CN102215863A - 包含脑膜炎奈瑟氏球菌的蛋白质nmb0964的疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含奈瑟氏球菌囊泡的免疫原性组合物，其具有上调的NMB0964抗原水平，使得产生针对所述抗原的杀菌抗体。首次发现，所述抗原的表达是锌调节的，因此提供通过去除细胞或启动子的锌阻抑机制，或者通过去除培养基中的锌而上调所述抗原表达的方法。
Description
发明领域
本发明涉及用于预防由奈瑟氏球菌属(Neisseria)细菌，特别是脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)引起的疾病的免疫原性组合物。
发明背景
奈瑟氏球菌菌株是许多人类疾病的致病因子，需要开发针对该菌的有效疫苗。特别是淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟氏球菌引起的可通过接种疫苗治疗的疾病。
淋病奈瑟氏球菌是淋病的病因，淋病是一种最常报道的性传播疾病，估计全球的年发病数为6200万例(Gerbase等，1998 Lancet 351；(增刊3)2-4)。淋病的临床表现包括泌尿生殖道、咽喉或直肠黏膜炎症和新生儿眼部感染。女性淋球菌感染增加，可导致不育、异位妊娠、慢性盆腔炎和输卵管卵巢脓肿形成。复合淋病伴有败血病、关节炎、心内膜炎和脑膜炎。
抗生素抗性的淋球菌菌株的巨大数量造成与淋病有关的发病率和并发症增加。一种有吸引力的替代抗生素治疗淋病的方法可能是使用接种疫苗进行预防。目前没有淋病奈瑟氏球菌感染的疫苗。
脑膜炎奈瑟氏球菌是一种重要的病原体，尤其是在儿童和年青人中。败血病和脑膜炎是侵袭性脑膜炎球菌病(IMD)最危急生命的形式。这种疾病因其高发病率和死亡率而成为全世界的健康问题。
根据荚膜多糖的抗原性差异，已鉴定出13种脑膜炎奈瑟氏球菌血清群/血清型，其中最常见的是造成全球疾病90％的A、B和C群。在欧洲、美国和几个拉丁美洲国家，B血清群是脑膜炎球菌病的最常见原因。
已开发出基于血清群A、C、W和Y的荚膜多糖的疫苗，并且表明可控制脑膜炎球菌病的爆发(Peltola等，1985 Pediatrics 76；91-96)。然而，B血清群的免疫原性差，只诱导主要是IgM同种型的短暂性抗体应答(Ala′Aldeen D and Cartwright K 1996，J.Infect.33；153-157)。因此，目前没有明显有效的针对B血清群脑膜炎球菌的疫苗，在气温最温和的国家，这种B血清群脑膜炎球菌是造成大多数脑膜炎球菌病的原因。由于B血清型脑膜炎球菌病的发病率在欧洲、澳大利亚和美国升高，多发生在5岁以下儿童中，因此这尤其成问题。由于多糖荚膜与人神经细胞黏着分子的免疫相似性而造成其免疫原性差，因此开发针对B血清群脑膜炎球菌的疫苗显得特别困难。因此，生产疫苗的策略一直集中在脑膜炎球菌外膜表面暴露的结构上，但却受阻于菌株间这些抗原的明显变异。
进一步开发引入了由外膜囊泡(vesicles)构成的疫苗，其可含有许多构成细菌膜的正常内含物的蛋白质。其中之一是针对脑膜炎奈瑟氏球菌B和C血清群的古巴VA-MENGOC-BC疫苗(Rodriguez等，1999 Mem Inst.Oswaldo Cruz，Rio de Janeiro 94；433-440)。这种疫苗是设计来对抗在古巴通过接种计划使用荚膜多糖AC疫苗不能消除的侵袭性脑膜炎球菌病的爆发。主要的血清群是B和C，
疫苗成功控制了爆发，估计针对脑膜炎奈瑟氏球菌的B血清群菌株的疫苗功效为83％(Sierra等，1990 In Neisseria，Walter Gruyter，Berlin，M.Achtman等(编著)，第129-134页；Sierra等，1991，NIPH Ann 14；195-210)。这种疫苗针对某次特定爆发是有效的，然而所引起的免疫应答却不能防御脑膜炎奈瑟氏球菌的其它菌株。
随后在拉丁美洲进行了由同源和异源B血清群脑膜炎球菌菌株引起的流行病期间的功效研究表明，在年龄较大的儿童和成人中有一些功效，但是在感染风险最大的年龄较小的儿童中其功效显著较低(Milagres等，1994，Infect.Immun.62；4419-4424)。在有多菌株地方病的国家(例如英国)，这类疫苗的功效如何仍有疑问。针对异源菌株的免疫原性研究表明，只有有限的交叉反应性血清杀菌活性，尤其是在婴幼儿中(Tappero等，1999，JAMA 281；1520-1527)。
在挪威，使用在斯堪的纳维亚盛行的典型血清型B的分离株开发出第二种外膜囊泡疫苗(Fredriksen等，1991，NIPH Ann，14；67-80)。在临床试验中对这种疫苗进行了试验，发现29个月后的保护功效为57％(Bjune等，1991，Lancet，338；1093-1096)。
现有的抗脑膜炎球菌疫苗存在各种问题。基于蛋白质的外膜疫苗往往只对少数菌株是特异性的和有效的。多糖疫苗也低于最佳水平，因为它们往往引起低下且短暂的免疫应答，特别是针对B血清群(Lepow等，1986；Peltola 1998，Pediatrics 76；91-96)。
奈瑟氏球菌感染代表着一个相当大的卫生保健问题，其中在淋病奈瑟氏球菌的情况下没有可用的疫苗，而在脑膜炎奈瑟氏球菌的情况下，可用疫苗的防御异源菌株的功效和能力有限。显然需要开发良好的针对奈瑟氏球菌感染的疫苗，其可改进现有疫苗的功效，并且可供防御较大范围的菌株。
发明综述
本发明的发明人发现，奈瑟氏球菌抗原NMB0964(NMB编号是指可获自www.neisseria.org的脑膜炎奈瑟氏球菌B群基因组序列)[在菌株Z2491的脑膜炎奈瑟氏球菌A群基因组中称为NMA1161，在WO 00/55327中称为BASB082，也称为ZnuD]在整个奈瑟氏球菌属中是一种保守抗原，可诱导针对许多奈瑟氏球菌属菌株的杀菌抗体。本发明的发明人发现，这种抗原在细菌中起Zn2+受体的作用，且其表达受介质中的Zn2+水平调节。
总的来讲，本发明提供用于在患者中诱导针对奈瑟氏球菌属细菌、特别是针对脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群菌株的免疫应答的方法和组合物。
本发明的一个方面提供包含由奈瑟氏球菌属细菌制备的分离的外膜囊泡和药学上可接受的赋形剂的免疫原性组合物，其中当给予患者时，奈瑟氏球菌属细菌产生足够水平的NMB0964多肽以供产生诱导抗NMB0964抗体的囊泡。
本发明可如下实现：通过例如以下方法遗传修饰奈瑟氏球菌属细菌的NMB0964多肽产生-破坏Zur阻抑蛋白(NMB1266)的功能性表达，Zur阻抑蛋白在培养基中存在Zn2+时关闭NMB0964的表达；用不结合Zur的启动子、特别是比内源NMB0964启动子更强的启动子(例如lac启动子)置换NMB0964启动子；或者通过使用低Zn2+浓度(即5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05或0.01μM以下的游离Zn2+)的培养基，例如Roswell Park Memorial Institute培养基1640(RPMI)(ICP-MS测定其Zn2+约1.69μM)；或者除去培养基中的Zn2+，例如使用已知的锌螯合剂(例如TPEN(N，N，N′，N′-四(2-吡啶基甲基)乙二胺))-将足够的锌螯合剂加入培养基中，使NMB0964的表达最大化。
奈瑟氏球菌属细菌可缺乏荚膜多糖，例如通过破坏siaD基因的功能性表达。可破坏奈瑟氏球菌属细菌的msbB和/或htrB基因的功能性表达以使外膜囊泡中的LOS解毒。可破坏奈瑟氏球菌属细菌的一种或多种下列基因的表达：PorA、PorB、OpA、OpC、PiIC或FrpB。可破坏奈瑟氏球菌属细菌的IgtB基因的功能性表达。这类破坏方法可参见WO 01/09350和WO2004/014417。奈瑟氏球菌属细菌可以是L2或L3免疫型(immunotype)。
由奈瑟氏球菌属菌株制备或分离外膜囊泡(亦称膜泡、微泡或小泡(blebs))的方法是本领域众所周知的，可参见WO 01/09350和WO2004/014417。通常，在不用洗涤剂(detergent)或者用0-0.5％、0.02-0.4％、0.04-0.3％、0.06-0.2％或0.08-0.15％洗涤剂(例如脱氧胆酸盐，例如用约0.1％或正好0.1％的脱氧胆酸盐)提取来分离外膜囊泡。
附图简述
图1.蛋白质印迹检测的TdfI。(A)生长于TSB(泳道1)、RPMI(泳道2)的HB-1和生长于RPMI的tdfI敲除菌株(泳道3)。(B)生长于RPMI的HB-1，其中加入的TSB量逐渐递增。(C)生长于RPMI的HB-1(泳道1)，其中补充了0.5μM锌(泳道2)或1μM锌(泳道4)。(D)生长于RPMI的HB-1(泳道1)，其中TPEN浓度逐渐递增(泳道2-4中分别为0.1、0.5和1μM)
图2.野生型和zur突变株的TdfI表达。通过蛋白质印迹分析，对生长于RPMI、RPMI与600nM锌或TSB中的HB-1和zur突变株细胞的裂解物中存在的TdfI进行了分析。
图3.TdfI的拓扑模型。塞子结构域(plug domain)为深灰色，β链为浅灰色，而胞外环为白色。组氨酸/天冬氨酸序列段方框示出。
图4.通过TdfI的锌结合和转运。(A)通过PAR竞争测定法测定与含TdfI或不含TdfI的外膜囊泡结合的锌；(B)通过ICP-MS测定的野生型菌株、tdfI突变株和tonB突变株的胞内锌浓度。
图5.TdfI的锌调节在脑膜炎球菌中是高度保守的。生长于加锌或不加锌的RPMI中的指定菌株细胞裂解物的蛋白质印迹。a得自(36)的克隆群名称；-表明菌株通过多位点酶电泳分型，但无法确定特异性克隆。
图6.TdfI疫苗的蛋白质谱。用于免疫小鼠以产生抗血清的外膜囊泡通过SDS-PAGE分离并用考马斯亮蓝染色。
图7.IPTG对TdfI在用于SBA的细胞上表达的影响。参见实施例1。
增补图1.脑膜炎奈瑟氏球菌菌株MC58的TdfI与053422、FAM18和Z2491、载体菌株α14、α153和α275的TdfI的氨基酸序列比对。在序列之上标注了TonB box(Tb)、塞子结构域、环和跨膜结构域(Tm)，富含His和Asp的序列段用下划线表示。
增补图2.TdfI同源物的氨基酸序列比对。富含组氨酸天冬氨酸的序列段以灰色突出显示。
发明详述
本发明基于这样的发现：即在特定的低Zn2+培养条件下制备的OMV疫苗，或者由经工程改造成过量表达NMB0964或去除通过Zur介导的锌阻抑机制的突变型脑膜炎奈瑟氏球菌菌株制备的OMV疫苗富含NMB0964，而且与不是用这些方法制备的OMV相比，这类OMV可引起良好的杀菌抗体反应。
本文的术语NMB0964多肽包括通常来自任何奈瑟氏球菌属菌株的奈瑟氏球菌TdfI多肽(由tdfI基因编码)(该蛋白质在奈瑟氏球菌属菌株中相当保守，本领域技术人员容易确定其在任何具体奈瑟氏球菌属菌株中的同一性)。因此，该术语包括NMA1161序列和WO 00/55327的BASB082多肽序列(且本发明有关BASB082多肽的全部多肽)。例如本发明的NMB0964多肽将包括WO00/55327的SEQ ID NO：2，或者与所述SEQ ID NO：2有超过70％、80％、90％或95％序列同一性的多肽，或者包含所述SEQ ID NO：2的7、10、12、15或20个(或更多个)连续氨基酸的免疫原性片段(特别是所述免疫原性片段能够诱导-如有必要与蛋白质载体偶联时-可识别所述SEQ ID NO：2的免疫应答)的多肽。当应用于任何给定的NMB0964序列时，特别优选的NMB0964免疫原性片段的实例是图3拓扑图中所示胞外环序列的免疫原性片段。特别提供第3胞外环(其中2个Cys残基任选为二硫键连接的或未连接的)。所述NMB0964免疫原性片段多肽序列可能与WO00/55327的SEQ ID NO：2中所述胞外环序列(如图3中定义)有超过70％、80％、90％或95％序列同一性，或者可以是包含SEQ ID NO：2的所述胞外环序列(如图3中定义)的7、10、12、15或20个(或更多个)连续氨基酸的免疫原性片段(特别是所述免疫原性片段能够诱导-如有必要与蛋白质载体偶联时-可以识别所述SEQ ID NO：2的免疫应答)的多肽，并且其以本发明的NMB0964多肽提供。所述NMB0964免疫原性片段多肽序列与图3给出的第三胞外环序列的序列有超过70％、80％、90％、95％、99％或100％的序列同一性(其中任选2个Cys残基应是保守的，且可以是或可以不是二硫键连接的)，或者可以是包含所述胞外环序列的7、10、12、15或20个(或更多个)连续氨基酸的免疫原性片段(特别是所述免疫原性片段能够引起-如有必要与蛋白质载体偶联时-可以识别WO00/55327的SEQ ID NO：2的免疫应答)的多肽，并以本发明的NMB0964多肽提供。在一个实施方案中，NMB0964免疫原性片段多肽不是全长NMB0964(成熟序列或具有信号序列)多肽。因此，本发明的另一个方面是包含本发明的这类NMB0964免疫原性片段多肽序列和药学上可接受的赋形剂的免疫原性组合物。
在一个实施方案中，术语“当给予患者时，NMB0964多肽的水平足以提供产生诱导抗NMB0964抗体的囊泡”是指该水平足以诱导可检测的杀菌抗体，例如SBA效价为100以上，例如，这表示采用实施例2的“血清杀菌测定法”部分的SBA测定法，在第0、21和28天给小鼠肌内注射蛋白质总含量为5μg的本发明外膜囊泡时，第42天的血清SBA效价超过100(例如大于150、200、250、300、350、400、500、700、900或1000)。
与本发明多肽有关的异源启动子比本发明多肽的非阻抑内源启动子“更强(的)”是指与使用本发明多肽的非阻抑内源启动子相比，它的使用导致表达更多的本发明的多肽。
术语“保护性免疫”是指给予哺乳动物的疫苗或免疫接种方案诱导免疫应答，其预防、延缓由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的脑膜炎球菌病的发生，或者降低由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的脑膜炎球菌病的严重程度，或者减轻或完全消除脑膜炎球菌病的症状。
表述“由脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群菌株引起的脑膜炎球菌病”包括表现在被脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群中的一个成员感染的任何临床症状或临床症状的组合。这些症状包括但不限于：脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群致病株在上呼吸道(例如鼻咽和扁桃体黏膜)的建群、细菌侵入黏膜和黏膜下层血管床、败血病、败血症性休克、炎症、出血性皮肤病变、激活血纤蛋白溶解和激活血液凝固、器官功能障碍(例如肾衰竭、肺衰竭和心力衰竭)、肾上腺出血和肌梗死、毛细血管渗漏、水肿、外周肢体缺血、呼吸窘迫综合征、心包炎和脑膜炎。
本文使用的“血清群”是指通过荚膜多糖中免疫学可检测的变异对脑膜炎奈瑟氏球菌进行的分类。已知大约12个血清群：A、B、C、X、Y、Z、29-E、W-135、H、I、K和L。任何一种血清群可包括多个血清型和多个血清亚型。
“富集/富含”是指实验人员或临床人员操作抗原组合物中的抗原，使得与从中获得抗原组合物的菌株中的抗原浓度相比，抗原存在的浓度(占总重)高至少3倍，通常高至少5倍，更优选高至少10倍或高至少100倍。因此，如果特定抗原的浓度为1微克/克细菌总制备物(或细菌总蛋白)，则富集制备物可能含有至少3微克/克细菌总制备物(或细菌总蛋白)。
可通过本文所述方法(例如培养条件，或通过重组方法过量表达所述多肽)，在本发明的外膜囊泡中富集本发明的NMB0964多肽。
术语“异源(的)”是指两种生物成分不会同时存在于自然界。所述成分可以是宿主细胞、基因或调节区，例如启动子。虽然异源成分不会同时存在于自然界，但是它们可以同时起作用，像当与基因异源的启动子与基因有效连接时一样。另一个实例是其中奈瑟氏球菌序列与不同菌株的奈瑟氏球菌宿主异源。在两种不同菌株中表达蛋白质的情况下，本文使用的“异源(的)”是指所述蛋白质的氨基酸序列不同。
生产株可以是荚膜缺陷菌株。荚膜缺陷菌株可提供囊泡型疫苗，其使得在给予疫苗的患者中诱导显著的自身抗体应答的风险降低(例如由产生与宿主细胞表面的唾液酸起交叉反应的抗体所致)。本文使用的“荚膜缺陷”或“缺乏荚膜多糖”是指细菌表面上的荚膜多糖水平低于天然菌株的荚膜多糖水平，或者其中经过遗传改造的菌株的荚膜多糖水平低于该荚膜缺陷菌株从中衍生的亲代菌株的荚膜多糖水平。荚膜缺陷菌株包括表面荚膜多糖产生降低至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％或以上的菌株，并包括其中细菌表面上无可检出荚膜多糖的菌株(例如使用抗荚膜多糖抗体通过完整细胞ELISA无法检出的菌株)。
荚膜缺陷菌株包括由于天然存在的遗传修饰或者重组产生的遗传修饰所引起的荚膜缺陷的菌株。本领域已知天然存在的荚膜缺陷菌株(参见例如Dolan-Livengood等，J.Infect.Dis.(2003)187(10)：1616-28)以及鉴定和/或产生荚膜缺陷菌株的方法(参见例如Fisseha等(2005)Infect.Immun.73(7)：4070-4080；Stephens等(1991)Infect Immun59(11)：4097-102；Frosch等(1990)Mol Microbiol.19904(7)：1215-1218)。
可供荚膜多糖产生下降的奈瑟氏球菌宿主细胞的修饰可包括参与荚膜合成的一个或多个基因的修饰，其中所述修饰提供例如与修饰前的亲本细胞相比荚膜多糖水平降低。这类遗传修饰可包括提供菌株荚膜缺陷的一个或多个荚膜生物合成基因中核苷酸和/或氨基酸序列的改变(例如由一个或多个荚膜生物合成基因中一个或多个插入、缺失、取代等引起的改变)。荚膜缺陷菌株可缺少一个或多个荚膜基因或一个或多个荚膜基因可以是无功能的。特别有益的是缺乏唾液酸生物合成的菌株。
这类菌株可供产生囊泡，其降低诱导与人唾液酸抗原交叉反应的抗唾液酸抗体的风险，并还可提供改进的制备安全性。唾液酸生物合成中有缺陷的菌株(由天然存在的修饰或工程改造的修饰所致)可能是在唾液酸生物合成途径中许多不同基因的任一个有缺陷。特别有益的是由N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸2-差向异构酶基因(称为synXAAF40537.1或siaA AAA20475)编码的基因产物中有缺陷的菌株，其中该基因失活的菌株尤其有益。例如，在一个实施方案中，通过破坏功能性synX基因产物的产生来制备荚膜缺陷菌株(参见例如Swartley等(1994)J Bacteriol.176(5)：1530-4)。
荚膜缺陷菌株还可采用非重组技术由天然菌株产生，例如，使用杀菌抗荚膜抗体选择荚膜多糖减少的菌株。
总体上如上所述，可按照本发明使用天然存在的或修饰的非天然存在的奈瑟氏球菌属菌株来产生囊泡，所述奈瑟氏球菌属菌株产生具有足够NMB0964蛋白、在给予患者时提供产生抗NMB0964抗体的囊泡。
在一个实施方案中，用于产生本发明的囊泡的奈瑟氏球菌属菌株可以是天然存在的菌株，与表达不可检出NMB0964或低水平NMB0964的菌株相比，其表达较高水平的NMB0964。
在另一个实施方案中，奈瑟氏球菌属菌株通过重组或非重组技术修饰以产生足够高水平的NMB0964。
这类修饰菌株一般如此产生，使得NMB0964产生的增加超过未修饰亲代细胞产生的NMB0964或超过菌株RM1O9O或H44/76产生的NMB0964的1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5倍或10倍以上。任何合适的菌株均可用于本实施方案，包括修饰前产生低水平或无可检出水平的NMB0964的菌株以及与表达无可检出水平或低水平的NMB0964的菌株相比天然产生高水平NMB0964的菌株。
可采用重组技术产生修饰菌株，通常通过引入编码NMB0964多肽的核酸或操纵内源NMB0964基因以增加内源NMB0964的表达。
如上所述，这可通过引入编码NMB0964多肽的核酸或操纵内源NMB0964基因以增加内源NMB0964的表达来进行。
可通过原位改变控制NMB0964表达的调节区来增加内源NMB0964的表达。提供增加内源奈瑟氏球菌基因表达的方法是本领域已知的(参见例如WO 02/09746)。
使内源NMB0964产生增加的奈瑟氏球菌宿主细胞的修饰可包括控制NMB0964表达的内源基因的全部或一部分的部分置换或完全置换，其中与未修饰亲代菌株相比，所述修饰提供例如升高的转录活性。
可通过内源调控区的变异(点突变、缺失和/或插入)、通过天然存在的或修饰的异源启动子或者通过两者的组合，赋予升高的转录活性。一般而言，遗传修饰赋予的转录活性大于未修饰的内源转录活性(例如通过引入强启动子)，使得NMB0964的表达增加。
可用于提高NMB0964转录产量的典型强启动子可包括例如porA、porB、IbpB、tbpB、p110、hpuAB、IgtF、Opa、p110、1st和hpuAB的启动子。PorA、RmpM和PorB作为组成型强启动子是特别有益的。PorB启动子活性存在于相当于porB起始密码子上游的核苷酸1-250的片段。
本领域可获得实现将启动子引入宿主细胞基因组使得启动子与内源NMB0964编码核酸有效连接的方法。例如，将启动子引入编码序列上游区域的双交换同源重组技术，例如在NMB0964编码核酸序列起始ATG密码子上游(5′)约1000bp、约30-970bp、约200-600bp、约300-500bp或约400bp处引入启动子，以提供上调表达。启动子的最佳位置可通过本领域可获得的常用方法确定。
例如，靶基因上游的高活性启动子(例如PorA、PorB或RmpM启动子)。例如，可按照van der Ende等，Infect lmmun 2000；68：6685-90中的描述，使用于表达的PorA启动子最优化。启动子的插入可如下进行：例如，PCR扩增NMB0964靶基因的上游区段，将上游区段克隆至载体，或在PCR扩增期间插入合适的限制位点，或使用天然存在的限制位点插入PorA启动子区段。例如，可以克隆NMB0964基因上游区段约700bp。使用天然存在的位于NMB0964启动子上游适当距离(例如约400bp)的限制性内切酶位点，在该克隆区段内插入PorA启动子区段。可将抗生素(例如红霉素)抗性盒插入PorA启动子上游更远的区段内，可通过同源重组，使用该构建体置换野生型上游NMB0964区段。
另一种方法包括在宿主细胞基因组中具有强转录活性的内源启动子下游引入NMB0964多肽编码序列。例如，RmpM基因的编码区可用NMB0964多肽的编码序列置换。这种方法利用高活性组成型RmpM启动子驱动表达。
可将编码NMB0964多肽的构建体引入奈瑟氏球菌宿主细胞，对奈瑟氏球菌属菌株进行遗传修饰以过量表达NMB0964。引入的用于表达的NMB0964在本文中称为“外源”NMB0964。宿主细胞产生内源NMB0964，与内源NMB0964相比，外源NMB0964可具有相同或不同的氨基酸序列。
用于本发明的NMB0964多肽还包括融合蛋白，其中融合蛋白包含在其N端或C端具有融合配偶体的NMB0964多肽。有益的融合配偶体包括例如谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、His-tag等，以及其它蛋白质的前导肽。
可采用核酸或氨基酸序列的比对和比较方法测定序列同一性，该方法是本领域众所周知的。较长序列的比较可能需要更精密的方法以获得两个序列的最佳比对。用于比对比较窗的序列的最佳比对可通过以下方法进行：局部同源性算法(Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482)、同源性比对算法(Needleman and Wunsch(1970)J Mol.Biol.48：443)、相似性检索方法(Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：2444)、这些算法的计算机执行(Wisconsin遗传学软件包7.0版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)或目测，以及选出通过各种方法产生的最佳比对(即在比较窗内产生序列相似性的最高百分比)。
可通过以下方法进行比较序列的最佳比对：例如局部同源性算法(Smith and Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981))、同源性比对算法(Needleman and Wunsch，J Mol.Biol.48：443(1970))、相似性检索方法(Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988))、这些算法的计算机执行(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BBSTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)或目测(通常参见Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等编著，Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley&Sons，Inc.的合资企业Current Protocols(1995增刊)(Ausubel))。
适于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的实例为BLAST和BLAST 2.0算法，分别可参见Altschul等(1990)J Mol.Biol.215：403-410和Altschuel等(1977)Nucleic Acids Res.25：3389-3402。执行BLAST分析的软件可通过National Center for Biotechnology Information公开获取(http:1/www.ncbi.nlm.nih.govl)。该算法包括首先确定查询序列(query sequence)中的短字码长度(short words of length)W来鉴定高评分序列对(high scoring sequence pair，HSPs)，当与数据库序列中相同长度字码比对时，其符合或满足某一正值的阈值分数T。T称为邻域字码分数阈值(neighborhood word score threshold)(Altschul等，同上)。
这些初始邻域字码采样数(hits)用作开始检索以查找包含它们的较长HSP的种子。字码采样数然后沿各个序列的两个方向延伸直到可以增加累积比对分数为止。核苷酸序列的累积分数采用参数M(匹配残基对的奖励分数；总是＞0)和N(错配残基的处罚分数；总是＜0)计算。对于氨基酸序列，采用评分矩阵计算累积分数。各方向上字码采样数的延伸在以下情况下终止：累积比对分数从其最大得分值下降到量X；累积分数由于一个或多个负得分残基比对的累积而变成零以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。以字长(W)为11、预期值(E)为10、M＝5、N＝-4和两条链的比较的默认值运用BLASTN程序(对于核苷酸序列)。对于氨基酸序列，以字长(W)为3、预期值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵的默认值运用BLASTP程序(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))。
除了计算百分比序列同一性以外，BLAST算法还进行两个序列间相似性的统计分析(参见例如Karlin&Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测量法是最小合计概率(P(N))，它提供两个核苷酸或氨基酸序列之间匹配偶然发生的概率的指标。例如，如果测试核酸与参比核酸比较的最小合计概率小于约0.1、更优选小于约0.01、最优选小于约0.001，则该核酸被视为与参比序列类似。
2个核酸序列或多肽具有序列同一性的另一个指标是如下所述的第一核酸编码的多肽与第二核酸编码的多肽有免疫交叉反应性。
因此，某一多肽通常与第二多肽具有序列同一性，例如，其中两个多肽只因保守取代而不同。两个核酸序列具有序列同一性的另一个指标是两个分子在严格条件下彼此杂交。特定杂交条件的选择按照本领域的标准方法进行(参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。严格杂交条件的一个实例是于50℃或以上并在0.1x SSC(15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠)中杂交。严格杂交条件的另一个实例是在以下溶液中于42℃温育过夜：％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15nlM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5x Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性的已剪切鲑精DNA，接着在0.1x SSC于约65℃洗涤过滤器。
严格杂交条件是至少与上述代表性条件一样严格的杂交条件，其中如果条件的严格程度至少达到上述具体严格条件的严格程度的约80％、通常至少约90％，则所述条件视为至少一样严格。其它严格杂交条件是本领域已知的，并也可用来鉴定本发明这个具体实施方案的核酸。
优选不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。保守氨基酸取代是指具有类似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的一组氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；而含硫侧链的一组氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
容易改变以供遗传修饰的奈瑟氏球菌在宿主细胞中表达外源NMB0964多肽的方法和组合物是本领域已知的。示例性载体和方法参见WO 02/09746和O′Dwyer et al.，Infect Immun 2004；72：6511-80。
将遗传物质转移进入奈瑟氏球菌宿主的方法包括例如缀合、转化、电穿孔、磷酸钙方法等。转移方法应供引入的NMB0964编码核酸稳定表达。NMB0964编码核酸可以可遗传的附加型元件(例如质粒)提供，或者可以通过基因组整合。
合适载体的组成将随即将进行的重组事件的类型而变化。整合载体可以是条件性复制质粒或自杀质粒、噬菌体、转座子或通过限制性水解或PCR扩增获得的线性DNA片段。可通过以下可选择的遗传标记进行重组事件的选择，例如赋予抗生素(例如卡那霉素、红霉素、氯霉素或庆大霉素)抗性的基因、赋予重金属和/或毒性化合物抗性的基因或补充营养缺陷突变型的基因(例如pur、leu、met、aro)。
在一个实施方案中，载体是基于附加型质粒的表达载体，该质粒含有在大肠杆菌(E.coli)和脑膜炎奈瑟氏球菌两者中自主复制的可选择药物抗性标记。这类“穿梭载体”的一个实例是质粒pFP1O(Pagotto等，Gene 2000 244：13-19)。
免疫接种
总的说来，本发明的方法提供用于将一种或多种本发明的抗原组合物给予哺乳动物受治疗者(例如人)而诱导针对一种以上奈瑟氏球菌属细菌菌株的保护性免疫应答，从而防止由这类细菌引起的脑膜炎球菌病。具体地讲，本发明的方法可提供针对脑膜炎奈瑟氏球菌的1、2、3、4种或更多种菌株的免疫保护性免疫应答或NMB0964多肽，其中所述菌株在至少一种血清群、血清型、血清亚型上不同。特别有益的是诱导针对B血清群脑膜炎奈瑟氏球菌的多个菌株的保护性免疫应答，特别是其中所述菌株在血清亚型上不同(例如具有异源PorA)。还特别有益的是就PorA和/或NMB0964而言，诱导针对彼此异源的菌株的保护性免疫应答。
可以在有或没有添加赋形剂的情况下，经口服、鼻、鼻咽、胃肠外、肠、胃、局部、经皮、皮下、肌内，以小片形式、固体形式、粉末形式、液体形式、气雾剂形式、局部或全身给予本发明的抗原组合物。用于制备可胃肠外给予的组合物的现行方法可以是已知的，或者对本领域技术人员而言是显而易见的，更多详情可参见例如Remingtonts Pharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania(1980)等。
口服给药可能需要保护组合物不被消化是公认的。这通常通过将组合物与赋予其抗酸和抗酶促水解抗性的成分缔合或者将组合物包装在合适抗性载体中来实现。避免消化的方法是本领域众所周知的。
将组合物给予有患奈瑟氏球菌性疾病(Neisserial disease)风险的动物以防止或至少部分抑制奈瑟氏球菌性疾病的发生/发展及其并发症。足以实现这种情况的量定义为“治疗有效量”。治疗性应用的有效量将取决于例如抗原组合物、给药方式、患者的体重和一般健康状况以及处方医生的诊断。可以根据患者需要和耐受的剂量和频率以及给药途径给予单剂量或多剂量的抗原组合物。
本文所述抗原组合物(本文亦称免疫原性组合物)可包含囊泡的混合物，所述囊泡可来自相同或不同的菌株。在另一个实施方案中，抗原组合物可包含2、3、4、5种或更多种菌株的囊泡的混合物。
以有效诱导宿主免疫应答、特别是体液免疫应答的量给予抗原组合物。用于混合物免疫接种的量一般为约0.001mg-约1.0mg/70千克患者，更常为约0.001mg-约0.2mg/70千克患者。可采用0.001mg/患者/天到高达约10mg/患者/天的剂量，特别是当将抗原给予隔离部位并且不进入血流时，例如进入某一体腔或进入某一器官内腔时。口服、经鼻或局部给药时，实际上较高的剂量(例如10-100mg或以上)是合理的。首次给予混合物后可继之以相同或不同的混合物强化免疫，优选至少一次强化免疫，更优选两次强化免疫。
通常将抗原组合物给予对于奈瑟氏球菌属、特别是对于脑膜炎奈瑟氏球菌是首次免疫的哺乳动物。在一个具体的实施方案中，哺乳动物是约5岁以下儿童，优选约2岁以下，且按下列任一个或多个时间给予抗原组合物：出生后2周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月或11个月，或者1岁或15个月、18个月或21个月，或者2、3、4或5岁。
总的来讲，优选在脑膜炎球菌病症状最初迹象或者在可能或实际暴露于奈瑟氏球菌属的最初迹象出现之前开始给予任何哺乳动物。
实施例
应当理解的是，本文所述实施例和实施方案仅用于说明目的，本领域技术人员可在其基础上进行各种修改或变动，并且各种修改或变动均包括在本申请的精神和范围以及随附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用其整体结合到本文中用于所有目的。
实施例1
具有TdfI上调的OMV的免疫原性
TdfI是一种基因，一般认为当脑膜炎奈瑟氏球菌进入血液中时其便被表达。因此，菌株在常规培养基中生长时通常不表达TdfI，但是可使例如野生型菌株H44/76在特殊培养条件(补充氯高铁血红素的RPMI培养基)下表达该蛋白质。下面的实验详细描述了H44/76菌株的使用，其中通过重组法使TdfI表达成为诱导型(通过使用IPTG)。这可使TdfI在由所述菌株制备的OMV疫苗表面过量表达，并提供一种容易的培养表达该抗原的菌株的方法，来证实所产生的抗TdfI抗体是否能够杀死在正常培养条件(+IPTG)下表达TdfI的这类修饰菌株。IPTG对TdfI在用于SBA的细胞上表达的影响参见图7。
通过肌内途径，在第0、21和28天用OMV免疫小鼠(10只/组)三次。每次接种都使用AlPO4与MPL配制的OMV 5μg(蛋白质含量)。OMV来源于脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76，经工程改造使得荚膜多糖和PorA下调，且LOS免疫型是galE型。对OMV进行了比较，其中TdfI上调或不上调(在IPTG诱导型启动子控制下上调)。在第42天，使用表达或不表达TdfI(培养基中加入或不加入IPTG后)的同源菌株H44/76(B:15:P1.7，16)，通过血清杀菌测定法采集用于分析的血样。
脑膜炎奈瑟氏球菌菌株在具有10μg/ml氯霉素的GC-琼脂培养皿上于37℃+5％CO2培养过夜。使之在补充或未补充IPTG 1000μM的液体TSB培养基中传代培养3小时。将各血清于56℃灭活30分钟。将血清样品在0.5％HBSS-BSA中稀释，然后在平底微量培养板中两倍稀释(8个稀释液)成25μl的体积。将细菌在0.5％HBSS-BSA中稀释得到8x103CFU/ml，将该稀释液12.5μl加入血清稀释液中。还向每孔中加入兔补体(12.5μl)。振荡下于37℃温育75分钟后，将15μl的混合物涂在预热GC-琼脂板上，于37℃+CO2温育过夜。
统计CFU，并计算杀菌百分比。SBA效价是杀菌50％的稀释度。
SBA效价：对靶细胞表达TdfI的影响
没有IPTG，则TdfI不在靶细胞中表达，所述靶细胞不会被得自用上调的TdfI OMV免疫的小鼠血清杀死。TdfI表达被IPTG特异性诱导时，靶细胞表达TdfI，并被抗TdfI-OMV小鼠血清杀死。
实施例2：在脑膜炎奈瑟氏球菌中具有疫苗潜力的新的锌调节外膜蛋白
摘要
由于人宿主中游离铁的浓度低下，有效获取铁的机制构成致病细菌的重要毒力因子。在革兰氏阴性菌中，TonB依赖性外膜受体参与铁获取。然而，在人宿主中同样稀缺的其它金属的跨细菌外膜转运远未明了。在该研究中，我们表征了一种新的脑膜炎奈瑟氏球菌中的TonB依赖性受体。我们发现，在锌限制情况下，细菌产生这种蛋白质，并且该蛋白质参与锌摄取。此外，由于该蛋白质在分离菌株中十分保守，并且能够诱导杀菌抗体，因此它便成为开发针对脑膜炎奈瑟氏球菌的疫苗的新的候选蛋白，对于脑膜炎奈瑟氏球菌，迄今尚未得到有效的通用疫苗。在呼吸道定居的许多其它病原体中存在该蛋白质的同源物，称为TfdI，表明了受体介导的锌摄取对于在这个小生境中存活是特别重要的。
引言
革兰氏阴性细菌的细胞被膜由两层膜即内膜和外膜组成，其被含有肽聚糖层的周质分隔开。外膜形成隔离环境的有害化合物的屏障。大多数营养物可通过被动扩散经由大量的成通道外膜蛋白(统称孔蛋白)穿过外膜。然而，当营养物的胞外浓度低时，扩散并不是可供选择的方法。例如对于铁就是这种情况。病原体在人宿主内面对低浓度的游离铁，其中铁与铁转运蛋白和铁贮存蛋白(例如乳铁蛋白和运铁蛋白)结合。因此，有效的铁获取机制构成重要的毒力因子，并且已在许多病原体中进行了广泛的研究(1，2)。
在铁限制条件下生长时，革兰氏阴性菌诱导外膜蛋白的合成，所述外膜蛋白起宿主铁结合蛋白的受体、血红素的受体或铁载体的受体的作用，它们是在铁限制下由细菌产生和分泌的小的铁螯合化合物。这类受体的解析晶体结构显示22链β桶，它们不形成开放通道，而是被N端塞子结构域封闭(3)。在配体与受体结合后，随后的摄取是一个主动过程，需要跨内膜的质子梯度能量，其通过3个蛋白质的复合体(TonB复合体)与外膜上的受体偶联(4，5)。
虽然在许多革兰氏阴性细菌中对铁获取机制进行了广泛研究，但还是几乎不了解有关其它必不可少的重金属(例如锌和锰)跨越细菌外膜的转运。这些痕量元素的浓度在人宿主中同样低下，例如人宿主通过产生金属硫蛋白和钙防卫蛋白而响应感染，从而降低入侵病原体对金属的可获取性(6，7)。因此，革兰氏阴性病原体可能具有这些金属的有效获取机制，其机制可能类似于铁获取系统，也可能不同于铁获取系统。
脑膜炎奈瑟氏球菌是一种专性人病原体，可以无症状地定居在鼻咽黏膜上。细菌偶尔进入血流，可引起具有高死亡率的脑膜炎和脓毒症(8)。虽然对于脑膜炎奈瑟氏球菌的大多数致病血清群可获得基于荚膜多糖的疫苗，但却缺乏针对B血清群脑膜炎球菌的疫苗。B血清群菌株的多糖荚膜由于其类似于人糖蛋白而导致免疫原性差(9)。因此，对各亚类荚膜抗原作为替代性疫苗成分进行了研究；然而，这些研究由于主要外膜蛋白的高抗原变异性而归于失败。因此，注意力转移到了次要抗原上，包括TonB依赖性受体。
当在铁限制下生长时，脑膜炎奈瑟氏球菌产生乳铁蛋白(10)、运铁蛋白(11)、血红蛋白(12，13)和肠杆菌素(14)的TonB依赖性受体，这些受体均参与铁摄取。根据同源性检索，Turner等人(15)在3个奈瑟氏球菌属菌株可获得的基因组序列中，鉴定出推定的TonB依赖性家族(Tdf)成员的7个其它基因。有趣的是，在不同微阵列研究中，这类tdf基因中有一些的表达似乎不受铁可利用性的影响(16，17)，这就表明了其产物可能参与铁以外的其它金属的转运。我们在本文中研究了这些受体之一的合成调节、功能和疫苗潜力，并证实该受体参与锌的摄取。
结果
TdfI不是血红素受体
TdfI(在脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A菌株Z2491和B血清群菌株MC58已测序的基因组中的基因座标签分别为NMA1161和NMB0964)之前被鉴定为存在于奈瑟氏球菌基因组中的7个新的推定TonB依赖性受体之一(15)，而且发现在幼稚人血清(
human serum)存在时上调(18)。由于几乎所有迄今研究的TonB依赖性受体都参与铁获取，因此我们假设，TdfI转运铁络合物。这个设想得到以下事实的支持：NMA1161氨基酸序列的blast检索(19)显示与摄取血红素的外膜受体有高的序列相似性，例如粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)的HumA(20)，达41％同一性和58％相似性。
为了评价TdfI的功能，我们构建了无荚膜衍生的B血清群菌株H44/76的tdfI缺失突变株，称为HB-1。通过点渍法分析评价，我们发现血红素与HB-1和tdfI突变株的类似结合，而且tdfI突变株在血红素作为唯一铁源的板上仍可生长。我们也未发现被表达TdfI的大肠杆菌细胞结合的血红素增加。我们也无法补充大肠杆菌血红素营养缺陷型(数据未显示)。因此，我们假设，TdfI虽然与血红素受体同源，但是不起血红素受体的作用。
锌调节tdfI
由于TdfI不是血红素受体，且未发现受铁调节，因此我们寻找其中我们能够检测在荚膜缺陷型H44/76脑膜炎奈瑟氏球菌HB-1中表达的tdfI的条件。当使细菌在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，一种复杂的富含养分的培养基)中生长时，我们在蛋白质印迹中从未检测到TdfI(图1A，泳道1)。然而，当使细菌在化学成分确定的RPMI培养基生长中时，在细菌裂解物中可检测出TdfI(图1A，泳道2)。通过其不存在于生长在RPMI中的tdfI敲除菌株中而证实了检出信号的特异性(图1A，泳道3)。我们注意到，即使在RPMI中加入少量TSB也会负面影响TdfI合成(图1B)；显然，TSB含有抑制tdfI转录的化合物。由于我们注意到RPMI不含痕量金属源，因此我们决定测试加入含有钴、钼、锰、铜和锌的痕量金属混合物是否可抑制tdfI表达，事实上的确如此。然后我们单独测试了所有的这些金属，发现尤其是锌，即使在低于μM的浓度下，也会抑制tdfI表达(图1C)。由于标准RPMI没有补充具体的锌源，据推测细菌生长需要的可用锌来自水和/或用于配制培养基的盐中的痕量锌。我们通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定了RPMI培养基的锌浓度，发现约为十亿分之110(约1.69μM)。当我们用具体的锌螯合剂N，N，N′，N′-四-(2-吡啶基甲基)-乙二胺(TPEN)补充RPMI培养基时，tdfI的锌调节变得甚至更明显。向培养基中加入TPEN导致TdfI合成呈剂量依赖性地增加(图1D)。然而，1μM TPEN以上浓度完全抑制细胞生长，据推测是由培养基中总的锌消耗所致。加入锌后，可恢复生长(数据未显示)。使用从生长在补充或未补充500nM锌或0.5μM TPEN的RPMI中的培养物获得的总RNA，通过实时定量PCR(RT-qPCR)证实了tdfI的锌调节。数据显示锌存在时的阻抑为13.8倍，而TPEN存在时上调3.8倍。添加TPEN和锌之间的倍数差异为52.6倍。
tdfI表达中转录调节子Zur的作用
研究表明在大肠杆菌中，锌摄取调节子(zinc uptake regulator，Zur)调节znuACB基因，该基因编码周质结合蛋白、ATP酶和将锌从周质转运到胞质所需要的必要内膜成分(23)。在锌存在时，Zur结合znuACB操纵子启动子中的Zur结合元件(共有序列GAAATGTTATANTATAACATTTC)，从而阻断转录。
在脑膜炎奈瑟氏球菌菌株MC58的基因组序列中，我们鉴定出大肠杆菌zur基因的同源物(即NMB1266)和znuCBA的同源物(即NMB0588、NMB0587和NMB0586)。另外，我们在奈瑟氏球菌tdfI的上游区域(GtAATGTTATATaATAACAaact)和znuC(cAAAcGTTATACagTAtCATaTC)中发现了类似于大肠杆菌Zur的序列结合共有序列(与大肠杆菌共有序列相同的核苷酸为大写字母)。为了证实Zur参与调节tdfI表达，我们制备了菌株HB-1的Zur突变株，其实际上组成型地产生TdfI(图2)。同样，RT-qPCR表明，Zur参与znuA和tdfI的表达，因为与其在锌存在下生长的亲本菌株两者相比，zur突变株的znuA和tdfI表达水平分别提高5倍和34倍。
TdfI促进锌获取
由于tdfI的表达受锌可获得性的调节，因此很可能TdfI作为锌受体或含锌络合物起作用。我们应用PROFtmb程序(www.rostlab.org)，首次分析了氨基酸序列并构建了TdfI的拓扑模型(图3)。
TdfI在推定的胞外环L3中含有2个半胱氨酸残基。如果这些半胱氨酸形成二硫键(得到我们通过对细菌膜流分进行的有和没有DTT的SDS-PAGE分析的支持，其中样品与还原剂温育导致电泳迁移率改变，据推测是由于二硫键遭破坏所致)，则它们使两个氨基酸残基序列段紧密相邻，两个序列段均富含组氨酸和天冬氨酸残基(图3)，这可能具有功能重要性，因为同样在大肠杆菌的周质ZnuA蛋白中，His和Asp残基的序列段参与结合锌(25)。因此，我们认为有可能TdfI结合游离锌并将其转运到周质中。为了验证这个假设，我们先测定了TdfI是否可以结合锌。我们比较了有TdfI和没有TdfI的外膜囊泡与4-(2-吡啶基偶氮基)间苯二酚(PAR)竞争锌的能力。与没有TdfI的囊泡相比，含有TdfI的外膜囊泡显示锌结合增加约40％(图4A)。为了验证锌的转运，我们采用ICP-MS，比较了tdfI敲除菌株、tonB敲除菌株及其亲本菌株胞内锌的蓄积。与tdfI突变株或tonB突变株相比，HB-1蓄积了约33％以上的锌，这就表明了TdfI转运游离锌，而且这种转运需要TonB系统(图4B)。
如果TdfI的确参与游离锌的摄取，则可以预期与野生型菌株相比，在tdfI突变株中，在较高外部锌浓度下发生znu基因表达的脱阻抑。为了验证该设想，我们使tdfI突变株和亲本菌株在具有额外的500nM锌的RPMI培养基中生长，这大大抑制(但不完全抑制)野生型菌株的tdfI表达(图1C)。我们接着通过RT-qPCR测定了tdfI和znuA mRNA的相对水平。tdfI突变株仍含有被用来检测基因表达的tdfI基因的头437个核苷酸。在tdfI突变株中，表达更多的tdfI达18.6倍和更多的znuA达7.4倍，这就表明在所应用的生长条件下，tdfI突变株中的胞内锌浓度的确低于亲本菌株的胞内锌浓度。同样，在锌存在时，znuA敲除菌株表达高水平的TdfI，这就证实了细胞中需要ZnuA以维持足够的锌水平(图4C)。因此，TdfI和ZnuA两者均参与锌的转运。
TdfI的保守性
除TdfI的功能以外，我们还希望研究TdfI是否是通用脑膜炎奈瑟氏球菌疫苗的候选疫苗。标准之一是抗原必须是保守的。我们先观察了可获得的脑膜炎奈瑟氏球菌基因组，发现TdfI与成熟蛋白质具有显著的97-99％氨基酸同一性(图S1)。序列差异分散在整个蛋白质中，并不集中在预测的胞外环区域，该区域在奈瑟氏球菌属外膜蛋白中通常是抗原可变区(图S1)。我们接着分析了不同血清群和不同克隆谱系的一组32个不同脑膜炎奈瑟氏球菌分离菌株中TdfI的存在。每个菌株都生长在补充或未补充500nM锌的RPMI培养基中，并通过蛋白质印迹法用针对H44/76的TdfI形成的抗血清进行了分析。所有菌株表明在锌存在时TdfI受抑制(图5)。
然后，我们希望了解TdfI与其它致病细菌的同源性。我们先用淋病奈瑟氏球菌进行了TdfI比较，发现在这两个奈瑟氏球菌属菌株之间有96％同一性和97％相似性。接下来，我们应用NCBI的blast程序，用氨基酸水平上40％同一性的截止值检索其它致病细菌中TdfI的同源物。我们鉴定出包括以下的其它致病细菌的同源物在氨基酸水平上平均有41％同一性和59％相似性，且所有TdfI同源物都具有His/Asp区域(图S2)：粘膜炎莫拉氏菌(M.catarrhalis)、副猪嗜血菌(Haemophilus parasui)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、百日咳鲍特氏菌(Bordetella pertussis)和胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)。有趣的是，在百日咳鲍特氏菌中，tdfI同源物位于znuABC和zur基因的同源物附近，再次表明这些基因间的功能关系。此外，所有这些TdfI同源物都含有富含His和Asp的序列段(图S2)。
TdfI诱导杀菌抗体
为了研究TdfI的疫苗潜力，我们用含有过量表达水平的该蛋白质的奈瑟氏球菌外膜囊泡给小鼠免疫(图6A)，验证了所得血清存在的杀菌抗体。按常规，我们对生长在TSB培养基中的细菌进行血清杀菌测定法；然而，在这些条件下，tdfI不表达。因此，我们在由异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导型启动子表达TdfI的菌株上测定了血清的细菌活性，并比较了在有和没有IPTG时生长的培养物。IPTG不存在时，血清的杀菌效价＜1∶100，而在细菌生长期间存在IPTG时为1∶1042。免疫前血清的效价也＜1∶100。这些数据清楚表明，TdfI能够诱导杀菌抗体。我们还希望研究正常染色体编码的tdfI表达水平是否足以介导补体介导的杀菌作用。为此，我们采用了在TSB培养基中组成型产生TdfI和与野生型菌株相应地生长在所述培养基的zur敲除菌株。
讨论
以前已在淋病奈瑟氏球菌中鉴定出锌的高亲和力ZnuABC摄取系统(30)。如上所述，同源物可能存在于脑膜炎球菌基因组和许多其它细菌的基因组中。在肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)中，该ABC转运蛋白与毒力有关(31)。在任何情况下，都未鉴定出参与锌获取的外膜受体，而是认为锌通过孔蛋白扩散。
然而，在人宿主中，游离锌水平很可能太低以致于不能通过被动扩散来维持细菌生长。人血清中锌的总量约为19μM，但是绝大部被白蛋白等血清蛋白结合(32)。我们在本文中鉴定出由锌调节的外膜受体TdfI。将700nM锌加入生长培养基中完全抑制TdfI表达。TdfI的功能是结合并转运未结合的(游离)锌。我们预测，锌最初被外部环上的His/Asp序列段结合，然后通过塞子结构域顶部的两个组氨酸内化(图3b)。TonB系统在锌摄取中的可能作用是将所述塞子从桶上拉开，伴随着该运动，结合在两个His残基上的锌被转运到周质，在周质中被周质结合蛋白ZnuA接受。
有趣的是，在使用淋病奈瑟氏球菌的微阵列研究中报导了tdfI和znuA表达的类似调节(33)。tdfI同源物NGO 1205和znuA同源物NGO0168在缺乏NGO0542基因的突变株中上调。在该研究中，所述基因由于与存在于革兰氏阳性生物中的锰依赖性过氧化物反应性调节子同源而被定义为perR(34)。然而，这与我们定义为zur的为同一基因。Zur的定义显然更准确，因为我们证实zur不存在或锌不存在有相同的调节作用。定义为zur而不是perR的更多证据来自淋病奈瑟氏球菌的相同研究。用淋球菌perR突变株进行的微阵列显示，核糖体蛋白L31和L36同样上调。奈瑟氏球菌基因组含有2拷贝编码这些蛋白质的各基因，其中各蛋白质的一种形式含有锌带状基序。发现锌可得性是控制在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中表达的L31/L36蛋白类型的关键因素(34)。在淋球菌perR突变体中，诱导特异性表达缺乏锌带状结构的L31和L36共生同源物(paralog)，高度表明在perR突变体中锌调节紊乱。而且在另一项研究(17)中，进行了微阵列以鉴定对氧化应激的反应，而且perR和在PerR研究(33)中鉴定的任何基因都未去阻抑，并且我们也未发现锰对tdfI和znuA表达有任何调节作用。
以前报道了在活性补体存在下诱导tdfI表达(18)。在该微阵列研究中，对在血清和热灭活血清存在下生长的脑膜炎奈瑟氏球菌的表达谱进行了比较，发现在未处理血清存在下TdfI去阻抑达23倍。初看之下锌与补体调节之间的关系可能并不明显。发现类似调节回路的一种可能的解释可能是阵列研究中细菌预先生长在具有BSA的RMPI中。已知白蛋白螯合锌，因此，之前的生长条件可能是严格锌限制的。人血清的热处理将从白蛋白中释放出锌，从而抑制tdfI表达。细菌生长期间将BSA加入TSB培养基中诱导TdfI表达的事实支持这种解释(数据未显示)。
Hagen和Cornelissen(35)的一项研究对所有Tdf蛋白对淋病奈瑟氏球菌在人上皮细胞中的胞内存活是否是必需的进行了研究。作者还测试了TdfI同源物敲除(NG1205)，但该突变株在胞内的存活不受影响。
TdfI的保守性是显著的；在测序的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株中具有98.6％同一性，而在成熟蛋白的氨基酸水平上具有99.2％相似性。在所测试的所有脑膜炎球菌中都存在TdfI蛋白，并且所有菌株都显示锌调节的tdfI表达。测序的脑膜炎球菌菌株和淋球菌菌株的TdfI蛋白间，氨基酸水平上有96.1％同一性和97.3％相似性。TdfI序列的差异分散在整个蛋白质中，并不集中在特定的环上。我们发现与其它细菌同源物的TdfI平均有41％氨基酸同一性，并且在所有情况下，His/Asp序列段都是保守的。吸引人的是，TdfI同源物特别存在于定居在人和动物呼吸道的细菌中。可能是在呼吸道的黏膜层中，未结合的锌浓度太低以致不足以被动扩散穿过孔蛋白，因而TdfI成为细菌生长和存活的必需成分。虽然对于胞内存活TdfI不是必不可少的(35)，但是它在体液如血清和其中游离锌浓度可能也非常低的液体中则可能是必不可少的。同样，我们不能排除这样的可能性：即TdfI另外识别在呼吸道、血清和/或脑液可得到的络合形式的锌。
我们进一步证实了TdfI可在小鼠中诱导杀菌抗体，而且这些抗体特异性针对TdfI。同样，当我们使用表达染色体基因座的TdfI的细菌时，我们可检测出杀菌活性，这就表明在感染期间，抗原浓度高到足以清除脑膜炎奈瑟氏球菌。
高水平的保守性和产生TdfI特异性杀菌抗体的可能性使TdfI成为良好的候选疫苗。
材料与方法
所使用的缩略词：IPTG，异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷；PAR，4-(2-吡啶基偶氮基)间苯二酚；RPMI，Roswell Park Memorial Institute培养基1640；Tdf，TonB依赖性家族；TPEN，N，N，N′，N′-四(2-吡啶基甲基)乙二胺；TSB，胰蛋白酶大豆肉汤；ICP-MS，电感耦合等离子体质谱法。
菌株与生长条件
图5所列奈瑟氏球菌属菌株来自实验室保藏物。除非另有说明，否则用菌株HB-1及其突变体进行实验。HB-1是B血清群菌株H44/76的无荚膜衍生株(Bos&Tommassen，2005)。在烛罐中，使脑膜炎奈瑟氏球菌在含有Vitox(Oxoid)和抗生素(适当时)(卡那霉素，100μg/ml；氯霉素，10μg/ml)的GC琼脂(Oxoid)板中于37℃生长。振荡的同时，使液体培养物在塑料培养瓶中的TSB(Difco)或RPMI(Sigma)中于37℃生长。按标出s的浓度加入IPTG、锌和TPEN。以混合物(340nMZnSO4、160nM Na2MoO4、800nM MnCl2、80nM CoCl2和80nM CuSO4终浓度)加入金属，或者以单独的化合物按与混合物中的相同浓度加入，除非另有规定。以8μM终浓度加入氯化铁。大肠杆菌菌株DH5α和TOP10F’(Invitrogen)用于常规克隆，BL21(DE3)(Invitrogen)用于表达。使用大肠杆菌hemA突变株评价TdfI的血红素转运(22)。使大肠杆菌在适当时补充了100μg/ml氨苄西林、50μg/ml卡那霉素或25μg/ml氯霉素的Luria-Bertani培养基中繁殖。对于大肠杆菌血红素营养缺陷型C600 hemAr::kan(22)为补充了5-氨基乙酰丙酸的培养基。
质粒和突变体的构建
使用NMB0964(tdfI)、NMB 1730(tonB)、NMN0586(znuA)、NMB1266(zur)，根据MC58基因组序列，设计了所有引物。
为了在大肠杆菌中高水平产生蛋白质，使用分别携带限制位点NdeI和BamHI(粗体)的引物0964-F-GAT
CATGAAACTGAGCAATCGGTG-和0964-R-GA
CTTAAATCTTCACGTTCACGCCGCC-，通过PCR，由菌株H44/76的染色体DNA扩增无信号序列编码部分的tdfI基因。按照生产商(Invitrogen)的建议，将所得产物克隆至pCRII-TOPO，得到pCRII-tdfI，并利用NdeI/BamHI限制酶切位点亚克隆至pET11a(Novagen)，得到质粒pET11a-tdfI。
为了获得tdfI缺失构建体，用引物Kan-R-TGCTCGACGCTGAGGTCTGC-和Kan-F-TG
GTCGACTTCAGACGGCCACG-通过PCR扩增卡那霉素抗性基因表达盒(36)，并在MluI和BsrGI消化后，克隆至用相同酶消化的pCRII-tdfI中。在所得构建体pCKII-tdfI::kan中，卡那霉素抗性表达盒取代tdfI的bp 437和1344之间的区域。pCRII-tdfI::kan用于用0964-R和0964-F引物的PCR，所得产物用于转化HB-1(37)。通过PCR测定卡那霉素抗性菌落的正确基因置换。
H44/76的完整tdfI基因分别用含有NdeI和AatII识别位点(粗体)的引物TdfI-F-GCAT
GCACAAACTACACTCAAACCC-和TdfI-R-AT
TTAAAACTTCACGTTCACGCCGCC-扩增。利用NdeI和AatII限制位点，将所得PCR产物克隆至pCRII-TOPO，并亚克隆至pEN11-pldA(36)。所得质粒pEN11-tdfI构成奈瑟氏球菌复制质粒，含有lacIQ基因和用于tdfI受控表达的串联lac/tac启动子。
对于一个片段使用引物tonB-1
(GTACGATGATTGTGCCGACC)、具有AccI限制位点(粗体)的tonB-2(ACTTTAAACTCCCGCAACTGCGGGGGTTAA)，对于另一片段为具有限制位点AccI(粗体)的tonB-3
(TTAACCCCCGCA
CTTGC
CGGAGTTTAAAGT)和tonB-4(GCCATACTGTTGCGGATTTGA)，通过扩增tonB基因上游和下游的DNA片段，制备产生tonB敲除的构建体。将两个片段分别克隆至pCRII-TOPO，然后利用引入的限制位点AccI和pCRII-TOPO载体的SpeI位点将彼此连接。随后用含有AccI位点的引物通过PCR扩增，利用AccI位点克隆之前克隆至CRII-TOPO的pKD3(38)的氯霉素转乙酰酶基因。使用引物tonB-1和tonB-4，使所得构建通过PCR扩增，且该线性片段用于转化脑膜炎奈瑟氏球菌HB-1。
按照相同策略敲除zur基因。在此情况下，上游和下游片段用以下引物扩增：zur-1(TTCGCCGATGGCGGAATACA)、具有限制位点AccI(粗体)的zur-2(CTTTCAGCGCAAA
TCC
GCGTGCCTGTTC)、具有限制位点AccI(粗体)的zur-3(GAACAGGCACGCGGA
TTTGCGCTGAAAG)和zur-4(TCCTATTGCGCAATACCCCC)。
脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76的porA衍生株(称为CE2001)(39)用pMF121转化，导致缺失完整荚膜基因座并产生截短外核(truncated outer core)的脂多糖(36)。之前已描述了含有脑膜炎奈瑟氏球菌tonB、exbB和exbD基因的pLAFR衍生质粒(13)。SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
细胞裂解物由生长6小时的细菌制备。将细胞稀释成OD600nm1，沉淀，并在100μl含有2％SDS和5％2-巯基乙醇的SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸。通过标准SDS-PAGE分离蛋白质。凝胶用考马斯亮蓝染色，或者使用25mM Tris-HCl、192mM甘氨酸、20％甲醇中的湿转印系统(Biorad)，将蛋白质转印至硝化纤维膜(Protran)上。膜用含有0.1％吐温20和0.5％Protifar(Nutricia)的PBS封闭1小时。将印迹在封闭缓冲液中与抗体一起温育。采用山羊抗兔IgG过氧化物酶缀合的第二抗体(Biosource)和化学发光增强检测法(Pierce)，检测抗体结合。
免疫接种
使含有pET11a-tdfI的BL21(DE3)细胞在LB中生长至OD A600为0.6，之后加入1mM IPTG，并继续生长2小时。TdfI蛋白在包含体中蓄积，包含体按所述方法分离(40)，使用纯的蛋白质于Eurogentec给兔免疫接种。按1/5000稀释度使用所得抗血清SN1042。
在1mM IPTG存在或不存在时生长的菌株CE 1523/pEN11-tdfI的外膜囊泡通过脱氧胆酸盐提取制备(41)，并按所述方法用于给小鼠免疫接种(32)。42天后收集10只小鼠/组的血清并合并。实验遵照比利时国家相关准则和Glaxo SmithKline Biologicals的机构政策。
RT-qPCR
按照生产商的建议，采用Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System和SYBR绿色主体混合物(SYBR green master mix)(Applied Biosystems)进行RT-qPCR。将约4x109个奈瑟氏球菌细胞重新悬浮于3ml Trizol(Invitrogen)中来分离总RNA。加入600μl氯仿后离心，上相1∶1与75％乙醇混合。将其加载到nucleospin RNA II柱(Macherey-Nagel)上，随后用nucleospin RNA II试剂盒的缓冲液R3洗涤，用100μl水洗脱。RNA然后用Turbo DNA Free(Ambion)处理，得到无DNA的RNA。为了制备cDNA，按照生产商的建议，采用转录子高保真cDNA合成试剂盒(Roche)，从随机六聚体反转录1μg总RNA。作为对照，制备平行样品，其中从反应混合物省略反转录酶。用以下循环参数，在96孔板(Applied Biosystems)中以25μl体积一式三份进行PCR：95℃10分钟用于酶激活，接着95℃15秒钟40次循环和60℃1分钟。绘制解链曲线以确保信号来自特定扩增子。采用比较循环阈值方法(Applied Biosystems)进行数据分析以确定相对表达水平。使用rmpM转录物使所有数据归一化。
ICP-MS
在乌得勒支大学(Utrecht University)地球化学系综合实验室，用ICP-MS测定了总锌浓度。使脑膜炎奈瑟氏球菌菌株从0.1起始OD A550起在RPMI培养基中生长6小时；在此时间点上，取出样品，在1μM锌存在下，使剩余的培养物再生长1小时。1小时后，取出第二样品。将两种样品(7ml)在磷酸缓冲盐溶液中洗涤后，再悬浮于水中，于56℃杀灭1小时，并于-80℃冷冻。然后使样品融化，超声处理后，经0.22-μm过滤器(Millipore)过滤。
PAR竞争测定法
PAR竞争测定法是一种比色反应，其中在蛋白质或能够从PAR中释放锌的化学试剂存在下，PAR-锌复合物的橙色变成黄色。按照所述方法(42)经下面的改动进行该测定：我们加入30μM锌而不是50μM锌，而且我们先测定了PAR-锌溶液，然后将外膜囊泡加入杯中后再次测定了溶液。这样，我们避免了最终由UV引起的可能的颜色改变。然后将数据先归一化至PAR-锌测量值，然后归一化至只有PAR样品，得到外膜囊泡的结合值。所示结果是500nm吸收的归一化数据。
血清杀菌测定法
野生型H44/76用pEN11-tdfI转化，从隔夜生长的板中接种到振动烧瓶中，在有或没有1mM IPTG并有125μM FeCl3的TSB中于37℃达3小时，直到OD A550达到0.5。将待测血清1∶100稀释于Hank平衡盐溶液(HBSS)(GIBCO)、0.3％BSA中，然后在灭菌U型底96孔微量滴定板(NUNC)中以50μl体积连续稀释(2倍稀释步骤，8次稀释)。将细菌在HBSS、0.3％BSA中稀释，得到约13,000CFU/ml，将37.5μl悬液样品加入血清稀释液中。振荡的同时，将微量滴定板于37℃温育15分钟。随后，将12.5μl幼兔补体(Pelfreez)或作为血清毒力的对照的热灭活(56℃达45分钟)补体加入孔中。振荡的同时于37℃温育1小时后，将微量滴定板置于冰上终止杀菌。每孔中，将20μl点样到GC板，同时使板倾斜使液滴顺板“流”下。在隔夜温育后，统计菌落，计算杀菌百分比。杀菌效价定义为产生＞50％杀菌的最高血清稀释度。
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表1.测序的奈瑟氏球菌属菌株中成熟TdfI蛋白序列的保守性。
Claims (57)
1.一种包含由奈瑟氏球菌属(Neisseria)细菌制备的分离的外膜囊泡和药学上可接受的赋形剂的免疫原性组合物，其中当给予患者时，所述奈瑟氏球菌属细菌产生足够水平的NMB0964多肽以提供诱导抗NMB0964抗体的囊泡的产生。
2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述NMB0964多肽是奈瑟氏球菌属细菌内源性的。
3.权利要求1或2的免疫原性组合物，其中所述奈瑟氏球菌属细菌经遗传修饰而含有编码外源NMB0964多肽的核酸。
4.权利要求1-3的免疫原性组合物，其中所述NMB0964多肽由具有内源启动子的NMB0964基因表达。
5.权利要求1-4的免疫原性组合物，其中所述奈瑟氏球菌属细菌的NMB0964多肽产生被遗传修饰。
6.权利要求5的免疫原性组合物，其中所述奈瑟氏球菌属细菌通过破坏Zur阻抑蛋白(NMB1266)的功能性表达而被遗传修饰。
7.权利要求5或6的免疫原性组合物，其中所述奈瑟氏球菌属细菌经遗传修饰以提供由异源启动子表达NMB0964多肽。
8.权利要求7的免疫原性组合物，其中所述异源启动子不结合Zur阻抑蛋白。
9.权利要求7或8的免疫原性组合物，其中所述异源启动子是在所述奈瑟氏球菌属细菌中比NMB0964基因的非阻抑内源启动子更强的启动子。
10.权利要求7-9的免疫原性组合物，其中所述异源启动子是IPTG诱导型lac启动子。
11.权利要求1-10的免疫原性组合物，其中所述奈瑟氏球菌属细菌产生的NMB0964多肽的水平高于生长在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中的脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)菌株H44/76产生的水平。
12.权利要求1-10的免疫原性组合物，其中所述奈瑟氏球菌属细菌产生的NMB0964多肽的水平等于或大于生长在Roswell Park Memorial Institute培养基1640(RPMI)中的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76产生的水平。
13.权利要求1-10的免疫原性组合物，其中所述奈瑟氏球菌属细菌产生的NMB0964多肽的水平等于或大于生长在加有1μM TPEN(N，N，N′，N′-四(2-吡啶基甲基)乙二胺)的Roswell Park Memorial Institute培养基1640(RPMI)中的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76产生的水平。
14.权利要求1-10的免疫原性组合物，其中所述奈瑟氏球菌属细菌产生的NMB0964多肽的水平等于或大于生长在游离Zn2+小于5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05或0.01μM的培养基中的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76产生的水平。
15.权利要求1-14的免疫原性组合物，其中所述奈瑟氏球菌属细菌是脑膜炎奈瑟氏球菌或脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群。
16.权利要求1-15的免疫原性组合物，其中所述奈瑟氏球菌属细菌缺乏荚膜多糖。
17.权利要求16的免疫原性组合物，其中所述奈瑟氏球菌属细菌通过破坏siaD基因的功能性表达而缺乏荚膜多糖。
18.权利要求1-17的免疫原性组合物，其中所述奈瑟氏球菌属细菌的msbB和/或htrB基因的功能性表达受到破坏。
19.权利要求1-18的免疫原性组合物，其中所述奈瑟氏球菌属细菌的一个或多个下列基因的表达受到破坏：PorA、PorB、OpA、OpC、PiIC或FrpB。
20.权利要求1-19的免疫原性组合物，其中所述奈瑟氏球菌属细菌的IgtB基因的功能性表达受到破坏。
21.权利要求1-20的免疫原性组合物，其中所述奈瑟氏球菌属细菌是免疫型L2或L3。
22.权利要求1-21的免疫原性组合物，其中所述外膜囊泡通过用0-0.5％、0.02-0.4％、0.04-0.3％、0.06-0.2％或0.08-0.15％洗涤剂提取而分离，所述洗涤剂例如脱氧胆酸盐，例如大约或正好0.1％脱氧胆酸盐。
23.一种产生免疫原性组合物的方法，所述方法包括：培养产生NMB0964多肽的奈瑟氏球菌属细菌，其中当给予患者时，所述NMB0964多肽产生的水平足以提供诱导抗NMB0964抗体的外膜囊泡的产生；由所培养的细菌制备外膜囊泡；并将所述外膜囊泡与药学上可接受的赋形剂混合以产生适用于给予患者的免疫原性组合物。
24.权利要求23的方法，其中所述NMB0964多肽是奈瑟氏球菌属细菌内源性的。
25.权利要求23或24的方法，其中所述奈瑟氏球菌属细菌经遗传修饰而含有编码外源NMB0964多肽的核酸。
26.权利要求23-25的方法，其中所述NMB0964多肽由具有内源启动子的NMB0964基因表达。
27.权利要求23-26的方法，其中所述奈瑟氏球菌属细菌的NMB0964多肽产生已被遗传修饰。
28.权利要求27的方法，其中所述奈瑟氏球菌属细菌通过破坏Zur阻抑蛋白(NMB1266)的功能性表达而被遗传修饰。
29.权利要求27或28的方法，其中所述奈瑟氏球菌属细菌经遗传修饰以提供由异源启动子表达NMB0964多肽。
30.权利要求29的方法，其中所述异源启动子不结合Zur阻抑蛋白。
31.权利要求29或30的方法，其中所述异源启动子在所述奈瑟氏球菌属细菌中是比NMB0964基因的非阻抑型内源启动子更强的启动子。
32.权利要求29-31的方法，其中所述异源启动子是IPTG诱导型lac启动子。
33.权利要求23-32的方法，其中所述奈瑟氏球菌属细菌产生的NMB0964多肽的水平大于生长在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76产生的水平。
34.权利要求23-32的方法，其中所述奈瑟氏球菌属细菌产生的NMB0964多肽的水平等于或大于生长在Roswell Park Memorial Institute培养基1640(RPMI)中的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76产生的水平。
35.权利要求23-32的方法，其中所述奈瑟氏球菌属细菌产生的NMB0964多肽的水平等于或大于生长在加有1μM TPEN(N，N，N′，N′-四(2-吡啶基甲基)乙二胺)的Roswell Park Memorial Institute培养基1640(RPMI)中的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76产生的水平。
36.权利要求23-32的方法，其中所述奈瑟氏球菌属细菌产生的NMB0964多肽的水平等于或大于生长在其中游离Zn2+小于5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05或0.01μM的培养基中的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76产生的水平。
37.权利要求23-32的方法，其中所述奈瑟氏球菌属细菌的培养是在其中游离Zn2+小于5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05或0.01μM的培养基中进行。
38.权利要求23-32的方法，其中所述奈瑟氏球菌属细菌的培养是在包含Zn2+螯合剂的培养基中进行。
39.权利要求38的方法，其中所述Zn2+螯合剂以0.01-100、0.1-10、0.3-5或0.5-1μM的浓度存在于培养基中。
40.权利要求38或39的方法，其中所述存在于培养基中的Zn2+螯合剂是TPEN。
41.权利要求23-40的方法，其中所述奈瑟氏球菌属细菌是脑膜炎奈瑟氏球菌或脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群。
42.权利要求23-41的方法，其中所述奈瑟氏球菌属细菌缺乏荚膜多糖。
43.权利要求23-42的方法，其中所述奈瑟氏球菌属细菌通过破坏siaD基因的功能性表达而缺乏荚膜多糖。
44.权利要求23-43的方法，其中所述奈瑟氏球菌属细菌的msbB和/或htrB基因的功能性表达受到破坏。
45.权利要求23-44的方法，其中所述奈瑟氏球菌属细菌的一个或多个下列基因的表达受到破坏：PorA、PorB、OpA、OpC、PiIC或FrpB。
46.权利要求23-45的方法，其中所述奈瑟氏球菌属细菌的IgtB基因的功能性表达受到破坏。
47.权利要求23-46的方法，其中所述奈瑟氏球菌属细菌是免疫型L2或L3。
48.权利要求23-47的方法，其中所述制备外膜囊泡的步骤通过用0-0.5％、0.02-0.4％、0.04-0.3％、0.06-0.2％或0.08-0.15％洗涤剂提取来进行，所述洗涤剂例如脱氧胆酸盐，例如大约或正好0.1％脱氧胆酸盐。
49.权利要求23-47的方法，其中所述制备外膜囊泡的步骤无需使用洗涤剂来进行。
50.一种诱导针对奈瑟氏球菌属的免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤：给予哺乳动物免疫有效量的权利要求1-22的免疫原性组合物，或者通过实施权利要求23-49的方法并给予哺乳动物免疫有效量的所制得的免疫原性组合物。
51.权利要求1-22的免疫原性组合物在制备预防奈瑟氏球菌性疾病的疫苗中的用途。
52.一种预防奈瑟氏球菌性疾病例如脑膜炎奈瑟氏球菌或脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群的疫苗，其包含权利要求1-22的免疫原性组合物或通过权利要求23-49的方法制备的免疫原性组合物。
53.一种包含多肽和药学上可接受的载体的免疫原性组合物，所述多肽包含与以下序列具有大于50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％序列同一性的肽序列：RDQYGLPAHSHEYDDCHADIIWQKSLINKRYLQLYPHLLTEEDIDYDNPGLSCGFHDDDNAHAHTHS，或所述多肽包含所述序列的7、10、12、15或20个(或更多个)连续氨基酸的免疫原性片段，任选其中所述肽序列或所述免疫原性片段能够诱导-如有必要与蛋白质载体偶联时-可识别WO00/55327的SEQ ID NO：2的免疫应答。
54.权利要求53的免疫原性组合物，其中两个Cys残基存在于多肽中。
55.权利要求54的免疫原性组合物，其中两个Cys残基是二硫键连接的。
56.权利要求53-55的免疫原性组合物，其中所述多肽不是全长成熟NMB0964多肽，或者不是具有完整信号序列的全长NMB0964多肽。
57.权利要求53-56的免疫原性组合物，其包含Zn2+盐。
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