈清洗带柱塞的毛细管，用匀浆法填充液相色谱填料(Kromasil，ODS，5μm，)，形成8mm固相载体填充床。
2、固相衍生牛血清蛋白：
(1)毛细管固相微反应器使用前，先后用50μL乙腈和50μL去离子水平衡。
(2)配制牛血清蛋白溶液(1.7×10-6M)，取50μL(85pmol)用注射泵进样，让样品以5μL/min的速度流过固相载体填充床。
(3)将荧光标记试剂FITC(荧光素异硫氰酸酯)用20mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液配制成1mM的溶液，取2μL流过固相载体填充床，在室温下避光衍生30分钟。
(4)用20μL含10％乙腈的20mM碳酸钠/碳酸氢钠溶液冲洗反应器，洗脱过量FITC试剂；之后用20μL含40％乙腈的20mM碳酸钠/碳酸氢钠溶液洗脱并收集BSA-FITC荧光标记产物，取200nL(850fmol)进纳升级反相高效液相色谱-激光诱导荧光(nano-RPLC-LIF)分离检测系统分析，所得谱图见图2，信噪比＝4800，检出限(S/N＝3)可达0.53fmol。
Claims (7)
1.一种毛细管固相微反应器，其特征在于，其包括：毛细管微通道(1)，毛细管内柱塞(2)和固相载体填充床(3)；
所述的毛细管微通道(1)，一端与注射泵相连；
所述的毛细管内柱塞(2)位于毛细管微通道(1)另一端；
所述的固相载体填充床(3)填充于柱塞(2)后。
2.根据权利要求1所述的毛细管固相微反应器，其特征在于所述的毛细管内柱塞(2)采用溶胶凝胶法制备。
3.根据权利要求1所述的毛细管固相微反应器，其特征在于所述固相载体为气相色谱或液相色谱填料，或者为多孔高分子聚合物颗粒以及高分子聚合物整体多孔床材料，或者为有机-无机材料杂和的颗粒或整体床材料。
4.根据权利要求1所述的毛细管固相微反应器，其特征在于所述固相载体为均相，或者为多相。
5.根据权利要求1所述的毛细管固相微反应器，其特征在于毛细管微通道内径为10～1000μm，固相载体填充床的长度为1～20mm。
6.一种如权利要求1-5之一所述毛细管固相微反应器的制备方法，其特征在于包括步骤如下：
(1)采用溶胶凝胶法制备毛细管柱塞；
(2)采用匀浆法在毛细管微通道内填充所需的固相载体的填充床。
7.一种权利要求1-5之一所述毛细管固相微反应器的使用方法，其特征在于包括步骤如下：
1～100μL蛋白样品以1～10μL/min的流速流经固相载体，微量蛋白被捕集到固相载体上，之后上样1～10μL荧光衍生试剂，在一定条件下反应后，先用洗脱液【1】将过量衍生试剂除去，而后用1-20μL洗脱液【2】将荧光标记产物从固相载体上洗脱下来，用于后续分析。其中所用的分析样品为含微量蛋白的样品溶液，蛋白含量10fmol～10nmol。
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