CN102154294A - 丝状真菌启动子、终止子和包含它们的质粒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丝状真菌启动子、终止子和包含它们的质粒，所述的丝状真菌启动子，具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述的丝状真菌终止子具有SEQ ID NO.2所述的碱基序列。本发明启动子是一个强启动子，在稻瘟病菌的菌丝、孢子和附着胞阶段都高强度启动。该启动子基因属于表达强度在稻瘟病菌细胞内稳定性在前100位以内的基因。该基因是一个清除细胞内活性氧的重要基因，对于维持细胞的正常运转具有重要作用。该基因在活性氧诱导下可以大量诱导表达，用于合成大量的重组蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种丝状真菌启动子、终止子和包含它们的质粒。
背景技术
稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是一种研究植物病原真菌-寄主植物相互作用的丝状真菌模式生物，具有许多病原真菌共有的植物致病侵染循环，包括孢子产生、萌发、附着胞形成、侵染栓形成、侵入菌丝生长等致病过程。由稻瘟病菌引起的稻瘟病是世界性的一种水稻上的毁灭性病害。世界上每年由稻瘟病造成的水稻产量损失在10～30％之间；我国几乎每年都有稻瘟病菌的流行爆发。许多发达国家正在进行研究其致病分子机制，期望通过此类研究开发具有抗瘟特征的水稻品种，以及开发、设计新型抗真菌药物。
稻瘟病菌的致病过程是一个复杂的分子过程。目前已经克隆了许多与稻瘟病菌致病性相关的基因，如：MPG1、CPKA、PMK1、MAGB、PLS1、SMO1、PDE1、MPS1、PTH11、CBP1、ICL1、BUF1、ALB1、ACR1、RSY1、HEX1、ATGs，MNH6等(Nguyen et al.，2008；Egan et al.，2007；Veneault-Fourrey et al.，2006；Dean，2005；Soundararajan et al.，2004；Talbot，2003；Talbot，1999；Choi and Dean，1997；Mitchell & Hamer，1995等)。尽管如此，稻瘟病菌的分子致病机制还是不很清楚，绝大多数的基因功能还未知。
鉴定、克隆植物病原真菌的致病性基因，尤其是与侵入过程相关的基因，可以为开发具有抗瘟特征的水稻品种，以及设计、筛选抗真菌药物提供有用的参考。目前根据稻瘟病菌无毒基因和水稻抗病基因的互作关系，选育了很多水稻抗瘟品种；也已经在包括稻瘟病菌在内的一些真菌中证明了一些药物的靶点，如三环唑是一种很重要的稻瘟病菌杀菌剂，其作用是抑制黑色素的合成，靶点是稻瘟病菌的三羟萘还原酶；多肽杀菌剂sorphenA的作用靶点是青霉的脱甲基酶(CYP51)。
鉴定、克隆植物病原真菌的致病性基因，需要分析蛋白在细胞内的定位、蛋白过量表达对植物病原真菌的作用等，这都需要一种丝状真菌细胞内蛋白快速表达和高效表达的系统。目前，每个基因研究还都需要各自建立一个基因表达系统(如NAR启动子；RP27启动子)，缺少高效的、通用的丝状真菌蛋白表达系统。
发明内容
本发明提供了一种丝状真菌启动子，利用该启动子可以在丝状真菌菌丝、分生孢子、附着孢等各个阶段高丰度表达蛋白、RNA或DNA。
一种丝状真菌启动子(或者互补链)，具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列。
一种丝状真菌终止子(或者互补链)，具有SEQ ID NO.2所示的碱基序列。
本发明提供了包含上述启动子和/或终止子的质粒。
该质粒可以是原始表达载体，该原始表达载体含有抗性基因SUR或抗性基因NEO，也可以是重组表达载体；也可以是重组表达载体，其外源基因为GFP蛋白基因或红色荧光蛋白基因。
本发明提供了上述质粒在丝状真菌中表达蛋白、DNA或RNA中应用。
本发明提供了包含上述质粒的转化子。
本发明启动子是一个强启动子，在稻瘟病菌的菌丝、孢子和附着胞阶段都高强度启动。该启动子基因属于表达强度在稻瘟病菌细胞内稳定性在前100位以内的基因。该基因是一个清除细胞内活性氧的重要基因，对于维持细胞的正常运转具有重要作用。该基因在活性氧诱导下可以大量诱导表达，用于合成大量的重组蛋白。
附图说明
图1是pKD6表达载体的构建过程示意图。pKD6质粒具有卡那霉素(Kana)抗性和磺胺嘧啶(SUR)抗性筛选标记。
图2是pKD6-GFP表达载体的构建过程示意图。pKD6-GFP质粒具有卡那霉素(Kana)抗性和磺胺嘧啶(SUR)抗性筛选标记，含有eGFP绿色荧光基因。
图3是pKD6-DsRED表达载体的构建过程示意图。pKD6-DsRED质粒具有卡那霉素(Kana)抗性和磺胺嘧啶(SUR)抗性筛选标记，含有DsRED红色荧光基因。
图4是pKD8表达载体的构建过程示意图。pKD8质粒具有卡那霉素(Kana)抗性和新霉素(Neo)抗性筛选标记。
图5是pKD8-GFP表达载体的构建过程示意图。pKD8-GFP质粒具有卡那霉素(Kana)抗性和新霉素(Neo)抗性筛选标记，含有eGFP绿色荧光基因。
图6是pKD8-DsRED表达载体的构建过程示意图。pKD8-DsRED质粒具有卡那霉素(Kana)抗性和新霉素(Neo)抗性筛选标记，含有DsRED红色荧光基因。
图7是SOD1启动子驱动的DsRED荧光蛋白在稻瘟病菌菌丝和孢子强烈表达。左方(A)为暗视场下拍摄，右方(B)为明视场下拍摄；红色为DsRED发出的红色荧光。
图8是SOD1启动子驱动的GAPDH-GFP融合蛋白在菌丝细胞中的定位。GAPDH-GFP融合蛋白发出的绿色荧光分布于细胞质中；上方(A)为暗视场下拍摄，下方(B)为明视场下拍摄。
具体实施方式
实施例1获得稻瘟病菌SOD1启动子序列。
从稻瘟病菌Guy11菌株(Fungal Genetics Stock Center)的菌丝体中提取DNA并作为模板，根据稻瘟病菌70-15菌株的基因组数据库设计引物，利用高保真PCR方法扩增SOD1基因的启动子序列。
上游引物a1：5’-ATgaattcCGGTCATAACGCCAAGTTAATA-3’；
下游引物a2：5’-ATTCTAGACCCGGGGGATCCGACCATTTTGACGGTTGTTTGGTA-3’。
在上游引物中引入EcoRI位点；在下游引物中引入BamHI-SmaI-XbaI位点。
PCR体系为：稻瘟病菌基因组DNA 1μl，高保真DNA聚合酶0.5μl，dNTP(50mM)0.4μl，上下游引物各0.5μl，10x PCR缓冲液5μl，加水至50μl。
PCR运行条件为：94℃3分钟，35个循环(94℃30秒，58℃1分钟，72℃1分钟30秒)，72℃10分钟。
PCR产物经琼脂糖电泳，切下1.5kb大小的目的条带，经胶回收纯化，连接到pGEM-T EASY载体上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定，然后测序证实。经测序证实SOD1启动子的DNA编码序列为SEQ ID NO.1所示。
实施例2获得稻瘟病菌RP27终止子序列的
从稻瘟病菌Guy11菌株的菌丝体中提取DNA并作为模板，根据稻瘟病菌70-15菌株的基因组数据库设计引物，利用高保真PCR方法扩增RP27基因的终止子序列。
上游引物b1：5’-ATCTGCAGTAAGCGACACGCCATCACGATA-3’；
下游引物b2：5’-ATAAGCTTTGTTGAAATTACCAGCGATTCGA-3’。
在上游引物中引入PstI位点；在下游引物中引入HindIII位点。PCR体系为：稻瘟病菌基因组DNA为1μl，高保真DNA聚合酶0.5μl，dNTP(50mM)0.4μl，上下游引物各0.5μl，10x PCR缓冲液5μl，加水至50μl。
PCR运行条件为：94℃3分钟，35个循环(94℃30秒，60℃1分钟，72℃30秒)，72℃10分钟。
PCR产物经琼脂糖电泳，切下1.5kb大小的目的条带，经胶回收纯化，连接到pGEM-T EASY载体上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定，然后测序证实。经测序证实RP27终止子的DNA编码序列为SEQ ID NO.2所示。
实施例3构建携带SOD1启动子和RP27终止子的重组表达载体
重组表达载体pKD6的构建：利用抗性基因SUR的PCR引物从pCB1528经PCR获得SUR基因片段。
上游引物c1：5’-GTGCCAACGCCACAGTGCC-3’
下游引物c2：5’-GCGAATTCACTAGTGATTGTGAATCGTGAGAGCATGCAATTCCC-3’
克隆到pGEM-T EASY载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。重组载体然后用XhoI和EcoRI酶切，2.8kb的酶切片段(SUR基因片段)插入pCAMBIA1300载体的XhoI和EcoRI位点；重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。鉴定正确的载体再用PstI和HinDIII双酶切后，与RP27终止子相连；重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。验证连接RP27终止子正确的载体用EcoRI和SalI酶切后，再与SOD1启动子相连；重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。将获得的验证正确的载体命名为pKD6(如附图1所示)。
(1)GFP蛋白重组表达载体pKD6-GFP的构建过程：
利用GFP的PCR引物从pGFP经PCR获得GFP基因片段，
上游引物d1：5‘-AAcccgggATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’
下游引物d2：5‘-AATCTAGACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’，
克隆到pGEM-T EASY载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。重组载体然后用SmaII和XbaI酶切，GFP基因片段插入表达载体pKD6的SmaII和XbaI位点；转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。将获得的验证正确的载体命名为pKD6-GFP(如附图2所示)。
(2)红色荧光蛋白重组表达载体pKD6-DsRED的构建过程：
利用DsRED的PCR引物，从pDsRED2经PCR获得DsRED基因片段，
上游引物e1：5‘-AAcccgggATGGCCTCCTCCGAGAACGTCATC-3’
下游引物e2：5‘-AATCTAGACAGGAACAGGTGGTGGCG-3’。
克隆到pGEM-T EASY载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。重组载体然后用SmaII和XbaI酶切，DsRED基因片段插入表达载体pKD6的SmaII和XbaI位点；转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。将获得的验证正确的载体命名为pKD6-RED(如附图3所示)。
(3)重组表达载体pKD8的构建过程：
利用抗性基因NEO的PCR引物，从pSilent-Dual1PCR扩增获得NEO基因片段，
上游引物f1：5’-GCactagtGAGGTCAACACATCAATGC-3’
下游引物f2：5’-TTctcgagTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3’，
克隆到pGEM-T EASY载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。重组载体然后用XhoI和EcoRI酶切，1.1kb的酶切片段(NEO基因片段)插入pCAMBIA1300载体的XhoI和EcoRI位点；重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。鉴定正确的载体再用PstI和HinDIII双酶切后，与RP27终止子相连；重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。验证连接RP27终止子正确的载体用EcoRI和SalI酶切后，再与SOD1启动子相连；重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。将获得的验证正确的载体命名为pKD8(如附图4所示)。
(4)GFP蛋白重组表达载体pKD8-GFP的构建过程：
利用GFP的PCR引物从pGFP经PCR获得GFP基因片段，
上游引物g1：5‘-AAcccgggATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’
下游引物g2：5‘-AATCTAGACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’
克隆到pGEM-T EASY载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。重组载体然后用SmaII和XbaI酶切，GFP基因片段插入表达载体pKD6的SmaII和XbaI位点；转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。将获得的验证正确的载体命名为pKD8-GFP。(如附图5所示)。
(5)红色荧光蛋白重组表达载体pKD8-DsRED的构建过程：
利用DsRED的PCR引物从pDsRED2经PCR获得DsRED基因片段，
上游引物h1：5‘-AAcccgggATGGCCTCCTCCGAGAACGTCATC-3’
下游引物h2：5‘-AATCTAGACAGGAACAGGTGGTGGCG-3’
克隆到pGEM-T EASY载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。重组载体然后用SmaII和XbaI酶切，DsRED基因片段插入表达载体pKD8的SmaII和XbaI位点；转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。将获得的验证正确的载体命名为pKD8-RED(如附图6所示)。
实施例4SOD1启动子驱动DsRED在稻瘟病菌菌丝中的强表达
ATMT法转化pKD6-RED载体到稻瘟病菌：将载体pKD6-RED通过冻融法转化到农杆菌菌株AGL1。然后ATMT法转化稻瘟病菌萌发孢子中：从新鲜培养的LB平板(含50mg/ml卡那霉素)上挑选一农杆菌单菌落接种于5ml LB液体培养基(含50mg/ml卡那霉素)，200rpm/min，28℃过夜培养；第二天将200-400μl培养液转移到5ml含50mg/ml卡那霉素的诱导液体培养基(IM)中，OD值约0.15，28℃培养5～6个小时使OD600达到0.5～0.6；稻瘟病菌分生孢子的收集：用10ml灭菌蒸馏水从培养大约10天的CM平板上洗下稻瘟病菌的分生孢子，三层擦镜纸过滤后用血球计数板计数，并用无菌水稀释孢子浓度为106个/ml；取100μl培养好的农杆菌AGL-1(含载体)菌液和100μl稀释好的稻瘟病菌分生孢子悬浮液混合，混合液(200μl)均匀涂于IM平板上的硝酸纤维素膜表面，IM平板含200μmol/L乙酰丁香酮(AS)或不含AS作为对照，22℃共培养48小时；然后将硝酸纤维素膜转移到含真菌抗生素(磺胺嘧啶)与抗生素的选择平板(DCM)上，选择性培养基中含100μg/ml磺胺嘧啶、400mg/ml头孢霉素、60mg/ml链霉素，将平皿置于28℃下培养到转化子出现；将转化子接种到含100μg/ml磺胺嘧啶DCM平板上再次鉴定。挑取具有磺胺嘧啶(SUR)抗性的转化子在荧光显微镜下检测。结果表明SOD1启动子驱动RED荧光蛋白在稻瘟病菌菌丝细胞质中的强烈表达，见图7。
转pKD6-RED稻瘟病菌的转化子在CM培养基平板上培养12天，洗取稻瘟病菌孢子，稀释至孢子浓度为1×105个/ml。孢子液20μl一滴点接种于附着胞诱导表面上，28℃诱导培养28-24小时，Trizol法提取RNA。DNase I处理RNA，然后RNA逆转录成cDNA，用Real Time定量PCR检测SOD1启动子驱动的DsRED基因的表达量，以β-tubulin的表达量最为对照。
DsRED的Real Time qPCR的引物为：
上游引物i1：5’-AAGGCCCTGAAGCTGAAG-3’
下游引物i2：5’-GATGGTGTAGTCCTCGTTGTG-3’；
β-tubulin的Real Time qPCR的引物为：
上游引物j1：5’-TCCCATCAACATCAGAATCCG-3’
下游引物j2：5’-GTTGTAAACTCCATTGCTGTCG-3’。
Real Time定量PCR结果显示SOD1驱动的DsRED的基因表达量是β-tubulin的18倍。
实施例4GAPDH蛋白在稻瘟病菌细胞内的亚细胞定位
荧光融合蛋白载体的构建：根据GAPDH的cDNA序列设计合成PCR引物
上游引物k1：5’-TAggatccATGGTCAAGTGTGGTATC-3’
下游引物k2：5’-TAcccgggCTTGCCACCGTCAACCTT-3’
PCR扩增包含整个基因编码区在内的GAPDH基因cDNA，然后克隆到pGEM-T EASY载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取胺苄平板上长出的菌落进行培养，提取质粒、酶切鉴定。重组载体然后用SmaI和XbaI酶切，GAPDH基因片段插入pKD6-GFP载体的BamHI和SmaI位点。
ATMT法将荧光融合蛋白载体转化到丝状真菌。挑取具有磺胺嘧啶(SUR)抗性的转化子在荧光显微镜下观察GAPDH-GFP融合蛋白在稻瘟病菌细胞中的分布。利用pKD6-GFP载体构建的GAPDH-GFP融合蛋白在稻瘟病菌中的表达结果表明：如附图8所示，GAPDH蛋白定位于细胞质中。
Claims (9)
1.一种丝状真菌启动子，其特征在于：所述的丝状真菌启动子或它的互补链具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列。
2.一种包含权利要求1所述的丝状真菌启动子的质粒。
3.一种丝状真菌终止子，其特征在于：所述的丝状真菌终止子或它的互补链具有SEQ ID NO.2所示的碱基序列。
4.一种包含权利要求3所述的丝状真菌终止子的质粒。
5.一种包含权利要求1所述丝状真菌启动子和权利要求3所述丝状真菌终止子的质粒。
6.根据权利要求5所述的质粒，其特征在于，包含抗性基因SUR或抗性基因NEO。
7.根据权利要求5所述的质粒，其特征在于，包含GFP蛋白基因或红色荧光蛋白基因。
8.权利要求2、3或5所述的质粒在丝状真菌中表达蛋白、DNA或RNA中应用。
9.一种包含权利要求5～7任一所述质粒的转化子。
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