CN102154141A - 一种降解苯磺隆的假单胞菌NyZ42菌株及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种降解苯磺隆的假单胞菌NyZ42菌株及制备方法，假单胞菌Pseudomonassp.NyZ42 CCTCC NO：M2010222。步骤是：A、从苯磺隆除草剂的麦田中取土壤样品，充分混匀后加入富集培养基中，无机盐基础培养基加入苯磺隆和葡萄糖，提高培养基中苯磺隆浓度；B、用固体LB培养基划线分离单菌落，降解能力好的单菌落进行进一步降解；C、筛选获得一株微生物菌株，命名为NyZ42；D、进一步以该菌株的基因组为模版，通过PCR扩增该菌株的16SrRNA基因序列，所用引物为，27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT，序列测定结果显示该菌株属于假单胞菌属，命名为假单胞菌NyZ42。本发明方法易行，操作简便，该菌株可以降解苯磺隆，可以在5天内降解200毫克/升的苯磺隆，降解效率达到80%。

Description

一种降解苯磺隆的假单胞菌NyZ42菌株及制备方法

技术领域

本发明属于微生物生物技术和环境生物技术领域，更具体涉及一种降解苯磺隆的假单胞菌NyZ42菌株，同时还涉及一种降解苯磺隆的假单胞菌NyZ42菌株的制备方法，一株假单胞菌NyZ42菌株，该菌株的生长细胞、细胞悬浮液可以降解苯磺隆。该菌株适用于进行苯磺隆污染环境的生物修复(生物整治)。

背景技术

现代农业的发展离不开农药的投入，农药在保证作物高产和稳产方面起重要作用。尤其是除草剂的广泛应用有效地控制了杂草危害，对于提高劳动生产率，增加作物产量和改善作物品质，发挥着不可替代的作用。近年来，随着除草剂的迅猛发展，除草剂在农药市场中的地位日益突出。特别是随着磺酰脲类除草剂的开发和应用，使除草剂进入到超高活性阶段，因其具有高效、低毒、选择性强和对环境安全等特点，在农业生产上得到广泛应用。

目前的磺酰脲类除草剂大多以乙酞乳酸合酶（ALS）为作用靶标，到目前为止，尚未发现任何一类除草剂明显优于ALS抑制剂类的除草剂，据统计在玉米、大豆、小麦、油菜、水稻五大作物中应用此类抑制剂品种就有二十几种，占五大作物应用除草剂品种的30%-40%，占除草剂应用面积的50-60%。

苯磺隆(tribenuron-methly)是一种重要的磺酰脲类除草剂，用于小麦、大麦等作物地防治田蓟、繁缕、播娘蒿、藜、蓼、反枝苋 、田芥及宝盖草、麦家公等对2,4-滴有抗药性的阔叶杂草，每公顷有效用量10-20g。具有良好的内吸传导作用，抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)的活性，阻碍缬氨酸与异亮氨酸生物合成，造成生长受抑制，植株在1-3周内死亡。杀草谱广，用量少，持效期适中，适用期宽。

20世纪90年代以来，我国开始大面积使用苯磺隆、豆磺隆、甲磺隆、绿磺隆等长残留除草剂，连续多年使用在土壤中持续积累，在轮作农田中对后茬敏感作物造成严重药害，导致作物减产或绝产，甚至发生在施用后2-3年之久。长期残留于土壤中的农药对微生物的影响都会影响到土壤的生化过程，最终影响土壤肥力和植物生长。由于长残留除草剂残留时间长，可能对土壤微生物造成的影响更加复杂。此外，土壤中存在的除草剂残留会对抗性杂草产生选择压力。

如何清除土壤中以苯磺隆为代表的长残留磺酰脲类除草剂，解决残留药害和减少环境污染是当前世界范围的研究热点，也是生产中亟待解决的问题。目前主要解决途径为，1)降低此类除草剂使用剂量及限制使用此类除草剂；2)利用助剂或其它措施降低长残效除草剂的使用剂量；3）利用除草剂的解毒剂解除除草剂对作物产生的药害；4)利用物理或化学的方法清除除草剂残留，如用活性碳吸附土壤中残留的除草剂。但到目前为止，还没有研究出一种有效的解决方法。

目前已经发现很多微生物具有降解磺酰脲类除草剂的能力，包括细菌、真菌和放线菌。当前，利用微生物降解长残留除草剂己成为清除土壤中长残留除草剂最具潜力的方法，一直是国内外的研究热点，己取得了很大进展，表现在降解微生物种类不断地被发现，降解机理日趋深入等方面。目前已经有苯磺隆降解菌株的研究报道，但存在降解效率低，降解活性不稳定等缺点，至今还未见苯磺隆降解菌株的专利申请。在这些降解菌株中，有些对苯磺隆的降解是由于微生物生长过程中培养基的pH值发生变化，进而使苯磺隆酸碱或碱解，并非真正的微生物产生的酶解，这种非特异性的降解往往使得苯磺隆不能完全矿化，其降解中间产物可能还对环境有毒害作用。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种降解苯磺隆的假单胞菌NyZ42菌株，该菌株降解效率高、速度快、易于培养繁殖的细菌。该菌株可以降解高浓度的苯磺隆，达到200毫克/升

本发明的另一个目的是在于提供了一种降解苯磺隆的假单胞菌NyZ42菌株的制备方法，方法易行，操作简便，该菌株可以降解苯磺隆，可以在5天内降解200毫克/升的苯磺隆，降解效率达到80%。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

具体的说，本发明提供了一株假单胞菌NyZ42菌株，该菌株于2010年9月6日，保藏于“中国典型培养物保藏中心”，假单胞菌Pseudomonas sp. NyZ42 CCTCC NO：M2010222。

一种降解苯磺隆的假单胞菌NyZ42菌株，其制备步骤是：

A、从长期使用苯磺隆除草剂的麦田中取土壤样品100克，充分混匀后取1克样品加入100 ml富集培养基中（无机盐基础培养基加入苯磺隆和1克/升的葡萄糖），30 °C（20 -37 °C）富集培养3天（20 -37 °C），然后连续3次（20 -37 °C）转接富集培养基，逐渐提高培养基中苯磺隆浓度，直至培养基苯磺隆浓度提高到200毫克/升。

B、用固体LB培养基划线分离单菌落，选择生长好、传代稳定、降解能力好的一株单菌落进行进一步降解特性验证。

C、最终筛选获得一株微生物菌株，命名为NyZ42。该菌株呈杆状，革兰氏阴性，菌落特征为：在LB培养基上培养1天的菌落大小位直径l-2毫米，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，凸起，无色。

D、进一步以该菌株的基因组为模版，通过PCR扩增该菌株的16S rRNA基因序列，所用引物为，27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。序列测定结果显示该菌株属于假单胞菌属，命名为假单胞菌NyZ42 （Pseudomonas sp. NyZ42）。

一种降解苯磺隆的假单胞菌NyZ42菌株，该菌具有以下特征：菌落特征：在LB培养基上培养1天的菌落大小位直径l-2毫米，所述的假单胞菌NyZ42呈杆状、革兰氏阴性、菌落呈圆形、表面光滑、边缘整齐、凸起、无色。根据其16S rRNA基因序列特征：所述的假单胞菌含有16S rRNA基因序列的SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

根据其形态特征和生理生化特征，以及根据其16S rRNA基因序列在GenBank中的搜索结果，鉴定该菌(CCTCC  No．M 2010222)为假单胞菌属。

该菌具有较高的降解苯磺隆的能力，生长细胞进行降解试验的结果表明，可以在5日内降解200 毫克/升的苯磺隆，降解效率达80％。

本发明提供的NyZ42菌株能在碳源、氮源营养培养基，如：普通牛肉汁、LB、营养琼脂中培养或在以苯磺隆为碳源的无机盐基础培养基中生长，并降解利用底物苯磺隆。在以水为基质的无机盐基中生长时，培养基pH值保持中性，证明苯磺隆的降解不是微生物生长引起的酸解或碱解和非特异性的降解。

以水为基质的无机盐基础培养基百份比组成(％) 每升含14.3 g Na₂HPO₄·12H2O，3g KH₂PO₄，0.28 mg MnSO₄·H₂O， 0.3 mg FeSO₄·7H₂O，0.06 mg MgSO₄·7H₂O，1 mg CaCl₂，0.05 mg CuSO₄，0.05 mg ZnSO₄ 和0.05 mg H₃BO₃。用NaOH 调节pH 成7.0，高压蒸汽灭菌（121℃）20 分钟后备用。使用前需加入适量碳源至适当终浓度。

本发明的优点在于：本发明提供了一个能够降解苯磺隆的微生物菌株，并且其降解是完全的微生物降解，而不是由于微生物生长产生的酸或碱引起的苯磺隆的酸解或者碱解，因此该菌株降解苯磺隆不会产生有害的中间产物。该菌株能够用于环境污染物——苯磺隆的降解和苯磺隆污染环境的生物修复(生物整治)。

本发明的技术要点在于，分离、鉴定能够利用苯磺隆为碳源生长的微生物菌株，以及利用微生物学的方法证明该菌株的降解能力。该菌具有较高的降解苯磺隆的能力，生长细胞进行降解试验的结果表明，可以在5日内降解200 毫克/升的苯磺隆，降解效率达80％。

附图说明

图1 假单胞菌NyZ42菌株利用污染物苯磺隆进行生长及底物苯磺隆的降解

苯磺隆初始浓度为200毫克/升，接种菌体为LB清洗细胞。

(□)培养物吸光值（OD₆₀₀）；(■)苯磺隆浓度。

具体实施方式

所有实施例中的培养基及微生物学、分子生物学操作方法为该领域技术人员所熟悉，下面结合附图及实施例子对本发明作进一步说明，但并不作为对本发明权利范围的限制。

实施例1. 降解苯磺隆的假单胞菌NyZ42菌株的分离和鉴定

一种降解苯磺隆的假单胞菌NyZ42菌株，其制备步骤是：（从河南安阳长期使用苯磺隆除草剂的麦田中取土壤样品100克，充分混匀后取1克样品加入100 ml富集培养基中，30 °C富集培养3天，然后连续3次转接富集培养基，逐渐提高培养基中苯磺隆浓度，直至培养基苯磺隆浓度提高到200毫克/升。用固体LB培养基划线分离单菌落，选择生长好、传代稳定、降解能力好的一株单菌落进行进一步降解特性验证。最终筛选获得一株微生物菌株，命名为NyZ42，进一步以该菌株的基因组为模版，通过PCR扩增该菌株的16S rRNA基因序列。序列测定结果显示该菌株属于假单胞菌属，命名为假单胞菌NyZ42 （Pseudomonas sp. NyZ42）。

A、从长期使用苯磺隆除草剂的麦田（河南安阳）中取土壤样品100克，充分混匀后取1克样品加入100 ml富集培养基中（无机盐基础培养基加入苯磺隆和1克/升的葡萄糖），30 °C富集培养3天，然后连续3次转接富集培养基，逐渐提高培养基中苯磺隆浓度，直至培养基苯磺隆浓度提高到200毫克/升。以水为基质的无机盐基础培养基百份比组成(％) ：每升含14.3 g Na₂HPO₄·12H2O，3g KH₂PO₄，0.28 mg MnSO₄·H₂O， 0.3 mg FeSO₄·7H₂O，0.06 mg MgSO₄·7H₂O，1 mg CaCl₂，0.05 mg CuSO₄，0.05 mg ZnSO₄ 和0.05 mg H₃BO₃。用NaOH 调节pH 成7.0，高压蒸汽灭菌（121℃）20 分钟后备用。使用前需加入适量碳源至适当终浓度。

B、用固体LB培养基划线分离单菌落，选择生长好、传代稳定、降解能力好的一株单菌落进行进一步降解特性验证。

C、最终筛选获得一株微生物菌株，命名为NyZ42。该菌株呈杆状，革兰氏阴性，菌落特征为：在LB培养基上培养1天的菌落大小位直径l-2毫米，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，凸起，无色。

D、进一步以该菌株的基因组为模版，通过PCR扩增该菌株的16S rRNA基因序列，所用引物为，27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。序列测定结果显示该菌株属于假单胞菌属，命名为假单胞菌NyZ42 （Pseudomonas sp. NyZ42）。所述的假单胞菌含有16S rRNA基因序列的SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

实施例2. 假单胞菌NyZ42菌株降解污染物苯磺隆的特性

将在液体LB中生长过夜的假单胞菌NyZ42菌株用生理盐水清洗后以1%（重量体积比）的接种量接种进100 ml的无机盐基础培养基中，加入200 毫克/升苯磺隆以及4克/升的葡萄糖作为碳、氮源供菌株生长，定时取样测定底物浓度和菌体浓度（OD₆₀₀）的变化。结果附图1所示，菌株NyZ42能够以苯磺隆作为唯一碳、氮源生长，并且伴随着菌液生物量的显著增加。通过HPLC检测菌液中的苯磺隆的浓度变化，表明NyZ42菌株可以降解底物苯磺隆，可以在5日内降解200 毫克/升的苯磺隆，降解效率达80％。

在生长过程中检测培养基的pH值，由于本发明使用的培养基具有较强的缓冲能力，因此生长过程中培养基的pH稳定保持在7.0，证明本发明中苯磺隆的降解不是微生物生长引起的酸解或碱解等非特异性的降解，而是微生物本身的代谢能力引起的苯磺隆的降解。

Claims (4)

1.一种降解苯磺隆的假单胞菌NyZ42菌株，其特征在于：假单胞菌Pseudomonas sp. NyZ42 CCTCC NO：M2010222。

2.根据权利要求1所述的一种降解苯磺隆的假单胞菌NyZ42菌株，其特征在于：所述的假单胞菌含有16S rRNA基因序列的SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

3.权利要求1所述的一种降解苯磺隆的假单胞菌NyZ42菌株，其制备步骤是：

A、从长期使用苯磺隆除草剂的麦田中取土壤样品100克，充分混匀后取1克样品加入100 ml富集培养基中：无机盐基础培养基加入苯磺隆和1克/升的葡萄糖，30 °C富集培养3天，连续3次转接富集培养基，提高培养基中苯磺隆浓度，培养基苯磺隆浓度提高到200毫克/升；

B、用固体LB培养基划线分离单菌落，选择生长好、传代稳定、降解能力好的一株单菌落进行进一步降解特性验证；

C、筛选获得一株微生物菌株，命名为NyZ42；

D、进一步以该菌株的基因组为模版，通过PCR扩增该菌株的16S rRNA基因序列，所用引物为，27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT，序列测定结果显示该菌株属于假单胞菌属，命名为假单胞菌NyZ42；

该菌株呈杆状，革兰氏阴性，菌落特征为：在LB培养基上培养1天的菌落大小位直径l-2毫米，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，凸起，无色。

4.权利要求1所述的一种降解苯磺隆的假单胞菌NyZ42菌株，其特征在于：所述的假单胞菌NyZ42呈杆状、革兰氏阴性、菌落呈圆形、表面光滑、边缘整齐、凸起、无色。

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