CN102165924A - 一种海参幼体的荧光标记方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种海参幼体的荧光标记方法。海参是珍贵的海产品之一，野生的海参资源日益匮乏。通过人工增殖放流是恢复野生海参资源的重要方法。为了评估增殖放流效果，需要定期回捕放流个体，如何有效区分人工增殖个体与野生个体，建立标记方法，成为行业急需。海参的体壁分布了大量的骨片，骨片主要成份为碳酸钙，针对这一特性，本发明提供了一种海参幼体的荧光标记方法，通过使用200mg/L浓度的钙黄绿素，在黑暗环境浸泡海参幼体20-24小时；或者通过注射的方式将200mg/L浓度的钙黄绿素注射入海参体腔进行标记。标记后体壁中50%以上的骨片将染上钙黄绿素，且养殖1年后标记个体的骨片荧光检出率仍在5%以上。此种标记方法不会影响海参幼体的摄食与生长，经2年后标记物钙黄绿素将通过海参的新陈代谢彻底清除体内。

Description

一种海参幼体的荧光标记方法

技术领域

本发明属于海洋生物的标记方法领域，特别涉及一种海参幼体的荧光标记方法。

背景技术

海参是珍贵的海产品之一，野生的海参资源日益匮乏。通过人工增殖放流是恢复野生海参资源的重要方法。为了评估增殖放流效果，需要定期回捕放流个体，因此必须有效区分人工增殖个体与野生个体。海参身体含有较高的自溶酶，国内外研究表明，采用传统的物理标记，如在体表穿刺、皮下埋植标记，穿刺或埋植部位容易发生炎症反应，附着物很快被清除，达不到有效标记的目的。

发明内容

本发明克服了现有技术的缺陷，提供了一种简便、安全的海参幼体的荧光标记方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种海参幼体的荧光标记方法，其特征在于使用钙黄绿素溶液标记海参幼体。

海参幼体为3-10g的小型个体时，钙黄绿素溶液是通过浸泡的方式标记海参幼体；浸泡步骤为：                                                将待标记的海参幼体置于装有海水的不透光容器中，加入钙黄绿素溶液；黑暗环境下将海参幼体在浓度为200mg/L的钙黄绿素海水溶液混合液中浸泡20-24小时后，用新鲜的海水置换容器内的混合液，幼体标记完成。

当海参幼体为10-30g的大型个体时，钙黄绿素溶液是通过注射的方式标记海参幼体；注射步骤为：将待标记的海参幼体置于装有4/5容器体积海水的不透光容器中，将浓度为200mg/L的钙黄绿素溶液注射入海参幼体体腔，黑暗环境下将注射过钙黄绿素溶液的海参幼体放置20-24小时，用新鲜的海水置换容器内的混合液，幼体标记完成。

钙黄绿素溶液由钙黄绿素母液稀释而成；钙黄绿素母液由钙黄绿素和灭菌水配制成；钙黄绿素母液浓度为200mg/ml，于4℃避光保存。

浸泡标记法里的海水或钙黄绿素海水混合液的水体溶解氧浓度不小于5.0mg/L；注射标记法里的海水的水体溶解氧浓度不小于5.0mg/L。

使用浸泡方法时，新鲜海水置换混合液的方法为每隔8小时向容器内添加等体积的新鲜海水，添加3次。

使用注射方法时，注射钙黄绿素溶液使用剂量为0.3-0.5 ml/尾海参幼体；注射部位为海参体后三分之一位置的体侧。

海参的体壁分布了大量的骨片，骨片主要成份为碳酸钙，针对这一特性，本发明通过钙黄绿素在黑暗环境浸泡或者注射的方式将其置入海参体腔进行标记。标记后海参幼体体壁中50%以上的骨片将染上钙黄绿素，通过紫外光手电筒在暗环境现场照射检测，标记个体的体表产生荧光，或取少量组织分离骨片，通过荧光显微镜对海参骨片检测，可以看到标记个体的部分骨片产生荧光，而野生个体的骨片不会产生荧光。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）     本发明的标记方法不会影响海参幼体的摄食与生长。

（2）     本发明的标记方法长久耐用，标记可有效保持12个月以上，此种标记方法12个月以后标记个体的骨片荧光检出率仍在5%以上。

（3）     本发明的标记方法是安全有效的海参人工增殖放流化学标记法。由于商品海参一般需要经过2年以上的养殖才能达到上市规格，而本发明的标记物质将通过海参的新陈代谢在2年内从海参幼体体内彻底清除，不会影响食品安全。

具体实施方式

实施例1

取个体平均重量为4.50g的糙刺参幼体，采取浸泡方式标记，具体实施方式如下：

1、将钙黄绿素（Calcein）用灭菌水配制成200mg/ml浓度的母液，于4℃避光保存。

2、将欲标记的海参幼体收集，置于50L体积的不透光敞口盆，加海水10L，并连续充气，使水体溶解氧达到5.0mg/L。

3、将10ml钙黄绿素母液添加至敞口盆海水中，使终浓度为200mg/L，轻轻搅动使母液分布均匀。

4、用遮光布将敞口盆遮光，并保持连续充气，使水体溶解氧达到5.0mg/L，放置22小时。

5、放置22小时后，向盆内添加10L新鲜海水，每隔8小时再添加1次，共添加3次。

6、用新鲜的海水置换盆内的所有海水，幼体标记完成。

7、检验标记效果，用紫外光手电筒在黑暗环境照射，标记过的幼体发出黄绿色的荧光；或取标记过的幼体少量皮肤组织于培养皿中，用3%的次氯酸钠溶液将组织溶解析出骨片，用蒸馏水清洗骨片后在荧光显微镜下观察骨片，可以看到部分骨片发出黄绿色的荧光。随机选择不同视野计数，发光骨片的比率为52.3%至54.9%。

8、将浸泡标记过的海参幼体与同批次未标记的幼体放在同一个养殖池中，采用同样的方法养殖24个月，每3个月分别随机各取30尾测量体长体重，并计数两者的成活率，检测标记个体的发光骨片比率，结果证实，荧光标记个体的体长、体重及成活率与未标记个体无显著差异；第6、12、18、24月的骨片发光率分别为21.8%、7.6%、2.5%和0%。

实施例2

取个体平均重量为15.40g的糙刺参幼体，采取注射方式标记，具体实施方式如下：

1、将钙黄绿素（Calcein）用灭菌水配制成200mg/ml浓度的母液，于4℃避光保存。

2、将欲标记的海参幼体收集，置于50L体积的不透光敞口盆，加海水40L，并连续充气，使水体溶解氧达到5.0mg/L。

3、在黑暗环境下，取0.1ml钙黄绿素母液于干净的烧杯中，用99.9ml灭菌海水将母液稀释，使终浓度为200mg/L，避光保存。

4、用2ml的无菌注射器吸取稀释后的钙黄绿素稀释溶液，按每尾0.3ml的剂量注射入海参体腔，注射部位为海参体后三分之一位置的体侧。

5、用遮光布将敞口盆遮光，并保持连续充气，使水体溶解氧达到5.0mg/L，放置20小时。

6、用新鲜的海水置换盆内的所有海水，幼体标记完成；

7、检验标记效果，用紫外光手电筒在黑暗环境照射，标记过的幼体注射部位会发出黄绿色的荧光。

8、将浸泡标记过的海参幼体与同批次未标记的幼体放在同一个养殖池中，采用同样的方法养殖24个月，每3个月分别随机各取30尾测量体长体重，并计数两者的成活率，检测标记个体的发光骨片比率，结果证实，注射荧光标记个体的体长、体重及成活率与未标记个体无显著差异；第6、12、18、24月的骨片发光率分别为20.3%、6.5%、1.7%和0%。

Claims (6)

1.一种海参幼体的荧光标记方法，其特征在于使用钙黄绿素溶液标记海参幼体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于当海参幼体为3-10g的小型个体时，钙黄绿素溶液是通过浸泡的方式标记海参幼体；浸泡步骤为：                                                用海水稀释钙黄绿素溶液成为浓度为200mg/L的钙黄绿素海水溶液；黑暗环境下将海参幼体在浓度为200mg/L的钙黄绿素海水溶液混合液中浸泡20-24小时后，用新鲜的海水置换容器内的混合液，幼体标记完成。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于当海参幼体为10-30g的大型个体时，钙黄绿素溶液是通过注射的方式标记海参幼体；注射步骤为：将待标记的海参幼体置于装有海水的不透光容器中，将浓度为200mg/L钙黄绿素溶液注射入海参幼体体腔，黑暗环境下将注射过钙黄绿素溶液的海参幼体放置20-24小时，用新鲜的海水置换容器内的混合液，幼体标记完成。

4.如权利要求2或3所述的任一方法，其特征在于所述的钙黄绿素海水溶液或钙黄绿素溶液由钙黄绿素母液稀释而成；钙黄绿素母液由钙黄绿素和灭菌水配制成；钙黄绿素母液浓度为200mg/ml，于4℃避光保存。

5.如权利要求2或3所述的任一方法，其特征在于所述海水或钙黄绿素海水混合液的水体溶解氧浓度不小于5.0mg/L。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于注射钙黄绿素溶液使用剂量为0.3-0.5 ml/尾海参幼体；注射部位为海参体后三分之一位置的体侧。