CN102203604A - 用于防止组织样品中伪像的方法和组合物 - Google Patents

用于防止组织样品中伪像的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

描述了用于防止使用醛系固定剂固定的组织样品中的伪像的方法和组合物。所述方法包括使用醛系固定剂，诸如福尔马林固定试剂固定组织样品。固定后，组织样品可以与单独的各自包含防止伪像的组合物或组织染剂的溶液相接触。然而，因为防止伪像的组合物可以增加染剂的保存期，所以所述染剂和所述组合物优选在加入至样品前混合。防止伪像的组合物可以包括一种或多种氨基酸、聚胺、和/或形成席夫碱的化合物。所述组合物的成分可以与游离的固定剂结合或反应，以防止固定剂伪像。另外，防止伪像的组合物和游离的醛系固定剂之间的反应可以是有利的，这归因于防止伪像的组合物的组分的热力学、小尺寸、高度扩散能力、和/或高浓度。

Description

用于防止组织样品中伪像的方法和组合物
背景
1.领域
本申请总体地涉及用于固定的组织样品的方法和组合物。更具体地，本申请涉及用于防止伪像，改善已经使用醛系固定剂保存的组织样品中的染色，和增加组织染剂的可用使用寿命的方法和组合物。
2.背景
组织样品可以包括一种或多种细胞、组织、器官、或其他获自生物体的材料，以及整个生物体或其一部分。所述组织样品可以有效用于研究和医学、组织学、病理学、细胞生物学、和一般的生物科学的实践。例如，组织样品可以有助于疾病、病症、功能、结构的研究、和生物样本的其他特性。尽管组织样品可以以许多方式获得，包括来自尸体剖检、活组织检查、手术、尸检等，一旦获得，样品通常经历蛋白水解酶和其他倾向于分解和降解生物材料的过程。
为了保存组织样品结构或形态学，以及为了保持蛋白稳定性，组织样品经常通过称为固定的过程来保存。固定是化学过程，其可以通过终止正在进行的生物反应来防止样品腐烂。存在许多固定方法以及试剂。例如，组织样品可以使用交联固定剂，诸如醛系固定剂来固定。认为醛系、交联固定剂可以与组织样品中的蛋白和其他分子反应形成亚甲基桥键。亚甲基桥键可以生成化学键的网络，所述化学键可以防止大分子，诸如蛋白的运动，并基本保持组织样品的物理结构。固定后，可以防止破坏性酶进一步降解组织样品。
尽管固定可以容许组织样品在获得后长时间和否则将发生样品自然降解的时间段内进行研究，但固定并非没有缺点。例如，一些醛系固定剂可以导致或增加染色的组织样品中的视觉伪像。在此类伪像的一个罕见实例中，在固定的组织样品中的酸性条件下，可由醛系固定剂形成色素。例如，在甲醛固定剂中，可以形成酸性甲醛氧化苏木精，或甲醛色素。甲醛色素和来自其他醛系固定剂的色素可以在固定的样品中形成呈褐色的有色色素沉积物。这样的色素沉积物不仅可以分散注意力并且还阻止精确的组织样品分析。
在与醛系固定剂相关的伪像的另一个更常见的实例中，一些醛系固定剂可以导致细胞或细胞结构皱缩。例如，使用醛系固定剂，诸如10％福尔马林磷酸缓冲液处理的细胞可以在固定后皱缩约15％。该皱缩可以使细胞和细胞结构变形并且，由此，改变细胞形态学。而且，该细胞皱缩还可以引起扩散屏障，该屏障阻止或削弱组织染剂或醛系固定剂适当地进入、染色、或固定样品的各部分。
在与醛系固定剂相关的潜在伪像的另一个实例中，在使用醛系固定剂固定过程中形成的亚甲基桥键网络可以降低免疫反应性，或阻止样品中分子和用于分析的分子之间所需的相互作用。例如，与醛系固定剂相关的亚甲基桥键可以在染色过程中阻止抗体分子穿透样品和到达目的抗原。因此，可能由于物理障碍阻止抗原的适当视觉化，即使抗原的表位可能没有被化学修饰。类似地，在使用醛系固定剂固定过程中形成的亚甲基桥键可以阻止一些组织染剂与样品适当的结合。例如，在固定过程中形成的亚甲基桥键可以结合与一些组织染剂相同的位点，并由此减少染剂结合并阻止合适的视觉化。
在不受理论限制的条件下，认为已经使用醛系固定剂固定的组织样品的长时间染色可能复制上述的一些传统醛系伪像。如所提及地，一些染剂，诸如苏木精和伊红，可以与醛系固定剂竞争组织样品中的结合位点。因此，使用该染剂的长时间染色可以导致一些醛系固定剂由样品释放至溶液中。一旦在溶液中，游离的醛系固定剂可以再次结合样品并导致另外的伪像。这些伪像可以限制组织染色和可视化程序的有效性。
因此，开发用于防止使用醛系固定剂制备的组织样品中的伪像和改善其中的染色的方法和组合物将是本领域中的改进。
简述
本发明提供用于防止已经使用醛系固定剂固定的组织样品中的伪像的新方法和组合物。一般地，所述方法可以包括使用醛系固定剂，诸如福尔马林固定试剂固定组织样品。醛系固定剂可以导致与组织样品中的极性氨基酸和类似残基形成亚甲基桥键。随着时间的过去和在存在水的条件下，认为这些亚甲基桥键中的一些可以天然地发生逆转并将醛系固定剂释放至溶液中。在不受理论限制的条件下，认为组织样品中游离的醛系固定剂分子的存在可以与组织染剂反应或干扰组织染剂。
本发明的范围包括使固定的组织样品与防止或抑制伪像形成的组合物相接触。该防止伪像的组合物可以包括以下列的方式与组织样品中的游离醛系固定剂分子结合或否则反应的任何化合物，所述方式是防止游离醛系固定剂形成伪像。例如，防止伪像的组合物可以包括一种或多种氨基酸、聚胺和/或在与醛系固定剂反应时形成席夫碱(Schiff base)的化合物。
合适的氨基酸的一些非限制性实例可以包括精氨酸，赖氨酸，酪氨酸，组氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，和色氨酸残基。合适的聚胺的一些非限制性实例包括由超过一个单元的单一类型氨基组成的聚合物(“均聚物”)和包含超过一种类型的氨基的聚合物(“杂聚物”)。因此，合适的聚胺的非限制性实例包括化学品或聚合物，其包括聚精氨酸，聚半胱氨酸，聚组氨酸，聚赖氨酸，腐胺，和聚乙烯亚胺，和/或带正电氨基酸的均聚物或杂聚物。
在无约束力的理论下，认为聚胺和/或氨基酸与已经由组织释放的醛系固定剂结合或否则反应，并可以，由此，防止或阻止固定剂结合组织和/或染剂而产生伪像。在类似的无约束力的理论下，认为添加一种或多种形成席夫碱的化合物容许组织中的一部分，如果不是全部，游离固定剂通过被形成席夫碱的化合物捕获和/或与形成席夫碱的化合物反应而形成席夫碱，并由此防止或阻止游离醛系固定剂与组织样品反应而形成伪像。在一些情形中，游离固定剂、聚胺、和/或形成席夫碱的化合物之间的反应在热力学方面是有利的。因此，添加一种或多种氨基酸、聚胺、和/或形成席夫碱的化合物可以有效地防止组织样品中的游离醛系固定剂形成新的或另外的伪像。
固定的组织样品可以在任意时刻与防止伪像的组合物相接触。例如，固定的组织样品可以在组织样品与组织染剂溶液相接触之前、之后、或同时与防止伪像的组合物接触。类似地，防止伪像的组合物可以单独地或与含有一种或多种组织染剂的溶液组合地与固定的组织样品合并。然而，在一些实施方案中，防止伪像的组合物和组织染剂合并在一起，随后它们与组织样品同时相接触。事实上，因为防止伪像的组合物可以意外地增加组织染剂的有用保存期，所以将组织染剂和防止伪像的组合物在溶液中混合在一起之后再将一部分该溶液与组织样品合并会是有益的。
附图简述
以下说明可以根据若干附图更好地理解，其中：
图1包含苏木精和伊红染色的骨髓样品的照片，所述样品未经使用防止伪像的组合物处理；
图2包含苏木精和伊红染色的骨髓样品的照片，所述样品已经使用防止伪像的组合物的代表性实施方案处理；
图3包含苏木精和伊红染色的人输卵管组织样品的照片，所述样品未经使用防止伪像的组合物处理；
图4包含苏木精和伊红染色的人输卵管组织样品的照片，所述样品已经使用防止伪像的组合物处理；
图5包含苏木精和伊红染色的人子宫内膜组织样品的照片，所述样品未经使用防止伪像的组合物处理；和
图6包含苏木精和伊红染色的人子宫内膜组织样品的照片，所述样品已经使用防止伪像的组合物处理。
所述附图与下列说明一起，可以有助于证明和解释所述方法和组合物的原理。
详述
可以参照下列的说明来理解所述发明的目前优选的实施方案。应该理解所述方法和组合物，如本文中一般公开地，可以以广泛多样的方式排列和设计。因此，本发明的实施方案的下列更详细的描述不意欲限制本发明所要求保护的范围，而仅代表本发明的目前优选的实施方案。
本申请一般地公开用于减少、逆转、阻止或否则防止固定的组织样品中的伪像的方法和组合物。更具体地，本申请公开了利用防止伪像的组合物来防止使用醛系固定剂固定的组织样品中的伪像和改善其中的染色。为了更好地解释所述的方法和组合物，本申请首先讨论了醛系固定并然后讨论了通过使样品与防止伪像的组合物相接触来防止使用醛系固定剂固定的组织样品中的伪像。
如所提及地，醛系固定剂可以用于化学地保存组织样品。而且，已知的或新型的多种醛系固定剂可以用作所述固定剂。合适的醛系固定剂的一些实例包括甲醛，戊二醛，多聚甲醛，等。然而，为了更好地解释防止伪像的组合物的应用，本申请讨论了一些非限制性实施方案，其中防止伪像的组合物用于已经使用甲醛固定的组织样品中。
尽管在使用防止伪像的组合物处理前可以使用其他已知的或新型的甲醛溶液来固定组织样品，但是甲醛经常基于通常称为福尔马林的标准化甲醛水溶液来描述和使用。甲醛，在室温和1大气压下，是气体。然而，甲醛通常作为水溶液来销售。所使用的最常见水性浓度是37重量％(40体积％)溶液。该溶液包含37克甲醛气体，至100克溶液中。当单独保持在水中时，甲醛倾向于聚合。为了抑制甲醛溶液的聚合，加入甲醇直至约10体积％-约15体积％的浓度。术语“福尔马林”指定为这样的溶液，即在水中的约37重量％甲醛气体，通常具有约10体积％-约15体积％甲醇。常用的甲醛固定试剂可以包括约10％福尔马林。因此，固定剂(或含有处于适合于组织样品固定的浓度的固定剂或其他所需物质的溶液)，即约10％福尔马林可以包含约3.7重量％-约4重量％甲醛。
在福尔马林作为固定剂使用时，不同类型的福尔马林或包含福尔马林的固定试剂可以应用于组织样品。例如，组织样品可以使用常规锌-福尔马林固定试剂、福尔马林-乙酸固定试剂、或福尔马林-醇固定试剂来固定。如本领域中已知地，所用的福尔马林的形式可以取决于被固定的组织样品的类型以及固定的样品所需要的用途。
合适浓度的固定剂可以用于固定试剂中，以化学保存组织样品。事实上，固定试剂中的固定剂的浓度可以取决于所需的应用。例如，如所述，常规福尔马林固定试剂可以具有约3.7重量％-约4重量％甲醛的浓度。在另一个实例中，固定试剂具有约0.2重量％-约6重量％甲醛的浓度。然而，在目前优选的实例中，固定试剂具有约0.2重量％-约2重量％甲醛的浓度。在一个非限制性实例中，福尔马林固定试剂具有约500毫渗摩尔-约2,000毫渗摩尔的克分子渗透压浓度和优选约500毫渗摩尔-约1,200毫渗摩尔的克分子渗透压浓度。然而，本公开内容的教导可以关于不同合适浓度的不同固定剂来使用。
醛系固定试剂，诸如福尔马林固定试剂，可以另外包含适合于固定试剂的所需应用的任何其他物质。例如，固定试剂可以包含溶剂(例如，二甲基亚砜(“DMSO”)和水)、去污剂、醇、缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)、聚合物等。另外，醛系固定试剂可以包括可以起核酸，诸如DNA或RNA的稳定剂作用的任何物质。
固定试剂，诸如含有福尔马林和其他所需物质的固定试剂，可以以任何合适的方式应用于组织样品中。例如，组织样品可以浸没于固定试剂中，用固定试剂灌注，用固定试剂喷洒，用固定试剂熏蒸，或否则与固定试剂接触。在一个实例中，组织样品可以完全浸没于固定试剂中一段任何需要的时间量。然而，在另一个实例中，固定试剂可以注射至生物体，如斑马鱼(Danio rerio)的心脏中，注射体积与生物体心输出量相匹配。在该实例中，固定试剂可以然后灌注整个生物体。
此外，可以遵从用于组织样品固定的任何所需方法或方案。固定方法的实例参见2007年12月10日提交的美国实用新型专利申请号11/953,670，其标题为制备用于显微镜分析的样本的组合物和方法；将其全部内容通常引用结合于此。
用于使用醛系固定剂，诸如福尔马林固定试剂固定组织样品的方案可以包括有助于固定组织样品的任何步骤或程序。例如，组织样品可以以多种方法来漂洗或洗涤。另外，方案可以需要将组织样品浸没在固定试剂中一段合适的时间量。在一个非限制性实例中，方案可以需要组织样品浸没在固定试剂中短至约30分钟或长至约72小时以上，其取决于样品尺寸、类型、试剂温度等。固定方案还可以包括加热或冷却样品。方案还可以需要样品通过一系列浴液(baths)脱水，所述一系列浴液可以逐渐增加醇浓度。而且，固定方案还可以包括将样品包埋在石蜡中或甚至应用第二固定剂。事实上，技术人员应该认识到固定方案可以包括许多另外的程序。此外，技术人员应该认识到已经使用醛系固定剂固定的组织样品可以以任何合适的方式来处理。例如，组织样品可以冷冻，由低温恒温器切片，冷却，保存，染色等。
如前所述，一旦组织样品已经使用醛系固定剂固定，则与固定相关的伪像可以通过使组织样品与防止伪像的组合物相接触来防止，如本文中所述。防止伪像的组合物基于这样的无约束力理论，即醛系固定剂与组织样品中的极性氨基酸和类似残基结合并与其形成亚甲基桥键。亚甲基桥键可以由亚甲醇或席夫碱中间物形成。亚甲醇或席夫碱中间物可以在醛系固定剂(例如，甲醛)与氨基酸残基的N端或与赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、和组氨酸残基上存在的氨基和/或硫醇基反应时产生。亚甲醇和席夫碱中间物可以然后与精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、胞嘧啶、和/或酪氨酸残基反应形成亚甲基桥键。(为了更完全讨论通过甲醛和合成肽中的极性氨基酸和类似残基反应形成亚甲基桥键，参见Bernard Metz等，Identification of Formaldehyde-induced Modifications in Proteins：Reactionswith Model Peptides(鉴定蛋白中甲醛诱导的修饰：与模型肽反应)，279J.BIOL.CHEM.(生物化学)，6235-43(2004年2月20日))。而且，在醛系固定过程中形成亚甲基桥键的化学反应可以具有天然逆转到一定程度的趋势。例如，当已经使用醛系固定剂固定的样品，即使以痕量暴露于水中，固定剂和组织之间的一些亚甲基桥键可以逆转并且一些量的固定剂可以释放至溶液中。经过一段时期，亚甲基桥键的逐渐逆转以释放醛系固定剂可以促进固定和染色的样品中一些伪像的形成。
在不受理论约束下，目前认为醛系固定剂可以通过使组织样品与防止伪像的组合物接触而被阻止或防止形成伪像，所述防止伪像的组合物包括一种或多种以这样的方式与醛系固定剂竞争和/或反应的化合物，所述方式是为释放的或游离的固定剂提供备选的结合或反应机会。另外，如果所述化合物呈现比组织样品中的极性氨基酸或类似残基更有利的结合条件，则由固定剂形成亚甲基桥键可以在热力学上以有利于这些另外的化合物的方式被驱动。所述化合物可以包括以这样的方式与醛系固定剂反应的任何化学品，所述方式是防止固定剂在组织样品中形成伪像。与醛系固定剂结合、竞争、和/或否则反应的防止伪像的组合物中的化合物的一些实例可以包括一种或多种氨基酸、聚胺、和/或在与醛系固定剂反应时形成席夫碱的化合物。
在一些实施方案中，防止伪像的组合物包括一种或多种游离氨基酸，或不彼此结合形成聚合物的氨基酸。在这样的实施方案中，组合物可以包括任何合适的氨基酸，所述合适的氨基酸能够对游离醛系固定剂提供备选的结合或反应位点，或否则能够防止与醛系固定剂相关的伪像。所述游离氨基酸的一些非限制性实例包括游离的赖氨酸、精氨酸、酪氨酸残基、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、和色氨酸残基。事实上，在一些实施方案中，精氨酸、酪氨酸，和在更小的程度上，组氨酸、天冬酰胺，谷氨酰胺，和色氨酸残基可以与由甘氨酸和甲醛形成的席夫碱加合物反应，从而进一步防止固定剂伪像。
在一些实施方案中，防止伪像的组合物包括一种或多种聚胺。事实上，所述组合物可以包括任何聚胺，所述聚胺可以结合醛系固定剂(例如，甲醛)，可以对游离的醛系固定剂提供备选的结合或反应位点，或可以以其他方式防止与醛系固定剂相关的伪像。防止使用醛系固定剂固定的组织样品中的伪像的聚胺的一些非限制性实例可以包括均聚物(例如，含单一氨基的单体的有机聚合物)或杂聚物(例如，含混合氨基的单体的有机聚合物)。均聚物的一些非限制性实例可以包括由聚赖氨酸、聚精氨酸、聚乙烯亚胺、聚色氨酸、腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、或任何其他合适的由单一氨基构成的天然或合成聚合物组成。类似地，杂聚物的一些非限制性实例包括这样的聚合物，所述聚合物包含赖氨酸、聚赖氨酸、精氨酸、聚精氨酸、聚乙烯亚胺、聚色氨酸、腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、和/或任何其他合适的天然或合成氨基，以任何合适的组合方式的组合。
在防止伪像的组合物包括聚胺时，所述聚胺可以具有这样的任何特性，即容许其防止游离醛系固定剂导致组织样品中产生伪像。例如，防止伪像的组合物可以包括任何长度的聚胺，所述长度容许聚胺与溶液中的醛系固定剂结合或以其他的方式反应。通过举例说明，合适的聚胺可以包括容许聚胺与游离醛系固定剂结合或否则反应的任何数量的氨基酸单体或残基。例如，合适的聚赖氨酸或聚精氨酸可以分别包含约2-约1,500个赖氨酸或精氨酸残基。另外，防止伪像的组合物可以包含任何分子量的聚胺，所述分子量适合于容许聚胺与醛系固定剂结合。在一个非限制性实例中，组合物包含分子量大于约20,000统一原子质量单位的聚胺。然而，在另一个实例中，组合物包含分子量小于约20,000统一原子质量单位的聚胺。在再一个实例中，组合物包括分子量在约4,000-约15,000之间的统一原子质量单位的聚胺。
虽然一些氨基酸和聚胺在与醛系固定剂反应时可以形成席夫碱，但是在一些实施方案中，防止伪像的组合物包含一种或多种另外的在与醛系固定剂反应时形成席夫碱的化合物。提出这样的理论，即包含所述形成席夫碱的化合物的组合物可以以防止不需要的伪像的方式与组织样品中的游离固定剂竞争或为其提供备选的结合和反应机会。虽然所述组合物可以包含任何在与醛系固定剂反应时形成席夫碱的化合物，但是合适的形成席夫碱的化合物的一些非限制性实例可以包括甘氨酸；精氨酸；天冬氨酸；聚乙烯亚胺；包含甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、聚乙烯亚胺的肽；和/或在与醛系固定剂反应时形成席夫碱的任何其他天然或合成的化合物。形成席夫碱的化合物的一些另外的非限制性实例可以包括在与甲醛反应时形成席夫碱的任何其他氨基酸。
当防止伪像的组合物包括包含形成席夫碱的化合物(例如，甘氨酸，精氨酸，天冬氨酸，和/或聚乙烯亚胺)的肽时，所述肽可以是天然的(例如，蛋白或其一部分)或合成的。另外，包含形成席夫碱的化合物的肽可以是仅包含单一类型的形成席夫碱的化合物的均肽(homopeptide)和/或所述肽可以是包含超过一种类型的形成席夫碱的化合物的杂肽(heteropeptide)。在另一个实例中，所述肽中的氨基可以处于适合于防止使用醛系固定剂固定的组织样品中的伪像的任何组合中。在再一个实例中，所述肽可以是任意长度。例如，所述肽可以短至约2个氨基酸或长至约2,000个氨基酸以上。然而，在一些实例中，所述肽长度范围是约5-约200个氨基酸。在其他实例中，所述肽长度范围是约10-约50个氨基酸。在再一个实例中，所述组合物包含多个不同长度的肽。
防止伪像的组合物可以包括与游离醛系固定剂结合或反应从而防止已经使用醛系固定剂固定的组织样品中的伪像的化学品或化合物的任意组合。事实上，在一些实施方案中，所述组合物包含一种或多种类型的聚胺。例如，所述组合物可以包含聚赖氨酸，聚精氨酸，或二者。然而，在其他实施方案中，所述组合物包含一种或多种形成席夫碱的化合物。例如，所述组合物可以包含甘氨酸；精氨酸；天冬氨酸；聚乙烯亚胺；和/或包含甘氨酸，精氨酸，天冬氨酸，和/或聚乙烯亚胺的肽。在一些优选的实施方案中，所述组合物包含至少一种聚胺和至少一种形成席夫碱的化合物。在这样的实施方案中，所述组合物可以包含任何合适数量的聚胺和形成席夫碱的化合物或它们的任何合适组合。在一个实例中，所述组合物包含聚赖氨酸、聚精氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、和聚乙烯亚胺中的两种或更多种的混合物。在另一个实例中，所述组合物包含聚赖氨酸和甘氨酸。在再一个实例中，所述组合物包含聚精氨酸和甘氨酸。
防止伪像的组合物中的多种化合物也可以具有容许它们防止已经使用醛系固定剂固定的组织样品中的伪像的任何特性。例如，所述化合物(例如，一种或多种聚胺和/或形成席夫碱的化合物)可以具有多种不同官能团、残基数目、分子量、化学亚群，等。
防止伪像的组合物还可以包含容许所述组合物防止已经使用醛系固定剂固定的组织样品中的伪像的任何其他元素或化学品。例如，所述组合物可以包含水和/或一种或多种缓冲液、醇、溶剂(例如，水或DMSO)、pH调节剂、去污剂、组织染剂、等。
防止伪像的组合物的终溶液或用于处理固定的组织样品的组合物的终溶液中的化合物可以具有容许该组合物防止已经使用醛系固定剂固定的组织样品中的伪像的任何浓度或浓度组合。例如，所述组合物的终溶液可以包含任何合适浓度的聚胺。在其中所述组合物包含一种或多种聚胺的一些实施方案中，所述组合物的终溶液中的一种或多种聚胺的浓度是约2重量％-约1×10-10重量％。在其他实施方案中，所述组合物的终溶液中的各聚胺的浓度是约1×10-4重量％-约1×10-8重量％。在其他实施方案中，所述组合物的终溶液中的各聚胺的浓度是约1×10-6重量％-约8.3×10-7重量％。例如，尽管防止伪像的组合物的终溶液可以包含不同浓度的不同聚胺，在一些情形中，所述终溶液包含终浓度为约3.3×10-7重量％的聚胺(例如，聚赖氨酸和聚精氨酸)。
在另一个实例中，防止伪像的组合物的终溶液可以包含任何合适浓度的形成席夫碱的化合物。在其中所述组合物包含一种或多种形成席夫碱的化合物的一些实施方案中，所述终溶液中的一种或多种形成席夫碱的化合物的浓度是约1×10-2重量％-约1×10-10重量％。在其他实施方案中，所述终溶液中各形成席夫碱的化合物的浓度是约1×10-4重量％-约1×10-8重量％。在其他实施方案中，所述终溶液中各形成席夫碱的化合物的浓度是约1×10-5重量％-约9.9×10-7重量％。在一些优选的实施方案中，形成席夫碱的化合物以约1×10-7重量％-约9.9×10-7重量％的浓度存在于所述终溶液中。尽管防止伪像的组合物的终溶液可以包含具有大致相同浓度的多种形成席夫碱的化合物，但是在一些情形中，所述组合物的终溶液包含浓度为约3×10-6重量％的一种形成席夫碱的化合物(例如，天冬氨酸)，浓度为约3×10-5重量％的另一种形成席夫碱的化合物(例如，甘氨酸)，和浓度为约3×10-7重量％的再一种形成席夫碱的化合物(例如，聚乙烯亚胺)。
所述组合物的终溶液可以以任何合适的方式制备，所述方式是为该溶液提供足够浓度的聚胺和/或形成席夫碱的化合物，从而防止与醛系固定剂相关的伪像。例如，防止伪像的组合物可以以终浓度或作为浓缩的储液来制备和分配，所述储液可以然后稀释形成终溶液。事实上，因为以低浓度防止伪像的组合物开始并然后增加浓度直至获得所需的结果是有益的，所以在一些实施方案中，浓缩的储液可以是优选的。在这样的实施方案中，所述储液可以具有任何合适浓度的醛反应性化合物。另外，多种醛反应性化合物的浓度可以逐个样品而变化，其取决于诸如组织厚度、组织类型、温度、处理时间期限等。
浓缩的储液可以以任何合适的方式添加至溶剂(例如，水、醇、组织染剂溶液等)，以形成所述组合物的终溶液。例如，储液可以借助于微量吸移管、滴管、量筒等添加至溶剂。然而，在一些实施方案中，将储液逐滴稀释至溶剂中可以是有益的。例如，当储液包含约0.02％聚赖氨酸，约0.02％聚精氨酸，约0.01％天冬酰胺，约0.1％甘氨酸，和约0.001％聚乙烯亚胺时，1滴(约40-约50微升)储液可以添加至约600微升溶剂。可以然后向溶剂中添加额外滴数的储液，直至在组织样品中获得所需的结果。例如，可以将2，3，4，5，或更多滴加入至600微升溶剂中。事实上，本领域中技术人员应该认识到组织类型、固定方法、组织染剂、组织厚度等在应用和实验室之间可以变化很大。
固定的组织样品可以使用防止伪像的组合物，在容许所述组合物防止伪像的任何时刻来处理。例如，在组织样品已经被固定后但在该样品被染色前，它可以与所述组合物接触。在另一个实例中，样品可以在该样品被固定后，与染剂和所述组合物接触。在该实例中，所述组合物可以在染色过程中的任何合适时刻与样品接触。例如，所述组合物可以与组织染剂合并形成可以与组织样品相接触的溶液。然而，在其他实例中，染剂可以与组织样品相接触并然后可以将所述组合物加入至样品周围的染剂溶液中。
事实上，在一些实施方案中，在染色过程中使用防止伪像的组合物处理样品是有益的。例如，一些组织染剂可以与醛系固定剂竞争组织中的结合位点，并由此，起防止伪像的作用。类似地，一些染剂可以逆转由醛系固定剂形成的亚甲基桥键，从而将固定剂释放至溶液中并增加与防止伪像的组合物中的聚胺和/或形成席夫碱的化合物结合或否则反应的固定剂的量。在一些实例中，在染色过程中添加防止伪像的组合物也可以通过修饰组织样品中结合位点起改善染色的作用。例如，防止伪像的组合物可以起修饰组蛋白尾部中的结合位点的作用，其可以增加与所述位点结合的染剂的量。
在其他实施方案中，在组织样品已经固定和染色后使组织样品和防止伪像的组合物相接触可能是有益的。在一个实例中，样品可以固定并使用第一染剂染色，随后与包含防止伪像的组合物的第二染剂溶液接触。例如，在样品已经固定并使用苏木精染剂染色后，该样品可以与包含防止伪像的组合物的伊红染剂溶液相接触。在另一个实例中，组织样品可以在该样品已经固定并染色后使用防止伪像的组合物来处理。例如，固定、染色并随后置于储藏器中的组织样品可以从储藏器中移出并然后使用防止伪像的组合物来处理，以减少、逆转、或否则防止组织中的伪像。
防止伪像的组合物可以与容许所述组合物防止已经使用醛系固定剂固定的组织样品中的伪像的任何组织染剂或任何数量的染剂一起使用。例如，所述组合物可以在使用简单染剂，包括但不仅限于苏木精和/或伊红染色的组织样品上使用。合适的简单染剂的一些另外的实例包括吖啶橙、俾斯麦棕、洋红、考马斯蓝、结晶紫、DAPI、溴化乙锭、品红、Hoechst染剂、红海葱(rodine)、孔雀石绿、甲基绿、亚甲基蓝、中性红、尼罗蓝、尼罗红、四氧化锇、罗丹明、safanin等。在另一个实例中，所述组合物可以在使用复杂染剂，诸如免疫过氧化物酶、碱性磷酸酶、和/或免疫荧光染色的样品上使用。例如，所述组合物可以在已经使用一种或多种荧光团，诸如绿色荧光蛋白染色的组织样品上使用。在这样的实例中，组织样品可以使用任何合适数量诸如2、5、10、20、30或更多个荧光团来染色。在另一个非限制性实例中，所述组合物可以用于防止已经在原位杂交过程中染色或使用考马斯蓝染色的组织样品中的伪像。
防止伪像的组合物可以以任何方式添加至固定的组织样品，所述方式是容许该组合物防止所述样品中的伪像。例如，固定的组织样品可以被防止伪像的组合物浸没，被防止伪像的组合物喷洒，用防止伪像的组合物漂洗，或否则与防止伪像的组合物接触。在一些实施方案中，在包含适当浓度的一种或多种醛反应性化合物和其他所需物质的组合物的终溶液中浸没样品是有益的。
在与组织样品接触后，防止伪像的组合物的终溶液可以保持与所述样品相接触持续足以防止与醛系固定剂相关的伪像的任意时间段。例如，样品可以保持与所述组合物相接触一段短至数秒或长至数日的时期。例如，所述组合物的终溶液可以保持与固定的组织样品相接触小于约25分钟。然而，在其他实例中，固定的组织可以与所述组合物的终溶液相接触约10秒-约5分钟的时间段。在其他实例中，组织样品可以保持与所述组合物相接触约2.5分钟-约3分钟。
一旦组织已经与防止伪像的组合物接触，来自所述组合物的聚胺和/或形成席夫碱的化合物可以通过本领域中已知的任何方法或技术从样品中除去。例如，组合物的聚胺和/或形成席夫碱的化合物以及任何反应的醛系固定剂可以通过冲洗样品，在一系列浴液中洗涤样品，等从组织样品中除去。以这样的方式，释放的醛系固定剂可以从组织样品中除去，从而防止释放的固定剂导致样品中增加伪像。
使用与已经释放至溶液中的醛系固定剂结合或否则反应的一种或多种聚胺和/或形成席夫碱的化合物可以提供若干优势。例如，使用所述的防止伪像的组合物处理固定的样品可以起容许更多染剂结合组织样品中的极性氨基酸和类似残基的作用。因此，防止伪像的组合物可以改善组织染色并增加染色强度。类似地，使用所述组合物的处理可以减少组织样品中醛系固定剂色素的量。所述组合物还可以起恢复使用醛系固定剂固定的组织的免疫反应性的作用并，由此，增加以免疫组化法染色组织的能力。另外，所述组合物可以起捕获醛系固定剂的作用，所述醛系固定剂已经通过与染剂诸如苏木精的延长时间暴露而释放至溶液中。因此，所述组合物可以防止另外的伪像的形成。而且，防止伪像的组合物可以使细胞和细胞结构恢复至它们固定前的尺寸和形状。以这样的方式，所述组合物可以改善组织形态学和染色特征。
另外，混合防止伪像的组合物和组织染剂(例如，苏木精，伊红，等)可以提供若干优势。在与混合所述组合物和组织染剂相关的出人意料的优势的一个实例中，所述组合物可以起增加组织染剂的有效保存期的作用。例如，其中无防止伪像的组合物的染剂溶液在其开始沉淀或否则失去其反应性之前，仅可以在室温和无细菌污染的条件下下维持几天(例如，一周)。具有防止伪像的组合物的相同组织染剂溶液可以维持2、3、4、5、6、7、8或更多倍更长的时间而不发生沉淀且不过度降低反应性。在一个非限制性实例中，在无防止伪像的组合物的染剂溶液的有效保存期为约7天的情况下，组织染剂的保存期可以增加选自约6-约8周的一段时期。该延长的保存期可以通过在所述组合物的效力耗尽时，添加防止伪像的组合物1次，或2、3、4或更多次来实现。当然，由防止伪像的组合物增加的组织染剂的保存期的倍数可以根据许多因素，诸如所用的染剂、组织厚度、组织类型、固定方法、防止伪像的组合物的浓度、组合物加入至染剂的次数等而变化。
实施例
关于本公开内容提供的附图包括三种不同类型的固定的和染色的人组织样品的比较图像。具体地，图1和2包含人骨髓组织的图像，图3和4包含人输卵管组织的图像，且图5和6包含人子宫内膜组织的图像。在各附图中，样品利用类似的固定剂介质和技术制备。例如，在图1-6中，组织样品使用固定试剂，即约5％福尔马林来固定。而且，图1-6中的样品分别使用类似的方法和组合物来染色。例如，图1-6中的样品分别使用靶向组蛋白末端尾部(细胞核中)的苏木精和靶向蛋白(细胞质中)的伊红来染色。另外，每幅照片均使用光学显微镜，以1250X放大倍数拍摄。
尽管图1-6中的样品以实质上相同的方式固定和染色，但是仅一半样品使用防止伪像的组合物处理。具体地，图2、4和6中的样品使用防止伪像的组合物处理，而图1、3、5中的样品没有。为了更好地说明防止伪像的组合物的效力，没有使用防止伪像的组合物处理的多种组织样品，或未处理样品，与相应的处理的组织样品，或使用该组合物处理的组织样品进行比较。
在一个比较实施例中，图1和2图示图1中的未处理的骨髓组织样品100具有若干伪像，这些伪像在图2所示的处理的样品200中减少或不存在。例如，图1的样品中的细胞核102的边界(boarder)趋向于模糊和轮廓不分明，而图2的样品中的细胞核202趋向于清楚和轮廓分明。而且，在图2中，核仁204与图1中的核仁104相比似乎轮廓更分明和更明显。
另外，图1中的细胞质106似乎具有空泡伪像，其中细胞质106中充满小泡，这使细胞质106呈现大理石状的外观并使其轮廓不分明。相反，图2中的细胞质206似乎无任何明显的细胞质空泡化。因此，图2中的细胞质206似乎是平滑的并与图1中的细胞质边界108相比似乎具有轮廓更分明的细胞质边界208。
在另一个比较实施例中，图3和4显示图3中未处理的输卵管组织样品300具有若干伪像，这些伪像在图4中处理的输卵管组织样品400中减少或不存在。例如，图3和4的样品300和400的比较显示图4中处理的样品400中的纤毛402与图3中未处理的样品300中的纤毛302相比似乎轮廓更分明。类似地，图4中通过细胞膜406的纤毛锚(anchoring)404与图3中的纤毛锚304相比似乎更明显和轮廓分明。另外，图4的处理的样品400中的细胞质408和细胞核410与图3中未处理的样品的细胞质308和细胞核310相比似乎更清楚和轮廓更分明。
在最后的比较实施例中，图5和6图示图5中未处理的子宫内膜组织样品500具有若干伪像，这些伪像在图6中处理的子宫内膜组织样品600中减少或不存在。例如，图5中的基质细胞502和子宫内膜管状腺细胞504与图6中的基质细胞602和子宫内膜管状腺细胞604相比似乎更加显著地靠在一起。类似地，处理的样品600(图6)中的细胞核606和细胞质608与图5的未处理样品500中的细胞核506和细胞质508相比似乎更轮廓分明，并包括图5的未处理样品500中的细胞核506和细胞质508中不存在的细微特征。
简言之，图1、3、和5中的未处理的样品和图2、4、和6中的处理的样品的比较显示在图2、4、和6中向样品加入防止伪像的组合物可以极大地减少固定的和染色的组织样品中的伪像。
本方法和组合物可以具体表现为其他特定形式，而不偏离如在本文中广泛所述和下面要求保护的其结构、方法、或其他基本特征。所述的实施例和实施方案在所有方面仅被认为是举例说明性的而非限制性的。本发明的范围因此通过所附的权利要求而非通过前述说明来指定。在权利要求的含义和等价范围内的所有变化包括在权利要求的范围内。

Claims (24)

1.一种用于防止使用醛系固定剂固定的组织样品中的固定剂伪像的方法，所述方法包括：
获得使用醛系固定试剂固定的组织样品；
使所述组织样品与防止伪像的组合物相接触，所述防止伪像的组合物与游离醛系固定试剂反应，从而防止伪像形成；和
使所述组织样品与组织染剂相接触。
2.根据权利要求1的方法，其中所述防止伪像的组合物包含聚胺。
3.根据权利要求2的方法，其中所述防止伪像的组合物包含形成席夫碱的化合物。
4.根据权利要求2的方法，其中所述聚胺选自包含精氨酸、聚精氨酸、赖氨酸、聚赖氨酸、腐胺、聚乙烯胺、色氨酸、聚色氨酸、尸胺、亚精胺、精胺、及其组合的聚合物。
5.根据权利要求3的方法，其中所述形成席夫碱的化合物选自甘氨酸；精氨酸；天冬氨酸；包含甘氨酸、精氨酸、或天冬氨酸的肽；聚乙烯亚胺；及其组合。
6.根据权利要求1的方法，其中所述醛系固定试剂包含甲醛。
7.根据权利要求2的方法，其中所述聚胺与处于选自以下的浓度的组织样品相接触：
a.约1×10-2％-约1×10-10重量％；
b.约1×10-4％-约1×10-8重量％；
c.约1×10-6％-约8.3×10-7重量％；
d.约3.3×10-7重量％。
8.根据权利要求3的方法，其中所述形成席夫碱的化合物存在于处于选自以下的浓度的终溶液中：
a.约1×10-2％-约1×10-10重量％；
b.约1×10-4％-约1×10-8重量％；
c.约1×10-5％-约9×10-7重量％；和
d.约1×10-7％-约9.9×10-7重量％。
9.根据权利要求1的方法，其中所述组织染剂选自简单的组织染剂或复杂的组织染剂。
10.根据权利要求9的方法，其中所述组织染剂选自免疫过氧化物酶、荧光团、苏木精、伊红、及其组合。
11.根据权利要求1的方法，其中所述组织染剂和所述防止伪像的组合物在接触所述组织样品之前合并在一起。
12.一种防止伪像的组合物，其防止使用醛系固定剂固定的组织样品中的伪像，所述组合物包含终浓度为约1×10-2重量％-约1×10-10重量％的聚胺。
13.根据权利要求12的组合物，还包含形成席夫碱的化合物。
14.根据权利要求12的组合物，其中所述聚胺选自包含精氨酸、聚精氨酸、赖氨酸、聚赖氨酸、腐胺、聚乙烯胺、色氨酸、聚色氨酸、尸胺、亚精胺、精胺、及其组合的聚合物。
15.根据权利要求12的组合物，其中所述防止伪像的组合物还包含组织染剂。
16.根据权利要求13的组合物，其中所述形成席夫碱的化合物选自甘氨酸；精氨酸；天冬氨酸；聚乙烯亚胺；包含甘氨酸、精氨酸、或天冬氨酸的肽；聚乙烯亚胺；及其组合。
17.根据权利要求16的组合物，其中所述形成席夫碱的化合物包含甘氨酸。
18.根据权利要求12的组合物，其中所述组合物的终溶液包含处于选自以下的终浓度的聚胺：
a.约1×10-4％-约1×10-8重量％；
b.约1×10-6％-约8.3×10-7重量％；和
c.约3.3×10-7重量％。
19.根据权利要求13的组合物，其中所述组合物的终溶液包含处于选自以下的终浓度的形成席夫碱的化合物：
a.约1×10-2％-约1×10-10重量％；
b.约1×10-4％-约1×10-8重量％；
c.约1×10-5％-约9×10-7重量％；和
d.约1×10-7％-约9.9×10-7重量％。
20.一种增加组织染剂的有效保存期的方法，所述方法包括：
提供组织染剂；和
将包含聚胺的防止伪像的组合物加入至所述组织染剂。
21.根据权利要求20的方法，其中所述防止伪像的组合物还包含形成席夫碱的化合物。
22.根据权利要求20的方法，其中所述组织染剂选自免疫过氧化物酶、荧光团、苏木精、伊红、及其组合。
23.根据权利要求20的方法，其中所述聚胺选自包含精氨酸、聚精氨酸、赖氨酸、聚赖氨酸、腐胺、聚乙烯胺、色氨酸、聚色氨酸、尸胺、亚精胺、精胺、及其组合的聚合物。
24.根据权利要求21的方法，其中所述形成席夫碱的化合物选自甘氨酸；精氨酸；天冬氨酸；聚乙烯亚胺；包含甘氨酸、精氨酸、或天冬氨酸的肽；聚乙烯亚胺；及其组合。
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