CN102183607A - 用于校正检测器间频带增宽效应的方法 - Google Patents

Abstract

色谱分离经常由多个检测器表征，样品连续流经所述检测器。当所述样品在几个检测器间流动时，它由于混合和扩散而逐步稀释。这种现象被传统地称为检测器间的“频带增宽”，经常导致例如摩尔质量的计算所得物理物理性质的显著畸变。本公开描述一种表征目前在色谱系统中所述增宽的方法以及一种算法，凭借该算法，上行检测器的窄波峰从数值上增宽，以使它们可与下行检测器的增宽波峰相比较。虽然所述技术导致分辨率的一些损失，但其稳定性和通用性允许其广泛应用。示例包含随MALS检测器的RI检测器增宽的较正、随UV检测的MALS增宽的较正、随MALS和RI检测的粘度增宽的较正以及其中的所有渗透。

Description

用于校正检测器间频带增宽效应的方法

本申请是2004年8月6日提交的名称为：“用于校正检测器间频带增宽效应的方法”的中国专利申请2004100626736的分案申请。

技术领域

本发明涉及用于校正频带增宽效应的方法，尤其涉及用于校正检测器间频带增宽效应的方法。

背景技术

用液相色谱技术对溶液中的大分子物质进行分析，通常是通过在适当的溶剂中制备样品，然后将它的小等份注射进入色谱仪来完成的。该色谱仪包括各种类型的分级器件，它们在样品经过它们时将其分离。一旦通过这些通常是基于尺寸、质量或柱亲和力的方法将样品分离后，便用光散射、折光指数、紫外线(UV)、粘度响应等方法对其进行分析。例如，为了确定通过尺寸排阻色谱柱进行分离的特定样品的质量和尺寸分布，色谱仪将先后用多角度光散射MALS和差动式折射计(differential refractometer)dRI测量样品。dRI确定浓度，而MALS仪器测定超瑞利比(excess Rayleigh ratio)，将它作为每个洗脱级分的角度函数。对于比入射光波长小得多的分子，通常在一个单一的角度上进行光散射测量就足够了。

当各个级分经过检测器时，便产生了通常称之为“频带(band)”或者“波峰(peak)”的信号。由于扩散和混合效应，样品每次穿过不同的器件时，这些频带便会增宽一些。考虑由单分散性蛋白的低浓度等分样品。在这种情况下，瑞利逾量比与摩尔质量和浓度成正比。光散射信号和浓度信号应该具有相同的形状，并且当这两种响应被归一化而具有相等面积时，它们将完全重叠。然而，当样品从MALS检测器经过而进入dRI检测器时，它要经过中间区域和连接部位，这会导致样品的扩散和混合。由John Wiley & Sons于1979年出版的Yau等人所著的《Modern size exclusion liquid chromatography》一书中详细讨论了频带增宽的许多因素和一些与其有关的补救措施。在上述例子中，dRI信号与MALS信号相比，总是显得略宽。

图1清楚地显示了增宽效应，该图表示了水缓冲液中的牛血清蛋白BSA样品的色谱图以及未校准增宽效应的计算出的摩尔质量。迹线1示出没有校准的摩尔质量。该摩尔质量是用除以单体的摩尔质量M_w0后的结果表示，因此对于单体，纵轴上的读数为1，二聚体的读数为2，等等。迹线2反映作为时间函数的90°光散射信号。迹线3反映dRI信号。聚集状态已经被分级，于是，最右边从16分钟到18分钟的波峰区域是来自纯单体的数据，从14分钟到16分钟的波峰区域来自二聚体，等等。在每个波峰中，增宽导致波峰中心处的浓度降低，而在“两翼”处的浓度增高。将此变宽的dRI信号和MALS信号结合起来确定各个洗脱时间处的摩尔质量，导致了在波峰中心附近确定的摩尔质量被系统地高估，而两翼处的却被低估。当浓度检测器在MALS检测器上游时，情况就反过来。假如没有频带增宽，数据将由一系列平台组成，对于单体来说是1，对于二聚体来说是2，等等。当被分级的样品变成更加多分散性时，频带增宽效应变得不那么明显(但是仍然存在)。对于被恰当地分级的具有离散的聚集状态的样品，该问题是明显的。在图1中，单体的波峰被很好地分辨出来，所以增宽问题是最清楚的。聚集体逐渐变得不能很好地分辨出来，所以它们显现出该问题的程度就轻些。

人们采用了各种方法来补偿这些变形。大多数方法都是基于L.H.Tung在其1969年的论文中介绍的成果，该论文发表在《the Journal of Applied Polymer Science》，第13卷，第775等页。在前面提到的Yau等人的著作讨论了一些校正频带增宽的方法。在整个色谱技术文献中，许多论文都提出了实施这些校正的方法，即，将变宽的频带恢复到假如没有增宽因素时它所具有的形状。这些技术中的大多数在数值上是不稳定的，可能导致实质上不合理的结果，例如负的浓度，或者负的散射强度，因此很少被使用。通过MALS测量得到的蛋白质特征表现为一个相当重要的面积，然而即便在这里，由于存在与实施相关的困难，因此很少见到对频带增宽进行校正。

频带增宽效应出现在液相色谱的各种多检测器操作中。例如，如果要使用在线粘度计测量样品以获得它的特性粘度，那么也需要使用dRI。当样品从dRI移动到粘度计时，便会出现频带增宽，这导致比粘度曲线相对于由dRI测量获得的浓度曲线出现扩展。另外，在将变宽的信号恢复为符合在没有增宽的情况下它所具有的信号时，所存在的计算上的困难常常导致有问题的结果，特别是当样品确实是单分散性的，例如非聚集的蛋白质时。

发明内容

本发明的目的是提供一种分析方法，通过该方法可以用软件既容易又精确地校正频带增宽效应。本发明的另一个目标是为这些校正提供一种新的方法，该方法与传统方法的不同之处使其明显区别于传统方法。认为本发明用于分析蛋白质样品的分离最为有效。该应用的一个结果将是更精确地表征蛋白质缀合物及其聚集态。本发明的进一步应用在于它能够改进特性粘度测量值的确定方法，这是通过校正样品在经过浓度检测器和粘度计之间时发生的频带增宽效应来实现的。本发明的一个重要应用是它可以用于快速测定不分级样品的第二维里系数，例如在美国专利第6,411,383号中以及Trainoff和Wyatt于2002年7月24日提交的、现在正处于公布阶段的美国专利申请第10/205,637号中所讨论的样品。该方法的成功实施关键取决于能够准确地确定每个洗脱体积处浓度的平方。这要求对每个洗脱体积处的浓度进行准确测量。后面的测定一般是在不分级样品上进行的，该不分级样品的检测器响应是一个单峰，它的质量组成在所选择的每个时间间隔都是相同的。当它从一连串检测器经过时，这个单峰变宽，如果不对增宽效应进行校正，则在获得的结果中出现了系统误差。

本发明包括一种对在液相色谱仪的检测器之间出现的频带增宽效应进行校正的方法。该方法扩宽第一检测器的频带使其与第二检测器处变宽了的频带相一致，而不是将在第二检测器处的频带恢复为第一检测器处的形式来校正第二检测器处所产生的频带增宽。由此获得一种更简单、更适用和更易实施的方法来校正所有检测器处的频带增宽效应。尽管这种方法在波峰部分重叠时会导致波峰的分离度下降，但是大多数应用领域都是针对具有被很好地被分离和分辨的波峰的单分散性样品。本发明还可应用于任何数目的串连的检测器。

还应说明，本发明所披露的方法特别与本发明的受让人和发明人的多个专利和专利申请相关，这些专利和专利申请包括：

Steven P.Trainoff和Philip J.Wyatt于2003年11月18日发布的美国专利申请第6,651,009号“Method for determining average solution properties of macromolecules by the injection method”。

Philip J.Wyatt于2002年6月25日获得授权的美国专利第6,411,383，25号“Method for measuring the 2^nd virial coefficient”。

Steven P.Trainoff于2001年1月30日获得授权的美国专利第6,180,906号“Electrode design for electrical field flow fractionation”。

Steven P.Trainoff等人于2000年10月3日获得授权的美国专利第6,128,080号“Extended range interferometric refractometer”。

Gary R Janik等人于1999年5月4日获得授权的美国专利第5,900,152号“Apparatus to reduce inhomogeneities in optical flow cells”。

Gary R Janik等人于1997年10月14日获得授权的美国专利第5,676,830号“Method and apparatus for reducing band broadening in chromato graphic detectors”。

Philip J.Wyatt等人于1996年6月25日获得授权的美国专利第5,530,540号“Light scattering measurement cell very small volumns”。

David W.Shortt于1996年6月18日获得授权的美国专利第5,528,366号“Precision determination for molecularweights”。

Philip J.Wyatt于1994年4月19日获得授权的美国专利第5,305,071号“Differential refractometer”。

附图说明

图1显示了BSA样品摩尔质量的未经校正的曲线，dRI检测器在MALS检测器下游。

图2显示了对注射量为5μl，溶于甲苯的200kD聚苯乙烯的90°光散射迹线进行拟合的混杂增宽模型。

图3显示了用本发明的方法校正的图1的数据。

图4显示了BSA样品的特性粘度对洗脱体积的未经校正的曲线，dRI检测器在粘度计下游。

图5显示了用本发明的方法校正的图4的数据。迹线11是校正后的特性粘度。

图6显示了BSA样品摩尔质量的未经校正的曲线，其中紫外检测器在MALS下游。

图7显示了用本发明的方法校正的图6的数据。

具体实施方式

溶液中的分子通常是用它们的重均摩尔质量M_w、它们的均方半径<r_g ²>和第二维里系数A₂来表征。后者是分子与溶剂之间的相互作用的量度。对于不分级的溶液，这些性质可以通过测量它们的光散射行为来确定，其中可以使用Bruno Zimm于1948年发表在《the Journal of Chemical Physics》，第16卷，第1093至1099页的开创性论文中描述的方法。最近，在由Trainoff和Wyatt的美国专利申请第6,651,009号中讨论的方法代表着一种将取代更传统的Zimm方法的先进技术。

在某个角度和浓度范围内测量来自小体积溶液的散射光。由光散射测量得到的性质的关系符合Zimm的下列公式：

R(θ)＝K^≠M_wcP(θ)[1-2A₂M_wcP(θ)]+O(c³)    (1)

其中，R(θ)是在(θ)方向上测到的每单位立体角的超瑞利比，定义为R(θ)＝[I_s(θ)-I_solv(θ)]r²/I₀V；I_s(θ)是每单位立体角的由溶液散射的光强度；I_solv(θ)是每单位立体角的由溶剂散射的光强度；I₀是入射光强度；r是该散射体积到检测器的距离；V是由检测器看到的被照射的体积；P(θ)是发生散射的分子的形状因子，定义为

其中N_a是阿伏加德罗常数，dn/dc是折光指数增量，n₀是溶剂折光指数，c是浓度，λ₀是入射光在真空中的波长。设定入射的准直光束相对于含有光散射检测器的平面为垂直偏振。形状因子与均方半径<r_g ²>的关系满足

$P\left(\mathrm{\&theta;}\right)=1-\frac{16{\mathrm{\&pi;}}^2{n}_0^2}{{3\mathrm{\&lambda;}}_0^2}<r_g^2>{\sin }^2(\mathrm{\&theta;}/2)+O({\sin }^4\left(\mathrm{\&theta;}\right)/2)---\left(2\right)$

多角度光散射仪测量来自流体样品的散射光的量，它是角度和时间的函数。对于小到可以与入射光的波长相比较的分子来说，光散射测量可以限制在一个单一的散射角，例如90°，原因在于测量不到散射光强度随角度的变化，但是，在这种限度内，可以测量摩尔质量却不能测量均方半径。

当该仪器被用来分析一个分离系统例如尺寸排阻色谱仪SEC的洗脱物时，样品的组成和浓度随时间变化。进一步地，SEC柱通常稀释该样品的浓度，以致于等式(1)的右边的第二和第三项与第一项相比可以忽略。这种情况在形式上表示为

2A₂cM_w＜＜1         (3)

对于与光散射仪器联合使用的色谱分离来说，通常设定上述条件，除非从先前的实验已经知道A₂，在这种情况下该数值可以在式1中直接使用。另外，如果恰当地实施了分离，在每一个时间点该样品的大小基本上是单分散性的，其质量通常也是单分散性的。如果该样品在质量上也是单分散性的，我们可以进一步简化得到

R(θ，t)＝K^≠Mc(t)P(θ，t)     (4)

所以，光散射信号应该与浓度信号成正比，摩尔质量可以通过下述比例式计算：

$M=\frac{1}{K^{\&NotEqual;}c\left(t\right)}\underset{\mathrm{\&theta;}\&RightArrow;0}{\lim }R(\mathrm{\&theta;},t)---\left(5\right)$

对于一个MALS系统的正确操作而言，一种普通的实验是注射近单分散性的样品使其通过分离柱，然后测量光散射和浓度信号，得到单分散性的波峰。假如进行归一化，则它们就应该在所有的洗脱时间都精确地重叠，与等式(5)表达的常数对应。然而，如果浓度检测器在MALS检测器的下游，两种效应将会改变波峰的形状：混合和扩散。在这种情况下，波峰会变宽；波峰的中心变低，而“两翼”增高。所以，当计算式(5)中的比值时，不会得到常数，从波峰附近得到的摩尔质量将被系统地高估，而在两翼附近得到的摩尔质量将被低估。当浓度检测器在MALS检测器上游时，情况相反。

应该指出，未经分级而注射进入色谱仪的样品，常常被描述为流式注射，在它们从一个检测器到达另一个检测器的过程中，也发生带的增宽。尽管期望每个连续的洗脱体积的摩尔质量分布都保持固定，但是频带增宽效应会影响从在所选择的检测器处发生增宽的下游获得的各种重均性质。所以，当被注射的样品经过，例如，光散射检测器和dRI浓度检测器之间时，具有多分散性摩尔质量分布的样品波峰将会变宽。当未分级的光散射信号与变宽的浓度检测器信号结合时，在波峰的中心附近获得的重均摩尔质量的计算结果将偏大，而在两翼获得的对应数值将偏小。这个结果和在分级样品中看到的结果是完全一样的。

样品的混合主要取决于系统的几何性质：管的长度和直径、连接器的数目、表面的粗糙程度和机械缺陷导致的夹杂物的数目，以及测量池的几何性质。混合效应在一定限度内基本上与样品的组成无关，在该限度内，体流体性质例如粘度不随样品而发生明显的变化。相反，扩散明显地取决于样品的性质。

估计样品在两个检测器之间流动时扩散和混合的相对重要性是具有指导意义的。对于均一的球体，Stokes-Einstein关系式

$D_T=\frac{k_{B}T}{\mathrm{c\&pi;\&eta;r}}---\left(6\right)$

将扩散常数D_T和球体半径r联系在一起，其中k_B是波耳兹曼常数，T是绝对温度，η是溶剂粘度。

存在许多导致混合的因素，但是，为了估计范围，考虑被充分混合的储水器的简单模型。假定光散射流动池是一个体积为V的混合室。用f表示流速，并假定进入该室的样品的浓度为c_i(t)。从流动室流出的样品的浓度用下式给出

c′(t)＝[c_i(t)-c(t)]/t_f        (7)

其中t_f＝V/f，是充满该储水器的时间。考虑到窄脉冲效应，在该脉冲中有质量为m₀的样品进入流动池，结果即有c_i(t)＝m₀δ(t)。从该池流出的样品的浓度则是

$c\left(t\right)=\frac{m_0}{t_f}\exp (-t/t_f)\mathrm{\&theta;}\left(t\right)---\left(8\right)$

其中，当t＜0时，θ(t)＝0；t≥0时，θ(t)＝1。结合上下文来看，假定流动池的体积V＝80μl，该池的进样流速f＝1.0ml/min。增宽的指数时间常数t_f＝4.8sec。假如流体通过内直径为0.25mm的毛细管流入和流出混合室，最初的局部浓度脉冲要在管长超过1.6m以上才会逐渐消失。当然，当样品流经光散射池时，它并没有“充分混合”，但是这仍然能够恰当地估计混合的长度范围。

接着，考虑小分子的扩散效应。平均来说，分子将扩散一定距离

$<x>=\sqrt{2D_{T}t}---\left(9\right)$

其中，D_T是分子的平移扩散常数，而t是时间。结合上下文，考虑蛋白质牛血清蛋白，BSA，它的扩散常数为7.7×10^-7cm²/sec。浓度峰信号在4.8sec内能扩散多远呢？等式(9)指出，它将沿着管子扩散仅仅27μm！所以，可得出结论，根本性的主要混合机理是非扩散性的，因此它不依赖于分子的扩散常数及其大小。检测器间增宽的主要机理是混合，而与样品无关。所以，如果能用一种参照样品来表征系统的几何增宽，由此获得的增宽参数就能用来校正所有后续数据处理。

考虑检测器间增宽的一种简单线性模型。出于讨论的目的，假定浓度检测器位于MALS检测器的下游。而且，假定满足等式(3)，并已经收集到一种单分散性的参照样品的数据。所以，被测量的浓度是以在MALS检测器中的浓度作为基础，通过使用用参数表示的增宽函数B(α₀，α₁，...，α_l，τ)进行卷积积分获得。可以得到

$c^m\left(t\right)=\underset{-\&infin;}{\overset{\&infin;}{\&Integral;}}c(t-\mathrm{\&tau;})B({\mathrm{\&alpha;}}_0,{\mathrm{\&alpha;}}_1,\&CenterDot;\&CenterDot;\&CenterDot;{,\mathrm{\&alpha;}}_l,\mathrm{\&tau;})\mathrm{d\&tau;},---\left(10\right)$

其中，c^m(t)是发生增宽后在下游检测器处测量到的浓度，c(t)是样品通过光散射检测器时它的浓度。参数α_l则视具体模型而定，包括增宽函数的宽度和检测器间的滞留体积。增宽校正的目标是找到这些参数的最佳拟合值。根据式(5)，可以得到

$c^m\left(t\right)=\frac{1}{K^{\&NotEqual;}M}\underset{-\&infin;}{\overset{\&infin;}{\&Integral;}}R(0,t-\mathrm{\&tau;})B({\mathrm{\&alpha;}}_0,{\mathrm{\&alpha;}}_1,\&CenterDot;\&CenterDot;\&CenterDot;,{\mathrm{\&alpha;}}_l,\mathrm{\&tau;})\mathrm{d\&tau;}---\left(11\right)$

其中

这里，已经利用了这个事实：波峰是单分散性的，以致于在该波峰的范围内摩尔质量M不变，可挪到积分之外。为了确定最佳的拟合参数，计算在下游测到的浓度信号c^m(t)和被增宽的上游光散射信号之间的χ²差，并在整个单分散性样品的波峰内对其积分

$\mathrm{\&chi;}{({\mathrm{\&alpha;}}_0,{\mathrm{\&alpha;}}_1,\&CenterDot;\&CenterDot;\&CenterDot;,{\mathrm{\&alpha;}}_l,\mathrm{\&tau;})}^2=\underset{\mathrm{peak}}{\&Integral;}{(c^m\left(t\right)-\frac{1}{K^{*}M}\underset{-\&infin;}{\overset{\&infin;}{\&Integral;}}R(0,t-\mathrm{\&tau;})B({\mathrm{\&alpha;}}_0,{\mathrm{\&alpha;}}_1,\&CenterDot;\&CenterDot;\&CenterDot;,{\mathrm{\&alpha;}}_l,\mathrm{\&tau;})\mathrm{d\&tau;})}^2\mathrm{dt}---\left(12\right)$

然后可以用标准的非线性最小二乘方拟合程序包来寻找使χ²最小化的最佳拟合参数K^≠M和α_i。将这些最佳的参数表示为α_i′。

在实践中，可以在上述拟合中引入其他系统特定的参数。例如，在等式(12)中的超瑞利比被定义为带有样品的溶剂的瑞利比与纯溶剂的瑞利比之间的差值。纯溶剂的瑞利比可以作为可调整的拟合参数被引入，由此取代通过设定溶剂基线来手工地确定它。类似地，假如浓度检测器有一个缓慢的漂移，那么该漂移的偏移量和斜率同样可以引入该拟合中。重要的是，要注意到基本的一点是，在整个波峰范围内摩尔质量是固定的，所以，等式(12)中的内部积分

只含有被测到的瑞利比和增宽函数。假如质量不是固定的，就不可能唯一地确定最佳拟合参数α_i′。

一旦确定了最佳拟合参数，在随后的分析中有两种方法可以使用。可以试图通过对式(10)进行去卷积积分来“变窄”浓度测量，并且由此试图回答这样的问题：假如浓度检测器与光散射检测器一致，那么该浓度检测器测量到的是多少？作为选择，可以人工地增宽光散射结果，从而回答概念上的问题：假如光散射在下游与浓度检测器一致地进行，光散射的结果会是什么？我们将证明前一种方法，即构成传统途径的方法，在数值上是不稳定的，常常给出不合理的结果，而后一种方法在数值上是稳定的，但是要以降低测量的分离度作为代价。既然增宽通常是一种小的校正，那么分离度的损失是次要的，后一种方法是优选的。

考虑传统的去卷积积分的方法。可以通过作傅立叶变换，由已知的c^m(t)重新构建c(t)

$c\left(t\right)=\frac{1}{\sqrt{2\mathrm{\&pi;}}}\underset{-\&infin;}{\overset{\&infin;}{\&Integral;}}{e}^{\mathrm{i\&omega;t}}\frac{{\tilde{c}}^m\left(\mathrm{\&omega;}\right)}{\tilde{B}({{\mathrm{\&alpha;}}_1}^{\&prime;},\&CenterDot;\&CenterDot;\&CenterDot;,{{\mathrm{\&alpha;}}_l}^{\&prime;},\mathrm{\&omega;})}\mathrm{d\&omega;},---\left(13\right)$

其中， ${\tilde{c}}^m\left(\mathrm{\&omega;}\right)=\frac{1}{\sqrt{2\mathrm{\&pi;}}}\underset{-\&infin;}{\overset{\&infin;}{\&Integral;}}{e}^{\mathrm{i\&omega;t}}{c}^m\left(t\right)\mathrm{dt}---\left(14\right)$

是被测量的浓度的傅立叶变换，

类似地是用上面发现的拟合参数评估的增宽核函的傅立叶变换。然后可以用式(5)计算作为时间函数的摩尔质量。这个步骤的问题在于计算比值

当ω→±∞时，

和

都趋向于零。所以，比值趋向于0/0，它是不定的。因为

含有实验噪音，对于大的ω，比值将有更大的波动。所以，当使用式(13)计算c(t)时，结果会含有更高频噪音和不合理的“震荡效应(ringing)”，包括负的浓度。噪音可以被滤去，不合理的震荡效应却不能被滤去。

第二种方法，即是本发明的主题，是增宽光散射波峰。

表示为：

$M\left(t\right)=\frac{1}{K^{\&NotEqual;}{c}^m\left(t\right)}\underset{\mathrm{\&theta;}\&RightArrow;0}{\lim }\underset{-\&infin;}{\overset{\&infin;}{\&Integral;}}R(\mathrm{\&theta;},t-\mathrm{\&tau;})B({{\mathrm{\&alpha;}}_1}^{\&prime;},\&CenterDot;\&CenterDot;\&CenterDot;,{{\mathrm{\&alpha;}}_l}^{\&prime;},\mathrm{\&tau;})\mathrm{d\&tau;},---\left(15\right)$

这构成了作为时间函数的摩尔质量的测量，它对检测器间的增宽作了校正。注意，等式(15)的右边只含有可被测量的量和用前面确定的参数估算的增宽函数。

增宽函数的模型

上面描述的算法允许人们针对检测器间频带增宽效应校正光散射的结果，只要给出了参数化增宽核函模型。然而，为了应用该算法，必须选择要使用的模型。在这一部分，我们将描述一种具体的模型，它对于由美国加利福尼亚州Santa Barbara的怀雅特技术公司所构建的DAWN仪器的MALS硬件来说工作良好。然而，重要的是，要注意到该算法同样适用于任何确定的模型。

在怀雅特技术公司的Wyatt MALS仪器中使用的光散射池是一个直径为1.25mm的圆筒，它通过直径为0.1mm的毛细管以90度进样，通过直径为0.2mm的毛细管排出液体。典型的流速是1ml/min的数量级。可以通过计算雷诺数(Reynolds number)来确定流动是层流还是紊流，雷诺数

其中

是平均流动速率，d是系统的表征尺寸，v是样品粘度。对于在入口毛细管中的流动，

d＝0.1mm，v＝0.89cm²/sec，由此Re＝14。流体流动直到雷诺数达到几百时才会变得不稳定。因此，可断定在入口毛细管中的流动是层流。接着，考虑流体进入流动池时它的喷射。流动速率不变，但是表征尺寸增加到d＝1.25mm。所以，雷诺数增加到Re＝178。由此，可推断在该池的进入口附近有一些紊流混合，其混合体积为该池体积的一小部分。同样地，在浓度检测器流动池的进入口处有一些混合。

还存在着一些仪器增宽，这是由于系统测量有限体积的流体，以及测量系统有某一固有的过滤时间常数。所以，我们将要考虑的模型是指数增宽与高斯项的卷积，前者代表在流动池中的混合，后者代表仪器的增宽。增宽核函的模型是

$B(\mathrm{\&delta;},w,\mathrm{\&tau;})=\frac{1}{\mathrm{\&delta;}\sqrt{2\mathrm{\&pi;}}}{e}^{-r^2/{2\mathrm{\&delta;}}^2}\&CircleTimes;\frac{1}{w}{e}^{-\mathrm{\&tau;}/w}\mathrm{\&theta;}\left(\mathrm{\&tau;}\right),---\left(16\right)$

其中，δ是仪器的高斯宽度，w是由在池子的进入口处的混合产生的增宽，卷积被定义为

$a\left(t\right)\&CirclePlus;b\left(t\right)\&equiv;\underset{-\&infin;}{\overset{\&infin;}{\&Integral;}}a(t-t^{\&prime;})b\left(t^{\&prime;}\right){\mathrm{dt}}^{\&prime;}---\left(17\right)$

为了测试该模型是否恰当，可进行了下面的试验。用溶于甲苯的200kD聚苯乙烯填充5μm的注射环，并将它直接注射到光散射流动池。流动速率是0.5ml/min，样品的收集间隔是0.25sec。将数据建模成δ函数与增宽模型的卷积，该δ函数代表注射环。为了将其与90°光散射信号比较，计算χ²为

其中，t₀是样品从注射器流到流动池所需的时间，而a是将无量纲的单位转换为瑞利比的标度因子。有四个拟合参数：a、t₀、σ和w。

图2显示了拟合的结果。光散射数据点4被归一化，所以波峰具有单位振幅。增宽函数的拟合结果是5。这仅仅包括在注射环和进行测量的流动池中心之间发生的增宽。明显地，增宽函数很好地对数据进行了拟合。这个增宽模型将在下面描述的示例中被使用。

将所述方法应用于任意串列的检测器

在这一部分，将针对两个或更多个串连连接的任意的检测器，对该方法进行推广。定义在样品顺次流经D₁，到D₂，...，到D_n时检测器的响应为D_i(t)。一般来说，在样品穿过该系统洗脱时，样品波峰逐渐地变宽。对数据(D₁(t)，D₂(t)，...，D_n(t))所作的任何分析都要考虑到这种逐渐的变宽。如前所述，变宽上游的检测器使其与具有最宽响应的检测器一致，在数值上更加稳定。具有最宽响应的检测器通常会是这条链中的最后一个检测器。然而，假如中间的某个检测器具有大的仪器增宽，这些结果可以转而以它作为参照。出于讨论的目的，假定上游检测器信号被变宽以配合D_n。

该步骤分为两个阶段。在第一阶段，通过测量单分散性的样品来确定增宽参数，该单分散性的样品具有足够低的浓度，以致于在没有增宽时检测器信号之间成正比。在实践中，注射近单分散性的样品让其穿过色谱仪，并选择单聚体子峰来确定增宽参数。对于从1到n-1的每个检测器i，计算

${\mathrm{\&chi;}}_i^2({\mathrm{\&beta;}}_i,{\mathrm{\&tau;}}_i,{\mathrm{\&alpha;}}_{\mathrm{ij}})={\&Integral;}_{\mathrm{peak}}{(D_n\left(t\right)-{\mathrm{\&beta;}}_i\underset{-\&infin;}{\overset{\&infin;}{\&Integral;}}{D}_i(t-\mathrm{\&tau;})B({\mathrm{\&alpha;}}_{\mathrm{ij}},\mathrm{\&tau;}-{\mathrm{\&tau;}}_i)\mathrm{d\&tau;})}^2\mathrm{dt},---\left(19\right)$

其中χ_i ²(β_i，τ_i，α_ij)是第i个检测器的χ²参数。参数β_i是把检测信号化为同样标度的比例因子，τ_i是与样品从一个检测器流到下一个检测器所用的时间有关的检测器间延迟，而α_ij是第i个检测器的j个增宽参数。使用标准的非线性最小二乘方拟合算法最小化χ²，由此确定最佳的拟合参数，β_i′、τ_i′和α_ij′。能够进行这种拟合的软件很容易在各种商业程序包中获得。这些步骤和各种软件方法中的一些已经在Hiebert于1981年发表在《the ACM Transactions on Mathematical software》第7卷，第1-16页的论文“An Evaluation of Mathematical Software That Solves Nonlinear Least Squares Problems”中被详细地讨论。

在第二阶段，应用在第一阶段确定的增宽参数来校正所有后续数据处理。在这个阶段，所有的上游检测器信号都被变宽，就像它们重合于该链中最后一个检测器似的。然后，可以将它们直接与最后一个检测器D_n比较。被变宽的数据是

${D_i}^b\left(t\right)=\underset{-\&infin;}{\overset{\&infin;}{\&Integral;}}{D}_i(t-\mathrm{\&tau;})B({{\mathrm{\&alpha;}}^{\&prime;}}_{\mathrm{ij}},\mathrm{\&tau;}-{{\mathrm{\&tau;}}^{\&prime;}}_i)\mathrm{d\&tau;}---\left(20\right)$

然后在数据组(D₁ ^b(t)，...，D_n-1 ^b(t)，D_n(t))上继续进行原来的分析。

算法示例

本部分将针对下面的仪器组合在样品数据上说明该算法：MALS+dRI、粘度计+dRI和UV+MALS。图1显示了来自注射进入由日本ShowaDenko制造的Shodex OH pack KW蛋白分离柱的100μlBSA的数据。流动速率是0.5ml/min。被分级的样品首先经过光散射检测器，然后经过dRI检测器。BSA样品主要由单体组成，但是也有一定含量的聚集体，它们通过该柱被分离。在16min和18min之间的波峰主要由纯单体组成。在14.4min和16min之间的波峰是纯二聚体，随后的波峰是更高的聚集体，它们的分离要差一些。横轴是时间，单位是分钟(min)。迹线1是算出的摩尔质量M_w(t)除以单体的摩尔质量M_w0的结果。所以，对于单体，纵轴上的读数为1，二聚体的读数为2，等等。迹线2是90°光散射信号，迹线3是折光指数信号。折光指数和光散射已经被归一化，因此它们的波峰具有同样的最大高度。迹线2和3的纵轴标度是任意的。

该算法的第一步是选择增宽模型。对于图1中的数据，使用了式(16)所描述的混杂模型。该算法的第二步是选择一个用来确定拟合参数的单分散性的波峰。在16min和18min之间的单体峰被使用。当计算式(19)中的χ²时，将有四个参数通过非线性最小二乘方拟合被确定。增加一个额外的参数来解释在两套数据之间可能存在的基线偏移。所以，被最小化的χ²是

${\mathrm{\&chi;}}^2(\mathrm{\&beta;},{\mathrm{\&tau;}}_0,\mathrm{\&delta;},w,x_0)={\&Integral;}_{\mathrm{peak}}{(\mathrm{dRI}\left(t\right)-\mathrm{\&beta;}\underset{-\&infin;}{\overset{\&infin;}{\&Integral;}}\mathrm{LS}(t-\mathrm{\&tau;})B(\mathrm{\&delta;},w,\mathrm{\&tau;}-{\mathrm{\&tau;}}_0)\mathrm{d\&tau;}+x_0)}^2\mathrm{dt}---\left(21\right)$

其中，LS(t)是作为时间函数的90°光散射信号，dRI(t)是作为时间函数的dRI数据。这个模型可以通过使用商业上的马夸特(Marquardt)非线性最小二乘方程序包最小化，例如在D.W.Marquart于1963年发表在《the Journal of the Society of Industrial and Applied Mathematics》第11卷，第431-441页的论文“An algorithm for least squares estimation of nonlinear parameters”中描述的。注意，进行式(20)所描述的增宽校正，并不需要β或者x₀，所以它们没有出现在下面的结果表格中，但是，为了确保正确地进行非线性最小化，需要将它们引入。

参数	数值
		δ′	0.0636sec
w′	3.178sec
		τ0′	21sec

可以这样来解释这些结果，注意到δ＜＜w，这意味着主导性的增宽效应是混合，而非高斯扩散或仪器增宽，正如被预料的那样。参数τ₀仅仅说明样品在两个仪器之间穿行需要21秒。结合上下文，式(20)还可以写成

${\mathrm{LS}}^b\left(t\right)=\underset{-\&infin;}{\overset{\&infin;}{\&Integral;}}\mathrm{LS}(t-\mathrm{\&tau;})B({\mathrm{\&delta;}}^{\&prime;},w^{\&prime;},\mathrm{\&tau;}-{{\mathrm{\&tau;}}_0}^{\&prime;})\mathrm{d\&tau;}---\left(22\right)$

图3显示了采用在上面第一步中得到的拟合参数，使用等式(22)算出的变宽的光散射信号7。使用迹线7代替最初的光散射数据，如前面一样地继续进行光散射分析。结果如迹线6所示。有许多需要注意的特征。首先是迹线7现在和迹线2在单体峰处重叠。这说明模型是正确的，并且非线性最小化恰当地起到了作用。观察到的第二点是在14.5min和16min之间的二聚体峰现在也是一个平台，正如所期望的。在13.5min和14.5min之间的三聚体峰也变得更平，但是由于它与邻近的峰没有被基线分离，所以结果不太清晰。接着可以看到，这些平台现在彼此成整数倍关系。这是预料之中的，因为二聚体的摩尔质量应该正好是单体的摩尔质量的两倍。类似地，三聚体平台现在是单体平台的三倍。

图4显示了来自注射进入Shodex OH pack KW蛋白分离柱的100μlBSA的数据。流动速率是0.5ml/min。被分级的样品首先经过一个在线桥式粘度计，然后经过一个dRI检测器。该粘度计测量比粘度，比粘度被定义为

η_sp(t)＝η(t)/η₀-1       (23)

其中，η(t)是流体样品联合物的粘度，而η₀是纯流体的粘度。dRI检测器测量样品的折光指数，如果已知样品dn/dc，该折光指数可转换为浓度。然后，可以计算出特性粘度

${\mathrm{\&eta;}}_{\mathrm{int}}\left(t\right)=\underset{c\&RightArrow;0}{\lim }{\mathrm{\&eta;}}_{\mathrm{sp}}\left(t\right)/c\left(t\right)---\left(24\right)$

假如浓度足够低，那么特性粘度近似为

η_int(t)≈η_sp(t)/c(t).   (25)

迹线9是比粘度，迹线10是dRI信号。迹线9和10已经被归一化，由此具有相同的最大高度。这两条迹线的纵轴标度是任意的。测量结果如迹线8所示，迹线8以ml/g为单位在纵轴上表示特性粘度。每个样品峰范围内的特性粘度应该是固定的。所看到的弯曲是由于检测器间的增宽，但是，在这种情况中，粘度信号实际上要比dRI信号宽。这是因为与dRI相比，粘度计在大得多的流体体积范围内测量粘度。在这个实施例中，占主导地位的增宽是粘度计所固有的仪器增宽。事实上，样品在两个检测器之间通过使得dRI信号变宽，这降低了峰宽的总体差别。可以和前面一样地应用本发明的这个方法，但是，在这种情况中，要将dRI信号变宽以配合粘度信号。该算法的第一步是选择增宽模型。依然选用混杂高斯-混合模型。在该算法中的第二步是选择一个用来确定拟合参数的单分散性的波峰。在15.2min和16.2min之间的单体峰被使用。如上所述，式(19)可以改写成

${\mathrm{\&chi;}}^2(\mathrm{\&beta;},{\mathrm{\&tau;}}_0,\mathrm{\&delta;},w,x_0)={\&Integral;}_{\mathrm{peak}}{({\mathrm{\&eta;}}_{\mathrm{sp}}\left(t\right)-\mathrm{\&beta;}\underset{-\&infin;}{\overset{\&infin;}{\&Integral;}}\mathrm{dRI}(t-\mathrm{\&tau;})B(\mathrm{\&delta;},w,\mathrm{\&tau;}-{\mathrm{\&tau;}}_0)\mathrm{d\&tau;}+x_0)}^2\mathrm{dt}---\left(26\right)$

对于可调整的参数，通过最小化χ²来确定这些拟合参数。得到的拟合参数为

参数	数值
		δ′	0.01sec

w′	9.04sec
		τ0′	15.6sec

在这种情况中，参数w是9.04秒，该参数出现如此大的值不是因为检测器间的混合，而是因为相对于dRI流动池的体积而言，粘度计毛细管具有一个巨大的内部体积。高斯项是极小的，它再次说明扩散是不重要的。通过将等式(20)改写为下式，可以将dRI信号变宽，

${\mathrm{dRI}}^b\left(t\right)=\underset{-\&infin;}{\overset{\&infin;}{\&Integral;}}\mathrm{dRI}(t-\mathrm{\&tau;})B({\mathrm{\&delta;}}^{\&prime;},w^{\&prime;},\mathrm{\&tau;}-{{\mathrm{\&tau;}}_0}^{\&prime;})\mathrm{d\&tau;}---\left(27\right)$

可以用变宽的dRI信号继续进行分析。图5的迹线12显示了变宽的dRI信号，迹线11显示了被校正的特性粘度信号。现在这些结果由代表每个波峰的平台组成。

如图6所示，最后一个实施例由浓度为3.0mg/ml的BSA的100μl样品所组成，该样品依次由UV检测器和MALS检测器测量。在这种情况中，用14表示的LS信号明显要比15表示的UV信号宽，从而得到了用13表示的弯曲的摩尔质量迹线。对于这个实施例，将UV信号变宽以配合LS信号。等式(19)被改写为

${\mathrm{\&chi;}}^2(\mathrm{\&beta;},{\mathrm{\&tau;}}_0,\mathrm{\&delta;},w,x_0)={\&Integral;}_{\mathrm{peak}}{(\mathrm{LS}\left(t\right)-\mathrm{\&beta;}\underset{-\&infin;}{\overset{\&infin;}{\&Integral;}}\mathrm{UV}(t-\mathrm{\&tau;})B(\mathrm{\&delta;},w,\mathrm{\&tau;}-{\mathrm{\&tau;}}_0)\mathrm{d\&tau;}+x_0)}^2\mathrm{dt}---\left(28\right)$

混杂混合和高斯模型再次被使用，在13.5min和15min之间单体峰被用来确定拟合参数。最小化χ²，得到这些拟合参数的值

参数	数值
		δ′	0.22sec
w′	3.61sec
		τ0′	39.5sec

同样，增宽的主要因素是内部混合。现在将等式(20)改写为下式，通过计算将UV数据变宽，如图7中所示。

${\mathrm{UV}}^b\left(t\right)=\underset{-\&infin;}{\overset{\&infin;}{\&Integral;}}\mathrm{UV}(t-\mathrm{\&tau;})B({\mathrm{\&delta;}}^{\&prime;},w^{\&prime;},\mathrm{\&tau;}-{{\mathrm{\&tau;}}_0}^{\&prime;})\mathrm{d\&tau;}---\left(29\right)$

变宽的UV信号如迹线17所示，摩尔质量如迹线16所示。和前面两种情况一样，数据由平台组成，检测器间的增宽效应明显降低了。

本发明方法的上述示例仅仅说明了可以用本说明书所公开的发明方法实施和修正的频带增宽校正的一些可能类型。对于色谱技术领域的技术人员而言，明显的是，在本发明之前，频带增宽效应严重阻碍着提高多检测器使用时的测量精度。本发明的方法和各种变化都实现了明显降低频带增宽效应这一期望。

Claims (8)

1.一种获得顺次通过一组两个或多个检测器i(i＝1，n)的样品的选择的物理性质的方法，其中n是检测器的数目，当一些所述检测器显示出其信号的频带增宽时，该方法使用响应于从中通过的所述样品由所述检测器产生的作为时间的函数的信号的组合D_i(t)，该方法包括步骤：

a)应用参数化增宽函数B(α₀，α₁，...，α_l，τ)到检测器组以因此获得相应组的检测器信号，其中α特性化检测器i的增宽的范围，而l是可调参数的数目，其中

是现在被增宽的所述检测器信号，而α′_ij和τ′_i是所述增宽函数的最佳拟合参数；和

b)使用现在被增宽的所述检测器信号，接着应用所述增宽函数来获得所述样品的选择的物理性质。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，要获得的所述选择的物理性质是所述样品的重均摩尔质量M_w，和所述样品的均方半径<r_g ²>。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测器信号依次来自紫外检测器和多角度光散射检测器，并且多角度光散射的信号被增宽。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测器信号依次来自折射率检测器和粘度计，并且所述折射率检测器的信号被增宽。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，可调参数α₀代表仪器的高斯宽度δ，并且可调参数α₁代表由于混合而导致的增宽w，并且所述增宽函数由下式给出：

$B(\mathrm{\&delta;},w,t)={\&Integral;}_{-\&infin;}^{+\&infin;}\frac{1}{\mathrm{\&delta;}\sqrt{2\mathrm{\&pi;}}}{e}^{-{\mathrm{\&tau;}}^2/2{\mathrm{\&delta;}}^2}\&CircleTimes;\frac{1}{w}\mathrm{\&theta;}(t-\mathrm{\&tau;})e^{-(t-\mathrm{\&tau;})/w}\mathrm{d\&tau;},$

其中，当t＜τ时，θ(t-τ)＝0，而当t≥τ时，θ(t-τ)＝1。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述检测器i(i＝1，n)的增宽函数的最佳拟合参数由下述步骤确定：

a)选择包含一组可调参数α_j(j＝0，...，l)的所述增宽函数B(α₀，α₁，...，α_l，τ)，其中l是可调参数的数目；

b)注入均匀成分的参考样品；

c)从所述i个检测器D_i(t)的每个检测器收集作为对应于来自每个所述检测器的所述样品的波峰的时间函数的检测器信号，其中波峰被定义为一段时间范围，在该时间范围内，具有均匀成分的样品被洗脱；

d)定义参考信号Dn(t)为显示最宽临时响应的信号；

e)对于每个检测器i，形成χ_i ²模型，该模型得自所述增宽模型，并且使用所述信号Dn(t)作为所述检测器i要被比较的参考，在所述波峰将被最小化；

其中所述最佳拟合参数是β_i、α_ij和τ_i；并且

1)β_i是检测器i的比例因子；

2)α_ij特征化检测器i、参数j的增宽的范围；和

3)τ_i是检测器i的检测器间的时间延迟；

f)最小化所述χ_i ²模型，以生成所述检测器的波峰的所述最佳拟合参数。

7.根据权利要求2所述的方法，其中，所述检测器信号依次来自多角度光散射检测器和折射率检测器，并且所述多角度光散射检测器的信号被增宽。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述样品的所述重量平均摩尔质量和所述均方半径得自Zimm公式R(θ)＝K^*M_wcP(θ)[1-2A₂M_wcP(θ)+O(c³)，其中P(θ)是从所述多角度光散射检测器获得的在时间t方向θ的超瑞利比，c是从所述折射率检测器获得的在时间t的浓度，p(θ)是所述样品中的散射分子的形状因子，A₂是第二维里系数，而K^*是一个常数，并且其中所述多角度光散射信号已经被增宽。

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