CN102206647A - 多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法 - Google Patents
多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102206647A CN102206647A CN 201110113360 CN201110113360A CN102206647A CN 102206647 A CN102206647 A CN 102206647A CN 201110113360 CN201110113360 CN 201110113360 CN 201110113360 A CN201110113360 A CN 201110113360A CN 102206647 A CN102206647 A CN 102206647A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hoxc10
- gecko
- sequence
- immunity
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法，包括多疣壁虎Hoxc10的EST序列的获得，RACE法获得Hoxc10全长序列，采用DNASTAR软件和SWISS-PLOT在线预测多疣壁虎Hoxc10蛋白的抗原表位，选取优势表位肽段构建Hoxc10的原核表达载体，体外诱导融合蛋白表达，融合蛋白的纯化及多克隆抗体的制备等步骤。本发明以pGEX-4T1为基础所构建的体外Hoxc10表达系统在BL21中能高效地表达目的蛋白，进一步进行纯化，可方便地获得大量的GST-Hoxc10融合蛋白，经此蛋白免疫新西兰大白兔所制备的兔源抗多疣壁虎Hoxc10抗血清滴度高、特异性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法。
背景技术
同源异型框基因(homeobox gene，Hox)，编码一个高度保守的转录因子家系，这些转录因子在胚胎发育的形态发生中起关键作用，能够维持正常的体节形成, 菱脑原节形成和发育，以及后脑和各个器官、组织及四肢的正常的分化和发育。Hoxc10是Hox基因家族中一位重要的成员。已有研究表明，Hoxc10不仅影响脊椎动物的胚胎发育，尤其是神经系统发育，同时也影响脊椎动物的断肢及尾部的再生过程。市场上多是针对小鼠、人及大鼠Hoxc10的抗体，这些抗体与羊、兔、猴等有一定的交叉反应，针对多疣壁虎的Hoxc10蛋白高特异性、高滴度的抗体目前还没有。为进一步探究Hoxc10在多疣壁虎断尾再生过程中的作用及其他相关生物学功能，本专利拟制备兔源抗多疣壁虎Hoxc10抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能大量制备出高质量的抗多疣壁虎Hoxc10蛋白抗体的多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法。
本发明的技术解决方案是：
步骤1）、多疣壁虎Hoxc10的EST序列的获得
根据同源比对小鼠、人、鸡等物种Hoxc10基因序列，设计一对简并引物，序列如下：
上游引物F: 5’-TGTCTCTCAACACCTACCCATC-3’;
下游引物R: 5’- GTTCTCCCK(G/T)GTTCATTTTCT -3’ ,
基因克隆获得多疣壁虎Hoxc10的EST序列。
步骤2）、多疣壁虎Hoxc10全长序列获得
RACE法获得多疣壁虎Hoxc10 的5’cDNA和3’cDNA 序列，与EST序列拼接后得到多疣壁虎Hoxc10全长序列，共包含2156bp,其ORF区位于112-1242bp，共编码376个氨基酸。经生物学相关分析确认为多疣壁虎Hoxc10基因。GenBank登陆号：GQ267528.1
步骤3）、使用DNA STAR软件和SWISS-PLOT在线预测多疣壁虎Hoxc10抗原表位，通过综合分析发现Hoxc10抗原表位极有可能位于氨基酸4-6,21-24,27,29-30,36-42,45,57,72-73,78-81,83-85,99,
131-132, 136,147-149,153-154,162-165,205-206,209,211,216-217, 226,233-234, 240-241,271-274,295,301-302,308-310,337,370,372-373。
本专利选取含有预测抗原表位较多的96-191片段为免疫肽段(对应397-684核苷酸序列)。
步骤4）、构建Hoxc10的原核表达载体
1.设计构建Hoxc10原核表达载体的引物，上游引物5’端加上XhoⅠ酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为：
5’- CCGGAATTCCAACTCCCCTCCTGCTCT-3’;下游引物在其5’端加上EcoRⅠ酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为：5’- CCGCTCGAGCGGTTGCTCCAGATGCTC-3’； 2.取多疣壁虎脑，脊髓及部分其他组织，用Trizol试剂法提取总RNA；3. RT-PCR扩增：用QIAGEN公司逆转录试剂盒及2μg总RNA进行逆转录反应，合成cDNA；4. 采用原核表达引物，以合成的cDNA为模板进行多疣壁虎Hoxc10 的397-684核苷酸序列（对应蛋白表位优势肽段96-191) PCR扩增；5. 用限制性内切酶XhoⅠ、EcoRⅠ消化Hoxc10的PCR产物和pGEX-4T1原核表达载体质粒，并进行酶切产物的胶回收。6. 连接：用T4 DNA连接酶将PCR酶切回收产物和pGEX-4T1原核表达载体质粒的酶切回收产物连接；7. 感受态细胞的制备：用无菌接种棒从-70℃保存的DH5α菌株中蘸少许菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板，37℃培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中，置细菌培养摇床中于37℃、250转/分震荡培养12小时。取0.5ml该菌液接种于无氨苄青霉素100ml LB液体培养基中，37℃震荡培养2-2.5小时，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2小时。将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g×10分钟，弃去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮30分钟。4℃离心，4000g×10分钟，弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬浮。以100μl/管分装入1.5ml离心管中，-70℃冻存备用。8.重组质粒的转化：取5μl DNA连接产物加入100μl感受态细胞中，轻轻旋转数次使DNA分散均匀，冰浴30分钟，42℃水浴中热休克90秒，继续冰浴2-3分钟后加入LB培养基200μl，于37℃缓摇孵育60分钟，将培养物适量涂于1.5%琼脂LB平板（含氨苄青霉素），待胶表面没有液体流动时，37℃温箱倒置培养12-16小时；9. 重组克隆的筛选及酶切鉴定：从上述培养板中挑取6个克隆接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，以碱裂解法小量提取质粒DNA，限制性内切酶消化1小时，电泳鉴定DNA目的片断是否正确构建于表达载体中；10. 将双酶切鉴定为阳性克隆的质粒进行测序鉴定，其测序结果序列与基因库中397-684核苷酸序列完全一致。
1 CAACTCCCCTCCTGCTCTTTCCCGACCAATGTCAAGGAAGAAAATGCCTG
51 CTGCATGTACAACGCAGACAAAAGGGCTAAAAACGCCACCGAGGCGACCC
101 TCTACCCCAGTCAGATGCCTGAATCTTGCCTCAGTGACCATGAAGTCCCC
151 GTGCCCAGCTACTACCGCGCCAGCCAAGGTTATTCCTCCATGGAGAAGGC
201 GTCCAACTGCAACAACCCGACCGAGTTTGAGGCAACTTTCGAACCCAGGG
251 CGAGCCTCAGCCAGAGGAGTGAGCATCTGGAGCAACCG
步骤5）、目的蛋白的表达：BL21感受态细胞的制备（方法同上述DH5α感受态细胞的制备）。用鉴定正确的pGEX-4T1-Hoxc10重组质粒转化BL21感受态细胞，挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB培养基（含氨苄青霉素 50mg/L）中37℃震荡培养过夜。将1ml菌液加入到含50ml LB培养基的1000ml培养瓶中，37℃震荡培养至OD600为0.6左右，取1ml菌液作为未诱导的对照组，余下菌液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0. 2 mmol/L，30℃诱导6小时。同时以转化了pGEX-4T1载体的BL21细菌作阴性对照。将诱导、末诱导的含pGEX-4T1载体的BL21菌液各1ml，室温10000g离心1分钟，弃去上清，0.01M PBS 500ml重悬，加入等体积 2 × SDS电泳上样缓冲液，100℃煮沸5分钟，然后以12000g离心1分钟，在12% SDS聚丙烯酰胺凝胶中各加入20μl悬液，电泳结束后凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后检测融合蛋白表达情况；
步骤6）、目的蛋白的纯化：证实有目的蛋白表达后，将20ml转化了pGEX-4T1-Hoxc10的BL21细菌接种到1000ml LB培养基中进行扩大培养，37℃震荡培养至OD600为0.6左右，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0. 2 mmol/L，30℃诱导6小时。菌液离心，超声破碎后，用GE healthcare公司的glutathione sepharose吸附GST-Hoxc10融合蛋白。用10 mM的还原型GSH洗脱glutathione sepharose，将洗脱液放入预处理的透析袋中，夹紧，放入去离子水中，4℃透析24小时，收集透析后的液体。用12% SDS聚丙烯酰胺凝胶检测经过洗脱、透析后的GST-Hoxc10融合蛋白。
步骤7）、多克隆抗体的制备：参照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书，定量透析后蛋白质的浓度并取一定量用于新西兰大白兔的免疫。第一次免疫，每只兔子用1 mg融合蛋白，加入等体积(1 ml)的Freud’s完全佐剂乳化完全，于皮下多点免疫；第一次免疫24天后进行第二次免疫，使用0.5mg融合蛋白与等体积的Freud’s完全佐剂乳化完全进行皮下多点免疫；第一次免疫42天后进行第三次免疫，使用0.5mg融合蛋白与等体积的Freud’s不完全佐剂乳化完全进行皮下多点免疫；末次免疫10天后，Elisa检测Hoxc10抗血清达到效价后，心脏取血，免疫血清储存于-80℃备用。使用制备的Hoxc10抗血清对细菌目的蛋白条带和动物组织中的Hoxc10蛋白进行检测，确定抗血清的特异性，并用于多克隆抗体的纯化。
本发明所述制备的兔源抗多疣壁虎Hoxc10蛋白多克隆抗体，体内外均可特异性的与多疣壁虎Hoxc10蛋白相结合。
本发明的优越性在于：以pGEX-4T1为基础所构建的体外Hoxc10表达系统在BL 21中能高效地表达目的蛋白，进一步以成熟的方法进行纯化，可方便地获得大量的GST-Hoxc10融合蛋白。另外，经此蛋白免疫新西兰大白兔所制备的兔源抗多疣壁虎Hoxc10抗血清滴度高、特异性好，完全可以满足相关实验的需要。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是多疣壁虎Hoxc10优势表位肽段构建入原核表达载体的测序结果示图。
图2是原核表达质粒pGEX-4T1-Hoxc10构建示图。
图3是GST-Hoxc10融合蛋白的诱导表达电泳示图
图4是GST-Hoxc10经glutathione sepharose纯化后电泳示图
图5是制备的抗体与细菌表达的Hoxc10融合蛋白Western Blot 结果示图
图6是制备的抗体与多疣壁虎各组织中的Hoxc10蛋白Western Blot 结果示图
图7是制备的抗体与多疣壁虎脊髓组织中的Hoxc10蛋白免疫组化结果示图。
图3中M：低分子量蛋白标准品； 1：未诱导的含pGEX-4T1质粒的细菌总蛋白； 2：经IPTG诱导的含pGEX-4T1质粒的细菌总蛋白； 3：未诱导的含pGEX-4T1-Hoxc10质粒的细菌总蛋白； 4：经IPTG诱导的含pGEX-4T1- Hoxc10质粒的细菌总蛋白。
图4中1：经glutathione sepharose纯化后的GST-Hoxc10融合蛋白；2：未诱导的含pGEX-4T1质粒的细菌总蛋白； 3：经IPTG诱导的含pGEX-4T1质粒的细菌总蛋白；4：未诱导的含pGEX-4T1-Hoxc10质粒的细菌总蛋白； 5：经IPTG诱导的含pGEX-4T1- Hoxc10质粒的细菌总蛋白；箭头表示GST-Hoxc10融合蛋白。
图5中1：经glutathione sepharose纯化后GST-Hoxc10 融合蛋白； 2：经IPTG诱导的含pGEX-4T1质粒的细菌总蛋白； 箭头所示分别为37 kD Hoxc10 蛋白和26 kD GST蛋白。
图6中1：壁虎睾丸组织总蛋白； 2：壁虎肾组织总蛋白； 3：壁虎肺组织总蛋白； 4：壁虎心组织总蛋白； 5：壁虎脊髓组织总蛋白； 6：壁虎脑组织总蛋白； 7：壁虎肝组织总蛋白；箭头所示为41 kD Hoxc10蛋白。
图7中A:多疣壁虎脊髓组织中TRITC标记的Hoxc10蛋白,bar=20μm；B:Hoechst标记细胞核, bar=20μm；C：A图与B图叠加,bar=20μm;D: C图矩形区域的放大，箭头标记Hoxc10蛋白,bar=20μm。
具体实施方式
步骤1）、多疣壁虎Hoxc10的EST序列的获得
根据同源比对小鼠、人、鸡等物种Hoxc10基因序列，设计一对简并引物，序列如下：
上游引物F: 5’-TGTCTCTCAACACCTACCCATC-3’;
下游引物R: 5’- GTTCTCCCK(G/T)GTTCATTTTCT -3’ ,
基因克隆获得多疣壁虎Hoxc10的EST序列。
步骤2）、多疣壁虎Hoxc10全长序列获得
RACE法获得多疣壁虎Hoxc10 的5’cDNA和3’cDNA 序列，与EST序列拼接后得到多疣壁虎Hoxc10全长序列，共包含2156bp,其ORF区位于112-1242bp，共编码376个氨基酸。经生物学相关分析确认为多疣壁虎Hoxc10基因。GenBank登陆号：GQ267528.1
步骤3）、使用DNA STAR软件和SWISS-PLOT在线预测多疣壁虎Hoxc10抗原表位，通过综合分析发现Hoxc10抗原表位极有可能位于氨基酸4-6,21-24,27,29-30,36-42,45,57,72-73,78-81,83-85,99,
131-132, 136,147-149,153-154,162-165,205-206,209,211,216-217, 226,233-234, 240-241,271-274,295,301-302,308-310,337,370,372-373。
本专利选取含有预测抗原表位较多的96-191片段为免疫肽段(对应397-684核苷酸序列)。
步骤4）、构建Hoxc10的原核表达载体
1.设计构建Hoxc10原核表达载体的引物，上游引物5’端加上XhoⅠ酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为：
5’- CCGGAATTCCAACTCCCCTCCTGCTCT-3’;下游引物在其5’端加上EcoRⅠ酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为：5’- CCGCTCGAGCGGTTGCTCCAGATGCTC-3’； 2.取多疣壁虎脑，脊髓及部分其他组织，用Trizol试剂法提取总RNA；3. RT-PCR扩增：用QIAGEN公司逆转录试剂盒及2μg总RNA进行逆转录反应，合成cDNA；4. 采用原核表达引物，以合成的cDNA为模板进行多疣壁虎Hoxc10 的397-684核苷酸序列（对应蛋白表位优势肽段96-191) PCR扩增；5. 用限制性内切酶XhoⅠ、EcoRⅠ消化Hoxc10的PCR产物和pGEX-4T1原核表达载体质粒，并进行酶切产物的胶回收。6. 连接：用T4 DNA连接酶将PCR酶切回收产物和pGEX-4T1原核表达载体质粒的酶切回收产物连接；7. 感受态细胞的制备：用无菌接种棒从-70℃保存的DH5α菌株中蘸少许菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板，37℃培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中，置细菌培养摇床中于37℃、250转/分震荡培养12小时。取0.5ml该菌液接种于无氨苄青霉素100ml LB液体培养基中，37℃震荡培养2-2.5小时，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2小时。将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g×10分钟，弃去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮30分钟。4℃离心，4000g×10分钟，弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬浮。以100μl/管分装入1.5ml离心管中，-70℃冻存备用。8.重组质粒的转化：取5μl DNA连接产物加入100μl感受态细胞中，轻轻旋转数次使DNA分散均匀，冰浴30分钟，42℃水浴中热休克90秒，继续冰浴2-3分钟后加入LB培养基200μl，于37℃缓摇孵育60分钟，将培养物适量涂于1.5%琼脂LB平板（含氨苄青霉素），待胶表面没有液体流动时，37℃温箱倒置培养12-16小时；9. 重组克隆的筛选及酶切鉴定：从上述培养板中挑取6个克隆接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，以碱裂解法小量提取质粒DNA，限制性内切酶消化1小时，电泳鉴定DNA目的片断是否正确构建于表达载体中；10. 将双酶切鉴定为阳性克隆的质粒进行测序鉴定，其测序结果序列与基因库中397-684核苷酸序列完全一致。
1 CAACTCCCCTCCTGCTCTTTCCCGACCAATGTCAAGGAAGAAAATGCCTG
51 CTGCATGTACAACGCAGACAAAAGGGCTAAAAACGCCACCGAGGCGACCC
101 TCTACCCCAGTCAGATGCCTGAATCTTGCCTCAGTGACCATGAAGTCCCC
151 GTGCCCAGCTACTACCGCGCCAGCCAAGGTTATTCCTCCATGGAGAAGGC
201 GTCCAACTGCAACAACCCGACCGAGTTTGAGGCAACTTTCGAACCCAGGG
251 CGAGCCTCAGCCAGAGGAGTGAGCATCTGGAGCAACCG
步骤5）、目的蛋白的表达：BL21感受态细胞的制备。用鉴定正确的pGEX-4T1-Hoxc10重组质粒转化BL21感受态细胞，挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB培养基（含氨苄青霉素 50mg/L）中37℃震荡培养过夜。将1ml菌液加入到含50ml LB培养基的1000ml培养瓶中，37℃震荡培养至OD600为0.6左右，取1ml菌液作为未诱导的对照组，余下菌液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0. 2 mmol/L，30℃诱导6小时。同时以转化了pGEX-4T1载体的BL21细菌作阴性对照。将诱导、末诱导的含pGEX-4T1载体的BL21菌液各1ml，室温10000g离心1分钟，弃去上清，0.01M PBS 500ml重悬，加入等体积 2 × SDS电泳上样缓冲液，100℃煮沸5分钟，然后以12000g离心1分钟，在12% SDS聚丙烯酰胺凝胶中各加入20μl悬液，电泳结束后凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后检测融合蛋白表达情况；
步骤6）、目的蛋白的纯化：证实有目的蛋白表达后，将20ml转化了pGEX-4T1-Hoxc10的BL21细菌接种到1000ml LB培养基中进行扩大培养，37℃震荡培养至OD600为0.6左右，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0. 2 mmol/L，30℃诱导6小时。菌液离心，超声破碎后，用GE healthcare公司的glutathione sepharose吸附GST-Hoxc10融合蛋白。用10 mM的还原型GSH洗脱glutathione sepharose，将洗脱液放入预处理的透析袋中，夹紧，放入去离子水中，4℃透析24小时，收集透析后的液体。用12% SDS聚丙烯酰胺凝胶检测经过洗脱、透析后的GST-Hoxc10融合蛋白。
步骤7）、多克隆抗体的制备：参照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书，定量透析后蛋白质的浓度并取一定量用于新西兰大白兔的免疫。第一次免疫，每只兔子用1 mg融合蛋白，加入等体积(1 ml)的Freud’s完全佐剂乳化完全，于皮下多点免疫；第一次免疫24天后进行第二次免疫，使用0.5mg融合蛋白与等体积的Freud’s完全佐剂乳化完全进行皮下多点免疫；第一次免疫42天后进行第三次免疫，使用0.5mg融合蛋白与等体积的Freud’s不完全佐剂乳化完全进行皮下多点免疫；末次免疫10天后，Elisa检测Hoxc10抗血清达到效价后，心脏取血，免疫血清储存于-80℃备用。使用制备的Hoxc10抗血清对细菌目的蛋白条带和动物组织中的Hoxc10蛋白进行检测，确定抗血清的特异性，并用于多克隆抗体的纯化。
制备BL21感受态细胞的方法是：用无菌接种棒从-70℃保存的BL21菌株中蘸菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板，37℃培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中，置细菌培养摇床中于37℃、250转/分震荡培养12小时；取0.5ml该菌液接种于无氨苄青霉素100ml LB液体培养基中，37℃震荡培养2-2.5小时，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2小时；将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g×10分钟，弃去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮30分钟；4℃离心，4000g×10分钟，弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬浮；以100μl/管分装入1.5ml离心管中，-70℃冻存备用。
Claims (2)
1.一种多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法，其特征是：包括下列步骤：
（1）多疣壁虎Hoxc10的EST序列的获得：
根据同源比对小鼠、人、鸡物种Hoxc10基因序列，设计一对简并引物，序列如下：
上游引物F: 5’-TGTCTCTCAACACCTACCCATC-3’;
下游引物R: 5’- GTTCTCCCK(G/T)GTTCATTTTCT -3’ ,
基因克隆获得多疣壁虎Hoxc10的EST序列；
（2）多疣壁虎Hoxc10全长序列获得：
RACE法获得多疣壁虎Hoxc10 的5’cDNA和3’cDNA 序列，与EST序列拼接后得到多疣壁虎Hoxc10全长序列，共包含2156bp,其ORF区位于112-1242bp，共编码376个氨基酸；经生物学相关分析确认为多疣壁虎Hoxc10基因，GenBank登陆号：GQ267528.1；
（3）使用DNA STAR软件和SWISS-PLOT在线预测多疣壁虎Hoxc10抗原表位，选取96-191片段为免疫肽段，对应397-684核苷酸序列；
（4）构建Hoxc10的原核表达载体：
设计构建Hoxc10原核表达载体的引物，上游引物5’端加上XhoⅠ酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为：
5’- CCGGAATTCCAACTCCCCTCCTGCTCT-3’;下游引物在其5’端加上EcoRⅠ酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为：5’- CCGCTCGAGCGGTTGCTCCAGATGCTC-3’；取多疣壁虎脑及脊髓组织，用Trizol试剂法提取总RNA； RT-PCR扩增：用QIAGEN公司逆转录试剂盒及2μg总RNA进行逆转录反应，合成cDNA；采用原核表达引物，以合成的cDNA为模板进行多疣壁虎Hoxc10 的对应蛋白表位优势肽段96-191的397-684核苷酸序列， PCR扩增；用限制性内切酶XhoⅠ、EcoRⅠ消化Hoxc10的PCR产物和pGEX-4T1原核表达载体质粒，并进行酶切产物的胶回收；连接：用T4 DNA连接酶将PCR酶切回收产物和pGEX-4T1原核表达载体质粒的酶切回收产物连接；感受态细胞的制备：用无菌接种棒从-70℃保存的DH5α菌株中蘸菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板，37℃培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中，置细菌培养摇床中于37℃、250转/分震荡培养12小时；取0.5ml该菌液接种于无氨苄青霉素100ml LB液体培养基中，37℃震荡培养2-2.5小时，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2小时；将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g×10分钟，弃去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮30分钟；4℃离心，4000g×10分钟，弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬浮；以100μl/管分装入1.5ml离心管中，-70℃冻存备用；重组质粒的转化：取5μl DNA连接产物加入100μl感受态细胞中，轻轻旋转数次使DNA分散均匀，冰浴30分钟，42℃水浴中热休克90秒，继续冰浴2-3分钟后加入LB培养基200μl，于37℃摇孵育60分钟，将培养物涂于含氨苄青霉素的1.5%琼脂LB平板，待胶表面没有液体流动时，37℃温箱倒置培养12-16小时；重组克隆的筛选及酶切鉴定：从上述培养板中挑取6个克隆接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，以碱裂解法小量提取质粒DNA，限制性内切酶消化1小时，电泳鉴定DNA目的片断是否正确构建于表达载体中；将双酶切鉴定为阳性克隆的质粒进行测序鉴定，其测序结果序列与基因库中397-684核苷酸序列完全一致：
1 CAACTCCCCTCCTGCTCTTTCCCGACCAATGTCAAGGAAGAAAATGCCTG
51 CTGCATGTACAACGCAGACAAAAGGGCTAAAAACGCCACCGAGGCGACCC
101 TCTACCCCAGTCAGATGCCTGAATCTTGCCTCAGTGACCATGAAGTCCCC
151 GTGCCCAGCTACTACCGCGCCAGCCAAGGTTATTCCTCCATGGAGAAGGC
201 GTCCAACTGCAACAACCCGACCGAGTTTGAGGCAACTTTCGAACCCAGGG
251 CGAGCCTCAGCCAGAGGAGTGAGCATCTGGAGCAACCG；
（5）目的蛋白的表达：制备BL21感受态细胞；用鉴定正确的pGEX-4T1-Hoxc10重组质粒转化BL21感受态细胞，挑取含重组质粒的菌体单斑至含氨苄青霉素 50mg/L 的2ml LB培养基中37℃震荡培养过夜；将1ml菌液加入到含50ml LB培养基的1000ml培养瓶中，37℃震荡培养至OD600为0.6，取1ml菌液作为未诱导的对照组，余下菌液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度为0. 2 mmol/L，30℃诱导6小时；同时以转化了pGEX-4T1载体的BL21细菌作阴性对照；将诱导、末诱导的含pGEX-4T1载体的BL21菌液各1ml，室温10000g离心1分钟，弃去上清，0.01M PBS 500ml重悬，加入等体积 2 × SDS电泳上样缓冲液，100℃煮沸5分钟，然后以12000g离心1分钟，在12% SDS聚丙烯酰胺凝胶中各加入20μl悬液，电泳结束后凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后检测融合蛋白表达情况；
（6）目的蛋白的纯化：证实有目的蛋白表达后，将20ml转化了pGEX-4T1-Hoxc10的BL21细菌接种到1000ml LB培养基中进行扩大培养，37℃震荡培养至OD600为0.6，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度为0. 2 mmol/L，30℃诱导6小时，菌液离心，超声破碎后，用GE healthcare公司的glutathione sepharose吸附GST-Hoxc10融合蛋白；用10 mM的还原型GSH洗脱glutathione sepharose，将洗脱液放入预处理的透析袋中，夹紧，放入去离子水中，4℃透析24小时，收集透析后的液体；用12% SDS聚丙烯酰胺凝胶检测经过洗脱、透析后的GST-Hoxc10融合蛋白；
（7）多克隆抗体的制备：参照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书，定量透析后蛋白质的浓度并取一定量用于新西兰大白兔的免疫：第一次免疫，每只兔子用1 mg融合蛋白，加入等体积的Freud’s完全佐剂乳化完全，于皮下多点免疫；第一次免疫24天后进行第二次免疫，使用0.5mg融合蛋白与等体积的Freud’s完全佐剂乳化完全进行皮下多点免疫；第一次免疫42天后进行第三次免疫，使用0.5mg融合蛋白与等体积的Freud’s不完全佐剂乳化完全进行皮下多点免疫；第三次免疫10天后，Elisa检测Hoxc10抗血清达到效价后，心脏取血，免疫血清储存于-80℃备用；使用制备的Hoxc10抗血清对细菌目的蛋白条带和动物组织中的Hoxc10蛋白进行检测，确定抗血清的特异性，并用于多克隆抗体的纯化。
2.根据权利要求1所述的多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法，其特征是：制备BL21感受态细胞的方法是：用无菌接种棒从-70℃保存的BL21菌株中蘸菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板，37℃培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中，置细菌培养摇床中于37℃、250转/分震荡培养12小时；取0.5ml该菌液接种于无氨苄青霉素100ml LB液体培养基中，37℃震荡培养2-2.5小时，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2小时；将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g×10分钟，弃去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮30分钟；4℃离心，4000g×10分钟，弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬浮；以100μl/管分装入1.5ml离心管中，-70℃冻存备用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110113360 CN102206647A (zh) | 2011-05-04 | 2011-05-04 | 多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110113360 CN102206647A (zh) | 2011-05-04 | 2011-05-04 | 多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102206647A true CN102206647A (zh) | 2011-10-05 |
Family
ID=44695710
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201110113360 Pending CN102206647A (zh) | 2011-05-04 | 2011-05-04 | 多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102206647A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102688475A (zh) * | 2012-01-14 | 2012-09-26 | 河南科技大学 | 一种壁虎抗癌提取物 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6358702B1 (en) * | 1997-10-03 | 2002-03-19 | Osiris Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding human Hox C10 |
-
2011
- 2011-05-04 CN CN 201110113360 patent/CN102206647A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6358702B1 (en) * | 1997-10-03 | 2002-03-19 | Osiris Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding human Hox C10 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 《Genbank database》 20090906 Chen H. et al Genbank Accession No. GQ267528 1-2 , * |
| 《南通大学学报（ 医学版）》 20110430 周晓芳等 多疣壁虎SPARCL1 多克隆抗血清的制备及鉴定 79-82，86 1-2 第31卷, 第2期 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102688475A (zh) * | 2012-01-14 | 2012-09-26 | 河南科技大学 | 一种壁虎抗癌提取物 |
| CN102688475B (zh) * | 2012-01-14 | 2014-10-29 | 河南科技大学 | 一种壁虎抗癌提取物的提取方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3734286A1 (en) | A method for determining the efficacy of a sars-cov-2 vaccine | |
| Tungatt et al. | Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig | |
| CN111471089B (zh) | 一种重组的非洲猪瘟病毒cd2v亚单位蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN110041411B (zh) | 稳定的非典型猪瘟病毒亚单位蛋白及其疫苗和制备方法和应用 | |
| CN111763256A (zh) | 鸡cr2基因的克隆、蛋白的表达和纯化及其多克隆抗体的制备 | |
| CN106084051A (zh) | 一种抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv‑C27及其应用 | |
| WO2008124176A2 (en) | Soluble and membrane-anchored forms of lassa virus subunit proteins | |
| WO2008119358A2 (en) | Surface-located streptococcus pneumoniae polypeptides for use in vaccine compositions | |
| CN103724413B (zh) | 旋毛虫副肌球蛋白b细胞抗原表位8a1及其应用 | |
| RU2012137304A (ru) | Рекомбинантные белки для применения в вакцине, антитела к указанным белкам и диагностические и терапевтические способы, включающие указанное | |
| CN101451136A (zh) | 犬S100β蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法 | |
| WO2018199538A1 (ko) | 소수성 테일 도메인이 제거된 먹장어 유래 VLRB 단백질과 C4ｂｐ 올리고머화 도메인이 연결된 융합 단백질 및 이의 용도 | |
| CN104610443A (zh) | 一种高稳定性重组降钙素原、制备方法及用途 | |
| CN102206647A (zh) | 多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法 | |
| Parham | Molecular definition of the transplantation antigens | |
| CN103880953B (zh) | 一种猪p21蛋白抗体及其制备方法与应用 | |
| CN107033225B (zh) | 一种小反刍兽疫病毒hn蛋白抗原表位肽及其确定、制备方法和应用 | |
| CN101580545A (zh) | 抗h5n1来源的血凝素蛋白的单克隆抗体及其应用 | |
| CN106084043A (zh) | 一种抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv‑C22及其应用 | |
| CN114163521B (zh) | 一种鉴别猪瘟病毒2.1亚型强毒株及其抗体的单克隆抗体 | |
| CN105218668A (zh) | 马耳他型布氏杆菌的EF-Tu蛋白单克隆抗体MAb及其制备方法与应用 | |
| CN109111507A (zh) | 病毒重组糖蛋白及其真核细胞高效表达方法与应用 | |
| CN111363031B (zh) | BNIP3的pSer131多克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| CN114181973A (zh) | 一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因及其制备方法 | |
| CN106995801B (zh) | 抗树鼩cd4分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20111005 |