CN102151155B

CN102151155B - 建立研究关节腔内环境及软骨下环境对关节软骨影响实验模型的工具

Info

Publication number: CN102151155B
Application number: CN 201110105338
Authority: CN
Inventors: 卫小春; 王宇泽
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-04-26
Filing date: 2011-04-26
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2031-04-26
Also published as: CN102151155A

Abstract

本发明涉及关节软骨研究方法的技术领域，具体涉及一种建立研究关节腔内环境及软骨下环境对关节软骨影响的实验模型的工具及其方法，解决了目前的实验方法不能简单可行地评估关节腔内环境和软骨下环境对软骨的影响的问题。其包括一端封闭而另一端开放的帽状内置物、两端开放的管状内置物以及两端封闭的空心柱状内置物，帽状内置物、管状内置物以及柱状内置物的内、外径相同，高度也相同，柱状内置物由上、下两部分组成。本发明的有益效果：设计简单，使关节内的可变因素减少，同时能设立科学的对照研究，适合研究关节腔内环境和软骨下环境对关节软骨的影响。

Description

建立研究关节腔内环境及软骨下环境对关节软骨影响实验模型的工具

技术领域

本发明涉及关节软骨研究方法的技术领域，具体涉及一种建立研究关节腔内环境及软骨下环境对关节软骨影响的实验模型的方法。

背景技术

关节软骨是覆盖在构成活动关节的两相对骨面，为透明软骨。关节软骨是一种特殊的结缔组织，由软骨细胞和软骨基质组成，关节软骨的主要生理功能有：均匀传递载荷，扩大关节负重面，减少接触应力，缓冲震荡，为关节活动提供低磨擦、低磨损的光滑界面。依据软骨细胞和基质的形态变化，关节软骨自浅向深可分为：切线层或浅表层(superficial zone)、中间层或移行层(transitional zone)、深层或辐射层(deep zone or radial zone)以及钙化软骨层(zone of calcified cartilage)。各层厚度在不同动物和不同关节中各不相同，各层之间也没有明确的界限。但各层软骨的组成、结构和力学特性不同，细胞的形态和功能也不同。

关节软骨没有血管、神经和淋巴管，软骨的营养来源只有两个途径，一个是通过软骨表面的关节液，另一个是通过软骨下骨的骨松质。早在1849年，Leidy观察到软骨的表面可以吸收水份。Virchow在1863年提出关节内游离体表面是正常的软骨，说明关节液可以为关节软骨提供足够的营养。关节液从软骨表面到软骨内的钻移在体内和体外均已得到了证实，也有研究证明关节软骨的营养来自软骨下骨，所以两条营养途径中哪条营养通路对软骨更重要是学者们一直争论的问题。

目前，研究关节软骨营养代谢的实验方法主要有：第一种，体外研究软骨细胞和软骨组织的代谢情况，但体外的环境不能完全代表活体关节腔内环境；第二种，在体阻断关节的血液以观察关节软骨的代谢情况，但阻断关节血液会使关节内多种组织受到影响，可变因素增多，关节软骨的代谢结果不能令人信服；第三种，通过干预软骨下骨和（或）骨髓以达到干预软骨的营养，如增加骨髓腔的压力以阻断软骨下骨的血运。但这种干预方法的效果不好评估。第四种，在关节腔内注入化学物质阻断关节液对软骨细胞的营养途径用以研究软骨的代谢情况，但是关节内的结构复杂，化学物质也可以对滑膜，韧带，半月板等组织产生影响，这些相互影响都可能影响最后的实验结果。

综上，目前没有一种简单可行的实验方法来评估关节腔内环境和软骨下软境对软骨的影响。

发明内容

本发明为了解决目前的实验方法不能简单可行地评估关节腔内环境和软骨下环境对软骨的影响的问题，提供了一种建立研究关节腔内环境及软骨下环境对关节软骨影响实验模型的工具及其方法，从而为研究关节软骨的病理生理提供方法。

本发明采用如下的技术方案实现：

一种建立研究关节腔内环境及软骨下环境对关节软骨影响实验模型的工具，其特征在于其包括一端封闭而另一端开放的帽状内置物、两端开放的管状内置物以及两端封闭的空心柱状内置物，帽状内置物、管状内置物以及柱状内置物的内、外径相同，高度也相同，柱状内置物由上、下两部分组成。

一种建立研究关节腔内环境及软骨下环境对关节软骨影响实验模型的方法，采用上述的工具完成，具体步骤如下，

1）、取帽状内置物，使其封闭端置于关节软骨与关节腔内环境之间，将关节软骨与关节腔内环境之间的营养联系阻断，建立研究关节腔内环境对关节软骨影响的实验模型；

2）、取帽状内置物，使其封闭端置于关节软骨与软骨下环境之间，将关节软骨与软骨下环境之间的营养联系阻断，建立研究软骨下环境对关节软骨影响的实验模型；

3）、取柱状内置物，使其两封闭端分别位于局部软骨的关节腔面和软骨下骨面，将局部软骨与关节腔内环境、软骨下环境的联系阻断，建立软骨上、下环境对关节软骨影响的实验模型；

4）、取管状内置物，将其垂直置于关节软骨内，建立保持局部软骨与软骨上、下环境联系的实验模型，用于对照实验。

本发明利用“帽状”、“管状”、“柱状”内置物，可分别阻断软骨表面的关节腔内环境、软骨下环境、软骨上下环境，阻断效果切实可靠，同时能够设立科学的对照。本发明的有益效果：设计简单，使关节内的可变因素减少，同时能设立科学的对照研究，适合研究关节腔内环境和（或）软骨下环境对关节软骨的影响。

附图说明

图1为帽状内置物阻断关节软骨与关节腔内环境联系示意图

图2为图1中的帽状内置物的放大图

图3为帽状内置物在软骨组织内的放大图

图4为帽状内置物阻断关节软骨与软骨下环境联系示意图

图5为图4中帽状内置物的放大图

图6为帽状内置物在软骨组织内的放大图

图7为柱状内置阻断关节软骨与关节液和软骨下骨的联系示意图

图8为图7中柱状内置物的放大图

图9为柱状内置物在软骨组织内的放大图

图10为管状内置物保持局部关节软骨与关节腔内环境和软骨下环境的联系示意图

图11为图10中管状内置物的放大图

图12为管状内置物在软骨组织内的放大图

图13为表1不同组别OARSI评分值

图14为不同组别OARSI评分值比较图

图中：1-股骨，2-关节软骨，3-胫骨，4-关节液，5-帽状内置物，6-非钙化层软骨，7-钙化层软骨，8-软骨下骨，9-柱状内置物，10-管状内置物。

具体实施方式

一、所用器械

1、内置物：包括帽状、管状、柱状内置物，化学和物理性质稳定，有一定硬度，并且机体排异反应小的内置材料制作，如钛合金，塑料、药用PVC、不锈钢等。材料的厚度要尽可能薄（100μm-300μm），内置物的内外直径要根据实验目的以及实验动物来设定。

2、空心环钻：内外径与帽状内置物相同。

二、研究方法与步骤

1、根据研究的内容设置内置物的直径、高度。

2、制作动物模型

1）、建立研究关节腔内环境对关节软骨影响的实验模型：阻断关节软骨与关节腔内环境的营养联系，在关节软骨表面用空心环钻制造与帽状内置物直径、高度一致的圆形痕迹，（如图1、2、3）所示，将帽状内置物盖在软骨上，使关节软骨与关节腔内环境隔离。

2）、建立研究软骨下环境对关节软骨影响的实验模型：阻断关节软骨与软骨下环境营养联系，在关节软骨表面用空心环钻制造与帽状结构直径，高度一样的圆形痕迹，并用环钻取出环钻内的软骨块，（如图4、5、6）所示，将帽状内置物盖住软骨下骨，并原位回植软骨块，使取出的关节软骨与软骨下环境隔离。

3）、建立研究软骨上、下环境对关节软骨影响的实验模型：阻断关节软骨与软骨上、下环境营养联系，在关节软骨表面用空心环钻制造与帽状结构直径，高度一样的圆形痕迹，并用环钻取出环钻内骨软骨块，将柱状内置物的上部和下部分别盖住软骨上、下表面，并原位回植，（如图7、8、9），使取出的软骨块与关节腔内环境和软骨下环境隔离。

4）、参照模型的建立：在关节软骨表面用空心环钻制造与帽状内置物直径，高度一样的圆形痕迹，将管状内置物植入，这样即可保留管内关节软骨与关节腔内环境的联系又可能保留管内关节软骨与软骨下环境的联系。（如图10、11、12）。

5）、观察一定时间后，在不同的时间点取出软骨块根据研究目的进行实验研究，如大体观察、特殊染色、免疫组化、电镜扫描、生物力学检测、生化检测等方法研究关节腔内环境和（或）软骨下环境对软骨的影响。

三、实施例

（一）、1材料和方法

1.1造模器械角膜环钻 (刃部口径4.0mm,有芯，北京易佰在线医疗器械有限责任公司) ，帽状内置物(用塑料自制的口径4.0mm ,高度4.0mm 、2.0mm )，管状内置物(用塑料自制的口径4.0mm ,高度4.0mm )，柱状内置物(用药用PVC,自制的口径4.0mm ,高度4.0mm ，本实验用两个高度为2.0mm的帽状内置物对扣而构成)。

1.2实验动物与分组健康成年新西兰大白兔36只，体重2--2.5 Kg，雌雄不限，由山西医科大学动物实验中心提供。随机分为四组：对照组（A组，n=6）,阻断软骨与关节腔内环境的联系组(B组， n=6),阻断软骨与软骨下环境的联系(C组， n=6)，阻断软骨与关节腔内环境、软骨下环境的联系(D组，n=6)。

1.3软骨缺血模型的制备

1.3.1造模前准备白兔术前称重，采用3%戊巴比妥耳缘静脉麻醉（1ml/kg体重，戊巴比妥购自SIGMA公司）仰卧于手术台上，双侧膝关节剃毛备皮，酪合碘消毒，铺巾。

1.3.2模型建立

采用本发明所述方法。

1.4 术后2周每组随机取3只动物（6例膝），向膝关节腔内注射0.5ml墨水，任由活动一天，过量3%戊巴比妥麻醉处死动物，切开关节观察墨水的分布情况,观察冒状内植物的阻断效果。术后4 周，取出圆柱形骨软骨块,观察骨软骨块的颜色， 4%多聚甲醛固定48小时,20%EDTA二钠（PH 7.15）溶液浸泡，每两天换液一次，继续脱钙40d,切片。HE、番红O法染色，甲苯胺蓝染色,中性树胶封片，随机选择3张切片，通过两名观察者采用OARSI评分独立判断评软骨组织学变化，分值越高说明软骨退化越明显。

1.5 统计学分析　实验数据应用SPSS13. 0 软件包处理,实验数据以表示,数据分析采用单因素反差分析,多重比较采用LSD法,P < 0.05为统计学意义。

2 结果

2.1 术后一般情况观察

2.1.1 术后1-4 h完全清醒，无麻醉意外动物，术后3天内白兔活动、饮食明显减少。术后4天，活动、饮食恢复正常。

2.1.2 术后2 周，关节腔内注射墨水自由活动1天后，内置物与周围骨软骨组织结合紧密，内置物与骨软骨间隙未见墨水渗入，帽状内置物内骨软骨块也未见墨水渗入。取出C、D组的软骨块，软骨块呈白色，表明帽状内置物阻断营养途径效果确切。

2.2 阻断软骨营养来源的不同途径后，软骨的变化

2.2.1 术后4周，采用OARSI评分独立判断评软骨组织学变化，

分值越高说明软骨退化越明显（见图13：表1不同组别OARSI评分值）。

如图14，不同组别OARSI评分值比较，A：对照组；B：阻断软骨与关节腔内环境的联系组；C：阻断软骨与软骨下环境的联系；D：阻断软骨与关节腔内环境、软骨下环境的联系；B 、D 组软骨退变比A、C组严重(P<0.05)；B、D组间软骨退变没有差异；A、C组间软骨退变没有差异。

2.2.2 （见图14）阻断关节液营养通路后，关节软骨短期内会表现出退变迹象。阻断软骨下营养通路后短期内对软骨没有明显影响，说明关节软骨的主要营养来原为关节液。

Claims

1.一种建立研究关节腔内环境及软骨下环境对关节软骨影响实验模型的工具，其特征在于其包括一端封闭而另一端开放的帽状内置物（5）、两端开放的管状内置物（10）以及两端封闭的空心柱状内置物（9），帽状内置物（5）、管状内置物（10）以及柱状内置物（9）的内、外径相同，高度也相同，柱状内置物（9）由上、下两部分组成，帽状内置物口径4.0mm，高度4.0mm或者2.0mm，管状内置物口径4.0mm，高度4.0mm，柱状内置物口径4.0mm，高度4.0mm。