CN102174147A

CN102174147A - 一种亲和温敏双水相体系及其应用

Info

Publication number: CN102174147A
Application number: CN 201110065150
Authority: CN
Inventors: 朱利民; 凌元清; 聂华丽
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University
Priority date: 2011-03-17
Filing date: 2011-03-17
Publication date: 2011-09-07

Abstract

本发明涉及一种亲和温敏双水相体系及其应用，包括：1)制备温敏聚合物PNiPAAm-co-AA二元线型聚合物；2)将上述制备的温敏聚合物PNIiPAAm-co-AA配制成水溶液，加入硫酸铜溶液，反应完成，收集沉淀得到亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu；3)用上述亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4万构建亲和温敏双水相体系并绘制相图。本发明亲和温敏双水相体系用于BSA牛血清蛋白的分离纯化。该方法所建立的亲和温敏双水相体系，分相行为好，操作简单，时间短，成相物质可回收利用，有效降低双水相成本，适用于规模化生产需要。

Description

一种亲和温敏双水相体系及其应用

技术领域

本发明属于双水相体系领域，特别涉及一种亲和温敏双水相体系及其应用。

背景技术

近年来，由于双水相萃取技术在微生物、有机化合物和金属螯合物的分离和纯化、预浓集过程中表现出相当好的性能，并有望用于大规模提取和纯化生物活性物质，因此越来越受到人们的关注。由于双水相体系易于放大、传质速度快、节省能耗、工作条件温和、易于实现过程连续化，所以双水相体系在生物技术中的应用越来越广泛。目前，双水相体系主要用于细胞的回收、从发酵液中提取蛋白质产品和酶以及与产物的萃取分离相结合的生物转化等。

N-异丙基丙烯酰胺(NiPAAm)的高聚物聚(N-异丙基丙烯酰胺)简称PNiPAAm，是一种具有最低临界溶液温度(LCST)特性的热敏性智能聚合物材料，由于其大分子侧链上同时具有亲水性的酰胺基-CONH-和疏水性的异丙基-CH(CH₃)₂，使线型PNiPAAm的水溶液随着外界温度的变化可在其LCST附件发生可逆相变。其相变温度在人体生理温度(37℃)附近，具有良好的离子型水溶性、热敏性以及生物相容性，因而在药物控释、酶固定化、免疫分析、生化分离等领域有潜在的应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种亲和温敏双水相体系及其应用，该双水相体系的制备方法操作简单、条件温和、时间短、成本低且成相聚合物可重复利用，本发明的亲和温敏双水相体系能够快速简便的从天然产物中分离纯化蛋白质。

本发明的一种亲和温敏双水相体系，其制备方法，包括：

1)将0.25～2.0g N-异丙基丙烯酰胺(NiPAAm)与50～400μl丙烯酸(AA)溶解在15～50ml去离子水中，然后将其置于反应容器中，真空脱气，再加入30～60μl N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)和含有0.015～0.120g过硫酸铵(APS)的过硫酸铵水溶液(0.15～1.20ml)，通氮气鼓泡后密封，接着在45～55℃恒温水浴中反应30～60min，收集沉淀后得到温敏聚合物PNiPAAm-co-AA二元线型聚合物；

2)将上述的温敏聚合物PNIiPAAm-co-AA配制成浓度为0.05～0.10g/ml的PNIiPAAm-co-AA水溶液，取上述水溶液5～10ml，加入5～10ml浓度为0.1～0.2mol/L硫酸铜溶液，室温下振荡反应1～2h，收集沉淀得到亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu；

3)用上述亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4万构建亲和温敏双水相体系并绘制相图。

上述步骤1)中的N-异丙基丙烯酰胺(NiPAAm)的质量为0.5～1.0g，丙烯酸(AA)的用量为100～300μl。

上述步骤1)中真空脱气时间为10～30min，氮气鼓泡时间为15～30min。

上述步骤1)中加入的四甲基乙二胺(TEMED)为40～50μl，过硫酸铵(APS)用量为0.050～0.100g。

上述步骤2)中在配制好PNIiPAAm-co-AA水溶液后，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调节上述溶液的pH值为7.0。

上述步骤3)中所述的绘制相图采用浊点法。

PNiPAAm-co-AA-Cu-葡聚糖4万双水相体系相图的绘制，具体步骤如下：将两种成相聚合物-亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4万分别制成一定浓度的母液。准确称量一定量亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu母液，加入试管中，然后加入葡聚糖4万母液混合均匀，直到试管开始出现混浊为止，称量加入的葡聚糖4万母液的质量，算出亲和温敏聚合物和葡聚糖4万在双水相体系中的重量百分浓度，再加入适量水，使体系变澄清，称量加入水的质量，并继续加入葡聚糖4万母液，使体系再次变混浊，如此反复操作，计算到达混浊时亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4万在系统中的重量百分含量，则可得到亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4万的双节线相图。

本发明的一种亲和温敏双水相体系应用于BSA(牛血清蛋白)的分离纯化。

所述的BSA的分离纯化，首先要进行BSA分离纯化条件的优化，采用单因素实验进行优化，只改变亲和温敏聚合物、葡聚糖4万、BSA初始浓度及pH值中的一个因素(亲和温敏聚合物浓度的改变范围为2.5～4.0wt％、葡聚糖4万浓度的改变范围为6～14wt％、BSA初始浓度的改变范围为5.0～25.0mg/ml、pH值的改变范围为4.0～8.0)，探讨亲和温敏聚合物、葡聚糖4万、BSA初始浓度以及pH值对BSA在双水相体系中分配的影响，得出BSA分离纯化的最优实验条件。

本发明在PNiPAAm高聚物上共聚丙烯酸(AA)，引入可与金属离子螯合反应的羧基-COOH，然后在PNiPAAm-co-AA二元线型聚合物上键合金属离子，从而制得同时具有温度敏感性和亲和特性的聚合物。将这种聚合物引入双水相体系，能有效解决目前双水相体系成本偏高的缺陷，同时保留了双水相本身的优点，使双水相萃取蛋白质更具有商业应用价值。

有益效果

(1)本发明所建立的亲和温敏双水相体系，分相行为好，操作简单，时间短，生物相容性好。

(2)本发明使用的成相物质可回收利用，大大降低了双水相成本，适用于规模化生产需要。

(3)本发明分离纯化后的BSA回收率高达80％～90％。

附图说明

图1为温敏聚合物PNIPAAm-co-AA的LCST测定曲线；

图2为亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu的储存稳定性图；

图3为PNiPAAm-co-AA-Cu/葡聚糖4万双水相体系相图；

图4为不同条件对BSA分配系数(K)和回收率(Recovery)的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

温敏聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸共聚物(PNiPAAm-co-AA)的合成，具体步骤如下：

将1.0g N-异丙基丙烯酰胺和100μl丙烯酸溶解在25ml去离子水中，置于100ml具塞磨口圆底烧瓶中，真空脱气10min，加入N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)(60μl)和0.6ml过硫酸铵溶液(0.1g/ml)，通氮气鼓泡15min后密封，之后50℃恒温水浴反应30min。反应结束后，将上层清液轻轻倒出，加入50ml去离子水将沉淀溶解。待沉淀完全溶解后，置于50℃恒温水浴中30min，离心收集聚合物沉淀。重复上述步骤3次，以去除未反应的单体。在最后一次聚合物沉淀过程中可加入0.2mol/L NaCl溶液来促进聚合物的沉淀，避免聚合物在沉淀过程中的损失。

实施例2

将0.25g N-异丙基丙烯酰胺和50μl丙烯酸溶解在15ml去离子水中，置于反应容器中，真空脱气20min，加入N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)(30μl)和0.15ml过硫酸铵溶液(0.1g/ml)，通氮气鼓泡30min后密封，之后45℃恒温水浴反应60min。反应结束后，将上层清液轻轻倒出，加入40ml去离子水将沉淀溶解。待沉淀完全溶解后，置于50℃恒温水浴中30min，离心收集聚合物沉淀。重复上述步骤3次，以去除未反应的单体。在最后一次聚合物沉淀过程中可加入0.2mol/L NaCl溶液来促进聚合物的沉淀，避免聚合物在沉淀过程中的损失。

实施例3

将2.0g N-异丙基丙烯酰胺和400μl丙烯酸溶解在50ml去离子水中，置于反应容器中，真空脱气10min，加入N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)(45μl)和0.6ml过硫酸铵溶液(0.2g/ml)，通氮气鼓泡20min后密封，之后55℃恒温水浴反应60min。反应结束后，将上层清液轻轻倒出，加入50ml去离子水将沉淀溶解。待沉淀完全溶解后，置于50℃恒温水浴中30min，离心收集聚合物沉淀。重复上述步骤3次，以去除未反应的单体。在最后一次聚合物沉淀过程中可加入0.2mol/L NaCl溶液来促进聚合物的沉淀，避免聚合物在沉淀过程中的损失。

实施例4

亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu的合成，具体步骤如下：

将上述制备的温敏聚合物PNIiPAAm-co-AA配制成0.1g/ml的水溶液，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调节溶液的pH值为7.0。取5ml聚合物水溶液置于50ml锥形瓶中，冰浴30min。缓慢滴加10ml，0.1mol/L CuSO₄溶液，室温下振荡反应2h。反应结束后加入1ml，2mol/L NaCl溶液，60℃水浴保温15min。10000rpm离心5min，轻轻倒去上层清液，加入10ml去离子水，置入4℃冰箱中溶解沉淀。重复2次后，将聚合物溶液的浓度调节到0.02g/ml，置于4℃冰箱中备用。

实施例5

亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu的合成，具体步骤如下：

将上述制备的温敏聚合物PNIiPAAm-co-AA配制成0.05g/ml的水溶液，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调节溶液的pH值为7.0。取10ml聚合物水溶液置于50ml锥形瓶中，冰浴30min。缓慢滴加5ml，0.2mol/L CuSO₄溶液，室温下振荡反应1h。反应结束后加入2ml，2mol/L NaCl溶液，60℃水浴保温15min。20000rpm离心5min，轻轻倒去上层清液，加入15ml去离子水，置入4℃冰箱中溶解沉淀。重复3次后，将聚合物溶液的浓度调节到0.02g/ml，置于4℃冰箱中备用。

实施例6

PNiPAAm-co-AA-Cu-葡聚糖4万双水相体系相图的绘制，具体步骤如下：

将两种成相聚合物-亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4万分别制成浓度为20wt％的母液。准确称量2.0g亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu母液，加入试管中，然后加入葡聚糖4万母液混合均匀，直到试管开始出现混浊为止，称量加入的葡聚糖4万母液的质量为0.22g，算出亲和温敏聚合物和葡聚糖4万在双水相体系中的重量百分浓度分别为5.06wt％和1.91wt％，再加入适量水，使体系变澄清，称量加入水的质量为0.89g，并继续加入葡聚糖4万母液，使体系再次变混浊，如此反复操作，计算到达混浊时亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4万在系统中的重量百分含量，则可得到亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4万的双节线相图，如图3所示。

实施例7

BSA分离纯化的实验条件的优化，具体步骤如下：

(1)PNiPAAm-co-AA-Cu含量的确定：将双水相体系中的葡聚糖4万的浓度固定在6.0wt％，改变体系中亲和温敏聚合物的浓度(2.5wt％、3.0wt％、3.5wt％、4.0wt％)来构建不同的葡聚糖/亲和温敏聚合物双水相体系。测定BSA在所构建的双水相体系中的分配系数和回收率。其他实验条件为，pH值为7.0，BSA溶液浓度为5.0mg/ml，如图4a所示。

(2)葡聚糖4万含量的确定：用不同浓度的葡聚糖4万(6wt％、8wt％、10wt％、12wt％、14wt％)来构建葡聚糖/亲和温敏聚合物双水相体系，测定BSA在所构建的双水相体系中的分配系数和回收率。其他实验条件为，亲和温敏聚合物的浓度为2.5wt％，pH值为7.0，BSA溶液浓度为5.0mg/ml，如图4b所示。

(3)BSA初始浓度的确定：在葡聚糖4万的浓度为6.0wt％，亲和温敏聚合物的浓度为3.5wt％构成的双水相体系(pH值为6.0)中，通过改变体系中BSA的加入量(5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mg/ml)，考察BSA溶液的初始浓度对BSA在亲和温敏双水相体系中的分配系数和回收率的影响并测定BSA在所构建的双水相体系中的分配系数和回收率，如图4c所示。

(4)pH的确定：在葡聚糖4万的浓度为6.0wt％，亲和温敏聚合物的浓度为3.5wt％构成的双水相体系中，通过改变体系的pH值(4、5、6、7、8)，考察pH值对BSA在亲和温敏双水相体系中的分配系数和回收率的影响并测定BSA在所构建的双水相体系中的分配系数和回收率。BSA溶液的初始浓度为5.0mg/ml，如图4d所示。

实施例8

BSA的分离纯化，具体步骤如下：

(1)用pH值为7.0的0.05mol/L tris-HCl缓冲液配置5.50wt％PNiPAAm-co-AA-Cu溶液、40wt％葡聚糖4万溶液及5.0mg/ml的BSA溶液；

(2)在试管中加入3.82g上述PNiPAAm-co-AA-Cu溶液及0.9g上述葡聚糖4万溶液，加入1ml上述BSA水溶液，并向双水相体系中加入pH值为7.0的tris-HCl缓冲液直至体系总重为6.0g，在旋涡混合器上混合1min振荡混合均匀，室温下静置30min，体系分成两相，使BSA在两相中进行分配；

(3)在上下两相中分别取出1ml样品，分别测定两相中BSA的浓度。其中，亲和温敏聚合物相置于40℃水浴中保温10min，使亲和温敏聚合物受热凝聚至完全沉淀，8000rpm离心5min弃上清。将所得沉淀用pH 6.0的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液洗涤数次，除去未吸附的蛋白质。最后用2ml，pH 4.0的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液(含有0.20mol/L NaCl和0.050mol/L EDTA)在4℃下将温敏聚合物充分溶解，在40℃水浴下保温10min，使亲和温敏聚合物完全沉淀，8000rpm离心5min取上层清液，分别测定洗脱前后溶液中蛋白质的含量；葡聚糖4万相直接进行蛋白质含量测定；

(4)根据BSA在两相中的分配情况，计算得BSA在该双水相体系中的分配系数为24.14，回收率为84.1％。

Claims

1.一种亲和温敏双水相体系，其制备方法，包括：

1)将0.25～2.0g N-异丙基丙烯酰胺与50～400μl丙烯酸溶解在去离子水中，然后将其置于反应容器中，真空脱气，再加入30～60μl N，N，N′，N′-四甲基乙二胺和含有0.015～0.120g过硫酸铵的过硫酸铵水溶液0.15～1.20ml，通氮气鼓泡后密封，接着在45～55℃恒温水浴中反应30～60min，收集沉淀后得到温敏聚合物PNiPAAm-co-AA二元线型聚合物；

2.根据权利要求1所述的一种亲和温敏双水相体系，其特征在于：步骤1)中所述的N-异丙基丙烯酰胺的质量为0.5～1.0g，丙烯酸的用量为100～300μl。

3.根据权利要求1所述的一种亲和温敏双水相体系，其特征在于：步骤1)中所述的真空脱气时间为10～30min，氮气鼓泡时间为15～30min。

4.根据权利要求1所述的一种亲和温敏双水相体系，其特征在于；步骤1)中加入的四甲基乙二胺为40～50μl，过硫酸铵用量为0.050～0.100g。

5.根据权利要求1所述的一种亲和温敏双水相体系，其特征在于：步骤2)中在配制好PNIiPAAm-co-AA水溶液后，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调节上述溶液的pH值为7.0。

6.根据权利要求1所述的一种亲和温敏双水相体系，其特征在于：步骤3)中所述的绘制相图采用浊点法。

7.一种亲和温敏双水相体系应用于BSA牛血清蛋白的分离纯化。

8.根据权利要求7所述的一种亲和温敏双水相体系应用于BSA牛血清蛋白的分离纯化，其特征在于：BSA牛血清蛋白的分离纯化的实验条件为：亲和温敏聚合物浓度的改变范围为2.5～4.0wt％、葡聚糖4万浓度的改变范围为6～14wt％、BSA初始浓度的改变范围为5.0～25.0mg/ml、pH值的改变范围为4.0～8.0。