CN102164606B - 光稳定化药物组合物 - Google Patents

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Abstract

抑制因光照导致透明质酸-甲氨蝶呤缀合物发生的交联反应和低分子化反应，从而提高透明质酸-甲氨蝶呤缀合物的光稳定性。具体而言，在含有透明质酸-甲氨蝶呤缀合物的药物组合物中添加具有消光效果和/或自由基捕捉效果的物质。

Description

光稳定化药物组合物
背景技术
在当今老龄化社会中，患有包括变形性关节炎(以下也称为“OA”)在内的关节疾病的患者数量不断增加。本发明人等在在先申请中提供了由透明质酸(以下也称为“HA”)与甲氨蝶呤(以下也称为“MTX”)的缀合物组成的、作为关节疾病治疗药而有用的药物组合物(WO05/85294号)。该缀合物是兼备了HA的特征和MTX的特征的优异的化合物，HA的特征在于能够作为可代替甾体制剂的安全的关节疾病用的关节注入剂而利用。MTX的特征在于能够抑制滑膜炎。
但是，通过之后的研究表明：该化合物受到光照射时，容易发生凝胶化、分子量的降低，保存稳定性未必可以说是充分的。因此，推荐将由透明质酸-甲氨蝶呤缀合物组成的药物组合物保存在阴凉处，待即将使用之前再取出。或者，还有通过铝箔等完全遮光的方法。但是，可以设想到：在医院等医疗现场中从阴凉处取出药物组合物后、拆除遮光性的包装后，经常会将该组合物放置在光之下几小时～十几小时左右。如此，仅通过用遮光性的包装材料包装药物的容器的方法，未必能充分确保透明质酸-甲氨蝶呤缀合物的充分的稳定性，因此期望提高其光稳定性。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO05/85294号公报
发明内容
发明要解决的问题
本发明人等对于由光照导致HA-MTX缀合物不稳定的原因(引起凝胶化、分子量降低的原因)进行了研究，结果推测为该光不稳定化的现象与至少两种反应相关。
在第一反应中，光照使得来自MTX残基的蝶啶环(a)从透明质酸-甲氨蝶呤缀合物分子脱离(图1的反应A)，在该缀合物分子中生成氨基苯甲酸部分(b)，然后两个该氨基苯甲酸部分结合在一起而形成偶氮二聚体(图1的反应B)。结果透明质酸分子之间通过偶氮二聚体而发生交联。
该反应机制可由后述的实施例2和3而得到启示。另外，已知在对MTX分子自身照射光时也能够形成偶氮二聚体(Photochemistry and Photobiology Vol.44，No.2，pp.231-233，1986；C.Chahide，et al)，依此也可以印证上述的反应机制。
可以认为，以这种方式发生的交联会使透明质酸-甲氨蝶呤缀合物发生凝胶化。
在第二反应中，认为通过光照而产生自由基种，该自由基种作用于透明质酸-甲氨蝶呤缀合物的透明质酸的聚合物链，其结果是，该缀合物的分子量降低。
因此，本发明的目的在于，抑制由光照导致透明质酸-甲氨蝶呤缀合物发生的上述两种反应，从而提高透明质酸-甲氨蝶呤缀合物的光稳定性。
用于解决问题的方案
为了防止由光照而引起的凝胶化、分子量降低而提高透明质酸-甲氨蝶呤缀合物的光稳定性，本发明人等进行了深入研究。其结果发现，通过在含有透明质酸-甲氨蝶呤缀合物的药物组合物中配合光稳定化剂，从而能够提高透明质酸-甲氨蝶呤缀合物的稳定性，具体而言，所述光稳定化剂是具有从处于由光照产生的激发态的分子吸收能量的效果(消光效果)、和/或捕捉由光照所产生的自由基的效果(自由基捕捉效果)的物质。该效果也能够应用于透明质酸衍生物与甲氨蝶呤的缀合物中。根据该见解，完成了本发明。
即，本发明涉及一种光稳定化药物组合物，其含有透明质酸或透明质酸衍生物与甲氨蝶呤的缀合物或其盐以及光稳定化剂。
本发明的另一方面提供了上述药物组合物，其中，组合物中的光稳定化剂的配合量为0.01～30％(w/v)。
本发明的又一方面还提供了上述药物组合物，其中，光稳定化剂为消光剂或自由基捕捉剂。优选的是，光稳定化剂既是消光剂又是自由基捕捉剂。
本发明的另一方面提供了上述药物组合物，其中，光稳定化剂为含硫的无机酸、含硫的有机酸、芳香族氨基酸衍生物或羟基苯甲酸类、或者它们的盐。
此外，本发明的另一方面提供了一种药品，其用包装材料包装上述药物组合物而成，所述包装材料至少阻断320～430nm的范围的整个光波长区域、优选阻断540nm以下的整个波长区域的光。
发明的效果
本发明中，通过添加光稳定化剂，能够提高透明质酸或透明质酸衍生物与甲氨蝶呤的缀合物的光稳定性。此外，能够提供一种药物组合物，其即使在拆除包装后可以长时间放置、这种在医疗现场的实践下处理，也能够充分确保稳定性。进而，在本发明中，通过并用用于阻断光的包装，能够进一步提高光稳定性。
附图说明
图1表示因光照导致HA-MTX缀合物发生的反应。
图2A表示未光照的HA-MTX缀合物的酶消化后的HPLC谱图。
图2B表示光照后经酶消化的HA-MTX缀合物的HPLC谱图。
图3表示光照后经酶消化的HA-MTX缀合物的反相制备型HPLC谱图。
图4表示反相制备级分F的MALDI-TOFMS光谱。
图5表示稳定化剂给HA-MTX缀合物的激发光谱带来的影响。
图6A表示遮光薄膜在各种波长下的透光性。
图6B表示遮光薄膜在各种波长下的透光性。
图6C表示遮光薄膜在各种波长下的透光性。
图6D表示遮光薄膜在各种波长下的透光性。
图7表示遮光薄膜在各种波长下的透光性。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
透明质酸-甲氨蝶呤缀合物
本说明书中所使用的“透明质酸-甲氨蝶呤缀合物”是指，具有透明质酸或透明质酸衍生物的分子与甲氨蝶呤分子直接地缀合而成的结构或通过连接体间接地缀合而成的结构的化合物、或者其盐。以下，将该缀合物也称作“HA-MTX缀合物”。
本说明书中的所谓“透明质酸”的用语，没有特别的限制，但例如是具有5万～1000万道尔顿的平均分子量的、由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺形成的二糖的聚合物。本发明中可以使用游离的透明质酸，也可以使用其盐。本发明中所使用的透明质酸的盐没有特别的限制，包括：例如钠盐、钾盐、钙盐、铝盐、锌盐、铁盐、铵盐、四丁基铵盐等。作为透明质酸及其盐、以及它们的混合物的具体例，包括：例如商品名Suvenyl(注册商标，制造和销售：中外制药株式会社)；商品名Artz(注册商标，制造：生化学工业株式会社，销售：科研制药株式会社)；商品名Opegan(注册商标，制造：生化学工业株式会社，销售：参天制药株式会社)等。本发明中的所谓“透明质酸衍生物”的用语是指由透明质酸衍生出的具有透明质酸骨架的物质。作为透明质酸衍生物，没有特别的限制，包括：例如透明质酸中的一个以上的羧基被酯化而得到的物质(例如，苄基酯化透明质酸(商品名Hyaff(注册商标)，Fidia Advanced Biopolymers))，通过甲醛使透明质酸发生交联而进一步高分子化而得到的物质(例如，商品名Synvisc(注册商标)，Biomatrix))，透明质酸中的一个以上的羟基被乙酰化而得到的乙酰化透明质酸等。在以下的说明中所使用的所谓“HA”的用语，是指透明质酸或透明质酸衍生物、或者其盐。
关于本发明的HA-MTX缀合物，不应损害HA的疼痛消除作用，因此作为HA-MTX缀合物，优选保持有与临床上确认到疼痛消除作用的HA同等的分子量大小和粘弹性的缀合物。此外，考虑到分子量变大时粘弹性升高而变得难以进行处理、以及HA作为生物体内的载体的效果，具体而言，HA-MTX缀合物的分子量优选为60万～600万道尔顿，HA-MTX缀合物的分子量更优选为80万～600万道尔顿，HA-MTX缀合物的分子量特别优选为100万～500万道尔顿。
在此，通过由特性粘度计算粘度平均分子量的方法来测定上述原料HA的分子量、HA-MTX缀合物的分子量。有关特性粘度，将试样溶解于0.2M NaCl水溶液中，使用乌氏粘度计(草野科学制造，粘度计编号0C)，在恒温槽中30℃下进行测定。使用下列公式可以计算从特性粘度([η])到粘度平均分子量(Mw)的转换。
Mw＝([η]/0.00036)1.282
适用于本发明的HA-MTX缀合物，例如有本申请人所申请的WO05/85294号中记载的HA-MTX缀合物。
具体而言，该缀合物为甲氨蝶呤通过含有由1～8个氨基酸组成的肽链的连接体与HA的羧基缀合而成的HA-MTX缀合物。
优选的是：该连接体包含由1～8个氨基酸组成的肽链、和可插入1～5个氧原子和/或可被羧基或C1-6烷氧羰基取代的C2-20亚烷基二胺链。
进一步优选的是：上述HA-MTX缀合物中，与连接体缀合的甲氨蝶呤用式(I)、(II)、(III)或(IV)来表示。
Figure BPA00001335058300061
Figure BPA00001335058300071
[式中，R1和R2分别独立地为羟基、氨基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基或二-C1-6烷氨基；
L0为连接体的缀合位置。]
进一步优选的是：上述HA-MTX缀合物中，含有肽链的连接体和与该连接体缀合的甲氨蝶呤用式(I’)或(II’)来表示。
Figure BPA00001335058300072
[式中，R1和R2分别独立地为羟基、氨基、C1-6烷氧基、C1-6烷氨基或二-C1-6烷氨基；
L是用式(X)表示的连接体。
Figure BPA00001335058300081
(式中，Q1与其所缀合的-NH-一起形成由1～8个氨基酸组成的肽链，该肽链内包含的氨基酸的各残基独立地可被选自由C1-6烷基、C1-6烷羰基、C1-6烷氧羰基、甲酰基、C1-6烷基磺酰基和C6-10芳基磺酰基组成的组中的一个以上基团取代或保护；该肽链内包含的各酰胺键独立地在氮原子上可被一个以上的C1-6烷基和/或C1-6烷羰基取代；该残基内包含的各羧基可独立地转变成可被一个或两个C1-6烷基取代的酰胺基；
R11和12分别独立地为氢原子或C1-6烷基；
Q2是可插入1～5个氧原子和/或可被羧基或C1-6烷氧羰基取代的C2-20亚烷基；和
[HA]表示与透明质酸的缀合位置，该连接体与该HA内包含的羧基形成酰胺键。)]
本发明的优选方式中所使用的连接体的肽链可通过氨基酸来构成。作为该氨基酸，包括：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、天冬胺酸、赖氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、蛋氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸等天然α-氨基酸，以及具有烷基侧链的α-氨基酸(例如原缬氨酸、正亮氨酸、叔亮氨酸等)、被环烷基取代的丙氨酸或甘氨酸(例如环戊基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸等)、或被芳基取代的丙氨酸或甘氨酸(例如吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸、萘基丙氨酸、取代的苯丙氨酸、苯基甘氨酸等)等非天然α-氨基酸，β-丙氨酸等β-氨基酸，γ-氨基丁酸等γ-氨基酸，及牛磺酸等氨基磺酸等。本发明的连接体肽中的氨基酸也包括其残基被适当取代或保护的氨基酸。例如，可以使用保护基保护该残基上的官能团。用于该目的的保护基是该技术领域所公知的，其部分实例记载于本说明书的其他段落中。各取代基和保护基、尤其是保护基的引入方法可以使用该技术领域中公知的方法。
该连接体可以仅由氨基酸构成，也可在肽链内或末端包含源自氨基酸以外的化合物的部分。例如，该连接体还包括在肽链内或末端缀合有如亚烷基二胺、氧杂亚烷基二胺之类的二氨基化合物或如琥珀酸之类的二羧酸化合物的物质等。在肽链内或末端包含氨基酸以外的化合物的情况下，在该连接体与甲氨蝶呤(MTX)的羧基和HA的羧基相缀合时，优选在肽链的末端存在如亚烷基二胺、氧杂亚烷基二胺之类的二氨基化合物，特别优选在肽链的末端存在乙二胺、4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺。此外，构成肽链的氨基酸没有特别的限制，但从对蛋白酶的亲和性的观点出发，优选α-氨基酸，含有肽链的连接体的与MTX缀合的末端优选为α-氨基酸。
构成该肽链的氨基酸的数目，没有特别的限制，但典型地为1～8，优选为1～6，特别优选为1～4。构成该肽链的氨基酸的各残基可以独立地被一个以上的基团适当取代或保护。作为这样的基团，包括：C1-6烷基、C1-6烷羰基、C1-6烷氧羰基(例如甲氧羰基、乙氧羰基、(正-或异-)丙氧羰基和(正-、仲-或叔-)丁氧羰基)、甲酰基、C1-6烷基磺酰基(例如甲磺酰基、乙磺酰基和(正-或异-)丙磺酰基)、C6-10芳基磺酰基(例如苯磺酰基、(邻-、间-或对-)甲苯磺酰基和(1-或2-)萘磺酰基)，但不受这些基团的限制。通过取代或保护，例如，该残基内包含的羧基可转变成C1-6烷氧羰基；羟基可转变成C1-6烷氧基或C1-6烷羰基氧基；氨基可转变成C1-6烷氨基、二-C1-6烷氨基、C1-6烷羰基氨基或N-C1-6烷基-C1-6烷羰基氨基。此外，该残基内包含的羧基可转变成可被一个或两个C1-6烷基取代的酰胺基。当该残基中包含如吲哚环、咪唑环之类的含氮杂环时，该环上的氮原子可各自独立地被C1-6烷基或C1-6烷羰基保护。当该残基中存在胍基时，其中包含的氮原子也可被C1-6烷基或C1-6烷羰基保护。作为对于氮原子的其他保护基，没有特别的限制，也可选择如上述的烷氧羰基、甲酰基、C1-6烷基磺酰基、C6-10芳基磺酰基之类的常用基团。在该残基内包含硫醇基时，可被C1-6烷基或C1-6烷羰基保护。此外，该肽链内包含的酰胺键也可被C1-6烷基和/或C1-6烷羰基取代，也可转变成例如-CON(C1-6烷基)-。
构成肽链的氨基酸序列，没有特别的限制，例如可列举出如以下所述的氨基酸序列。另外，当作为靶的活体内蛋白酶存在、并且其底物识别的氨基酸序列已知时，也可使用包含其识别位点和/或切断位点的氨基酸序列。
由一个氨基酸组成的肽链：Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val等。优选Phe、Tyr、Ile、Glu。
由两个氨基酸组成的肽链：PhePhe、PheGly、PheLeu、TyrPhe、TrpPhe、PheTrp、PheTyr、GlyPhe、GlyGly等。优选PhePhe、PheGly。
由三个氨基酸组成的肽链：PheGlyGly、PheLeuGly、PhePheGly、AsnPhePhe、GlyPhePhe、LeuPhePhe、LeuAlaLeu、AlaValAla、GlyAlaPhe、GlyPheAla、GlyIleAla、GlyIlePhe、GlyLeuAla、GlyValAla、GlyValPhe、GlyGlyGly等。优选AsnPhePhe。
由四个氨基酸组成的肽链：GlyPheLeuGly、GlyPhePheLeu、GlyPhePheAla、GlyPheTyrAla、GlyPheGlyPhe、GlyPheGlyGly、GlyGlyPheGly、GlyGlyPheTyr、GlyGlyGlyGly、LeuAlaLeuAla、AlaLeuAlaLeu、AlaGlyValPhe、GluAsnPhePhe等。优选GlyPheLeuGly。
本发明中的连接体可具有例如用上述式(X)表示的结构，此时，Q1与其所缀合的-NH-一起形成如上所述的由1～8个氨基酸组成的肽链。此外，Q2是可插入1～5个氧原子或可被羧基或C1-6烷氧羰基取代的C2-20亚烷基。作为Q2的具体例，可列举出乙烷-1，2-二基、丙烷-1，3-二基、丁烷-1，4-二基、戊烷-1，5-二基、己烷-1，6-二基、庚烷-1，7-二基、辛烷-1，8-二基、壬烷-1，9-二基、癸烷-1，10-二基、2-甲基丙烷-1，3-二基、2-甲基丁烷-1，4-二基、3-甲基丁烷-1，4-二基、3-甲基戊烷-1，5-二基、3-乙基戊烷-1，5-二基、2-甲基己烷-1，6-二基、3-甲基己烷-1，6-二基、4-甲基庚烷-1，7-二基、3-氧杂戊烷-1，5-二基、3-氧杂己烷-1，6-二基、4-氧杂己烷-1，6-二基、3-氧杂庚烷-1，7-二基、4-氧杂庚烷-1，7-二基、4-氧杂辛烷-1，8-二基、3，6-二氧杂辛烷-1，8-二基、3，6-二氧杂壬烷-1，9-二基、3，6-二氧杂-4-甲基壬烷-1，9-二基、4，7-二氧杂癸烷-1，10-二基、4，9-二氧杂十二烷-1，12-二基、4，7，10-三氧杂十三烷-1，13-二基等，优选可列举出乙烷-1，2-二基、戊烷-1，5-二基、3-氧杂戊烷-1，5-二基、3，6-二氧杂辛烷-1，8-二基、4，7-二氧杂癸烷-1，10-二基、4，9-二氧杂十二烷-1，12-二基、4，7，10-三氧杂十三烷-1，13-二基等。
在本发明组合物中使用的HA-MTX缀合物中，MTX与连接体的缀合方式没有特别的限制。但是，典型地是，含有肽链的连接体缀合于：
1)MTX的α位的羧基；
2)MTX的γ位的羧基；和
3)MTX的氨基。
并且，这些缀合方式可多种混合存在(例如，与MTX的α位的羧基缀合的缀合物和与MTX的γ位的羧基缀合的缀合物可混合存在)。但是，从对蛋白酶的亲和性和合成方面的观点出发，含有肽链的连接体优选与MTX的α位的羧基和/或γ位的羧基缀合，该连接体更优选与MTX的α位的羧基缀合。
在本发明的组合物中使用的HA-MTX缀合物中，具有含有肽链的特别优选的连接体和特别优选的缀合方式的HA-MTX缀合物是如下缀合物：含有肽链的连接体是在由α-氨基酸组成的肽链的末端存在二氨基化合物的连接体，该肽链的N末端通过酰胺键与MTX的α位的羧基缀合，该肽链的C末端经由二氨基化合物通过酰胺键与HA的羧基缀合。
本发明的HA-MTX缀合物中的甲氨蝶呤(MTX)部分，除了被连接体修饰以外，还可通过公知的方法制备成前药形式。
本说明书中的“C1-6烷基”是指碳原子数1～6的直链或支链状的烷基，包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、3-甲基丁基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基和正己基等。
本说明书中的“C1-6烷羰基”是指碳原子数1～6的直链或支链状的烷羰基，包括例如乙酰基、丙酰基、2-甲基丙酰基、2，2-二甲基丙酰基等具有之前定义的烷基作为烷基部分的烷羰基。
本说明书中“的C1-6烷氧基”是指碳原子数1～6的直链或支链状的烷氧基，包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基等具有之前定义的烷基作为烷基部分的烷氧基。
本说明书中的“C1-6烷氨基”是指碳原子数1～6的直链或支链状的烷氨基，包括例如甲氨基、乙氨基、正丙氨基等具有之前定义的烷基作为烷基部分的烷氨基。
本说明书中的“二C1-6烷氨基”是指碳原子数1～6的直链或支链状的二烷氨基，包括例如二甲氨基、乙基甲氨基、二乙氨基、乙基正丙氨基等具有可相同或不同的之前定义的烷基作为烷基部分的二C1-6烷氨基。
本说明书中的“二C2-20亚烷基”是指碳原子数2～20的直链或支链状的亚烷基，包括例如亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚辛基、亚癸基等。
本说明书中的“C1-6烷氧羰基”是指碳原子数1～6的直链或支链状的烷氧羰基，包括例如甲氧羰基、乙氧羰基、正丙氧羰基等具有之前定义的烷基作为烷基部分的C1-6烷氧羰基。
本说明书中的“C1-6烷基磺酰基”是指碳原子数1～6的直链或支链状的烷基磺酰基，包括例如甲磺酰基、乙磺酰基、正丙磺酰基等具有之前定义的烷基作为烷基部分的C1-6烷基磺酰基。
本说明书中的“酰化”包括C1-6烷羰基化和苯甲酰化等，该苯甲酰基可被C1-6烷基、卤素原子、C1-6烷氧基等取代。
本发明的HA-MTX缀合物中的MTX的缀合率优选在发挥药效且不用担心副作用的范围。本说明书中的MTX的缀合率可以通过以下公式计算：
MTX的缀合率没有特别的限制，从体现药效的观点出发，优选0.5％以上，更优选1.0％以上。另一方面，为了使MTX的作用局限在给药部分、并减小MTX具有的全身性的副作用，缀合率优选小于10％。此外，考虑到本发明的HA-MTX缀合物当分子量大且MTX的缀合率高时该缀合物不溶解从而在合成方面带来麻烦，因此MTX的缀合率优选0.5％以上且小于4.5％，特别优选1.0％以上且小于4.5％。
本发明的HA-MTX缀合物也可以盐的形式存在，但考虑到其用途，优选为药学上可容许的盐。例如可列举出钠盐、钾盐、钙盐、铝盐、锌盐、铁盐、铵盐、四丁基铵盐等。
作为HA-MTX缀合物的合成法，只要适当使用WO05/85294号中记载的方法即可。简要说明的话，可以通过使HA、含有肽链的连接体、MTX以适当的顺序缀合而得到HA-MTX缀合物。这些缀合反应可以使用在通常的酰胺键反应中使用的溶剂、缩合剂及根据需要添加的反应促进性的添加剂来进行。溶剂、缩合剂、温度等反应条件只要考虑WO05/85294号的记载和有机化学领域的技术常识进行适当选择即可。
光稳定化剂
本说明书中的所谓“光稳定化剂”的用语是指具有从处于由光照引起的激发态的分子吸收能量的消光效果、可捕捉自由基的自由基捕捉效果、或这两方面的效果的物质。
作为消光剂，优选具有抑制由320～430nm的光照所激发的HA-MTX缀合物发出的荧光生成的效果(消光效果)的物质。
可适用于本发明的具有消光效果或/和自由基捕捉效果的光稳定化剂的例子包括下述(a)～(c)的化合物。
(a)含硫的无机酸或有机酸以及它们的盐
该化合物组包括例如硫代硫酸钠、巯基乙酸、巯基乙酸铵、巯基乙酸钠、巯基乙酸钾、巯基乙酸乙酯、硫代苹果酸、硫代苹果酸铵、硫代苹果酸钠、硫代苹果酸钾、巯基丙酸、巯基丙酸铵、巯基丙酸钠和巯基丙酸钾。
优选的化合物为硫代硫酸、硫代硫酸钠、巯基乙酸、巯基乙酸铵、巯基乙酸钠、巯基乙酸钾和巯基乙酸乙酯。
特别优选的化合物为硫代硫酸、硫代硫酸钠和巯基乙酸钠。
(b)芳香族氨基酸衍生物及其盐
该化合物组包括例如N-乙酰基色氨酸、色氨酸、色氨酸甲酯、色氨酸乙酯、酪氨酸和苯丙氨酸以及它们的盐。
优选的化合物为N-乙酰基色氨酸和色氨酸。
特别优选的化合物为N-乙酰基色氨酸。
这些氨基酸衍生物的盐，没有特别的限制，包括例如盐酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐等酸加成盐；和钠盐、钾盐、钙盐、铝盐、锌盐、铁盐、铵盐、四丁基铵盐等碱加成盐。
(c)羟基苯甲酸类及其盐
该化合物组包括例如水杨酸、水杨酸钠、水杨酸甲酯、水杨酸乙酯、水杨酸苯酯、水杨酸苯酯、水杨酸苄酯、水杨酸异戊酯、对羟基苯甲酸甲酯(尼泊金甲酯)、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸正丁酯、对羟基苯甲酸异丁酯、4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸钠、3-羟基苯甲酸和3-羟基苯甲酸钠。
优选的化合物为水杨酸、水杨酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。
特别优选的化合物为水杨酸、水杨酸钠和对羟基苯甲酸甲酯。
虽然不受理论的限制，但认为光稳定化剂通过以下方式来发挥其效果。
首先，参照图1对通过光照而发生的第一反应进行说明。受光照的HA-MTX缀合物的MTX部分处于激发态。此时，认为在从激发单线态向基态的电子跃迁的过程中放出荧光。具有蝶啶环的化合物(a)容易从处于激发态的MTX部分脱离，并且在其脱离后形成该缀合物的残存部(包含2-(4-氨基苯甲酰氨基)-4-羧丁基羰基的、蝶啶环脱离的MTX-连接体-HA)(b)(反应A)。进而，两个该残存部(b)一起形成偶氮二聚体(反应B)，认为结果是透明质酸分子之间通过偶氮二聚体而发生交联。
事实上，由于HA-MTX缀合物发出荧光的激发波长的区域与使该缀合物发生凝胶化的光的波长区域大体上是一致的(实施例1)，而且在光照后的HA-MTX缀合物中包含MTX的蝶啶环脱离而生成的偶氮二聚体(实施例2和3)，因此可认为HA-MTX缀合物的荧光生成与凝胶化密切相关。本申请发明中使用的光稳定化剂具有较强的消光作用(从处于激发态的分子吸收能量、相对地抑制荧光生成的效果)，即使照射HA-MTX缀合物可放出荧光的激发波长的光，也可在光稳定化剂的存在下抑制荧光的生成(实施例4)。认为其结果是：可以抑制继激发之后发生的蝶啶环的脱离和偶氮二聚体的形成，进而与凝胶化的抑制有关。
此外，还存在一个可认为是通过光照而发生的反应。该反应为HA-MTX缀合物的低分子化。认为该反应如下进行：通过因光照而处于激发态的MTX部分或者从MTX部分脱离的具有蝶啶环的化合物的直接作用、或由具有蝶啶环的化合物参与的光化学反应所生成的自由基种的间接作用，从而切断HA聚合物分子。认为本发明的光稳定化剂通过对处于激发态的MTX部分的较强的消光作用而抑制蝶啶环的脱离、继其后发生的光化学反应本身，或者通过捕捉由光化学反应产生的自由基种而抑制之前所述那样的低分子化。
本发明的药物组合物
与WO05/85294号公报中记载的含有HA-MTX缀合物的药物组合物同样，含有HA-MTX缀合物和光稳定化剂的本发明的药物组合物对于治疗关节疾病也是有效的。
具体而言，本说明书中的“关节疾病”是指关节软骨缺损、变形性关节炎(包括没有明显起因的原发病和可确认起因疾病的继发病)、肩周炎、类风湿性关节炎、反应性关节炎、病毒性关节炎、化脓性关节炎、结核性关节炎、神经性关节病等疾病，进而还包括这些疾病中的关节痛(例如类风湿性关节炎中的膝关节痛等)。此外，所谓“关节疾病治疗药”不仅包括用于治疗上述关节疾病的药物，而且包括用于预防这些疾病的药物、用于抑制病情发展(防止恶化或维持现状)等的药物。
向有效量的HA-MTX缀合物中适当添加药学上可容许的载体、赋形剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、香料、着色剂等，可以作为药物组合物来使用。以本发明的HA-MTX缀合物为有效成分的药物组合物优选用作关节疾病治疗药，其中特别优选用作关节局部给药制剂。
将本发明的药物组合物制备成制剂(例如关节疾病治疗药)的方法，没有特别的限制，例如，可以使HA-MTX缀合物和光稳定化剂以所期望的浓度溶解在生理盐水或磷酸生理盐水等中，制备成注射用溶液的形式；也可以制备成在使用时溶解的注射用粉末剂的形式。此时，为了将溶液调节至所期望的pH值，可根据需要添加酸或碱。此外，为了将溶液调节至所期望的盐浓度，可添加钠盐、钾盐等1价金属盐，镁盐、钙盐、锰盐等2价属盐等无机盐等。进而，可根据期望加入稳定化剂等。这样制备的经溶解而得到的溶液可以预先填充在一次性注射筒等注射器中的形式进行流通。
将本发明的组合物作为以HA-MTX缀合物为有效成分的关节疾病治疗药进行给药时，只要每次给患者投与1～3mL的以0.01％～10％(w/v)的溶液浓度、优选以0.1％～2.0％(w/v)的溶液浓度、特别优选以0.5％～1.5％(w/v)的溶液浓度含有HA-MTX缀合物的组合物即可。但是，该给药量可分别根据医师指示、受治疗患者、疾病的种类及其严重性、或HA-MTX缀合物的分子量等而适当增减至最佳给药量。
本发明的药物组合物为溶液(例如注射剂溶液)时，光稳定化剂在该溶液中以0.01～30％(w/v)、优选以0.1～20％(w/v)、特别优选以0.5～15％(w/v)的范围的浓度存在(“％(w/v)”表示100ml该溶液中所溶解的该物质的g。例如，30％(w/v)是指100ml溶液中溶解光稳定化剂30g)。组合物为在使用时溶解的粉末剂(例如注射用粉末剂)时，在以制品的指示书中规定的量的溶剂溶解该粉末剂而得到的溶液中，以光稳定化剂为0.01～30％(w/v)、优选0.1～20％(w/v)、特别优选0.5～15％(w/v)的范围的浓度存在的方式包含光稳定化剂。
包装材料
本发明中，用阻断具有特定波长的光的包装材料包装本发明的药物组合物时，对光照的稳定性进一步提高，故优选。可以使用像100％阻断光透射之类的、例如由铝层压而成的薄膜等，但考虑到实际的医疗现场中的便利性，与完全阻断光透射相比，使用可确认内容物的包装时，其商品价值也更高，故优选。因此，作为以能够确认包装内容物的程度保持光的透射、并且对本发明的药物组合物的稳定性有贡献的包装材料，使用具有阻断具有可给稳定性带来不良影响的特定范围波长的光或使具有该范围的波长的光的透射率减少的特征的包装材料时，对包装时的光照的稳定性进一步提高，并且在商品价值方面也是优选的。可以适用阻断具有优选至少320～430nm、进一步优选540nm以下的波长的光的包装材料。可任选阻断或不阻断不包含在前述范围的波长的光，但从自外部能够确认到所包装的内容物的状况的观点出发，包装材料优选具有不阻断或不减少不包含在上述范围的波长的至少一部分的波长、优选上述范围以外的波长的光、更优选可见光区域的波长(380～780nm)中不包含在上述范围的波长的光的特征。
但是，也可以将以铝层压而成的薄膜等阻断包含上述特定范围的波长的所有波长的光的包装材料与不阻断上述特定范围的波长的光以外的包装材料并用。例如，在制品独立包装时，为了在医疗现场中直至使用之前能确认内容物，使用不阻断上述特定范围的波长的光以外的包装材料进行包装，作为将这样独立包装的制品各数个一起装箱时所使用的箱子，可以进一步使用以铝层压而成的薄膜等阻断包含上述特定范围的波长的所有波长的光的包装材料。
本说明书中某物质具有“遮光”作用或“光阻断”作用的情况是指该物质所具有的光透射率为10％以下。光透射率可以使用本领域技术人员公知的任意方法进行测定，例如，像后述的实施例5所记载的那样，通过分光光度计进行测定。从凝胶化、低分子化的观点来看，对HA-MTX缀合物照射的光的光透射率越低越理想。优选“遮光”或“阻断”在实际的使用环境下实质上凝胶化和低分子化得以抑制的范围即320～430nm、优选540nm以下的光。
作为包装材料，可列举出用可吸收具有上述波长的光的氧化钛、炭黑等色素或颜料着色的塑料薄膜例如聚酯薄膜、聚偏氟乙烯(PVDF)薄膜或玻璃等。
包装可通过使用由具有这些特征的包装材料构成的容器来进行；或者通过用这些包装材料包覆容器的外侧来进行。例如可设想出：对注射器或小药瓶的容器使用具有上述特征的包装材料的情况；作为包装通常的注射器、小药瓶时的包装材料使用具有上述特征的包装材料的情况。
在本发明中无需使药品中使用的所有包装材料均为阻断光的包装材料。但是，优选药品的大部分包装材料、特别优选药品的所有包装材料使用至少阻断上述特定范围的波长的光的包装材料。
在使用上述的遮光薄膜等包装材料时，即使降低光稳定化剂的使用量也能够确保充分的稳定性。具体而言，例如可使光稳定化剂的使用量降低至相对于组合物为0.01～2％(w/v)、优选为0.05～1％(w/v)的程度。
实施例
以下通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明不受这些实施例的限制。
制造例1
HA-MTX缀合物的制造
根据WO05/85294公报的实施例2-1中记载的方法，使透明质酸钠盐与缀合在连接体上的甲氨蝶呤(2-[N-[N-[N-[4-[[(2，4-二氨基-6-喋啶基)甲基]甲氨基]苯甲酰基]-α-(O5-甲基谷氨酰基)]苯丙氨酰基]苯丙氨酰基氨基]乙胺：MTX-α-PhePhe-NH-C2H4-NH2)缀合，从而制造HA-MTX缀合物(MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA；DK-226)。通过以透明质酸为标准物质的凝胶过滤色谱法求得该缀合物的分子量。凝胶过滤色谱法使用安装有色谱柱：OHpakSB-806HQ(Shodex)、检测器：RI检测器RI-71(Shodex)和UV检测器875-UV(JASCO，检测波长：304nm)的装置，在以下条件下进行了分析，即，洗脱液：50mM磷酸钠水溶液(pH6.0)；洗脱速度：0.6mL/min；柱温：40℃。
作为标准物质，制备具有不同分子量的透明质酸，通过特性粘度法算出其分子量，备用。通过上述的凝胶过滤色谱法求出该缀合物的洗脱时间，根据标准物质的洗脱时间与分子量的关系求出该缀合物的分子量。该缀合物的分子量为约207万。此外，该缀合物的MTX的缀合率通过测定紫外吸收(259nm)而算出，其结果为2.2％。将HA-MTX缀合物干燥并以粉末状保管，供于以下的实验中。
实施例1
该实验是为了验证由特定波长的光照所致的HA-MTX缀合物的凝胶化、和凝胶化与产生荧光的关系而进行的。
将制造例1中得到的HA-MTX缀合物溶解在含有0.9％NaCl的2mM磷酸缓冲液(pH7.3)中(HA换算浓度9.9mg/ml)，使用液相色谱法用的荧光检测器(日立公司制造，F1050型荧光检测器)照射各种波长的光(260nm、310nm、360nm、405nm)，观察该缀合物的凝胶化和荧光产生。凝胶化的观察通过用刮铲穿刺试样溶液的表面并以目视确认伴随凝胶化的界面形成来进行。此外，有关荧光产生的观察，直接以目视观察对试样照射激发光时的照射前后的发光状态，在照射后观察到较强的发光时为“+”，照射前后未发生变化时为“-”。结果如表1所示。
[表1]
  波长   凝胶化   荧光
  405nm   1小时时发生凝胶化   +
  360nm   1小时时发生凝胶化   +
  310nm   6小时时发生凝胶化   -
  260nm   在24小时时也未发生凝胶化   -
如表1所述，在对HA-MTX缀合物照射特定波长的光时，在360nm、405nm下目视观察到较强的荧光。此外，在这些波长下该缀合物在1小时时发生凝胶化。此外，照射了310nm的光的HA-MTX缀合物，在6小时时也发生凝胶化。另一方面，照射了260nm的光的HA-MTX缀合物，即使经过24小时也未发生凝胶化。
由以上结果可以明确，具有一定范围波长的光会使HA-MTX缀合物发生凝胶化或产生荧光。关于引起凝胶化的波长的范围，可以推测短波长侧的临界点处于比260nm长的波长侧～比310nm短的波长侧；长波长侧的临界点处于比405nm长的波长侧。尤其是关于在短时间内引起凝胶化的波长的范围，可以推测短波长侧的临界点处于比310nm长的波长侧且比360nm短的波长侧；长波长侧的临界点处于比405nm长的波长侧。此外，如实施例4中说明的那样，HA-MTX缀合物的激发波长的范围为包括基于表1以目视观察到较强荧光和短时间内的凝胶化的360nm、405nm在内的320～430nm的范围，由此暗示了HA-MTX缀合物的凝胶化和荧光产生与HA-MTX缀合物的激发波长密切相关。
实施例2
实施例2和后述的实施例3是为了调查受光照后的HA-MTX缀合物发生的反应的机制而进行的。
方法
使用透明质酸分解酶切断受光照的HA-MTX缀合物的HA链，通过分析所得的产物来推测其结构。
具体而言，使用根据WO05/85294公报的实施例2-1中记载的方法制备的HA-MTX缀合物(DK-226：MTX-α-PhePhe-NHC2H4NH-HA，该缀合物中的MTX的缀合率＝2.1％，该缀合物的分子量＝206万)，按照以下方法进行。
将该缀合物溶解在含有0.9％NaCl的2mM磷酸缓冲液(pH7.3)中，制备成HA换算浓度10.5mg/ml的溶液。采集1ml该缀合物溶液，使用光稳定性试验用荧光灯(东芝FL20S·D-EDL-D65)对其照射光(5000Lux×24hr)后，加入1ml含有制成5U/ml的Chondoroitinase ACII(生化学工业)的50mM磷酸缓冲液(pH6.0)，在37℃下进行3天HA链的消化(试验样品)。此外，向1ml未照射光的该缀合物溶液中加入1ml含有制备成0.5U/ml的上述酶的50mM磷酸缓冲液(pH6.0)，在37℃下进行1天HA链的消化(对照)。
在以下条件下通过凝胶过滤色谱法和反相液相色谱法对所得的试验样品和对照进行了分析。装置均使用SMARTsystem(Pharmacia公司制造)，UV检测器的波长使用205nm、220nm、310nm。
在凝胶过滤色谱法中，用含有0.1％TFA的30％CH3CN将酶消化液稀释成50倍，用0.45μm的过滤器过滤，分析使用20μl。色谱柱使用Superdex Peptide PC 3.2/30，洗脱液使用含有0.1％TFA的30％CH3CN，在洗脱速度100μl/分钟下进行了分析。
在反相色谱法中，用0.1％TFA水溶液将酶消化液稀释成50倍，用0.45μm的过滤器过滤，分析使用20μl。色谱柱使用μRPCC2/C18 PC 3.2/3，洗脱液使用洗脱液A(0.1％TFA水溶液)和洗脱液B(含有0.1％TFA的CH3CN溶液)的梯度组合，在洗脱速度200μl/分钟下进行了分析。该梯度的条件如以下所述。洗脱液(洗脱液A和B的混合液)中的洗脱液B的比率％(v/v)在分析开始后0分钟～5分钟维持在0％；在5分钟～30分钟以每分钟2％的比例从0％线性增加至50％；在30分钟～35分钟维持在100％；在35分钟～40分钟维持在0％。
结果
对对照进行了凝胶过滤或反相色谱法分析，其结果确认到被认为是2个糖单元(以下也称为“Δ2糖”)和缀合了4个糖单元的MTX-连接体分子(以下也称为“MTX-连接体-Δ4糖”)的峰(图2A)。接着，对试验样品进行了同样的分析，其结果确认到与Δ2糖和MTX-连接体-Δ4糖均不同的新的峰1、2、3和4(图2B)。按照实施例3中记载的方式对与这些新的峰相对应的化合物进行了分离和分析。
实施例3
将用实施例2中记载的方法制备的试验样品供于使用反相色谱柱的制备液相色谱法。其色谱图如图3所示。
分析条件如以下所示。
作为制备用试验样品，使用200μl的以0.45μm的过滤器过滤酶消化液原液而得到的溶液。装置使用SMARTsystem(Pharmacia公司制造)，UV检测器的波长使用205nm、220nm、310nm。色谱柱使用μRPC C2/C18 PC 3.2/3，洗脱液使用洗脱液A(0.1％TFA水溶液)和洗脱液B(含有0.1％TFA的CH3CN溶液)的梯度组合，在洗脱速度200μl/分钟下进行了分析。
该梯度的条件如以下所述。洗脱液(洗脱液A和B的混合液)中的洗脱液B的比率％(v/v)在分析开始后0分钟～5分钟维持在0％；在5分钟～30分钟从0％以每分钟2％的比例线性增加至50％；在30分钟～35分钟维持在100％；在35分钟～40分钟维持在0％。
将自分析刚开始后直至24分钟为止的洗脱液每100μl采集到试验管中，采集图3所示的级分A～F(保留时间：11.5～14.5分钟(A～C)、15.0～16.0分钟(D)、17.0～18.0分钟(E)和18.5～19.0分钟(F))，对其分别进行LC/MS分析。其结果如表2所示。
[表2]
表2.取得的级分的MS分析(LC/MS、离子化模式：ESI(+))
Figure BPA00001335058300241
Figure BPA00001335058300251
F*具有与由MTX的光分解物生成的偶氮二聚体同样的UV吸收极大值。
表2所示的级分A～C中所含的成分的主要的m/z值可以推测具有下述式a所示的结构。
Figure BPA00001335058300252
即，可推测生成了从MTX-连接体-Δ4糖结构脱离了蝶啶环的结构的化合物。
进而，如表2所示，在级分E和F的质谱中检测到的m/z的值与MTX脱离蝶啶环后生成的偶氮二聚体的加钠离子相对应。此外，在使用分光光度计(日立公司制造，U-2000双光束分光光度计，扫描速度400nm/min)测定级分F的UV吸收时，级分F具有与从MTX自身的光分解物分离出的偶氮二聚体同样的UV吸收极大值(约330nm)(参照Photochemistry and Photobiologyvol.44，No.2，pp.231-233，1986；C.Chahide，et al中的化合物II的数据)。以上事实暗示了在级分E和F中存在这些二聚体。
进而，使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)对级分F进行了分析(Voyager DE STR(Applied Biosystems公司制造)，基质：10mg/mL α-CHCA(在50％CH3CN溶液中含0.1％TFA)，点样：将2μL基质与1μL级分F混合，在MALDI板上结晶化后进行了测定。检测模式：Linearpositive)。其结果，在m/z 2705.98和2722.14处检测到与具有式(b)所示结构的蝶啶环脱离的MTX-连接体-Δ4糖的偶氮二聚体的加钠离子和加钾离子相对应的离子(图4)。
由此暗示了：在对HA-MTX缀合物照射光并通过酶切断HA链而得到的分解物中包括认为是由两个MTX脱离蝶啶环后生成的苯胺氮缀合而生成的偶氮二聚体的物质。
因此，由实施例2和3的结果印证了通过光照在HA-MTX缀合物中发生了图1所示的反应A和B。
实施例4
实施例4证实了本发明中的光稳定化剂的效果。
(1)调查了各种光稳定化剂对HA-MTX缀合物的激发光谱所带来的效果。将各种光稳定化剂(对羟基苯甲酸甲酯(尼泊金甲酯)、水杨酸钠、硫代硫酸钠、N-乙酰基色氨酸)溶解在缓冲制剂(含有0.9％NaCl的2mM磷酸缓冲液(pH7.4))中使其浓度为9mg/ml(只有尼泊金甲酯为0.9mg/ml)，然后用0.2μm过滤器(Millex GV)进行无菌过滤。在无菌条件下量取根据制造例1制备的HA-MTX缀合物的粉末，溶解在过滤后的含光稳定化剂的缓冲制剂中使其浓度为1mg/ml，制备成待测样品。此外，将HA-MTX缀合物溶解在不具有光稳定化剂的缓冲制剂中使其浓度为1mg/ml，制备成对照液。对待测样品和对照液照射300～480nm的光，测定458nm下的荧光强度。
由图5所示的对照液的激发光谱可以确认，HA-MTX缀合物的主要的激发波长范围为320～430nm。并且，本申请发明中使用的光稳定化剂具有较强的消光作用，在光稳定化剂的存在下，即使照射HA-MTX缀合物产生荧光的激发波长的光，荧光生成也会受到抑制(尤其参照图5的右侧的图表)。由此可以认为，使用的所有光稳定化剂使得HA-MTX缀合物在320～430nm附近所激发的荧光消失(尤其，在关注HA-MTX缀合物的激发极大波长(Exλmax＝380nm)时，可知由于添加光稳定化剂而使峰消失变得明显，荧光生成受到抑制)，因此以某种形式吸收被用于荧光放出、化学反应中的被激发的能量。
(2)接着，调查了各种光稳定化剂对HA-MTX缀合物的伴随光照而产生的凝胶化和分子量·缀合率所带来的效果。
在缓冲制剂(2mM磷酸缓冲液，0.9％NaCl pH7.4)中以1mg/ml或10mg/ml溶解各种光稳定化剂(对羟基苯甲酸甲酯(尼泊金甲酯)、水杨酸钠、硫代硫酸钠、巯基乙酸钠、N-乙酰基色氨酸、色氨酸)，然后用0.2μm过滤器(Millex GV)进行无菌过滤。在无菌条件下量取按照制造例1制备的HA-MTX缀合物的粉末，溶解在过滤后的含光稳定化剂的缓冲制剂中使其浓度为10mg/mL，制备成待测样品。此外，在不具有光稳定化剂的缓冲制剂中溶解HA-MTX缀合物使其浓度为10mg/mL，制备成对照液。
将这些溶液加入到未遮光的玻璃小药瓶中供于光照。
光照是通过光稳定性试验机(ETAC LABONIC LA110)使用光稳定性试验用荧光灯(东芝FL20S·D-EDL-D65)在25℃、照度4000Lux的条件下进行的。进行光照并经过规定时间(0小时、25小时、50小时、100小时、150小时、300小时)后取样，进行凝胶化的确认以及HA-MTX缀合物的分子量和MTX缀合率(HA-MTX缀合物中的MTX的缀合率)的测定。
凝胶化的程度是用刮铲穿刺试样溶液的表面并目视观察伴随凝胶化的界面形成来判断的。在对照中光照开始后即刻发生凝胶化。与此相对，在添加了光稳定化剂的所有样品中凝胶化受到抑制。即使在光照300小时的时刻也能够确认到该抑制效果。通过凝胶过滤色谱法分析得到的HA-MTX缀合物的分子量和MTX缀合率如表3A和3B所示。凝胶过滤色谱法使用安装有色谱柱：OHpakSB-806HQ(Shodex)、检测器：RI检测器RI-71(Shodex)和UV检测器875-UV(JASCO，检测波长：304nm)的装置，在以下条件下进行了分析，即，洗脱液：50mM磷酸钠水溶液(pH6.0)；洗脱速度：0.6mL/min；柱温：40℃。通过上述的凝胶过滤色谱法求出该缀合物的洗脱时间，根据标准物质的洗脱时间与分子量的关系求出该缀合物的分子量。作为标准物质，制备具有不同分子量的透明质酸，通过特性粘度法算出分子量，备用。另外，各样品在0小时时的MTX缀合率在2.1～2.3％的范围内波动，该程度的波动范围是在MTX缀合率的测定中通常观测到的程度。
[表3A]
表3A未遮光样品的分子量的时间经过
Figure BPA00001335058300281
NT：未检测*由于凝胶化而无法测定
[表3B]
表3B未遮光样品的MTX缀合率的经时经过
Figure BPA00001335058300291
NT：未检测*由于凝胶化而无法测定
根据光加速试验规程(ICH Module 3/Q1B)，在光稳定性试验中，必须使用按照显示D65(国际上认可的ISO10977中规定的室外日光标准)或ID65的发射标准的输出的方式设计的光源，在总照度为120万Lux×h以上、总近紫外放射能量为200W·h/m2以上的条件下，将试样暴露于光下。确认到在该条件下光稳定性低时，需要实施遮光等处理来确保充分的光稳定性。但是，本发明的目的在于在制造工序中曝露于光下的情况下、或在医院剥离包装而放置几天之类的医疗现场的实践下确保稳定性，未必需要上述规程中规定的那样严酷的试验条件。为了达成本发明的目的，认为只要照射照度4000Lux的光50～100小时左右时制剂的稳定性得以确保就足够了。以下，按照该标准评价了光稳定性。
另外，有关光加速试验规程(ICH Module 3/Q1B)所涉及的具体信息，请参照以下的文件：
「新原薬及び新製剤の光安定性試験ガイドラインについて」(“关于新原药及新制剂的光稳定性试验规程”)，平成9年5月28日 药审第422号(寄给各都道府县卫生主管部(局)长)；或
ICH Harmonised Tripartite Guideline，Stability Testing：PHOTOSTABILITY TESTING OF NEW DRUG SUBSTANCESAND PRODUCTS，Recommended for Adoption at Step 4 of theICH process on 6 November 1996 by the ICH Steering Committee
根据表3A和B，除了上述的凝胶化抑制效果，光稳定化剂还具有抑制HA-MTX缀合物的分子量的降低和MTX缀合率的降低的效果。尤其，在以10mg/ml的浓度添加水杨酸钠、硫代硫酸钠、和巯基乙酸钠时，即使照射时间超过100小时，对分子量降低和缀合率降低也显示出较大的抑制效果。进而，关于尼泊金甲酯、N-乙酰基色氨酸和色氨酸，如果照射时间长达100小时左右，即使添加量为低浓度(1mg/mL)，也能够抑制分子量降低和MTX缀合率降低。
实施例5
实施例5证实了阻断特定波长的光的薄膜阻碍HA-MTX缀合物的凝胶化。
薄膜
如实施例1和实施例4所记载的那样，HA-MTX缀合物通过照射特别是具有320～430nm的波长的光而产生荧光。因此，本实施例中，主要使用阻断该范围或其附近的波长的光的薄膜进行了验证。通过分光光度计(日立公司制造，U-2000双光束分光光度计，数据模式：％T，扫描速度：400nm/min)测定所使用的薄膜在各种波长下的光透射率。其结果如图6A～D所示。
薄膜A：UVGuard(富士胶片公司制造，70μm)
薄膜B：Teijin(注册商标)Tetoron(注册商标)薄膜S(帝人杜邦薄膜公司制造，25μm)
薄膜C：Teijin(注册商标)Tetoron(注册商标)薄膜S(帝人杜邦薄膜公司制造，50μm)
薄膜D：Teijin(注册商标)Tetoron(注册商标)薄膜HB(帝人杜邦薄膜公司制造，25μm)
薄膜E：Teijin(注册商标)Tetoron(注册商标)薄膜HB(帝人杜邦薄膜公司制造，50μm)
薄膜F：DENKA DX FILM(注册商标)DX14S系列(电气化学工业公司制造，DX14S0230 30μm)
薄膜G：DENKA DX FILM(注册商标)DX14S系列(电气化学工业公司制造，DX14S0250 50μm)
薄膜H：DENKA DX FILM(注册商标)DX14S系列(电气化学工业公司制造，DX14S02100 100μm)
薄膜I：聚酯薄膜，Lumiler(注册商标)(东丽公司制造，25μm)
薄膜J：聚酯薄膜，Lumiler(注册商标)(东丽公司制造，50μm)
薄膜K：紫外吸收聚酯薄膜，T-UV(注册商标)(TOCHISEN公司制造，25μm)
薄膜L：紫外吸收聚酯薄膜，T-UV(注册商标)(TOCHISEN公司制造，50μm)
如图6A～D所示，所使用的薄膜均至少阻断具有300nm以下的波长的光。其中，UVGuard(富士胶片株式会社)阻断410nm以下的波长，且将420nm以下的波长的透射率控制在50％以下。即，具有阻断实施例1中使HA-MTX缀合物发生凝胶化的波长(310nm、360nm、405nm)的特征，并且具有在HA-MTX缀合物产生荧光的波长范围(320～430nm)下抑制光透射率的特征。
凝胶化试验
接着，使用这些薄膜对HA-MTX缀合物的凝胶化的抑制进行了试验。将根据实施例2制备的HA-MTX缀合物DK-226(分子量：207万，缀合率：2.2％)溶解在含有0.9％NaCl的2mM磷酸缓冲液(pH7.3)中，制备成HA-MTX缀合物的HA换算浓度为9.9mg/ml的溶液，将250μl的该溶液填充到外侧缠绕有上述薄膜的玻璃小药瓶中。使用光稳定性试验用荧光灯(东芝FL20S·D-EDL-D65)，在孵化器内在25℃下对各小药瓶照射照度3600Lux的光，目视判断凝胶化程度。结果如下述表4所示。
[表4]
表4在缠绕有各种薄膜的容器中的凝胶化
Figure BPA00001335058300322
与不使用薄膜的对照相比，所有薄膜均延长了凝胶化所需的时间。
HB-25和HB-50抑制凝胶化长达2小时左右。S-25和S-50抑制凝胶化长达1小时左右。使用UVGuard(富士胶片株式会社)时凝胶化最延迟，抑制凝胶化长达10小时左右。
考虑抑制凝胶化的时间、和各薄膜的特征即波长与光透射率的关系(图6A～D)，为了在实际应用中延迟凝胶化，优选抑制300nm以下的波长的光透射率，更优选抑制370nm以下的波长的光透射率，特别优选阻断410nm以下的光。
另一方面，如果一并考虑到根据实施例1的结果认为凝胶化与产生荧光彼此密切相关这一点，可以认为，为了延迟凝胶化，越是阻断引起荧光产生的波长范围即320～430nm的范围的波长、更优选阻断比320～430nm更宽的范围的波长越为有效。
事实上，即使控制300nm以下的波长的光透射率，凝胶化也延迟，但其效果不充分，使用阻断540nm以下的光的薄膜(Lumicool(注册商标)1905，LINTEC公司，阻断540nm以下的波长范围；参照图7)进行与上述同样的试验时，如表5所示，凝胶化在10天时也得以抑制。因此，为了抑制凝胶化，抑制(优选阻断)320～430nm、优选540nm以下的光是有效的。
[表5]
Figure BPA00001335058300331
实施例6
接着，使用以实施例5中所用的薄膜中的Lumicool(注册商标)1905(褐色薄膜，LINTEC公司制造，参照图7)包装的小药瓶进行与实施例4(2)同样的实验。作为完全阻断光时的对照，用铝箔包覆不含有光稳定剂的样品的小药瓶。
本实验中，在所有样品中均未确认到凝胶化。由本试验的结果可以确认：通过并用阻断被认为是凝胶化、低分子化的起因的范围、即320～430nm、优选540nm以下的波长的光的薄膜(Lumicool(注册商标)1905具有阻断540nm以下的波长的特征)，能够抑制凝胶化、低分子化，即使经过300小时后也能够稳定地保持其品质。还确认到：可以得到与使用完全阻断光的铝箔时同等的效果。
以下示出HA-MTX缀合物分子量和MTX缀合率的测定结果(分子量、缀合率的测定按照制造例1的记载进行了测定)。
[表6]
表6并用遮光薄膜(Lumicool(注册商标)1905)的样品的测定结果
Figure BPA00001335058300341
如表6所示，通过使用遮光薄膜，确认到对凝胶化、低分子化的更进一步的抑制效果。即，表明在所有样品中，对分子量降低和缀合率降低的抑制效果较大。尤其是尼泊金甲酯、水杨酸钠、硫代硫酸钠，在任意的浓度下均显示出与用铝箔完全遮光时(对照)相匹敌的稳定化效果(对低分子化和MTX缀合率降低的抑制效果)。

Claims (7)

1.一种光稳定化药物组合物，其含有透明质酸或透明质酸衍生物与甲氨蝶呤的缀合物或其盐以及光稳定化剂，
其中，光稳定化剂为硫代硫酸、硫代硫酸钠、巯基乙酸、巯基乙酸铵、巯基乙酸钠、巯基乙酸钾、巯基乙酸乙酯、硫代苹果酸、硫代苹果酸铵、硫代苹果酸钠、硫代苹果酸钾、巯基丙酸、巯基丙酸铵、巯基丙酸钠、巯基丙酸钾；
所述透明质酸衍生物是透明质酸中的一个以上的羧基被酯化而得到的物质、通过甲醛使透明质酸发生交联而进一步高分子化而得到的物质或透明质酸中的一个以上的羟基被乙酰化而得到的乙酰化透明质酸。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，光稳定化剂为消光剂或自由基捕捉剂。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，光稳定化剂为硫代硫酸或硫代硫酸钠。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，光稳定化剂为硫代硫酸钠。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，组合物中的光稳定化剂的配合量为0.01～30%（w/v）。
6.一种药品，其用包装材料包装如权利要求1至5中任一项所述的药物组合物而成，所述包装材料具有至少阻断320nm～430nm所示范围的整个光波长区域的光的特征，所述包装材料不阻断或不减少不包含在上述范围的波长的至少一部分的波长的光。
7.根据权利要求6所述的药品，其中，所述包装材料至少阻断540nm以下的整个光波长区域的光。
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