CN102227626A

CN102227626A - 使用道威棱镜的高分辨率表面等离子体共振仪器

Info

Publication number: CN102227626A
Application number: CN2009801477458A
Authority: CN
Inventors: 琼-弗朗索瓦.马森; 奥利维尔.博尔达克
Original assignee: Universite de Montreal
Current assignee: Universite de Montreal
Priority date: 2008-09-30
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2011-10-26
Also published as: US20110310383A1; US8982353B2; EP2335050A1; WO2010037227A1; CA2738688A1; EP2335050A4

Abstract

表面等离子体共振仪器和测量方法，其中，透镜将光准直成光束，棱镜利用棱镜的一个面上的内反射以单传播角度传播所述准直光束，并且分析仪处理来自棱镜的所述准直光束。棱镜的所述面构造成接收表面等离子体共振传感器，并且至少第一透镜和棱镜沿单光轴排列。

Description

使用道威棱镜的高分辨率表面等离子体共振仪器

技术领域

本发明涉及表面等离子体共振(SPR)仪器。

背景技术

SPR感测已成为广泛应用的、用于生物分子交互作用的测量、蛋白质的量化、和DNA的测量的技术。简要地说，SPR依赖于在薄金属膜与介电材料之间的界面处存在的电荷密度振荡(charge-density oscillation)的光激发。当光在与表面等离子体(SP)的波矢量匹配的波长-角度耦合下处于全内反射时实现共振条件。多种光学构造可能激发SP。

一种普遍的构造采用单色光来调节与SP共振的角度，通常被称为克莱舒曼(Kretschmann)构造。许多商业上成功的SPR仪器是基于这种克莱舒曼光学构造的。然而，此技术有在生物医学应用中使用受限的缺点：这种SPR仪器通常实施起来昂贵，由于光路的尺寸限制，它们不能布署在现场中，并且它们与生物学样本不兼容。因此，尽管克莱舒曼SPR仪器的普遍性，但是仍有需要开发一种将高分辨率的角度调节构造与便宜且便携的仪器的优点相结合的SPR仪器。

作为角度调节SPR构造的替代，人们已对基于不同构造的SPR仪器做了研究。在它们之中，一种使用光纤作为感测元件的SPR仪器是成本有效的、对研究级仪器的替代；它们是便携式的且能适用于各种应用，例如盐度(salinity)传感器、用于伤口愈合的生物传感器、用于心脏病标志物(cardiac marker)的生物传感器、和用于葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B)的生物传感器。利用位于光纤的尖端(tip)的微棱镜的近红外激发能改善光纤SPR的灵敏度(sensitivity)。然而，利用光纤SPR实现的分辨率受到实现光纤SPR所要求的光纤的数值孔径(NA)的限制。大数值孔径(NA＝0.39)光纤用于传播SPR-有效的(SPR-active)波长-角度耦合。然而，由于大量的波长-角度耦合在光纤中传播并且与SPR表面进入共振，所以SPR光谱变宽从而导致此构造的有限的分辨率特性。为最小化此影像，低数值孔径(NA＝0.12)光纤可以更改成在光纤远端处具有微棱镜来改善SPR光谱和增大折射率的可达范围。使用该光纤SPR构造，分辨率限制在近似1.4×10^-6RIU(折射率单元)。光纤的数值孔径的进一步减小能实现与角度调节SPR构造相似的分辨率(近似5×10^-7RIU)。然而，当前的制造技术无法实现这样的低数值孔径。

一种对于角度调节SPR或光纤SPR的替代是采用多波长激发。此构造组合了光纤SPR仪器与角度调节SPR的元件。在多波长激发方案(scheme)中，来自激发光纤的准直白光以单角度反射，并且对所反射的光利用使用采集光纤的分光光度计进行分析。除了其它因素以外，多波长SPR的分辨率受到分光光度计的光谱分辨率的限制，所述分光光度计的光谱分辨率是光栅密度(grating density)的函数。具有高光谱分辨率的小型分光光度计的最近发展有可能使得能够以较小的占地面积(footprint)利用SPR以高分辨率实现对折射率的测量。在角度调节SPR构造情况下，分辨率取决于入射角度的扫描(慢测量和复杂机械设置)，或者取决于将棱镜与薄金属膜(例如由Au制得)之间界面处的入射光束聚焦在光电二极管的线性阵列上(为实现高分辨率而需要精确排列和很长的光路)。因而，角度调节SPR构造不适用于SPR仪器的廉价设计和便携性。使多波长SPR仪器的使用受限的当前缺点是，光学元件在激发角度下的精确排列或小感测元件的制造。

对于多分析物的同时检测，日益需要一种多路复用阵列。空间分辨的SPR测量提供一种用于监测在表面上的折射率的局部变化的技术。这样，用于多系统/复制(replicate)的生物分子交互作用的检测可能在空间分辨的感测阵列上进行。SPR成像，也称为SPR显微镜，已应用于生物分子绑定活动(binding event)的高处理能力(throughput)分析。SPR成像方法近来也通过改善分辨率、光学耦合、和蛋白质阵列构成而得以优化。然而，没有SPR测量具有对表面的SPR图像和传统SPR响应进行测量的双重能力。

附图说明

在附图中：

图1是使用道威棱镜的SPR仪器的示意图，其中，激发光纤与采集光纤之间的单轴光路产生占地面积小(small-footprint)的仪器；

图2A是一种自动参考的(auto-referenced)或双通道的SPR仪器的透视图，所述仪器中，来自道威棱镜的光束被分束成s偏振参考光束和p偏振检测光束；而图2B是图2A的SPR仪器的示意俯视图；

图3A是示出短程构造中对于折射率在1.33与1.36RIU之间变化的蔗糖溶液(sucrose solution)的SPR光谱的图表；而图3B是示出长程构造中对于折射率在1.33和1.42RIU之间变化的蔗糖溶液的SPR光谱的图表；

图4是示出使用最小值搜寻(λ_SPR)和利用(a-b)/(a+b)算法对SPR光谱的数据分析的图表，其中，单值分解(SVD，singular value decomposition)和利用包含化学信息的前几个分量进行的重构(reconstitution)用于对该光谱减噪；

图5A是示出磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS，1.33498RIU)和水(1.33287RIU)的反复测量的图表；图5B是图表，示出使用SPR光谱的最小值搜寻程序单值分解、使用前三个分量进行的重构、随后的最小值搜寻程序进行的数据分析；图5C是示出与图5B相同的单值分解处理的图表，然而使用(a-b)/(a+b)算法；图5D是示出使用流控池(flow cell)、主成分分析(PCA)处理和(a-b)/(a+b)算法获得的对蔗糖溶液(RI范围在1.333RIU和1.334RIU之间)的校准曲线的图表；

图6A是示出使用道威棱镜SPR和最小值搜寻算法(相对误差＝21％)对nM级的PBS中中β-内酰胺酶的测量图表；图6B是示出使用道威棱镜SPR和带单值分解的最小值搜寻算法(相对误差＝3.9％)对nM级的PBS中的β-内酰胺酶的测量图表；图6C是示出使用道威棱镜SPR和(a-b)/(a+b)算法(相对误差＝13％)对nM级的PBS中的β-内酰胺酶的测量图表；图6d是示出使用道威棱镜SPR和带单值分解的(a-b)/(a+b)算法(相对误差＝3.7％)对nM级的PBS中的β-内酰胺酶的测量图表；

图7A是从原始数据获得的金膜上的水滴的SPR图像；和图7B是由利用单值分解降噪之后的数据获得的金膜上的水滴的SPR图像；

图8A是流控池的示例的透视图，图8B是流控池的道威棱镜支承的透视图，图8C是流控池的盖的透视图；

图9是小型化的SPR仪器的透视图。

具体实施方式

根据本发明的第一方面，提供一种表面等离子体共振仪器，其包括：用于将光准直成光束的第一透镜；棱镜，利用在该棱镜的面上的内反射以单传播角度传播所述准直光束，其中，该棱镜的所述面构造成接收表面等离子体共振传感器；和用于分析来自所述棱镜的准直光束的分析仪；其中，至少所述第一透镜和所述棱镜沿单光轴排列(align)。

根据本发明的第二方面，提供一种表面等离子体共振测量方法，其包括：将表面等离子体共振传感器应用在棱镜的面上；通过第一透镜将光准直成光束；利用在所述棱镜的所述面上的内反射以单传播角度将所述准直光束传播通过棱镜；并且分析来自棱镜的准直光束；其中，所述方法还包括将至少第一透镜和棱镜沿单光轴排列。

当阅读本发明实施例的参考附图以仅为示例的方式给出的以下非限制性描述时，本发明的前述的和其它的目的、优点和特征将变得更加明显。

多波长激发当集成到SPR仪器时提供一种便携的、廉价的、具有高分辨率的SPR仪器。然而，如前面的描述所表明，使多波长SPR仪器的使用受限的当前缺点是，光学元件在SPR激发角度下的精确排列和/或小感测元件的制造。

道威棱镜、或其它的适合的棱镜的使用，有利于避开这些缺点。道威棱镜将平行于道威棱镜的长面(长面)照射的准直光束的图像反转。BK7道威棱镜中的传播角度相对于竖直方向是72.8°。此72.8°的传播角度导致BK7道威棱镜的长面处的全内反射，并且依据所感测的溶液的折射率在激发波长为600nm与1000nm之间的SPR中有效(active)。因而，需要单轴光路来构造该SPR仪器，这大大简化了光学设置而无空间分辨率或光学分辨率的损失。感测元件可简单地由涂覆有Au的载玻片构成，流控装置(fluidics)可安装在所述载玻片上用于高效的样本传递。此构造将便携的、廉价的SPR仪器的优点与角度调节构造SPR仪器的生物感测的高分辨率优势相结合。

此外，如前面所描述，没有SPR测量拥有测量传统SPR响应和表面的SPR图像的双重能力。带道威棱镜的SPR构造的使用能以独特的仪器模式(instrumental template)执行传统SPR响应测量和SPR成像。

在以下描述中，描述了一种基于使用BK7道威棱镜的光学设置的SPR仪器的非限制性示意实施例，所述BK7道威棱镜耦合至光纤和分光光度计，例如小型分光光度计，以减小SPR仪器的尺寸。此外，描述了对β-内酰胺酶(lactamase)的生物感测、动态范围、灵敏度、折射率分辨率、和再现性。所开发的用于改善SPR信号的分辨率的多数据分析策略中，最小值搜寻(多项式拟合(polynomial fit))和算法(a-b)/(a+b)被用于最大化SPR响应的分辨率。此外，还使用光谱的单值分解执行光谱降噪，以提高信噪比并且增大测得的SPR响应的分辨率。

SPR仪器的可能的两种构造：

1)第一种构造，使用采集光纤，带有用于多波长SPR的分光光度计；

和

2)第二种构造，使用带通滤波器和成像相机以执行SPR成像。SPR传感器的Au表面上的水滴的图像展示SPR成像构造。

使用道威棱镜的SPR仪器

首先将描述多波长SPR构造。

图1是围绕波长-调节光纤SPR和例如BK7道威棱镜101中的全内反射的组合而构建的SPR仪器100的示意图。BK7等同于熟知的用于制造可视范围内的光学部件的光学玻璃。BK7玻璃是较硬的硼-冕玻璃(bor-crown glass)，它显示出良好的耐擦伤性，具有非常低量的夹杂物(inclusions)且几乎无气泡(bubble-free)，并且在下至350nm的可视范围中具有高线性的光透射性。

如图1所示，该SPR仪器包括宽带光(broadband light)102的发生器103，例如卤素灯。反转的形状记忆合金(SMA)准直透镜105将来自卤素灯103的宽带光102聚焦至200μm直径的可见-近红外(Visible-NearInfraRed，Vis-NIR)光纤束(激发光纤104)中。SMA准直透镜106将来自激发光纤104的光准直成具有大约3mm直径的准直光束107。来自SMA准直透镜106的准直光束107经过偏光器108例如p-偏光器进行处理，经过BK7道威棱镜101传播，并且经过反转的SMA准直透镜110由另一个200μm直径的可视-近红外光纤束(采集光纤109)采集。采集光纤109可与激发光纤104相同。BK7道威棱镜101包括应用了SPR传感器112的长面111。SPR传感器包括具有一个表面上覆盖有金属膜121例如48-nm金膜的介电层，例如载玻片。载玻片的覆盖有金膜的表面布置成与面111相对。

从采集光纤109出射的光被提供到分析仪，例如可由小型分光光度计形成的分光光度计113。根据要覆盖的折射率(RI)范围，可使用短光谱范围的分光光度计(550nm-850nm)以覆盖从1.32至1.39RIU的RI范围，或者可使用较长光谱范围的分光光度计(550nm-1100nm)以覆盖从1.32至1.42RIU的RI范围。

在SPR成像构造中，采集光纤109被移除并且由光学带通滤波器(610±10nm)(未示出)取代。由光学带通滤波器处理过的准直光然后由分析仪分析。在此情况下，分析仪可包括相机，例如CCD相机(安道尔科技(Andor technology))(未示出)。50：50分束器可安装在BK7道威棱镜101与带通滤波器(未示出)之间，用于例如将来自透镜110的准直光同时提供到：(a)采集光纤109和分光光度计113(SPR波长调节)和(b)在单平台上的带通滤波器和相机(SPR成像)。

如图1所示，光学部件106、108、101和110沿单光轴排列。实际上，上述的使用例如BK7道威棱镜101的SPR仪器100在激发光纤104与采集光纤109之间限定出紧凑的(compact)单轴光路。因此，无需光学元件在SPR激发角度下的精确排列。

此外，当如图1所示的SPR仪器100包括光纤束和小型分光光度计时，可以构造占地面积较小的仪器，其中光学部件占据例如17cm长、6.5cm宽和17cm高的那么小的空间。

仍参考图1，来自偏光器108的准直的入射光束114照射在相对于单光轴倾斜(angular)的BK7道威棱镜101的面115上，从而以相对于竖直方向72.8°的单角度经过此棱镜101的本体传播。在此角度下，准直光束114的全内反射发生BK7道威棱镜101的平行于单光轴的在长面111处。此外，在此角度下，SPR传感器112的48nm金膜上的表面等离子体共振利用水溶液在近似610nm波长下被激发(图3)。金膜121上的表面等离子体共振改变该准直光束的光谱内容。当接触金膜121的流体样本的特性或成分改变金膜121上的表面等离子体共振时，所述准直光束的光谱内容相应地改变，由此，所述准直光束的光谱内容的适当分析能检测所述流体样本的特性或成分。利用此构造，SPR仪器100将多波长激发与分光光度计113结合以观察SPR光谱。

传感器112上的有效SPR面积小于1cm²。通过在激发光纤104与BK7道威棱镜101之间设置光阑(未示出)，可使此有效SPR面积可调。

准直光束116经过相对于单光轴倾斜(angular)的所述棱镜101的面117而离开BK7道威棱镜101，并且经过反转的SMA准直透镜110由采集光纤109采集，用于由分光光度计113分析。如前面的描述中所表明的，对于短范围的可达到的折射率(1.32至1.39RIU)，波长范围可以从550nm至850nm，或者对于SPR传感器112可达到的更宽范围的折射率(1.32至1.42RIU)，波长范围可从550nm至1100nm。多波长SPR仪器100具有同时获取SPR光谱的全波长扫描的能力，因此容许SPR光谱的快速获取。数据可以50Hz的速率获取，该速率允许积累构成一个数据点的50条光谱(1秒分辨率)。相比之下，扫描角度(通过物理地移动光源和/或光学元件)的SPR仪器不能实现这种时间分辨率。否则，光束聚焦在SPR棱镜上要求很长的光路来实现最优的光谱分辨率。相反，使用图1的BK7道威棱镜101，可以实现紧凑的设计而无需损失光谱分辨率和时间分辨率。相比于同时调节多个角度的SPR仪器，光学部件的排列也简单多了。相比于采用角度调节构造、要求以一组精确的角度将光聚焦的SPR仪器，BK7道威棱镜101简单地要求光学部件沿单光轴的排列。

可调的光谱范围有益于不同的应用。一些应用要求高光谱分辨率用于以高分辨率监测低含量分析物的SPR响应(例如用于生物感测低蛋白质含量)，而其它一些应用要求大的光谱范围以监测由于溶液的大量成分造成的折射率变化。采用多波长SPR构造，SPR仪器的光谱范围取决于分光光度计中所用的光栅(grating)。例如，有较高刻槽密度(groove density)的光栅将获得较大的光谱分辨率，但是仪器可达到的折射率范围较小。

第一实施方式使用上述光谱范围在550nm和850nm之间的分光光度计作为分光光度计113。此分光光度计产生1.33和1.39RIU之间的SPR仪器100的折射率范围(图3a)，这对于大多数利用水溶液的应用例如生物感测而言是足够的。波长＞750nm处光谱上所观察到的噪声归因于使用发射550nm和700nm之间的光的窄光谱范围的LED作为光发生器103。高功率LED(Philips Lumiled)用作光发生器103是有利的，其导致单次获取的积分时间较短(20ms)，以便累积多次获取以构成信号上减噪了的单光谱。因此，能以高获取速率获得动态(kinetic)数据，而测得的光谱具有低噪。

在第二实施方式中，利用用作分光光度计113，上述灵敏性在550nm和1100nm之间的分光光度计，示出SPR光谱(图3B)。使用卤素灯作为光发生器103可达到这种较长的光谱范围，并且为包括在1.33和1.42RIU之间的溶液产生可测量的SPR响应。

因此，SPR仪器100可达到的折射率的范围可利用不同的分光光度计来调节。SPR仪器100的这种多波长SPR构造产生可应用于不同情况的单模式(single template)。

SPR传感器

例如，为制造SPR传感器112，使用80℃的食人鱼溶液(piranha solution)(70％H₂SO₄∶30％H₂O₂)对3″×1″的载玻片120清洁90分钟。然后以18MΩ的水彻底漂洗(rinse)该载玻片。此后，以H₂O∶H₂O₂∶NH₄OH为5∶1∶1的溶液将该载玻片在超声浴中进一步清洁60分钟。然后，以18MΩ的水彻底漂洗该载玻片并且将其存放在18MΩ的水中直至使用。在对载玻片120敷金属(metallization)之前，载玻片120静止地进行空气干燥。然后，为制造SPR传感器112，首先将5nm厚的Cr黏接层沉积在载玻片的一个表面上，随后在该Cr黏接层上沉积48nm金膜121。

参考图1，SPR传感器112的载玻片120的未金属化的表面122经过折射率匹配油(折射率(RI)＝1.5150)贴靠至BK7道威棱镜101的长面111。

流控池(fluidic cell)

如图2A和图2B所示，流控池201安装在载玻片120的金属化表面202(Au膜121)上。流控池201包括本体，所述本体由例如底面施有金膜121的特富龙(Teflon)立方块材料制成。该Teflon立方块的底面形成有方形凹部，所述凹部形成用于容纳待分析的流体样本的池，并且所述底面预定要为此而接触金属化的表面202(Au膜121)。Teflon块还形成有：用于将流体样本提供到所述方形凹部的进口端口和导管；和将流体样本从所述方形凹部排出的出口导管和端口。注射泵(syringe pump)能用于产生经过与金属化的表面202接触的方形凹部的流体样本流。例如，该注射泵用于经过进口端口和导管、方形凹部、和出口导管和端口从容器抽吸流体样本。

例如，方形凹部能容纳的总容积小于100μL。此外，经过方形凹部的流体样本的流动速率将通常为16μLs^-1级。

参考图2A和2B，已经设计出一种机构来将流控池201保持和贴靠到载玻片120的金属化的表面202。该机构包括用于道威棱镜101的下支承203。上支承204安装在下支承203的上方。可移除的弹簧和活塞臂205安装在上支承204上，并且具有中心在流控池201的Teflon立方块的顶面的凹部中的自由端。该弹簧施压于流控池201的Teflon立方块上，以便：(a)确保由流控池201的Teflon立方块的底面中的方形凹部所形成的容积的不透性，和(b)维持流控池201的竖直位置。安装到下支承203的金属件206维持流控池201的Teflon立方块的水平位置，例如通过握持连接到流控池201的出口端口的导管的螺母。

流控池的具体示例

在图8A、8B和8C中，示出可与SPR仪器100一起使用的流控池401的具体示例。流控池401大体由盖402和道威棱镜支承403构成。道威棱镜404由压在它侧壁上的尼龙(nylon)螺钉405保持在棱镜支承403中适当的位置。道威棱镜404置于两个定位螺钉406上，从而容许它倾斜用于流控池401的适当密封或用于提供与光束的更佳对准。金属柱407使流控池401能够附接到防振台。使用匹配油将涂覆有金或银的常规BK7载玻片408置于道威棱镜404的顶部，以避免之间的折射率的任何变化。橡胶密封409结合在Teflon块410中以避免任何不希望的黏接将溶液流过敏感区域(sensitive zone)处的流体通道(fluidic corridor)封闭。所述流体通道由钻石形状的切口(carve)411形成，所述切口容许溶液的适当分布和更换。所述溶液经过连接到Teflon块410中的螺纹孔412的管(tube)而被引至流控池401，并且经过孔413而离开。金属压力板414拧紧在Teflon块410的顶部以避免由三个定位螺钉415引起的任何变形，所述三个定位螺钉415用于施压于Teflon块410以完全密封流控池401。经由尼龙螺钉405附接到棱镜支承403的流控池401的盖402对准载玻片408并且将流控部件保持在适当位置。此流控池401容许溶液的手动更换和自动更换。还可以利用传感器上方的恒定流执行测试，或将溶液留在池中用于静止化验(static assays)。

小型化的SPR仪器

现在参考图9，其中示出SPR仪器100的一种小型化版本。该小型化的SPR仪器501大体由小尺寸的铝底座(mount)502构成，所述铝底座502集成了SPR仪器100的所有部件同时优化了它的光学部件之间的距离。光由光纤引至小型化的SPR仪器501，并且由固定位置光发射准直仪透镜503进行准直。该光束然后穿过附接到偏振控制器504的两个偏振器中的一个。偏振器中的一个对应于“S”偏振，而另一个对应于“P”偏振。根据使用者的需要，偏振控制器504滑动以暴露一个偏振器或另一个偏振器。可变光阑505限制照射小尺寸道威棱镜506的倾斜表面的光束的面积。使用匹配油置于道威棱镜506上的、涂覆有金或银的22mm×22mm的载玻片用作传感器。尼龙螺钉通过在它的侧壁上施压从而将道威棱镜506保持在适当位置。采集透镜507安装在角度可调节的光采集器保持器508上以容许其旋转。该光采集器保持器508能通过它在高度调节滑块509的孔中滑动而侧向(sideway)运动，所述高度调节滑块509通过在槽中滑动而上下运动。两个透镜503和507、保持器508和滑块509由尼龙螺钉保持在适当位置。该小型化的SPR仪器501的总尺寸为60mm×75mm×30mm，这使它充分便携，从而能够直接地现场使用它。然而，要理解的是，给定的尺寸是可以改变的。还要理解的是，流控池可添加至小型化的SPR仪器501。

自动参考的(auto-referenced)或双通道的SPR仪器

如上文参考图1所述，SPR仪器包括用于将来自激发光纤104的光准直成准直光束107的SMA准直透镜106。来自SMA准直透镜106的准直光束107经过BK7道威棱镜101传播，并且由例如直角棱镜所构成的分束器208采集。分束器203将所采集的光束分成两个不同的光束209和210。第一光束209经过s-偏光器211处理以产生s-偏振的参考光束212，所述s-偏振的参考光束212经过SMA准直透镜213和采集光纤214而传递到分析仪(未示出)。第二光束210经过p-偏光器215处理以产生p-偏振检测光束216，所述p-偏振检测光束216经过SMA准直透镜217和采集光纤218而传送到分析仪(未示出)。因此，光被分成两个不同的光束，一束用作s-偏振参考光束，另一束作为p-偏振检测光束。以此方式，实时地获取参考以最小化偏差。

图2A和2B的构造和构想(concept)也能用于测量SPR传感器112的载玻片120的金属化表面202的两个区域。这产生带双测量通道的SPR仪器。

SPR传感器的校准(calibration)

SPR传感器112被校准以确定它在折射率的生物范围(biological realm)内对折射率的灵敏度。来自不同折射率的溶液的SPR响应的测量对用于大量(bulk)折射率变化的SPR传感器112进行校准。

例如，为此目的，在水中制备浓度范围从0％w/w至50％w/w的蔗糖溶液以覆盖1.33和1.42RIU之间的折射率范围。此后，使用注射泵和流控池201将该溶液连续地暴露给SPR传感器112。分光光度计113可使用两种方法执行数据分析：最小值搜寻[Gentleman，D.J.，Obando，L.A.，Masson，J.F.，Holloway，J.R.，Booksh，K.S.，Anal.Chim.Acta，515(2004)291]和关于SPR光谱的最小反射比(reflectance)的(a-b)/(a+b)算法[Tao，N.J.，Boussaad，S.，Huang，W.L.，Arechabaleta，R.A.，DAgnese，J.，Rev.Sci.Instrum.，70(1999)4656]。SPR光谱的单值分解(SVD)和使用前三个分量对SPR光谱的重构，被执行来优化信噪比。与上述两种数据分析方法一起，常线性最小二乘法(OLLS，Ordinary Linear Least Squares)回归(regression)模型被用于校准SPR传感器112。

图3A和3B分别示出以具有增加的浓度从而具有增加的折射率的蔗糖溶液获得的用于以上第一和第二实施方式的SPR光谱。使用具有1×10^-5RIU的准确度的折射计(refractometer)准确测量该蔗糖溶液的折射率。因为蔗糖不与SPR传感器112的金膜相互作用，所以蔗糖溶液是用于折射率校准的合适模型。因此，利用SPR传感器112测得的响应由来自大量(bulk)溶液的折射率唯一地产生，而未观察到由来自表面的分子积累所产生的贡献。由此，使用BK7道威棱镜101的SPR仪器100的灵敏度测得为1765±100nm/RIU。由于溶液折射率更高时折射率灵敏度增加，所以用于SPR传感器的校准曲线对于大折射率变化是非线性的。因此，以上测得的灵敏度仅对1.33和1.35RIU之间折射率的生物学相关范围有效。误差是使用常线性最小二乘(OLLS)回归法计算的、关于回归的两个标准偏差的误差。

下面将关于使用图1的SPR仪器100的β-内酰胺酶的检测的非限制性示例进行描述。

β-内酰胺酶(β-内酰胺酶)的检测

由SPR传感器112的载玻片202的裸金膜表面与5mM的16-巯基十六酸(16-mercaptohexadecanoic acid)(NHS-MHA)过夜(overnight)溶液的接触而形成NHS-MHA的N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimide ester)的单层。例如，可以根据文献[Masson，J.F.，Battaglia，T.M.，Khairallah，P.，Beaudoin，S.，Booksh，K.S.，Anal.Chem.，79(2007)612]中公布的程序制备NHS-MHA。在用乙醇(ethanol)且之后用磷酸盐缓冲盐水(PBS，PhosphateBuffered Saline)将NHS-MHA单层彻底漂洗之后，SPR传感器112的金属化的Au表面与在冷冻的PBS pH 7.4中以37μg/mL制备的抗β-内酰胺酶(QED Bioscience inc.)反应。反应在4℃环境下持续一夜以使抗体(antibody)降解(degradation)最小化。此后，用PBS漂洗样本并且在用10M NaOH调节成处于pH 8.5的乙醇胺盐酸盐的1M水溶液中反应10分钟。然后在使用前将载玻片120存放在4℃的PBS中至少60分钟。

通过原料溶液(stock solution)的稀释，在4℃的PBS中制备700nM的β-内酰胺酶溶液。此溶液在使用前保持在4℃直至20分钟，然后在室温下达到平衡以用于分析。以下测量的执行无需使用流池。带有β-内酰胺酶特定单层的SPR传感器112置于SPR仪器100的BK7道威棱镜101的长面111上，并且将处于室温的PBS置于SPR传感器112上10分钟以使SPR传感器112稳定。在马上要开始实时测量之前获取光谱参考(S-偏振光)。测量PBS 5分钟以获取基线(baseline)响应，此后将PBS换为β-内酰胺酶溶液测量20分钟。最后，PBS传感器112再次置于PBS中5分钟，验证抗β-内酰胺酶与β-内酰胺酶之间的绑定(binding)是否是可逆的(reversible)。

数据分析方法

SPR传感器112响应于折射率，在发生SPR现象的波长处出现偏移。因此，相反于大多数借助分光镜(spectroscopic)的应用中的光强(intensity)，用于确定折射率变化的数据处理方法将是准确的并且对光谱位置的小变化感测灵敏。而且，测得的响应的噪声也将最小化。通常，使用最小值搜寻算法，方法是通过对SPR光谱的二阶多项式进行数学拟合(fitting)和由该二阶多项式的导数为零确定最小值(图4)。要不然，采用一种算法，所述算法计算围绕一设定波长(λ₀)的分支波长的光强之间的差，除以两个分支的光强的和，得到SPR响应的位置的测量值(图4)。因此，算法(a-b)/(a+b)对SPR响应的位置的微小变化敏感，所述算法中，a是对于λ＜λ₀的分支的和，而b是对于λ＞λ₀的分支的和。此算法用于以原子力显微镜准确测量形貌(topography)。为了降低SPR光谱的噪声，将SPR光谱单值分解成它的主要分量，随后以包含化学信息的前若干分量对该光谱重构来减噪。在这种情况下，以前三种主要分量对SPR光谱的重构对化学信息是无损的。

如上所述，流控池201设计成使用注射泵将样本传递到SPR传感器112。注射泵具有0.5mL/min(8.3μL/s)至6.5mL/min(108μL/s)之间的可变流速。下文所示的结果是在16μL/s下获得的。为测量SPR测量的再现性，将SPR传感器112连续地暴露给18MΩ水5分钟，然后暴露给PBS另外5分钟，持续总共四次循环(图5A)。使用所述最小值搜寻数据分析，SPR响应在PBS(在20.00℃RI＝1.33498)与水(在20.00℃RI＝1.33316)之间的2.470±0.011nm的波长偏移下是可再现的(图5B)。原始SPR光谱的单值分解和以前三个分量对SPR光谱的重构得到2.482±0.021nm的波长偏移。所记录的误差是针对平均SPR响应的两个标准偏差的。因此，可观察到，利用单值分解和以前三个分量进行重构而实现降噪的SPR光谱不改变SPR响应。使用算法(a-b)/(a+b)和单值分解(图5C)降噪产生0.0257±0.0002(无单位)的响应。利用每种数据分析方法，流控池201的再现性优于1％的变化(n＝4)。

利用单值分解对原始SPR光谱降噪，从而可观察到SPR响应的噪声的显著下降。使用(a-b)/(a+b)算法用于数据处理，可观察到SPR光谱的噪声的进一步下降。利用流控池201对水样本的SPR响应的连续测量用于计算每种数据分析方法的分辨率(表1)。

表1

对用于流池(flow cell)稳定性和β-内酰胺酶生物感测的数据分析方法的比较

在16μL/s的流速下持续2分钟暴露于水的过程中的SPR响应的平均测量的两个标准偏差，并病将该值除以灵敏度，计算所述分辨率。使用最小值搜寻而无单值分解，测得的折射率的分辨率是3×10^-6RIU。单值分解降噪原始光谱将分辨率提高到1×10^-6RIU。因此，当使用利用最小值搜寻的单值分解对数据降噪时，可观察到分辨率提高3倍。相比之下，算法(a-b)/(a+b)相比最小值搜寻算法显著地改善分辨率。使用不带降噪的算法(a-b)/(a+b)和带有单值分解降噪的算法(a-b)/(a+b)进行数据处理，分别观察到9×10^-7RIU和1.5×10^-7RIU的分辨率。因此观察到，与最小值搜寻算法相比，通过在利用算法(a-b)/(a+b)处理之前对数据降噪得到更大的改善。对于所观察到的使用算法(a-b)/(a+b)降噪在分辨率上的更大改善可能归因于数据处理的方法。对于最小值搜寻程序而言限制分辨率的主要因素是SPR最小值的多项式拟合的准确度。SPR光谱的随机噪声不显著改变该光谱的形状。因此，用于最小值搜寻的二阶多项式的拟合通过降噪仅被稍微改善。对于算法(a-b)/(a+b)，分辨率主要受限于测量值上的随机噪声。在这种情况下，来自光谱的随机波动的噪声的减少显著影响SPR响应的分辨率。其结果是，噪声更大地减少，并且显著提高SPR仪器的分辨率。在10^-7RIU范围中的分辨率与最好的SPR仪器匹敌并且适合于高分辨率的SPR生物感测。根据报道，对于角度调节SPR分辨率在5×10^-7RIU，对于光纤SPR分辨率在1.4×10^-6RIU，对于波长调节SPR分辨率在近似10^-5RIU，而对于光强测量SPR(SPR成像)分辨率在5×10^-5RIU。相比于其它波长调节仪器，包括BK7道威棱镜101的SPR仪器100所获得的显著改善的分辨率归因于数据处理方法和SPR现象的单角度激发。其它波长调节技术不以唯一角度照射SPR传感器。这产生更宽的SPR光谱并且降低其它多波长SPR仪器的分辨率。

为了具有测量带有小折射率差异的溶液的潜在能力，为折射率在1.333和1.334之间的蔗糖溶液构建校准曲线(图5D)。因此，每种蔗糖溶液之间的折射率的差异＜2×10^-4RIU。如在图5D中可观察到，SPR响应上的信噪比不接近检测的极限。由于校准曲线的范围短，所以利用算法(a-b)/(a+b)测量的SPR信号显示出对于折射率的线性响应。SPR校准的非线性对于折射率校准跨度在差异＞0.02RIU时是显著的。利用算法(a-b)/(a+b)在12.5RIU^-1测得对折射率的灵敏度。利用该数据处理算法测得的响应是无单位的。

β-内酰胺酶生物感测

SPR仪器具有适用于利用模型生物系统(model biological system)进行生物感测的特征。通过将抗β-内酰胺酶固定在16-巯基十六酸(NHS-MHA)的N-羟基琥珀酰亚胺酯的单层上，执行对β-内酰胺酶的生物测定(bioassay)。将抗体固定至NHS-MH单层已经被证实能够在直接生物测定格式中最大化灵敏度[Masson，J.F.，Battaglia，T.M.，Cramer，J.，Beaudoin，S.，Sierks，M.，Booksh，K.S.，Anal.Bioanal.Chem.，386(2006)1951]表现最大灵敏度。由于β-内酰胺酶在对抗传统抗生素中的作用，因此β-内酰胺酶是一种合适的生物模型系统，所述对抗传统抗生素是患者中普遍发生的一种问题。β-内酰胺酶的存在是抗生素抗性(antibiotic resistance)的一个最常见的因素。然而，对于抗生素抗性的检测技术仍依赖于标准的微生物学方法，从而限制了执行鉴定所需要的时间以及对抗生素抗性的鉴定的处理能力。因此，相比于实际的检测技术，使用SPR生物传感器检测β-内酰胺酶将提供改进的方法来对β-内酰胺酶定量。

β-内酰胺酶的检测在nM浓度的PBS溶液中执行(图6A-6B)。在有限扩散范围中，在无流池的情况下测量β-内酰胺酶。上文所考察的每种数据分析方法用于在比较研究中处理数据。根据数据分析方法，可观察到在β-内酰胺酶生物传感器的响应中噪声水平的显著改善。采用最小值搜寻算法程序，β-内酰胺酶的绑定活动在视觉上难以从背景噪声中区分(图6A)。在β-内酰胺酶绑定之后测得的PBS与来自β-内酰胺酶的绑定之前的基线测得的PBS之间的SPR响应的变化是0.17±0.03nm。误差表示对于平均的两个标准偏差和21％的相对误差。利用单值分解对数据降噪显著改善信噪比(图6B)。在对以最小值搜寻算法分析过的SPR光谱进行降噪之后，清楚地观察到β-内酰胺酶绑定曲线。于是，SPR响应的变化为0.127±0.005nm，这将相对误差显著减小3.9％。相比于最小值搜寻程序，算法(a-b)/(a+b)减小β-内酰胺酶绑定曲线上的噪声水平(图6C)。利用算法(a-b)/(a+b)测得的响应是(6.4±0.8)×10^-4(无单位)。因此，相对误差是13％，这相比于最小值搜寻程序显著减小了。然而，这仍然太大而不能观察到β-内酰胺酶绑定曲线。利用单值分解对数据降噪和利用算法(a-b)/(a+b)进行分析，这将噪声减小至等量于最小值搜寻的水平(图6D)。为β-内酰胺酶绑定测得的响应是(4.05±0.15)×10^-4(无单位)。因此，利用算法(a-b)/(a+b)对SPR光谱降噪还改善绑定曲线的信噪比并且得到3.7％的相对误差。在最小值搜寻算法与算法(a-b)/(a+b)之间，动态过程的测量产生相似的相对误差。在这种情况下，该相对误差主要归因于对β-内酰胺酶绑定曲线的测量的准确度。

SPR成像

因为多路复用阵列格式容许在单样本中同时对多分子的分析，所以SPR成像的普及度增加。如前所述，利用带通滤波器/成像CCD相机取代采集光纤109/分光光度计113，从而能将图1的使用BK7道威棱镜101的SPR仪器100轻而易举地更改成成像构造。因此，610±10nm带通滤波器(未示出)安装在BK7道威棱镜101与成像CCD相机(未示出)之间。进入BK7道威棱镜101的准直光束114通过棱镜被反转，而空间信息保留。因此，利用SPR仪器100的这种构造能获得SPR表面的图像。作为示例，利用SPR仪器100的这种构造(图7A和7B)获取在SPR传感器112的暴露的Au表面的单个水滴的SPR图像。该图像表示近似1cm²的区域。使用望远镜式透镜以便在表面上进行缩放(zoom)，从而可提高该图像的空间分辨率。对六个水滴的每一个测得的吸收率恒定在0.0317±0.0012。利用单值分解对原始数据降噪(图7A)显著减小SPR图像上的噪声(图7B)。在这种情况下，对SPR图像的重构要求使用前五个分量以避免化学信息的损失。对于平常的SPR光谱(图3A-3B和4)，前三个分量可用于适当地重构该光谱而无化学信息的损失。然而，SPR图像要求很多分量来适当地重构该图像。

利用SPR多波长和成像构造，上述的SPR仪器100能用于执行生物感测。SPR仪器100结合低成本和现成的光学部件，并具有测得的响应的高分辨率。根据用于处理原始SPR光谱的数据分析方法，分辨率在3×10^-6RIU和1.5×10^-7RIU之间变化。对SPR光谱的二阶多项式拟合产生的分辨率低于使用算法(a-b)/(a+b)所得到的。利用单值分解对数据降噪和利用包含化学信息的成分进行重构，这将分辨率提高近似一个数量级。因此，算法(a-b)/(a+b)与利用分解进行降噪的组合提高了分辨率。根据所使用的分光光度计，可达到的折射率范围不同，利用550-850nm分光光度计，可达到的折射率范围从1.33至1.39RIU，利用550-1100nm分光光度计，可达到的折射率范围从1.33至1.42RIU。利用流控池201对PBS的反复注射的测量证实利用道威棱镜SPR仪器100实现了测量再现性＜1％。

应注意的是，BK7道威棱镜101可由任何其它适合的、能够执行大致相同功能的棱镜取代。所述取代也同样适用于SPR仪器100的其它部件，SPR传感器112和流控池201。

虽然对本发明已参考示出的本发明实施例进行描述，但是在不背离发明主题的本质、精神、和范围的情况下，在随附权利要求的范围内，可对这些实施例任意更改。

Claims

1.一种表面等离子体共振仪器，包括：

用于将光准直成光束的第一透镜；

棱镜，利用在该棱镜的面上的内反射、以单传播角度传播所述准直光束，其中，该棱镜的所述面构造成接收表面等离子体共振传感器；和

用于分析来自所述棱镜的准直光束的分析仪；

其中，至少所述第一透镜和所述棱镜沿单光轴排列。

2.如权利要求1所述的表面等离子体共振仪器，其中，所述棱镜是道威棱镜，并且其中所述棱镜的所述面是所述道威棱镜的长面。

3.如权利要求1所述的表面等离子体共振仪器，包括用于接收来自所述棱镜的准直光束的采集光纤，其中，所述分析仪包括连接到所述采集光纤的分光光度计。

4.如权利要求1所述的表面等离子体共振仪器，其中，所述分析仪包括：用于处理来自所述棱镜的准直光束的光学带通滤波器，和连接到该光学带通滤波器的成像相机。

5.如权利要求1所述的表面等离子体共振仪器，包括：光发生器、激发光纤，和用于在将被聚焦的光提供到所述第一透镜以前将来自所述发生器的光聚焦到所述激发光纤中的第二透镜。

6.如权利要求1所述的表面等离子体共振仪器，包括用于处理来自所述第一透镜且传播通过所述棱镜的准直光束的偏光器。

7.如权利要求1所述的表面等离子体共振仪器，其中，来自所述棱镜的准直光束经过第二反转光准直透镜由采集光纤采集。

8.如权利要求1所述的表面等离子体共振仪器，其中，所述表面等离子体共振传感器包括具有覆盖有金属膜的表面的介电层。

9.如权利要求7所述的表面等离子体共振仪器，其中，所述分析仪包括提供有来自所述采集光纤的准直光束的分光光度计。

10.如权利要求1所述的表面等离子体共振仪器，包括：用于将来自所述棱镜的光束进行准直的第二反转光准直透镜；和用于处理来自所述第二透镜的准直光束的光学带通滤波器，其中，所述分析仪包括提供有由所述光学带通滤波器处理过的准直光束的相机。

11.如权利要求1所述的表面等离子体共振仪器，包括：用于将来自所述棱镜的光束进行准直的第二反转光准直透镜；和提供有来自所述第二透镜的准直光束的分束器，所述分束器用于将来自所述第二透镜的准直光束提供给来自所述棱镜的光束的多个分析仪。

12.如权利要求1所述的表面等离子体共振仪器，包括：用于将来自所述棱镜的光束进行准直的第二反转光准直透镜，其中，所述第一透镜、棱镜、和第二透镜沿单光轴排列。

13.如权利要求12所述的表面等离子体共振仪器，包括：用于处理来自所述第一透镜且传播通过所述棱镜的准直光束的偏光器，其中，所述第一透镜、偏光器、棱镜、和第二透镜沿单光轴排列。

14.如权利要求2所述的表面等离子体共振仪器，其中：

-所述道威棱镜包括本体；

-所述道威棱镜的长面大体平行于所述单光轴；

-所述道威棱镜包括相对于所述单光轴的斜面；

-所述表面等离子体共振传感器被贴靠到所述道威棱镜的所述长面，所述表面等离子体共振传感器包括具有覆盖有金属膜的表面的介电层；和

-来自所述第一透镜的准直光束照射在所述道威棱镜的斜面上从而以单一预定角度传播通过所述道威棱镜的本体，在所述单一预定角度下，在所述长面上发生所述准直光束的全内反射，以激发所述金属膜上的表面等离子体。

15.如权利要求14所述的表面等离子体共振仪器，其中，所述道威棱镜包括相对于所述单光轴的第二斜面，所述准直光束通过所述第二斜面离开所述道威棱镜。

16.如权利要求1所述的表面等离子体共振仪器，其中，所述表面等离子体传感器包括载玻片，所述载玻片具有未金属化的表面和覆盖有金属膜的表面，其中，所述未金属化的表面贴靠至所述棱镜的面。

17.如权利要求16所述的表面等离子体共振仪器，其中，所述金属膜包括Au。

18.如权利要求8所述的表面等离子体共振仪器，还包括用于使流体样本接触所述金属膜的流控池。

19.如权利要求18所述的表面等离子体共振仪器，其中，所述流控池包括：本体，所述本体由一面有凹部的材料制成；进口端口和导管，用于将流体样本供给到所述凹部；和出口导管和端口，用于将流体样本从所述凹部排出。

20.如权利要求19所述的表面等离子体共振仪器，包括泵，所述泵产生经过进口端口和导管、方形凹部、和出口导管和端口的流体样本流。

21.如权利要求1所述的表面等离子体共振仪器，还包括将来自棱镜的准直光束分成不同的第一光束和第二光束的分束器。

22.如权利要求21所述的表面等离子体共振仪器，包括使所述第一光束成为偏振参考光束的第一偏光器，和使所述第二光束成为偏振检测光束的第二偏光器。

23.如权利要求21所述的表面等离子体共振仪器，其中，所述不同的第一光束和第二光束用于测量所述金属膜的两个区域。

24.一种表面等离子体共振测量方法，包括：

将表面等离子体共振传感器贴靠在棱镜的面上；

通过第一透镜将光准直成光束；

利用在所述棱镜所述面上的内反射以单传播角度使所述准直光束传播通过所述棱镜；并且

分析来自所述棱镜的准直光束；

其中，所述方法还包括将至少所述第一透镜和棱镜沿单光轴排列。

25.如权利要求24所述的表面等离子体共振测量方法，其中，所述棱镜是道威棱镜，并且其中所述棱镜的所述面是道威棱镜的长面。

26.如权利要求24所述的表面等离子体共振测量方法，其中，分析来自所述棱镜的准直光束包括使用分光光度计。

27.如权利要求24所述的表面等离子体共振测量方法，其中，分析来自所述棱镜的准直光束包括：将来自所述棱镜的准直光束送入光学带通滤波器和连接至该光学带通滤波器的成像相机。

28.如权利要求24所述的表面等离子体共振测量方法，包括：产生光；并且在将聚焦的光提供给所述第一透镜之前聚焦所述产生的光。

29.如权利要求24所述的表面等离子体共振测量方法，包括：使来自所述第一透镜且传播通过所述棱镜的准直光束偏振。

30.如权利要求24所述的表面等离子体共振测量方法，包括：通过第二反转光准直透镜将来自所述棱镜的准直光束采集在采集光纤中。

31.如权利要求24所述的表面等离子体共振测量方法，包括：使用具有覆盖有金属膜的表面的介电层形成表面等离子体共振传感器。

32.如权利要求30所述的表面等离子体共振测量方法，其中，分析来自所述棱镜的准直光束包括将来自所述采集光纤的准直光束提供给分光光度计。

33.如权利要求24所述的表面等离子体共振测量方法，包括：使用第二反转光准直透镜将来自所述棱镜的光束准直；在光学带通滤波器中处理来自所述第二透镜的准直光束；和将所述光学带通滤波器处理过的准直光束提供给相机。

34.如权利要求24所述的表面等离子体共振测量方法，包括：使用第二反转光准直透镜将来自所述棱镜的光束准直；和将来自所述第二透镜的准直光束分束；和将来自所述第二透镜的已分束的准直光束提供给多个分析仪。

35.如权利要求24所述的表面等离子体共振测量方法，包括：使用第二反转光准直透镜将来自所述棱镜的光束准直，其中，沿单光轴排列至少所述第一透镜和棱镜包括：沿单光轴排列所述第一透镜、棱镜、和第二透镜。

36.如权利要求35所述的表面等离子体共振测量方法，包括：将来自所述第一透镜的准直光束通过偏光器处理，其中，沿单光轴排列至少所述第一透镜和棱镜包括：沿单光轴排列所述第一透镜、偏光器、棱镜、和第二透镜。

37.如权利要求25所述的表面等离子体共振测量方法，其中：

-所述道威棱镜包括本体；

-所述道威棱镜的长面大体平行于所述单光轴；

-所述道威棱镜包括相对于所述单光轴的斜面；

-将表面等离子体共振传感器贴靠在棱镜的一个面上包括将所述表面等离子体共振传感器贴靠到所述道威棱镜的长面，所述表面等离子体共振传感器包括具有覆盖有金属膜的表面的介电层；和

-所述方法包括：使来自所述第一透镜的准直光束照射到所述道威棱镜的斜面上，从而使来自所述第一透镜的准直光束以单一预定角度传播通过所述道威棱镜的本体，所述准直光束在所述单一预定角度下在所述长面发生全内反射以激发所述金属膜上的表面等离子体。

38.如权利要求24所述的表面等离子体共振测量方法，包括：使来自所述道威棱镜的准直光束通过所述道威棱镜的第二斜面出射，所述第二面相对于所述单光轴是倾斜的。

39.如权利要求24所述的表面等离子体共振测量方法，其中，所述表面等离子体传感器包括载玻片，所述载玻片具有未金属化的表面和覆盖有金属膜的表面，其中，将表面等离子体共振传感器贴靠于所述棱镜的所述面上包括将所述未金属化的表面贴靠于棱镜的所述面上。

40.如权利要求39所述的表面等离子体共振测量方法，包括以Au形成所述金属膜。

41.如权利要求31所述的表面等离子体共振测量方法，还包括利用流控池使流体样本接触所述金属膜。

42.如权利要求41所述的表面等离子体共振测量方法，包括形成所述流控池，所述流控池具有：本体，所述本体由一面有凹部的材料制成；用于将流体样本提供到所述凹部的进口端口和导管；和用于将流体样本从所述凹部排出的出口导管和端口。

43.如权利要求42所述的表面等离子体共振测量方法，包括泵送流体样本流，使之经过所述进口端口和导管、方形凹部、和出口导管和端口。

44.如权利要求24所述的表面等离子体共振测量方法，还包括将来自所述棱镜的准直光束分束成不同的第一光束和第二光束。

45.如权利要求44所述的表面等离子体共振测量方法，包括：将所述第一光束偏振成偏振参考光束，和将所述第二光束偏振成偏振检测光束。

46.如权利要求44所述的表面等离子体共振测量方法，包括使用所述不同的第一光束和第二光束测量所述金属膜的两个区域。