CN102174438A - 新大环内酯及其制备方法和应用 - Google Patents

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本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及从黑翅土白蚁Odontotermesformosanus(Shiraki)内生放线菌的发酵液中提取到的新大环内酯(deminamicin)及其制法和应用。deminamicin对幽门螺旋杆菌有很强的抑制作用，因此deminamicin可作为抗幽门螺旋杆菌的化合物，并在制备新型抗生素药物中得到应用。

Description

新大环内酯及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及从黑翅土白蚁Odontotermes formosanus (Shiraki)内生放线菌的发酵液中提取到的新大环内酯(deminamicin) 及其制备方法与应用。
背景技术
放线菌能产生多种生物活性物质，它为抗生素工业的建立和发展发挥过巨大作用。经过多年的研究，从放线菌中分离得到的先导化合物数量锐减，发现新抗生素的几率也大大降低。来源于特殊生境的放线菌引起了一些研究者的兴趣，研究特境放线菌的次生代谢产物成为筛选新型抗生素的一条重要途径。昆虫是地球上一类分布广泛、种类和数量巨多的生物资源，昆虫肠道内生存着无数微生物，昆虫种类、数量及分布的多样性造就了昆虫肠道内生菌的多样性。昆虫肠道放线菌是一类特境放线菌，人们对其次生代谢产物的研究较少。
白蚁以各种树木为食，它们能消化难以分解的树木纤维，白蚁肠道内的微生物在白蚁消化树木纤维的过程中发挥着很大作用。然而，到目前为止，尚未见对白蚁内生放线菌次生代谢产物的研究报道。
发明内容
本发明需要解决的问题是：
1.      提供一种白蚁内生放线菌；
2.      具有抗菌活性的新大环内酯(deminamicin)；
3.      提供一种提取、分离deminamicin的方法；
4.      提供新大环内酯(deminamicin)在开发抗生素药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
deminamicin的结构为：
Figure 2011100279001100002DEST_PATH_IMAGE001
deminamicin
deminamicin的制备方法，它包括下述步骤：
步骤1. 将新鲜的从黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus)肠道中分离、纯化得到的放线菌（BY-4）菌体块接种到在高氏1号培养基（可溶性淀粉20 g，KNO3 1 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，1 L 蒸馏水）上，在140 rpm、28℃条件的摇床上培养5天作为种子液；
步骤2. 将种子液接种于高氏1号培养基中，在140 rpm、28℃条件下发酵14天；
步骤3. 将步骤2所得发酵液经纱布过滤，滤液用乙酸乙酯萃取4次，真空浓缩干燥得黑色粗浸膏F1；
步骤4. 将粗浸膏F1悬浮于水，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，所得乙酸乙酯萃取液经浓缩得浸膏F2；
步骤5. 对浸膏F2进行硅胶柱层析，依次用4倍体积的氯仿、氯仿：甲醇=100:1、氯仿:甲醇=100:2、氯仿:甲醇=100:4、氯仿:甲醇=100:8、氯仿:甲醇=100:16和甲醇进行洗脱，浓缩100:4（氯仿:甲醇）段得到黑色浸膏F3；
步骤6. 然后对浸膏F3进行Sephadex LH-20分离（洗脱液为甲醇），共得11瓶，将7-9瓶合并得浸膏F4；
步骤7. 对浸膏F4，用反相硅胶柱进行分离，先用20%甲醇（酒精计测量）进行洗脱除去大极性杂质，然后用45%甲醇洗脱，真空浓缩洗脱液得褐色固体F5；
步骤8. 用高压液相色谱法（色谱柱：Allsphere ODS-2.5 mm (250R4.6 mm) column）在流动相为51%甲醇（酒精计测量）、波长为210 nm、流速为2.0 mL/min的条件下对浸膏F5进行分离，共出现6个主要成分，保留时间为32.9 min的第4成分为deminamicin。
本发明的新大环内酯deminamicin对厌氧菌具有较强的抑制作用，特别是对幽门螺旋杆菌标准菌有很强的抑制作用，deminamicin可作为一种新颖的抗生素，制备新抗生素药物。
与现有技术相比，本发明具有下述突出优点：
1. 本发明的deminamicin是结构新颖的化合物，可以作为抗生素或先导化合物，制备成新型抗生素药物；
2. 本发明的deminamicin可以利用微生物进行液体发酵生产，工艺简便，周期短，成本低，来源有保证。
具体实施方式
通过下面给出的具体实施例可以进一步了解本发明。但它们不是对本发明的限定。
实施例1：白蚁内生放线菌BY-4的分离与纯化
本发明所用的放线菌是于2005年9月从南京市紫金山南麓捕捉的黑翅土白蚁Odontotermes formosanus (Shiraki)的肠道内分离得到的一株内生放线菌，菌株编号为BY-4，现保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：武汉珞珈山武汉大学内），保藏编号为CCTCC M 2010366，保藏日期为2010年12月27日。
在无菌条件下将白蚁在70%酒精中表面消毒2分钟，剪去头部，取用腹部，用无菌水漂洗腹部3次，加少量无菌水在无菌研钵中研磨，用无菌水对研磨液梯度稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，分别取各梯度稀释液0.2毫升涂布于高氏1号培养基中，置于28℃恒温箱中培养，待菌落长出后，挑取孢子纯化培养，得到白蚁肠道内生放线菌。
实施例2：白蚁内生放线菌BY-4的液体发酵
活化白蚁内生放线菌BY-4，将新鲜的菌体块接种到1000 mL 锥形瓶中，每瓶含有400 mL的高氏1号培养基，接种5－6瓶于摇床上，在140 rpm、28 ℃条件下培养5天作为种子液，然后将20 mL种子液接种于含有400 mL的高氏1号培养基的1000 mL 锥形瓶中，在140 rpm、28℃条件下发酵14天。
实施例3：deminamicin的提取与分离
实施例2中所得发酵液经纱布过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，真空浓缩干燥得黑色粗浸膏F1。将粗浸膏F1悬浮于水，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，所得乙酸乙酯萃取液经浓缩得浸膏F2，对浸膏F2进行硅胶柱层析，依次用4倍体积的氯仿、氯仿：甲醇=100:1、氯仿:甲醇=100:2、氯仿:甲醇=100:4、氯仿:甲醇=100:8、氯仿:甲醇=100:16、甲醇进行洗脱，浓缩100:4（氯仿:甲醇）段得到黑色浸膏F3，然后对浸膏F3进行Sephadex LH-20分离（洗脱液为纯甲醇），共得11瓶，将7-9瓶合并得浸膏F4，对浸膏F4用反相硅胶柱进行分离，先用20%甲醇（酒精计测量）进行洗脱除去大极性杂质，然后用45%甲醇洗脱，真空浓缩洗脱液得褐色固体F5，用高压液相色谱法（色谱柱：Allsphere ODS-2.5 mm (250R4.6 mm) column）在流动相51%甲醇（酒精计测量）、波长为210 nm、流速为2.0 mL/min的条件下对浸膏F5进行分离，共出现6个主要成分，保留时间为32.9 min的第4成分为deminamicin。
实施例4：deminamicin的结构鉴定
deminamicin的结构是根据它们的质谱、核磁共振谱（包括1H-NMR、13C-NMR、DEPT、HMQC、COSY、HMBC、NOE）而确定的。
deminamicin一些光谱学数据如下：
deminamicin，无色晶体，易溶于丙酮和甲醇，在254和365nm紫外下无荧光吸收，1H 和 13C NMR数据见表1；HRESIMS: m/z 447.1992 [M+Na]+, calculated for C22H32NaO8, 447.1986。
表1. deminamicin的1H (300 MHz) 和13C-NMR (75 MHz) 数据 (CD3COCD3)
Position δC δH(J in Hz)
1 173.4
2 84.0 3.68 dd(12.1, 4.5)
3 33.9 2.46 ddd(14.7, 12.1, 2.7)
1.21 ddd(14.7, 4.5, 4.4)
4 39.4 1.83 m
5 130.0 5.49 dd (9.5,2.6)
6 131.0 5.85 ddd(9.5, 6.5, 2.4)
7 30.2 2.27 m
8 33.0 1.57 brdd(12.8, 10.8)
1.43 dddd(12.8, 4.9, 2.4, 2.3)
9 66.0 3.84 dt(5.2, 2.5)
10 37.2 1.88 m
1.80 m
11 69.0 3.93 m
12 39.1 2.11 brd(5.0)
13 77.1
14 142.2
15 124.4 5.54 brd(7.7)
16 41.9 3.14 dddd(8.4, 7.7, 6.1, 5.2)
17 74.8 5.31 dd(9.7, 6.1)
18 71.2 3.99 ddd(9.7, 6.7, 3.0)
19 64.8 3.60 dd(11.3, 3.0)
20 63.2 4.09 dd(10.5, 8.4)
3.74 dd(10.5, 5.2)
21 15.4 1.69 s
22 57.7 3.25 s
实施例5：deminamicin抗幽门螺旋杆菌的活性测试
(1) 培养基的制备
强化布鲁氏琼脂中加入5% (v/v)溶解绵羊血、氯化血红素5 μg/mL和1 μg/mL维生素K1。
(2) 琼脂稀释平板的制备
首先配制好不同浓度的试验用的抗生素溶液及事先配制好试验用的强化布鲁氏琼脂。然后制备含不同浓度抗生素的琼脂平板。具体步骤如下：在每块平板上标记好每一种抗生素的浓度，然后放置于水平桌面上。将熔化的强化布鲁氏琼脂冷却至50℃左右，加入不同浓度的抗生素，同时加入5%(v/v)溶解绵羊血，轻轻混匀，注意不要产生气泡，然后倒入平板内，使其凝固，可放在无菌层流橱内并将平板盖半开着，或35℃孵育30 min，使其表面干燥。
(3) 接种方法及接种菌量
首先在平板上标记好接种菌的位点，使用含量为1-2 μL的多点接种器，蘸取菌液后直接加在琼脂表面，每点最终接种菌量为105 CFU。
(4) 琼脂稀释法药敏试验
首先将不同稀释度的抗生素加入已熔化并冷却至50℃左右的琼脂中，混匀后倾注平板，待其凝固后，使用接种器将接种标准化的被检菌株菌悬液分别接种在含不同抗生素的平板上，在接种后30 min内将接种平板放入无氧环境中，越快越好，以免对氧极度敏感的厌氧菌死亡。孵育48 h后，肉眼检查接种的平板，能抑制细菌生长的最低的抗生素浓度，可报告为抗生素的MIC。
deminamicin抗幽门螺旋杆菌的活性测试结果表明：deminamicin对幽门螺旋杆菌标准菌株的MIC50为4.0 μg/mL，阳性对照硫酸庆大霉素(Gentamicin)的MIC50为1.0 μg/mL；deminamicin对临床菌株的MIC50为8 μg/mL，阳性对照硫酸庆大霉素(Gentamicin)的MIC50为1.0 μg/mL。
以上结果提示，deminamicin具有很强的抗抗幽门螺旋杆菌活性，因此本发明deminamicin可用于制备新型抗生素。

Claims (4)

1.一种白蚁内生放线菌，菌株编号为BY-4，其特征是在高氏一号平板上，基内菌丝灰褐色，气生菌丝白色，孢子灰褐色，菌落产生花状边缘；在查氏培养基上状态较特殊，基内菌丝浅黄色，气生菌丝亮黄绿色，孢子褐色；经鉴定为链霉菌属Streptomyces sp.，现保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：武汉珞珈山武汉大学内，保藏编号为CCTCC M 2010366，保藏日期为2010年12月27日；从其高氏液体发酵提取物中可以分离纯化获得具有抗菌活性的新大环内酯deminamicin。
2.一种权利要求1所述白蚁内生放线菌制备的大环内酯的结构为：
 。
3.一种权利要求2所述的大环内酯deminamicin的制备方法，其特征是由以下步骤构成：
步骤1. 将新鲜的从黑翅土白蚁Odontotermes formosanus肠道中分离、纯化得到的放线菌BY-4菌体块接种到在高氏1号培养基，培养基组成为：可溶性淀粉20 g，KNO3 1 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，1 L 蒸馏水，于摇床上，在140 rpm、28 ℃条件下培养5天作为种子液；
步骤2. 然后将种子液接种于高氏1号培养基中，在140 rpm、28 ℃条件下发酵14天；
步骤3. 将步骤2所得发酵液经纱布过滤，滤液用乙酸乙酯萃取4次，真空浓缩干燥得黑色粗浸膏F1；
步骤4. 将粗浸膏F1悬浮于水，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，所得乙酸乙酯萃取液经浓缩得浸膏F2；
步骤5. 对浸膏F2进行硅胶柱层析，依次用4倍体积的氯仿、氯仿：甲醇=100:1、氯仿:甲醇=100:2、氯仿:甲醇=100:4、氯仿:甲醇=100:8、氯仿:甲醇=100:16和甲醇进行洗脱，浓缩氯仿:甲醇=100:4段得到黑色浸膏F3；
步骤6. 然后对浸膏F3进行Sephadex LH-20分离，洗脱液为甲醇，共得11瓶，将7-9瓶合并得浸膏F4；
步骤7. 对浸膏F4，用反相硅胶柱进行分离，先用20%甲醇—酒精计测量，进行洗脱除去大极性杂质，然后用45%甲醇洗脱，真空浓缩洗脱液得褐色固体F5；
步骤8. 用高压液相色谱法，色谱柱：Allsphere ODS-2.5 mm —250R4.6 mm column在流动相为51%甲醇——酒精计测量、波长为210 nm、流速为2.0 mL/min的条件下对浸膏F5进行分离，共出现6个主要成分，保留时间为32.9 min的第4成分为deminamicin。
4.根据权利要求2所述的大环内酯在制备抗生素药物中的应用。
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