CN102229961A - 小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体及构建方法和应用 - Google Patents
小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体及构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体，在人腺病毒5型基因组2245bp-3327b之间有1083bp碱基的缺失，在人腺病毒5型基因组2245bp与3327bp之间处插入一个表达第一外源基因的表达元件，在腺病毒5型基因组第32679bp处即纤维蛋白HI loop处，插入编码含有一个小肽序列，在人腺病毒5型基因组32787bp与32788bp之间插入双表达第二外源基因与eGFP的表达元件。其构建方法为：构建pAd5E1B 55kd缺失的shuttle、构建pHE1B55D-第一外源基因的shuttle、构建pHE1B55D-第一外源基因/SwaI的腺病毒载体骨架、构建pshuttleAd5-E4-fiber-小肽序列shuttle、构建表达eGFP及第二外源基因的shuttle、制备小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体。上述的腺病毒载体在制备治疗肿瘤药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤的基因治疗领域，具体涉及到小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体及其构建方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁到人类的身体健康，已经是人类致死的一大原因，除了手术、化放疗外还没有发现有效的治疗方法，探索新的治疗方法显得极为重要。基因治疗是近年来兴起的一种新手段，在恶性肿瘤治疗中成为最有希望的方案之一。基因治疗分为病毒载体和非病毒载体，其中病毒载体的应用最广泛，最引人注目的病毒载体是条件复制型腺病毒载体(ConditionallyReplicating oncolytic Adenoviral Vector，CRAd)。这类载体可以选择性地在肿瘤组织中扩增，大量扩增的病毒最终可将肿瘤杀死，因此具有明显的抗肿瘤活性。
CRAd5载体大致可分为三种类型：一类是利用肿瘤特异性启动子控制病毒复制所必需的基因。例如Ad5-hTERT-E1A，是用人端粒酶逆转录酶(human Telomerase Reverse Transcriptase，hTERT)启动子取代腺病毒E1A(Early Transcription Units)基因自身的启动子构建而成，该腺病毒可特异地在肿瘤细胞中扩增，并杀死肿瘤细胞。一类是删除一些特定基因，这些特定基因是病毒在正常细胞中复制所必需、而在肿瘤细胞中复制非必需的。另外是E1B-55kD缺失的溶瘤腺病毒CRAd5-E1BΔ55KD，可以选择性地在p53功能异常的肿瘤细胞内复制并破坏肿瘤细胞，却不能在正常细胞内复制。这是因为CRAd5-E1BΔ55KD丧失了E1B-55kD的活性而不能结合并失活宿主细胞的p53功能，因而在p53功能正常的细胞(如正常细胞)内不能复制，而在p53功能异常细胞(如肿瘤细胞)内则可以大量复制。另一类是将负责编码Ad5E1A区的120～127位氨基酸的24个碱基对序列(919-943bp)去除，构建的一种新型溶瘤腺病毒CRAd5-D24。腺病毒的E1A能够结合成视网膜母细胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein，Rb，一种重要的抑癌基因)并使之失活，释放E2F(细胞从G1期进入S期的一种转录因子)，使细胞从G1期进入S期，腺病毒因而可以复制并将宿主细胞溶解。CRAd5-D24不能结合Rb使其失活，导致宿主细胞不能进入细胞分裂周期，因此CRAd5-D24仅能在Rb异常的肿瘤细胞中复制产生杀伤作用。但由于这类病毒载体自身的一些不足，例如对肿瘤组织感染效率低及表达治疗基因的数目有限等，从而导致治疗效果并不十分明显。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于克服上述条件复制型腺病毒载体的缺点，提供一种对肿瘤组织感染效率高、能增加载体外源基因表达数目的小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体。
本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种方法简单、操作简便的小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体的构建方法。
本发明所要解决的还有一个技术问题在于为小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体提供一种新用途。
解决上述技术问题采用的技术方案是：在人腺病毒5型基因组2245bp-3327b之间有1083bp碱基的缺失，在人腺病毒5型基因组2245bp与3327bp之间处插入一个表达第一外源基因的表达元件，在腺病毒5型基因组第32679bp处即纤维蛋白HI loop处，插入编码含有一个小肽序列，在人腺病毒5型基因组32787bp与32788bp之间插入双表达第二外源基因与eGFP的表达元件；上述的小肽序列为RGD、SIKVAV、YGRKKRRQRRR、NGR、pK7序列中的任意一个。
本发明的在人腺病毒5型基因组2245bp与3327bp之间处插入一个表达第一外源基因的表达元件中的第一外源基因是Arresten、Trail、Endostatin、Canstatin、tumostatin中的任意一种。
本发明的在人腺病毒5型基因组32787bp与32788bp之间插入双表达第二外源基因与eGFP的表达元件中的第二外源基因是IL-24、Trail、Endostatin、Canstatin、tumostatin的任意一种。
上述的小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体的构建方法由下述步骤组成：
1、构建pAd5 E1B 55kd缺失的穿梭载体
以Ad5基因组质粒为PCR反应模板，引物XbaI A序列为GCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATG与引物XbaI B序列为TCAGATGGGTTTCTTCACTCCATTTATCCT进行第一次聚合酶链式反应，聚合酶链式反应产物经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳后回片段，该聚合酶链式反应产物片段大小为719bp。以引物BglII A序列为ATAAAGGATAAATGGAGTGAAGAAACCCATCTGAG和引物BglII B序列为GAAGATCTATACAGTTAAGCCACCTATACAACA进行第二次聚合酶链式反应，所得到的聚合酶链式反应产物片段大小为270bp，将上述两次聚合酶链式反应产物混合作为模板，以引物XbaI A序列为GCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATG与引物BglIIB序列为GAAGATCTATACAGTTAAGCCACCTATACAACA进行第三次聚合酶链式反应，产物经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳后得到聚合酶链式反应产物片段大小为955bp，得到第三次聚合酶链式反应产物，将聚此片段与pGEMT-T easy载体连接，连接产物转化感受态的DH5α细胞，涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得阳性克隆经XbaI和BglII双酶切，经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳纯化后得到的片断与用XbaI和BglII双酶切处理的腺病毒E1区穿梭载体进行连接，连接产物采用同样的方法转化，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pHE1B55D shuttle，获得pAd5E1B 55kd缺失的穿梭载体。
2、构建pHE1B55D-第一外源基因的穿梭载体
采用聚合酶链式反应扩增第一外源基因，经电泳纯化后与pGEMT-easy载体相连接，经转化感受态细胞DH5a，小量提取DNA，经酶切鉴定，所获得阳性克隆命名为pGEMT/第一外源基因；将第一外源基因的片段从pGEMT/第一外源基因上经ClaI和Not I双酶切下来，经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳纯化后与用相同双酶切处理的pAd5.E1B55kd shuttle进行连接，连接与转化采用上述同样的方法，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，所获得的载体为表达第一外源基因的Ad5E1区穿梭载体，命名为pHE1B55D-第一外源基因shuttle。
3、构建pHE1B55D-第一外源基因/SwaI的腺病毒载体骨架
将ScaI线性化的pHE1B55D-第一外源基因shuttle的穿梭载体与ClaI线性化腺病毒骨架载体pTG3602/SwaI按摩尔比3∶1共转化感受态细胞BJ5183，将菌液涂布在含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中，经酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得的阳性克隆即为pHE1B55D-第一外源基因/SwaI的腺病毒载体骨架，命名为pHE1B55D-第一外源基因/SwaI载体。
4、构建pshuttle Ad5-E4-fiber-小肽序列穿梭载体
以pUC19载体为基础，在氨苄抗性基因的开放读码框的两端通过基因突变的方式产生两个单一的酶切位点XbaI及SfuI，然后将卡那抗性基因克隆到XbaI和SfuI的位点中，所获得的卡那抗性载体与EcoRI-HindIII l inker连接，获得的载体命名为pUCKanEHL；聚合酶链式反应扩增位于Ad5E4区3′端上游2.0kb的片段，基因片段两端分别含有PacI与SwaI位点，将此片段克隆到pUCKanEHL载体相应的酶切位点中，得到的载体称为pshuttle Ad5E4-3′；采用聚合酶链式反应方法扩增Ad5纤维蛋白3′端上游2.0kb的片段，基因片段两端分别含有SwaI与SpeI位点；将此片段克隆到pshuttle Ad5E4-3′载体相应的酶切位点中，获得的新载体称为pshuttleAd5-E4-fiber，通过重叠聚合酶链式反应方法，将小肽序列插入以上载体的fiber中，获得的载体称为pshuttle Ad5-E4-fiber-小肽序列。
5、构建表达eGFP及第二外源基因的穿梭载体pshuttle Ad5-CMVeGFP/第二外源基因-E4-fiber-小肽序列
通过聚合酶链式反应方法扩增miniCMV-SV40表达元件，聚合酶链式反应产物经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳后回收聚合酶链式反应片段，将聚合酶链式反应片段与pGEMT-T easy载体连接，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得阳性克隆命名为pGEMT/miniCMV-SV40，将miniCMV-SV40片段从pGEMT/miniCMV-SV40上经ClaI和NotI双酶切下来，与经同样酶切的双向启动子穿梭载体进行连接，连接产物采用同样的方法转化，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40；采用聚合酶链式反应方法扩增第二外源基因，扩增的产物经电泳纯化后与pGEMT-easy载体相连接，经酶切鉴定，获得阳性克隆命名为pGEMT/第二外源基因，将第二外源基因片段从pGEMT/第二外源基因上经XhoI和XbaI双酶切下来，用相同双酶切处理的pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40进行连接；连接与转化采用上述同样的方法，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，所获得的载体为表达eGFP及第二外源基因的双向启动子穿梭载体，命名为pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因；将pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因经BamHI及SfuI双酶切末端补平后与经SwaI酶切的腺病毒E4-fiber穿梭载体进行连接，获得的阳性克隆为表达eGFP及第二外源基因的腺病毒E4-fiber穿梭载体，命名为pshuttle Ad5-CMVeGFP/第二外源基因-E4-fiber-小肽序列；
6、制备条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因
用XhoI线性化的pshuttle Ad5-CMVeGFP/第二外源基因-E4-fiber-小肽序列的穿梭载体与SwaI线性化的pHE1B55D-第一外源基因/SwaI腺病毒载体骨架按摩尔比3∶1共转化E.coliBJ5183，通过酶切及测序获得阳性克隆，所得到的载体命名为pHE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因；采用磷酸钙法将PacI线性化的表达绿色荧光蛋白的pHE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因的条件复制型腺病毒载体转染HEK 293细胞系，经过7～10天后，离心收获病毒原液，经2～3轮的病毒扩增，通过两次氯化铯密度梯度超速离心纯化，获得纯化的表达绿色荧光蛋白的的条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因，-80℃冰箱内保存。
小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体在制备治疗恶性脑胶质瘤药物中的用途。
小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体在制备治疗肝癌药物中的用途。
小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体在制备治疗胃癌药物中的用途。
小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体在制备治疗肺癌药物中的用途。
小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体在制备治疗结肠癌药物中的用途。
小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体在制备治疗乳腺癌药物中的用途。
小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体在制备治疗黑色素瘤药物中的用途。
本发明在Ad5-E1B55kd条件复制型腺病毒载体的基础上，经过两方面的改造以提高增加载体外源基因的表达数目(2-3个)，对病毒载体进行修饰以提高其感染效率。采用本发明构建方法构建的条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten载体，经药效试验表明，条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten载体对恶性脑胶质瘤细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞有明显的抑制作用。
附图说明
图1是实施例1条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten载体的结构图。
图2是条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten载体对恶性脑胶质瘤细胞生长抑制作用。
图3是条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten载体对肝癌细胞生长抑制作用。
图4是条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten载体对胃癌细胞生长抑制作用。
图5是条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten载体对肺癌细胞生长抑制作用。
图6是条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten载体对结肠癌细胞生长抑制作用。
图7是条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten载体对乳腺癌细胞生长抑制作用。
图8是条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten载体在体外对黑色素瘤细胞的生长抑制作用。
图9是条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten载体在体内对黑色素瘤细胞生长抑制作用。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
本实施例的条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten载体如下：
1、在人腺病毒5型基因组2245bp-3327b之间有1083bp碱基的缺失，所缺失的序列如下：
ATGTTGTACAGGTGGCTGAACTGTATCCAGAACTGAGACGCATTTTGACAATTACAGAGGATGGGCAGGGGCTAAAGGGGG
TAAAGAGGGAGCGGGGGGCTTGTGAGGCTACAGAGGAGGCTAGGAATCTAGCTTTTAGCTTAATGACCAGACACCGTCCTG
AGTGTATTACTTTTCAACAGATCAAGGATAATTGCGCTAATGAGCTTGATCTGCTGGCGCAGAAGTATTCCATAGAGCAGC
TGACCACTTACTGGCTGCAGCCAGGGGATGATTTTGAGGAGGCTATTAGGGTATATGCAAAGGTGGCACTTAGGCCAGATT
GCAAGTACAAGATCAGCAAACTTGTAAATATCAGGAATTGTTGCTACATTTCTGGGAACGGGGCCGAGGTGGAGATAGATA
CGGAGGATAGGGTGGCCTTTAGATGTAGCATGATAAATATGTGGCCGGGGGTGCTTGGCATGGACGGGGTGGTTATTATGA
ATGTAAGGTTTACTGGCCCCAATTTTAGCGGTACGGTTTTCCTGGCCAATACCAACCTTATCCTACACGGTGTAAGCTTCT
ATGGGTTTAACAATACCTGTGTGGAAGCCTGGACCGATGTAAGGGTTCGGGGCTGTGCCTTTTACTGCTGCTGGAAGGGGG
TGGTGTGTCGCCCCAAAAGCAGGGCTTCAATTAAGAAATGCCTCTTTGAAAGGTGTACCTTGGGTATCCTGTCTGAGGGTA
ACTCCAGGGTGCGCCACAATGTGGCCTCCGACTGTGGTTGCTTCATGCTAGTGAAAAGCGTGGCTGTGATTAAGCATAACA
TGGTATGTGGCAACTGCGAGGACAGGGCCTCTCAGATGCTGACCTGCTCGGACGGCAACTGTCACCTGCTGAAGACCATTC
ACGTAGCCAGCCACTCTCGCAAGGCCTGGCCAGTGTTTGAGCATAACATACTGACCCGCTGTTCCTTGCATTTGGGTAACA
GGAGGGGGGTGTTCCTACCTTACCAATGCAATTTGAGTCACACTAAGATATTGCTTGAGCCCGAGAGCATGTCCAAGGTGA
ACCTGAACGGGGTGTTTGACATGACCATGA。
2、在人腺病毒5型基因组2245bp与3327bp之间处插入一个表达Arresten的表达元件，该表达元件序列为：
AGCCTGCAGGTCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCA
ATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTG
CCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTG
GCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATG
GTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTG
ACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCA
AATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATGGTACCGTTTAAA
CTCGAGGTCGACGGTATCGATatgTCTGTTGATCACGGCTTCCTTGTGACCAGGCATAGTCAAACAATAGATGACCCAC
AGTGTCCTTCTGGGACCAAAATTCTTTACCACGGGTACTCTTTGCTCTACGTGCAAGGCAATGAACGGGCCCATGGACA
GGACTTGGGCACGGCCGGCAGCTGCCTGCGCAAGTTCAGCACAATGCCCTTCCTGTTCTGCAATATTAACAACGTGTGC
AACTTTGCATCACGAAATGACTACTCGTACTGGCTGTCCACCCCTGAGCCCATGCCCATGTCAATGGCACCCATCACGG
GGGAAAACATAAGACCATTTATTAGTAGGTGTGCTGTGTGTGAGGCGCCTGCCATGGTGATGGCCGTGCACAGCCAGAC
CATTCAGATCCCACCGTGCCCCAGCGGGTGGTCCTCGCTGTGGATCGGCTACTCTTTTGTGATGCACACCAGCGCTGGT
GCAGAAGGCTCTGGCCAAGCCCTGGCGTCCCCCGGCTCCTGCCTGGAGGAGTTTAGAAGTGCGCCATTCATCGAGTGTC
ACGGCCGTGGGACCTGCAATTACTACGCAAACGCTTACAGCTTTTGGCTCGCCACCATAGAGAGGAGCGAGATGTTCAA
GAAGCCTACGCCGTCCACCTTGAAGGCAGGGGAGCTGCGCACGCACGTCAGCCGCTGCCAAGTCTGTATGAGAAGAACA
TAAACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGGGAGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACA
ACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCA
ATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCASGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAA
GTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCCCGGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTC
TTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCG
TCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGAGGTCGACTCTAGTCCCCGCGGTGGC。
3、在人腺病毒5型基因组第32679bp处即纤维蛋白HI loop处，插入编码含有RGD的序列，该序列为Tgt gac tgc cgc gga gac tgt ttc tgc。
4、在人腺病毒5型基因组32787bp与32788bp之间插入双表达IL-24与eGFP的表达元件。其序列如下：
CCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATGCCTGCTATTGTCTTCCCAATCCTCCCCCTTGCTGTCCTGCCCCACCCCACCC
CCCAGAATAGAATGACACCTACTCAGACAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCACC
TTCCAGGGTCAAGGAAGGCACGGGGGAGGGGCAAACAACAGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGtctagaTTACTTGTA
CAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGT
CTTTGCTCAGGGCGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGC
TGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTG
CTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGA
AGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCG
TCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTG
GTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGG
TGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAACTTGTGGCCG
TTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATctcgagATA
CAGCTCCACCGCACATGCCACCCTCCGGATATATTCGTCTCGAGCAAATCACTCGAGTATGTCGAGGTGGCGTGTACGGT
GGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGTTGGCAGTCTAGCGgctagcATACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCA
AGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTC
CACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGA
AGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGGAGTAGCACGTCTCACTACTAGCTAGTCTCGT
GCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTT
TCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGG
TCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCT
TTCGACCTGCAGCCCatcgatATGAATTTTCAACAGAGGCTGCAAAGCCTGTGGACTTTAGCCAGACCCTTCTGCCCTCC
TTTGCTGGCGACAGCCTCTCAAATGCAGATGGTTGTGCTCCCTTGCCTGGGTTTTACCCTGCTTCTCTGGAGCCAGGTAT
CAGGGGCCCAGGGCCAAGAATTCCACTTTGGGCCCTGCCAAGTGAAGGGGGTTGTTCCCCAGAAACTGTGGGAAGCCTTC
TGGGCTGTGAAAGACACTATGCAAGCTCAGGATAACATCACGAGTGCCCGGCTGCTGCAGCAGGAGGTTCTGCAGAACGT
CTCGGATGCTGAGAGCTGTTACCTTGTCCACACCCTGCTGGAGTTCTACTTGAAAACTGTTTTCAAAAACTACCACAATA
GAACAGTTGAAGTCAGGACTCTGAAGTCATTCTCTACTCTGGCCAACAACTTTGTTCTCATCGTGTCACAACTGCAACCC
AGTCAAGAAAATGAGATGTTTTCCATCAGAGACAGTGCACACAGGCGGTTTCTGCTATTCCGGAGAGCATTCAAACAGTT
GGACGTAGAAGCAGCTCTGACCAAAGCCCTTGGGGAAGTGGACATTCTTCTGACCTGGATGCAGAAATTCTACAAGCTCT
GAactagtCACAGCGGGGAGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAA
AAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAAC
AACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATG
TGGTATGGCTGATTATGATCCGGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGA
GACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTC
GGGGCGCAGCCATGAG
上述的条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten载体的构建方法步骤如下：
1、构建pAd5 E1B 55kd缺失的穿梭载体
以Ad5基因组质粒为PCR反应模板，Ad5基因组质粒为市场上销售的商品，引物XbaI A序列为GCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATG与XbaI B序列为TCAGATGGGTTTCTTCACTCCATTTATCCT，进行第一次PCR反应，反应条件为：94℃、2分钟，94℃、50秒，55℃、60秒，72℃、45秒，30个循环。聚合酶链式反应产物经质量浓度为1.0％的琼脂糖电泳后回片段，该聚合酶链式反应产物片段大小为719bp。以引物BglIIA序列为ATAAAGGATAAATGGAGTGAAGAAACCCATCTGAG和引物BglIIB序列为GAAGATCTATACAGTTAAGCCACCTATACAACA进行第二次聚合酶链式反应，反应条件为：94℃、2分钟，94℃、50秒，55℃、60秒，72℃、20秒，30个循环，所得到的聚合酶链式反应产物片段大小为270bp。将上述两次聚合酶链式反应产物混合作为模板，以引物XbaI A序列为GCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATG与引物BglIIB序列为GAAGATCTATACAGTTAAGCCACCTATACAACA进行第三次聚合酶链式反应，产物经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳后得到聚合酶链式反应产物片段大小为955bp，得到第三次聚合酶链式反应产物。将此片段与pGEMT-T easy载体连接。连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μlT4连接酶，5.5μl三蒸水，16℃连接过夜，将连接产物转化感受态的DH5α细胞，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得阳性克隆经XbaI和BglII双酶切，经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳纯化后得到的片断与用XbaI和BglII双酶切处理的腺病毒E1区穿梭载体进行连接。连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，5.5μl三蒸水。连接产物采用同样的方法转化，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pHE1B55D shuttle。此载体为获得的Ad5E1B 55kd缺失的穿梭载体。
2、构建pHE1B55D-Arresten的穿梭载体
采用聚合酶链式反应扩增Arresten基因，聚合酶链式反应扩增条件：94℃、5分钟，94℃、30秒，55℃、30秒，72℃、1分钟。使用伯乐聚合酶链式反应扩增仪，30个循环后收获DNA，经电泳纯化后与pGEMT-easy载体相连接，经转化感受态细胞DH5a，小量提取DNA，经酶切鉴定，所获得阳性克隆命名为pGEMT/Arresten。将Arresten片段从pGEMT/Arresten上经ClaI和NotI双酶切下来，经质量浓度为1.0％的琼脂糖电泳纯化后与用相同双酶切处理的pAd5.E1B55kdshuttle进行连接。连接与转化采用上述同样的方法，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，所获得的载体为表达Arresten的Ad5E1区穿梭载体，命名为pHE1B55D-Arresten shuttle。
3、构建pHE1B55D-Arresten/SwaI的腺病毒载体骨架
将ScaI线性化的pHE1B55D-Arresten shuttle的穿梭载体与ClaI线性化腺病毒骨架载体pTG3602/SwaI按摩尔比3∶1共转化感受态细胞BJ5183，将菌液涂布在含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中，16～24小时后，挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA。经酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得的阳性克隆即为pHE1B55D-Arresten/SwaI的腺病毒载体骨架，命名为pHE1B55D-Arresten/SwaI载体。
4、构建pshuttle Ad5-E4-fiber-RGD穿梭载体
以pUC19载体为基础，在氨苄抗性基因的开放读码框(ORF)的两端通过基因突变的方式产生两个单一的酶切位点(XbaI及SfuI)，将卡那抗性基因克隆到XbaI和SfuI的位点中，所获得的卡那抗性载体与EcoRI-HindIII linker(EcoRI PacI SwaI SpeI HindIII)连接，所获得的载体命名为pUCKanEHL。聚合酶链式反应扩增位于Ad5E4区3′端上游约2.0kb的片段，基因片段两端分别含有PacI与SwaI位点，将此片段克隆到pUCKanEHL载体相应的酶切位点中，由此得到的载体称为pshuttle Ad5E4-3′。采用聚合酶链式反应方法扩增Ad5纤维蛋白3′端上游约2.0kb的片段，基因片段两端分别含有SwaI与SpeI位点。将此片段克隆到pshuttle Ad5E4-3′载体相应的酶切位点中，所获得的新载体称为pshuttle Ad5-E4-fiber，然后通过重叠聚合酶链式反应方法，将RGD插入以上载体的fiber中，获得的载体称为pshuttle Ad5-E4-fiber-RGD。
5、构建表达eGFP及IL-24的穿梭载体pshuttle Ad5-CMVeGFP/IL-24-E4-fiber-RGD
通过聚合酶链式反应方法扩增miniCMV-SV40表达元件，聚合酶链式反应扩增条件是：94℃、2分钟，94℃、50秒，55℃、30秒，72℃、40秒，30个循环。聚合酶链式反应产物经质量浓度为1.0％的琼脂糖电泳后回收聚合酶链式反应片段。将聚合酶链式反应片段与pGEMT-T easy载体连接。连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μlT4连接酶，5.5μl三蒸水，16℃连接12小时，将连接产物转化感受态的DH5α细胞，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pGEMT/miniCMV-SV40。将miniCMV-SV40片段从pGEMT/miniCMV-SV40上经ClaI和NotI双酶切下来，与经同样酶切的双向启动子穿梭载体进行连接，连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，5.5μl三蒸水。连接与转化采用上述同样的方法，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40穿梭载体。利用聚合酶链式反应的方法扩增IL-24基因，聚合酶链式反应扩增条件：94℃、5分钟，94℃、30秒，55℃、30秒，72℃、1分钟。使用伯乐聚合酶链式反应扩增仪，30个循环后收获DNA，经电泳纯化后与pGEMT-easy载体相连接，经转化感受态细胞DH5a，小量提取DNA，经酶切鉴定，所获得阳性克隆命名为pGEMT/IL-24。将IL-24片段从pGEMT/IL-24上经XhoI和XbaI双酶切下来，经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳纯化后与用相同双酶切处理的pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40进行连接。连接与转化采用上述同样的方法，提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，所获得的载体为表达eGFP及IL-24的双向启动子穿梭载体，命名为pshuttle-Bio-eGFP-IL-24。将pshuttle-Bio-eGFP-IL-24经BamHI及SfuI双酶切末端补平后与经SwaI酶切的腺病毒E4-fiber穿梭载体进行连接，所获得的阳性克隆为表达eGFP及IL-24的腺病毒E4-fiber穿梭载体，此载体命名为pshuttleAd5-CMVeGFP/IL-24E4-fiber-RGD。
6、制备条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten载体
XhoI线性化的pshuttle Ad5-CMVeGFP/IL-24-E4-fiber-RGD穿梭载体与SwaI线性化的pHE1B55D-Arresten/SwaI腺病毒载体骨架按摩尔比3∶1共转化E.coliBJ5183，通过酶切及测序获得阳性克隆，所得到的载体称为pHE1B55D-RGD.IL-24/Arresten见图1。采用磷酸钙法将PacI线性化的表达绿色荧光蛋白和Arresten的pHE1B55D-RGD.IL-24/Arresten条件复制型腺病毒载体转染HEK 293细胞系。经过7～10天后，可见明显的细胞病变，然后经过离心收获病毒原液，经过2～3轮的病毒扩增后，进一步将所获得的病毒原液感染10个150cm的细胞培养平皿，扩增获得足够量的病毒原液用于后续的进一步纯化。感染的病毒的细胞经37℃/酒精干冰反复冻融3次，3500转/分钟离心15分钟，通过两次氯化铯密度梯度超速离心纯化，获得纯化的条件复制型腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten，并于-80℃冰箱内保存。
实施例2
本实施例的条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Trail载体如下：
实施例1中，在腺病毒基因组2245bp与3327bp之间处插入一个表达Arresten的表达元件中的Arresten第一外源基因用Trail替换。其它结构与实施例1相同，构成条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Trail载体。
其构建方法与实施例1相同。
实施例3
本实施例的条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Endostat in载体如下：
实施例1中，在腺病毒基因组2245bp与3327bp之间处插入一个表达Arresten的表达元件中的Arresten第一外源基因用Endostatin替换。其它结构与实施例1相同，构成条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Endostat in载体。
其构建方法与实施例1相同。
实施例4
本实施例的条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Canstatin载体如下：
实施例1中，在腺病毒基因组2245bp与3327bp之间处插入一个表达Arresten的表达元件中的Arresten第一外源基因用Canstatin替换。其它结构与实施例1相同，构成条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/Canstatin载体。
其构建方法与实施例1相同。
实施例5
本实施例的条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/tumostatin载体如下：
实施例1中，在腺病毒基因组2245bp与3327bp之间处插入一个表达Arresten的表达元件中的Arresten第一外源基因用tumostatin替换。其它结构与实施例1相同，构成条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.IL-24/tumostatin载体。
其构建方法与实施例1相同。
实施例6
本实施例的条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.Trail/Arresten载体如下：
实施例1中，在腺病毒基因组32787bp与32788bp之间插入双表达IL-24与eGFP的表达元件中的IL-24第二外源基因Trail替换。其它结构与实施例1相同，构成条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.Trail/Arresten载体。
其构建方法与实施例1相同。
实施例7
本实施例的条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.Endostatin/Arresten载体如下：
实施例1中，在腺病毒基因组32787bp与32788bp之间插入双表达IL-24与eGFP的表达元件中的IL-24第二外源基因Endostatin替换。其它结构与实施例1相同，构成条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.Endostatin//Arresten载体。
其构建方法与实施例1相同。
实施例8
本实施例的条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.Canstatin/Arresten载体如下：
实施例1中，在腺病毒基因组32787bp与32788bp之间插入双表达IL-24与eGFP的表达元件中的IL-24第二外源基因用Canstatin替换。其它结构与实施例1相同，构成条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.Canstatin/Arresten载体。
其构建方法与实施例1相同。
实施例9
本实施例的条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.tumostatin/Arresten载体如下：
实施例1中，在腺病毒基因组32787bp与32788bp之间插入双表达IL-24与eGFP的表达元件中的IL-24第二外源基因用tumostatin替换。其它结构与实施例1相同，构成条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-RGD.tumostatin/Arresten载体。
其构建方法与实施例1相同。
实施例10
以上的实施例1～9，在腺病毒5型基因组第32679bp处即纤维蛋白HI loop处，插入编码含有RGD的序列中，RGD序列用SIKVAV序列替换。其它结构与相应的实施例相同。
其构建方法与实施例1相同。
实施例11
以上的实施例1～9，在腺病毒5型基因组第32679bp处即纤维蛋白HI loop处，插入编码含有RGD的序列中，RGD序列用YGRKKRRQRRR序列替换。其它结构与相应的实施例相同。
其构建方法与实施例1相同。
实施例12
以上的实施例1～9，在腺病毒5型基因组第32679bp处即纤维蛋白HI loop处，插入编码含有RGD的序列中，RGD序列用NGR序列替换。其它结构与相应的实施例相同。
其构建方法与实施例1相同。
实施例13
以上的实施例1～9，在腺病毒5型基因组第32679bp处即纤维蛋白HI loop处，插入编码含有RGD的序列中，RGD序列用pK7序列替换。其它结构与相应的实施例相同。
其构建方法与实施例1相同。
实施例14
有效成分小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体在制备治疗恶性脑胶质瘤、肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌、黑色素瘤药物用常规药用制剂的形式来使用。所述的药用常规制剂含作为活性成分的小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体，该活性成分在制剂中与药学上可接受的载体如适宜于静脉注射给药的有机或无机固体或液体赋形剂混合，在制剂中，活性成分的小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体含量为95％。
为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1的条件复制型腺病毒HE1B55D-RGD.IL24/Arresten载体(以下简称HE1B55D-RGD.IL24/Arresten)进行了药效试验，各种试验情况如下：
1、HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten对恶性脑胶质瘤细胞生长抑制作用
采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法检测HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten对恶性脑胶质瘤细胞系U87增殖的影响，具体操作如下：
(1)接种细胞：取对数生长期的恶性脑胶质瘤细胞系U87，用质量分数为0.1％胰酶消化后接种于96孔板，每孔细胞数为1×103。
HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten处理：将10MOI的HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten病毒载体及对照病毒感染恶性脑胶质瘤细胞系U87，每组设3个复孔。以磷酸盐缓冲液(PBS)处理作为对照组。分别在24小时，48小时及72小时后检测以上病毒载体对恶性脑胶质瘤细胞系U87生长的抑制作用。
(2)显色：培养48小时后加入5g/L的MTT 20μL，继续培养4小时。
(3)读数：去掉培养基，加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，置于水平摇床上，室温作用10分钟。酶标仪570nm处测得吸光值。取各孔光吸收值，将所得结果用统计产品与服务解决方案软件(SPSS)13.0软件的One Way ANOVA进行统计分析，各组间差异比较采用方差分析。实验结果见图2。由图2可见，HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten对恶性脑胶质瘤细胞系U87增殖具有明显的抑制作用。
2、HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten对肝癌细胞生长抑制作用
采用MTT方法检测HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten对肝癌细胞系HepG2增殖的影响，具体操作如下：
(1)接种细胞：取对数生长期的肝癌细胞系HepG2，用质量分数为0.1％胰酶消化后接种于96孔板，每孔细胞数为1×103。
HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten处理：将5MOI的HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten病毒载体及对照病毒感染肝癌细胞系HepG2，每组设3个复孔。以磷酸盐缓冲液处理作为对照组。分别在24小时，48小时及72小时后检测以上病毒载体对肝癌细胞系HepG2生长的抑制作用。
(2)显色：培养48小时后加入5g/L的MTT 20μL，继续培养4小时。
(3)读数：去掉培养基，加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，置于水平摇床上，室温作用10分钟。酶标仪570nm处测得吸光值。取各孔光吸收值，将所得结果用SPSS 13.0软件的One Way ANOVA进行统计分析，各组间差异比较采用方差分析。实验结果见图3。由图3可见，HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten对肝癌细胞系HepG2增殖具有明显的抑制作用。
3、HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten对胃癌细胞生长抑制作用
采用MTT方法检测HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten对胃癌细胞系BGC-823增殖的影响，具体操作如下：
(1)接种细胞：取对数生长期的胃癌细胞系BGC-823，用质量分数为0.1％胰酶消化后接种于96孔板，每孔细胞数为1×103。
HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten处理：将5MOI的HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten病毒载体及对照病毒感染胃癌细胞系BGC-823，每组设3个复孔。以磷酸盐缓冲液处理组作为对照。分别在24小时，48小时及72小时后检测以上病毒载体对胃癌细胞系BGC-823生长的抑制作用。
(2)显色：培养48小时后加入5g/L的MTT 20μL，继续培养4小时。
(3)读数：去掉培养基，加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，置于水平摇床上，室温作用10分钟。酶标仪570nm处测得吸光值。取各孔光吸收值，将所得结果用SPSS 13.0软件的One Way ANOVA进行统计分析，各组间差异比较采用方差分析。实验结果见图4。由图4可见，HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten对胃癌细胞系BGC-823增殖具有明显的抑制作用。
4.HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten对肺癌细胞生长抑制作用
采用MTT方法检测HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten对肺癌细胞系A549增殖的影响，具体操作如下：
(1)接种细胞：取对数生长期的肺癌细胞系A549，用质量分数为0.1％胰酶消化后接种于96孔板，每孔细胞数为1×103。
HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten处理：将5MOI的HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten病毒载体及对照病毒感染肺癌细胞系A549，每组设3个复孔。以磷酸盐缓冲液处理组作为对照。分别在24小时，48小时及72小时后检测以上病毒载体对肺癌细胞系A549生长的抑制作用。
(2)显色：培养48小时后加入5g/L的MTT 20μL，继续培养4小时。
(3)读数：去掉培养基，加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，置于水平摇床上，室温作用10分钟。酶标仪570nm处测得吸光值。取各孔光吸收值，将所得结果用SPSS 13.0软件的One Way ANOVA进行统计分析，各组间差异比较采用方差分析。实验结果见图5。由图5可见，HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten对肺癌细胞系A549增殖具有明显的抑制作用。
5、HE1B55D-RGD.IL24/Arresten对结肠癌细胞生长抑制作用
采用MTT方法检测HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten对结肠癌细胞系Caco2增殖的影响，具体操作如下：
(1)接种细胞：取对数生长期的结肠癌细胞系Caco2，用质量分数为0.1％胰酶消化后接种于96孔板，每孔细胞数为1×103。
HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten处理：将5MOI的HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten病毒载体及对照病毒感染结肠癌细胞系Caco2，每组设3个复孔。以磷酸盐缓冲液处理组作为对照。分别在24小时，48小时及72小时后检测以上病毒载体对结肠癌细胞系Caco2生长的抑制作用。
(2)显色：培养48小时后加入5g/L的MTT 20μL，继续培养4小时。
(3)读数：去掉培养基，加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，置于水平摇床上，室温作用10分钟。酶标仪570nm处测得吸光值。取各孔光吸收值，将所得结果用SPSS 13.0软件的One Way ANOVA进行统计分析，各组间差异比较采用方差分析。实验结果见图6。由图6可见，HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten对结肠癌细胞系Caco2增殖具有明显的抑制作用。
6、HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten对乳腺癌细胞生长抑制作用
采用MTT方法检测HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten对乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖的影响，具体操作如下：
(1)接种细胞：取对数生长期的乳腺癌细胞系MDA-MB-231，用质量分数为0.1％胰酶消化后接种于96孔板，每孔细胞数为1×103。
HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten处理：将10MOI的HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten病毒载体及对照病毒感染乳腺癌细胞系MDA-MB-231，每组设3个复孔。以磷酸盐缓冲液处理组作为对照。分别在24小时，48小时及72小时后检测以上病毒载体对乳腺癌细胞系MDA-MB-231生长的抑制作用。
(2)显色：培养48小时后加入5g/L的MTT 20μL，继续培养4小时。
(3)读数：去掉培养基，加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，置于水平摇床上，室温作用10分钟。酶标仪570nm处测得吸光值。取各孔光吸收值，将所得结果用SPSS 13.0软件的One Way ANOVA进行统计分析，各组间差异比较采用方差分析。实验结果见图7。由图7可见，HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten对乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖具有明显的抑制作用。
7、HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten在体外对黑色素瘤细胞的生长抑制作用
采用MTT方法检测HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten对黑色素瘤细胞系B16F10-G5-luc增殖的影响，具体操作如下：
(1)接种细胞：取对数生长期的黑色素瘤细胞系B16F10-G5-luc，用质量分数为0.1％胰酶消化后接种于96孔板，每孔细胞数为1×103。
HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten处理：将10MOI的HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten病毒载体及对照病毒感染黑色素瘤细胞系B16F10-G5-luc，每组设3个复孔。以磷酸盐缓冲液处理组作为对照。分别在24小时，48小时及72小时后检测以上病毒载体对黑色素瘤细胞系B16F10-G5-luc生长的抑制作用。
(2)显色：培养48小时后加入5g/L的MTT 20μL，继续培养4小时。
(3)读数：去掉培养基，加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，置于水平摇床上，室温作用10分钟。酶标仪570nm处测得吸光值。取各孔光吸收值，将所得结果用SPSS 13.0软件的One Way ANOVA进行统计分析，各组间差异比较采用方差分析。实验结果见图8。由图8可见，HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten对黑色素瘤细胞系B16F10-G5-luc增殖具有明显的抑制作用。
8、HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten在体内对B16F10-G5-luc黑色素瘤细胞生长抑制作用
取处于对数生长期的B16F10-G5-luc黑色素瘤细胞，用PBS洗涤后经质量分数为0.2％胰酶消化，PBS吹打悬浮细胞，4℃，2000g离心10min，弃上清；用无血清培养液重悬细胞，并用血球计数板计数，制备成6.6×106/mL的细胞悬液，并按1mL每支分装至1.5mL EP管中。
取健康纯种4-6周龄Balb/c雌性裸鼠49只，在本实验室适应性饲养一周后进行动物实验，动物试验根据NIH试验动物的护理和使用指导说明实施。先用75％酒精在其右后肢消毒，进行乙醚吸入麻醉，细胞悬液摇匀后进行皮下注射，按150μL(细胞总数为1×106)/只进行注射。每天观察皮下成瘤情况。皮下接种4天，裸鼠皮下出现直径5mm的黑色硬结，即为种植瘤生长。49只裸鼠随机分成7组，每组7只。重组腺病毒基因治疗抗肿瘤实验方案如下：各组均使用瘤体内注射，每只裸鼠注射病毒总量均为2×109空斑形成单位(Plaque Forming Units，PFU)，隔日注射1次，共注射4次，每次剂量为5×108PFU。开始治疗后，每隔一天进行移植瘤的体积测量，根据移植瘤的长径(a)、短径(b)，按公式计算瘤体体积(V＝a×b2/2)，绘制肿瘤体积-时间变化曲线。以对照组裸鼠平均体积超过3,000mm3时，作为实验终点。
结果显示各组裸鼠皮下种植瘤的体积均有增加，但是在同一个检测时间点比较(如注射肿瘤细胞后的第16天时)，HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten组比对照组Ad5.eGFP的肿瘤生长缓慢，实验结果见图9，由图9可见，HE1B55D-RGD.IL-24/Arresten具有更强肿瘤抑制作用。
Claims (11)
1.一种小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体，其特征在于：在人腺病毒5型基因组2245bp-3327b之间有1083bp碱基的缺失，在人腺病毒5型基因组2245bp与3327bp之间处插入一个表达第一外源基因的表达元件，在腺病毒5型基因组第32679bp处即纤维蛋白HIloop处，插入编码含有一个小肽序列，在人腺病毒5型基因组32787bp与32788bp之间插入双表达第二外源基因与eGFP的表达元件；上述的小肽序列为RGD、SIKVAV、YGRKKRRQRRR、NGR、pK7序列中的任意一个。
2.按照权利要求1所述的小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体，其特征在于：所说的在人腺病毒5型基因组2245bp与3327bp之间处插入一个表达第一外源基因的表达元件中的第一外源基因是Arresten、Trail、Endostatin、Canstatin、tumostatin中的任意一种。
3.按照权利要求1所述的小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体，其特征在于：所说的在人腺病毒5型基因组32787bp与32788bp之间插入双表达第二外源基因与eGFP的表达元件中的第二外源基因是IL-24、Trail、Endostatin、Canstatin、tumostatin的任意一种。
4.一种权利要求1小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体的构建方法，其特征在于由下述步骤组成：
(1)构建pAd5E1B 55kd缺失的穿梭载体
以Ad5基因组质粒为PCR反应模板，引物XbaI A序列为GCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATG与引物XbaI B序列为TCAGATGGGTTTCTTCACTCCATTTATCCT进行第一次聚合酶链式反应，聚合酶链式反应产物经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳后回片段，该聚合酶链式反应产物片段大小为719bp。以引物BglII A序列为ATAAAGGATAAATGGAGTGAAGAAACCCATCTGAG和引物BglII B序列为GAAGATCTATACAGTTAAGCCACCTATACAACA进行第二次聚合酶链式反应，所得到的聚合酶链式反应产物片段大小为270bp，将上述两次聚合酶链式反应产物混合作为模板，以引物XbaI A序列为GCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATG与引物BglIIB序列为GAAGATCTATACAGTTAAGCCACCTATACAACA进行第三次聚合酶链式反应，产物经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳后得到聚合酶链式反应产物片段大小为955bp，得到第三次聚合酶链式反应产物，将聚此片段与pGEMT-T easy载体连接，连接产物转化感受态的DH5α细胞，涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得阳性克隆经XbaI和BglII双酶切，经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳纯化后得到的片断与用XbaI和BglII双酶切处理的腺病毒E1区穿梭载体进行连接，连接产物采用同样的方法转化，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pHE1B55D shuttle，获得pAd5E1B 55kd缺失的穿梭载体；
(2)构建pHE1B55D-第一外源基因的穿梭载体
采用聚合酶链式反应扩增第一外源基因，经电泳纯化后与pGEMT-easy载体相连接，经转化感受态细胞DH5a，小量提取DNA，经酶切鉴定，所获得阳性克隆命名为pGEMT/第一外源基因；将第一外源基因的片段从pGEMT/第一外源基因上经ClaI和NotI双酶切下来，经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳纯化后与用相同双酶切处理的pAd5.E1B55kd shuttle进行连接，连接与转化采用上述同样的方法，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，所获得的载体为表达第一外源基因的Ad5E1区穿梭载体，命名为pHE1B55D-第一外源基因shuttle；
(3)构建pHE1B55D-第一外源基因/SwaI的腺病毒载体骨架
将ScaI线性化的pHE1B55D-第一外源基因shuttle的穿梭载体与ClaI线性化腺病毒骨架载体pTG3602/SwaI按摩尔比3∶1共转化感受态细胞BJ5183，将菌液涂布在含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中，经酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得的阳性克隆即为pHE1B55D-第一外源基因/SwaI的腺病毒载体骨架，命名为pHE1B55D-第一外源基因/SwaI载体；
(4)构建pshuttle Ad5-E4-fiber-小肽序列穿梭载体
以pUC19载体为基础，在氨苄抗性基因的开放读码框的两端通过基因突变的方式产生两个单一的酶切位点XbaI及SfuI，然后将卡那抗性基因克隆到XbaI和SfuI的位点中，所获得的卡那抗性载体与EcoRI-HindIII linker连接，获得的载体命名为pUCKanEHL；聚合酶链式反应扩增位于Ad5E4区3′端上游2.0kb的片段，基因片段两端分别含有PacI与SwaI位点，将此片段克隆到pUCKanEHL载体相应的酶切位点中，得到的载体称为pshuttle Ad5E4-3′；采用聚合酶链式反应方法扩增Ad5纤维蛋白3′端上游2.0kb的片段，基因片段两端分别含有SwaI与SpeI位点；将此片段克隆到pshuttle Ad5E4-3′载体相应的酶切位点中，获得的新载体称为pshuttleAd5-E4-fiber，通过重叠聚合酶链式反应方法，将小肽序列插入以上载体的fiber中，获得的载体称为pshuttle Ad5-E4-fiber-小肽序列；
(5)构建表达eGFP及第二外源基因的穿梭载体pshuttle Ad5-CMVeGFP/第二外源基因-E4-fiber-小肽序列
通过聚合酶链式反应方法扩增miniCMV-SV40表达元件，聚合酶链式反应产物经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳后回收聚合酶链式反应片段，将聚合酶链式反应片段与pGEMT-T easy载体连接，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得阳性克隆命名为pGEMT/miniCMV-SV40，将miniCMV-SV40片段从pGEMT/miniCMV-SV40上经ClaI和NotI双酶切下来，与经同样酶切的双向启动子穿梭载体进行连接，连接产物采用同样的方法转化，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40；采用聚合酶链式反应方法扩增第二外源基因，扩增的产物经电泳纯化后与pGEMT-easy载体相连接，经酶切鉴定，获得阳性克隆命名为pGEMT/第二外源基因，将第二外源基因片段从pGEMT/第二外源基因上经XhoI和XbaI双酶切下来，用相同双酶切处理的pshuttle-Bio-PGK-eGFP-miniCMV-SV40进行连接；连接与转化采用上述同样的方法，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，所获得的载体为表达eGFP及第二外源基因的双向启动子穿梭载体，命名为pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因；将pshuttle-Bio-eGFP-第二外源基因经BamHI及SfuI双酶切末端补平后与经SwaI酶切的腺病毒E4-fiber穿梭载体进行连接，获得的阳性克隆为表达eGFP及第二外源基因的腺病毒E4-fiber穿梭载体，命名为pshuttle Ad5-CMVeGFP/第二外源基因-E4-fiber-小肽序列；
(6)制备条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因
用XhoI线性化的pshuttle Ad5-CMVeGFP/第二外源基因-E4-fiber-小肽序列的穿梭载体与SwaI线性化的pHE1B55D-第一外源基因/SwaI腺病毒载体骨架按摩尔比3∶1共转化E.coliBJ5183，通过酶切及测序获得阳性克隆，所得到的载体命名为pHE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因；采用磷酸钙法将PacI线性化的表达绿色荧光蛋白的pHE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因的条件复制型腺病毒载体转染HEK 293细胞系，经过7～10天后，离心收获病毒原液，经2～3轮的病毒扩增，通过两次氯化铯密度梯度超速离心纯化，获得纯化的表达绿色荧光蛋白的的条件复制型溶瘤腺病毒HE1B55D-小肽序列.第二外源基因/第一外源基因，-80℃冰箱内保存。
5.权利要求1小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体在制备治疗恶性脑胶质瘤药物中的用途。
6.权利要求1小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体在制备治疗肝癌药物中的用途。
7.权利要求1小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体在制备治疗胃癌药物中的用途。
8.权利要求1小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体在制备治疗肺癌药物中的用途。
9.权利要求1小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体在制备治疗结肠癌药物中的用途。
10.权利要求1小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体在制备治疗乳腺癌药物中的用途。
11.权利要求1小肽修饰表达两个外源基因的条件复制型溶瘤腺病毒载体在制备治疗黑色素瘤药物中的用途。
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