CN102149675B - 用于免疫佐剂E6020之合成前体的β-酮酰胺合成的试剂和方法 - Google Patents

用于免疫佐剂E6020之合成前体的β-酮酰胺合成的试剂和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及通过β-酮酰胺醇中间体化合物22合成E6020的前体化合物26的方法。该合成方法使化合物22与化合物25反应，并氧化所得中间体得到化合物26即E6020的前体。化合物22和25及其晶形代表本发明的独立实施方案。本发明还涉及式(3)和(4)的化合物及其制备方法。所述β-酮酰胺醇中间体化合物22是式(3)的化合物，化合物25是式(4)的化合物。

Description

用于免疫佐剂E6020之合成前体的β-酮酰胺合成的试剂和方法
相关申请的交叉引用
本申请按照35U.S.C.§119要求于2007年12月18日提交的美国临时申请61/014,648的优先权，在此将其通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及通过β-酮酰胺中间体合成免疫佐剂E6020的前体的方法。本发明还涉及所述合成方法中的中间体化合物及其晶形的两种化合物。
发明背景
已经证明疫苗是用来预防传染病的成功方法。通常，其是有成本效益的，并且不会诱导针对靶标病原体的抗生素抗性或影响存在于宿主中的正常菌群。在很多情况中，比如当诱导抗病毒免疫时，疫苗可以预防没有可治愈性或改善性治疗方法的疾病。
疫苗通过触发免疫系统以引起对物质或抗原的应答而起作用，其通常是以非感染性或非病原体形式引入到体内的感染性生物或其一部分。一旦免疫系统对所述生物已经是“预处理过的”(primed)或敏化的，那么之后免疫系统暴露于作为感染性病原体的该生物后产生快速强烈的免疫应答，所述免疫应答在病原体能够在宿主生物中繁殖和感染足够的细胞以引起疾病症状之前破坏所述病原体。用来预处理免疫系统的物质或抗原可以是处于较弱感染性状态的完整生物(称为减毒生物)，或者在某些情况下是生物的组分，比如代表生物的不同结构组分的碳水化合物、蛋白质或肽。
在许多情况下，为了以足够的程度刺激免疫系统使疫苗有效，即赋予免疫性，有必要增强针对存在于疫苗中的抗原的免疫应答。许多蛋白质和大多数肽以及碳水化合物抗原单独施用不会引起足以赋予免疫性的抗体应答。这样的抗原需要以其会被识别为是外来的并会引起免疫应答的方式呈递给免疫系统。为此目的，已经设计了激发、增强和/或导向针对所选抗原的免疫应答的添加剂(佐剂)。
最著名的佐剂即弗氏完全佐剂由在油/水乳液中的分枝杆菌的混合物组成。弗氏佐剂通过两种方式起作用：第一种，通过增强细胞和体液介导的免疫，第二种，通过阻止抗原激发的迅速分散(“储存效应”)。然而，由于对该物质的频繁的毒性生理和免疫反应，弗氏佐剂不能用于人。
另一种已经表现出具有免疫刺激活性或佐剂活性的分子是内毒素，又称为脂多糖(LPS)。LPS通过触发“先天性的”免疫应答来刺激免疫系统，所述″先天性的″免疫应答是已经演化为使得生物不需要预先与生物体接触而能够识别内毒素(和入侵细菌，其中内毒素是入侵细菌的组分)的应答。虽然LPS的毒性太大而不能作为可利用的佐剂，但是在结构上与内毒素相关的分子例如单磷酰脂质A(“MPL”)已经在临床试验中进行作为佐剂的测试。已经证实LPS和MPL都是人toll-样受体-4(TLR-4)的激动剂。然而，目前FDA批准的用于人类的唯一佐剂是过硫酸铝盐(明矾)，其用于通过将抗原沉淀而“储存”抗原。明矾还刺激针对抗原的免疫应答。
E6020是一种高效的TLR-4受体激动剂，因此当与抗原(比如疫苗)共同施用用于细菌性和病毒性疾病时其用作免疫佐剂。例如，E6020可以与任何合适的抗原或疫苗成分联合使用，所述抗原或疫苗成分例如选自来自病原性和非病原性生物、病毒和真菌的抗原的抗原物质。作为进一步的实例，E6020可以与对于诸如以下的疾病状态和病症有药理学活性的蛋白质、肽、抗原和疫苗联合使用：天花、黄热病、癌症、瘟热(distemper)、霍乱、禽痘、猩红热、白喉、破伤风、百日咳、流行性感冒、狂犬病、流行性腮腺炎、麻疹、口蹄疫和脊髓灰质炎，以及病毒性疾病比如疱疹和疱疹相关疾病及肝炎和肝炎相关疾病。当作为疫苗使用而向被预防接种的宿主动物、胚胎或卵施用时，E6020和抗原各自以能够有效引起免疫应答的量存在。
由于其具有比单独使用抗原刺激更强烈的抗体应答的能力，因此化合物如E6020是重要的免疫化合物。需要开发制备化合物如E6020及其合成前体的合成方法，所述化合物可以与抗原以疫苗形式共同施用。新的合成方法包括作为中间体的新化合物和作为方法步骤的新反应。本发明提供了一种合成TLR-4受体激动剂(如E6020)的中间体和前体的改进方法。
发明内容
本发明涉及通过β-酮酰胺中间体化合物22产生可得到E6020前体化合物26的新的合成方法、中间体和前体。本发明的合成从化合物14开始，制得化合物22，然后使其与化合物25反应，制得化合物26，化合物26是免疫佐剂E6020的倒数第二位前体。化合物22和化合物25及其晶形代表本发明的独立实施方案。
在另一个实施方案中，本发明涉及式(3)化合物：
其中R1、R2和R3在每次出现时独立地为C5-C15烷基、C5-C15烯基或C5-C15炔基。本发明还涉及一种用于制备式(3)化合物的方法。所述β-酮酰胺中间体化合物22是式(3)化合物。
本发明的另一个实施方案为式(4)化合物：
其中R4在每次出现时独立地为保护基，比如C1-C6烷基、C3-C5烯基、芳基、苄基或其它合适的保护基；R5和R6在每次出现时各自独立地为C1-C6烷基，或者与它们连接的氮一起形成5或6元杂环。本发明还涉及一种用于制备式(4)化合物的方法。化合物25是式(4)化合物。
附图说明
图1为根据本发明的E6020的β-酮酰胺合成方法的概述。
图2为晶体化合物22的粉末X射线衍射图。
图3为晶体化合物22的DSC热分析图。
图4为晶体化合物25的粉末X射线衍射图。
图5为晶体化合物25的DSC热分析图。
图6为利用不同原子标记的晶体化合物25的ORTEP图。
图7为晶体化合物25沿C-轴的晶体堆积图。
图8为晶体化合物25的模拟粉末X射线衍射图。
发明详述
2006年6月30日提交的美国专利申请No.11/477,936“CompoundsFor Preparing Immunological Adjuvant”(2007年4月12日公开，US2007-0082875A1)描述了E6020的合成方法，将其通过引入并入本文。该合成方法通过磷酸酯脲基二聚体化合物19进行。US 2007-0082875A1的方案1-3描述了通过化合物19合成E6020的方法。方案1中所示的起始原料为ER-028694(1，3-癸二醇；可购自供货商Mitsui&Co.(US)，New York，NY；制造商Nippon Fine Chemicals)和ER-807277(4-噁唑甲醇，4，5-二氢-2-苯基-，(4R)-丙二醇；可购自Catalytica Pharmaceuticals，Boonton，NJ)。E6020的倒数第二位前体是化合物26。
本发明涉及通过β-酮酰胺中间体化合物22产生E6020前体化合物26的新的合成方法、中间体和前体。本发明的合成方法从化合物14开始，制得化合物22，然后使其与化合物25反应，制得化合物26，化合物26是免疫佐剂E6020的前体。本发明的合成方法的这些步骤：制备β-酮酰胺中间体(3)，接着使该β-酮酰胺(3)与二亚磷酰胺脲(4)缩合，都显示在方案4中，在下面进行详细描述。化合物22和25及其晶形代表本发明的独立实施方案。
获得化合物例如化合物22或25的晶形对于药物研发非常有用。固态形式(晶体或无定形)的化合物可具有不同的物理和化学性质，例如溶解性、稳定性或再生产的能力。这些性质常使得制备方法优化，尤其是从中获得晶体中间体。在多步骤合成中(比如本文所描述的那些)，制备中间体，并可以将不需要的副产物或杂质从早期步骤中除去。通常引入过滤、分离和/或纯化步骤以除去不需要的副产物或杂质。引入这些步骤不仅可增加生产成本，而且还可降低合成方法的总产率。在多步骤合成方法中具有晶体中间体可以解决这些问题。结晶中间体提供了某些优点-高纯度中间体可以减少对其它纯化步骤的需要和降低合成过程的成本。
方案1
步骤1：TsCl，Et3N，THF
步骤2：NaHMDs，THF，色谱法，结晶
步骤3：月桂酸，EDC，DMAP，CH2Cl2，色谱法
步骤4：H2，10％Pd/C，EtOH
步骤5：Boc2O，THF，色谱法
方案2
步骤6：a.二异丙胺，Py.TFA，((iPr)2N)2P(O烯丙基)，CH2Cl2
b.HOAc，Py.TFA，FmocNH(CH2)2OH
c.H2O2，色谱法
步骤7：二甲胺，THF
步骤8：在甲苯中的20％光气，饱和NaHCO3水溶液，色谱法
方案3
步骤9：TFA，CH2Cl2
步骤10：3-氧代-十四烷酸，EDC，DMF，色谱法
步骤11；Pd(PPh3)4，PPh3，PhSiH3，THF，色谱法
β-酮酰胺醇中间体(3)的制备制备
化合物26及类似化合物的合成首先包括在合适的反应条件下使式(1)的α羟基胺与式(2)化合物反应以形成式(3)的β-酮酰胺。这显示在方案5中。
方案5
根据方案5制备化合物(3)可以使用不同的制备方法来实现。基团R1、R2和R3的定义如下。因为R1、R2和R3彼此可以独立地变化，所以化合物(3)可以具有对称或不对称的R1、R2和R3基团。在化合物(2)中，X为合适的离去基团，例如OH、Cl、F、咪唑烷基、碳酸酯基和酯基。优选的离去基团包括OH、Cl、F、咪唑烷基、三甲基乙酰氧基、碳酸乙酯基、碳酸甲酯基、碳酸异丁酯基或式Z的基团：
其中R7与式(2)中的R3相同，从而式(2)化合物是对称的β酮酯酸酐。这种酸酐可以由两种相同的β-酮酸分子缩合得到。
在一种制备方法中，化合物(3)可以由化合物(1)与其中X为咪唑鎓(imidazolide)的化合物(2)缩合而得到。后一种化合物是在极性非质子溶剂(比如乙腈)中用CDI(羰基二咪唑)试剂活化其中X为OH的化合物(2)(羧酸)而得到的。
在第二种制备方法中，化合物(3)还可以在溶剂(比如DMF或CH2Cl2)中，在酰胺键偶联试剂如HBTU(O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯)或同一家族的其它偶联试剂和叔胺碱(例如Hünig′s碱，N，N-二异丙基乙胺)的存在下，由化合物(1)与其中X为OH的化合物(2)(羧酸)缩合而得到。另外，碳二亚胺试剂比如EDC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐)可用于活化其中X为OH的化合物(2)(羧酸)。
制备化合物(3)的第三种制备方法是在溶剂如CH2Cl2中，在叔胺碱(例如Hünig′s碱)的存在下，使化合物(1)与其中X为F的化合物(2)(酰基氟)缩合。其中X为F的化合物(2)(酰基氟)可以在溶剂比如CH2Cl2中，用TFFH(氟-N，N，N′，N′-四甲基甲脒鎓六氟磷酸酯)试剂活化其中X为OH的化合物(2)(羧酸)而产生。
化合物(3)还可以通过第四种制备方法得到，即在溶剂比如CH2Cl2中，在叔胺碱(例如Hünig′s碱)的存在下，使化合物(1)与其中X为Cl的化合物(2)(酰氯)缩合。其中X为Cl的化合物(2)(酰基氯)可以在溶剂(比如CH2Cl2)中用草酰氯试剂活化其中X为OH的化合物(2)(羧酸)而得到。
制备化合物(3)的第五种制备方法可以在溶剂如CH2Cl2中，在叔胺碱(例如Hünig′s碱)的存在下，使化合物(1)与其中X为碳酸酯基的链烷酸碳酸酸酐化合物(2)缩合。后一种化合物是在溶剂比如CH2Cl2中，在叔胺碱(例如三乙胺)的存在下，用氯甲酸乙酯试剂活化其中X为OH的(2)(羧酸)而得到的。
制备化合物(3)的第六种制备方法可以在溶剂如CH2Cl2中，在叔胺碱(例如Hünig′s碱)的存在下，使化合物(1)与其中X为酯基的混合酸酐化合物(2)缩合。后一种化合物是在溶剂比如CH2Cl2中，在叔胺碱(例如三乙胺)的存在下，用新戊酰氯试剂活化其中X为OH的(2)(羧酸)而得到的。
化合物(3)还可以通过第七种制备方法得到，其中首先在溶剂比如CH2Cl2中，在草酰氯试剂的作用下，使X为OH的化合物(2)(羧酸)转变成对称酸酐。在溶剂比如CH2Cl2中，在叔碱(例如三乙胺)的存在下，使得到的酸酐与化合物(1)缩合。
如下述实施例1所示，可以通过氢化式Y的化合物来制备式(1)化合物：
其中R1和R2如上所定义。所述氢化可以在任何合适的溶剂例如乙醇、异丙醇和本领域已知的其它溶剂中进行，但优选在异丙醇中进行。
在式(1)、(2)和(3)中，R1、R2和R3在每次出现时可以各自独立地为C5-C15烷基、C5-C15烯基或C5-C15炔基。所述烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的、直链或支链的，优选直链的。在一个优选的实施方案中，R1为C5-C12烷基、C5-C12烯基或C5-C12炔基，更优选为C5-C9烷基、C5-C9烯基或C5-C9炔基，同时R2和R3在每次出现时各自独立地为C7-C14烷基或C7-C14烯基，更优选为C9-C13烷基或C9-C13烯基。优选地，R1为C7烷基，最优选为未取代的正庚基，R2和R3都为C11烷基，最优选为未取代的正十一烷基。
本发明上述R1、R2和R3的各个基团提及的烷基、烯基、炔基可以是取代或未取代的。取代基的实例包括但不限于卤素取代基(例如F、Cl、Br和I)；C1-C6烷氧基(例如-OCH3、-OCH2CH3、-OCH(CH3)2等)；C1-C6卤代烷基(例如-CF3、-CH2CF3、-CHCl2等)；C1-C6烷硫基；酰胺基；-NO2和-CN。除非另有说明，否则所述烷基、烯基和炔基可以是直链或支链的，通常优选直链的。
式(3)的β-酮酰胺醇化合物是新化合物，可用作制备化合物(如E6020)中的中间体。式(3)的化合物是本发明的独立实施方案。具有式(3a)中所示立体化学的β-酮酰胺醇化合物是特别优选的。
在E6020的合成方法中，所述β-酮酰胺醇是化合物22。化合物22及其晶形也是本发明的独立实施方案。从化合物14开始合成化合物22的方法描述在下述实施例1中，晶体22的固态表征描述在下述实施例2中。
化合物22
二亚磷酰胺脲(4)的制备
式(4)的二亚磷酰胺脲化合物代表了E6020的β-酮酰胺醇合成中的另一种新的中间体化合物。因此，式(4)化合物是本发明的独立实施方案。式(4)的二亚磷酰胺脲化合物可以如方案6所示，通过使1，3-双(2-羟乙基)脲与式(7)的两个亚磷酰二胺(phosphorodiamidate)化合物反应而制备，其中R4、R5和R6如下所述。
方案6
在某些实施方案中，1，3-双(2-羟乙基)脲与亚磷酰二胺的反应通过使所述双羟基化合物与合适的活化剂(比如本领域技术人员已知的活化剂)反应并且然后向反应混合物中加入亚磷酰二胺而实现。在某些实施方案中，所述活化剂选自(1H)-四唑和三氟乙酸吡啶鎓。在某些实施方案中，所述活化剂为三氟乙酸吡啶鎓。在某些实施方案中，方案6的反应是在溶剂中进行的，所述溶剂包括选自乙腈、二氯甲烷、二氯乙烷和叔丁基甲基醚的溶剂。在某些实施方案中，方案6的反应是在乙腈作为溶剂的情形下进行的。
β-酮酰胺醇(3)与二亚磷酰胺脲(4)的缩合
如上述方案4所示，化合物26的合成包括使式(3)的β-酮酰胺醇与式(4)的二亚磷酰胺脲化合物缩合而形成式(5)的β-酮酰胺亚磷酸脲化合物，然后将其氧化成式(6)的β-酮酰胺磷酸脲化合物。这显示在下述方案7中。
方案7
在式(4)、(5)和(6)中，R1、R2和R3与上述相同，包括其优选的实施方案，并且是彼此独立的。在每次出现时，R1、R2和R3可以相同或不同。换言之，式(6)的化合物可以在每个R1、R2或R3位置上具有相同或不同的烷基、烯基和/或炔基。每个R4基团可以独立地为保护基，包括但不限于下述基团：烷基或取代的烷基，比如甲基、乙基、异丙基、叔丁基等，优选C1-C6烷基；烯基或取代的烯基，比如烯丙基、2-甲基丙烯基、丁烯基等，优选C3-C5烯基；炔基，优选C3-C5炔基；环烷基，比如环己基；2-取代的乙基，比如2-氰基乙基、2-氰基-1，1-二甲基乙基、2-(三甲基甲硅烷基)乙基等；卤代乙基，比如2，2，2-三氯乙基、2，2，2-三氯-1，1-二甲基乙基、2，2，2-三溴乙基等；苄基或取代的苄基，比如苄基、4-硝基苄基、4-氯苄基等；芳基或取代的芳基，比如苯基、4-硝基苯基、4-氯苯基、2-氯苯基、2-甲基苯基、2，6-二甲基苯基、2-溴苯基等；以及甲硅烷基，比如三甲基甲硅烷基等。R4的特别优选的保护基是甲基、乙基、叔丁基、烯丙基、2-甲基丙烯基、丁烯基、2-氰基乙基(NCCH2CH2-)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基((CH3)3SiCH2CH2-)和2，2，2-三氯乙基(Cl3CCH2-)。与R1、R2和R3一样，R4在每次出现时可以在R4的定义内彼此不同。
R5和R6在每次出现时独立地为C1-C6烷基、C3-C6烯基或C3-C6炔基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的，或者与它们连接的氮一起形成5或6元杂环。所述杂环可以包括另外的杂原子，例如N、O和/或S；其可以是饱和或不饱和的，且可以是未取代或取代的。取代基的实例包括但不限于卤素取代基(例如F、Cl、Br和I)；C1-C6烷氧基(例如-OCH3、-OCH2CH3、-OCH(CH3)2等)；C1-C6卤代烷基(例如-CF3、-CH2CF3、-CHCl2等)；C1-C6烷硫基；-NO2基团和-CN基团。合适的杂环基团包括但不限于哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、吡咯烷基等。R4、R5和R6的烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的、直链或支链的。取代基的实例包括但不限于卤素取代基(例如F、Cl、Br和I)；C1-C6烷氧基(例如-OCH3、-OCH2CH3、-OCH(CH3)2等)；C1-C6卤代烷基(例如-CF3、-CH2CF3、-CHCl2等)；C1-C6烷硫基；-NO2基团和-CN基团。在一个优选的实施方案中，R4为C3-C5烯基，R5和R6各自独立地为支链的C1-C6烷基。优选地，R4为烯丙基，R5和R6为异丙基。
在某些实施方案中，通过向式(3)化合物和式(4)化合物的混合物中加入溶剂，搅拌直到所有固体溶解，并向该混合物中加入乙酸，使式(3)化合物与式(4)化合物反应。在某些实施方案中，所述溶剂是无水的，并且可以是共溶剂混合物。在某些实施方案中，所述共溶剂混合物包含乙腈和烃溶剂。在一个优选的实施方案中，所述溶剂可以是例如无水乙睛和无水庚烷的混合物。在某些实施方案中，所述共溶剂混合物包含庚烷和乙腈。在某些实施方案中，所述共溶剂混合物中庚烷的重量为式(3)化合物重量的4至6倍。在某些实施方案中，所述共溶剂混合物中庚烷的重量为式(3)化合物重量的4.5至5.5倍。在某些实施方案中，在所述共溶剂混合物中乙腈的重量为式(3)化合物重量的1至2倍。在某些实施方案中，所述共溶剂混合物中乙腈的重量为式(3)化合物重量的1.2至1.5倍。在某些实施方案中，所用乙酸的重量为所用式(3)化合物的量的1至2摩尔当量。在某些实施方案中，所用乙酸的量为所用式(3)化合物的量的1.2至5摩尔当量。在某些实施方案中，在加入乙酸期间，反应混合物的温度保持在约20-25℃。
在某些实施方案中，用氧化剂将按照方案7的方法形成的式(5)化合物氧化成式(6)化合物。在某些实施方案中，所述氧化剂为过氧化氢、氧化剂、mCPBA(间氯过苯甲酸)等。在某些实施方案中，所述过氧化氢为在水中的30％(wt/wt)的H2O2。在某些实施方案中，在所述氧化步骤之前，用另外的庚烷稀释含有所形成的式(5)化合物的反应混合物。在某些实施方案中，所述另外加入的庚烷的重量为所用式(3)化合物重量的5至10倍。在某些实施方案中，所述另外加入的庚烷的重量为所用式(3)化合物重量的约8倍。在某些实施方案中，在加入所述另外的庚烷之后和加入氧化剂之前，将含有所形成的式(5)化合物的反应混合物冷却至约-5至10℃。在某些实施方案中，在加入所述另外的庚烷之后和加入氧化剂之前，将含有所形成的式(5)化合物的反应混合物冷却至约0至5℃。在某些实施方案中，在加入氧化剂之后，反应混合物的温度保持在约-5至10℃。在某些实施方案中，在加入氧化剂之后，使反应混合物的温度保持在约0至2℃。在某些实施方案中，在加入氧化剂之后直到反应完全，在约-5至10℃的温度下搅拌该反应。在某些实施方案中，在加入氧化剂之后直到反应完全，在约-1至2℃的温度下搅拌该反应。在某些实施方案中，用HPLC监测反应以确定反应完全。在某些实施方案中，在反应完全之后，用硫代硫酸钠五水合物破坏过量的过氧化物来淬灭该反应。
在化合物26的合成方法中，式(4)的化合物为化合物25。化合物25及其晶形也是本发明的独立实施方案。从二羟基脲化合物24开始合成化合物25的方法描述在下述实施例4中，晶体化合物25的固态表征描述在下述实施例5中。
下述实施例6描述了由化合物22和化合物25反应制备E6020前体化合物26(一种式(6)的化合物，其中R1为正庚基、R2和R3都为正十一烷基，R4为烯丙基)。
本文中所描述的合成方法可适合于制备化合物26和相应E6020的任何所有可能的立体异构体，例如分别具有如下通式结构的化合物(A)和(B)：
虽然下述实施例公开了特定立体异构体的制备，但是认为用于制备化合物26的其它立体异构体的方法也落入本发明的范围内。本发明的合成方法非常适于提供纯的立体异构体，为得到该纯的立体异构体，限定起始原料(3)的初始立体化学并将其以相对于二亚磷酰胺脲(4)的2当量比例进行使用，如方案7(上述)所示。该方法使得能够制备四种纯的立体异构体，包括在1、6、22、27位具有(R，R，R，R)立体化学的E6020；ER-824156(S，S，S，S)；ER-804053(R，S，S，R)和ER-824095(S，R，R，S)。为了制备其它立体异构体(ER-826685(R，R，S，R)；ER-824887(R，R，R，S)；ER-826682(R，R，S，S)；ER-827905(R，S，R，S)；ER-826683(R，S，S，S)；ER-804097(S，S，R，S))，应当使用1当量的具有在2和7位的限定立体化学的起始原料(3)和1当量的具有在2和7位的不同的限定的立体化学的起始原料(3)以获得产物混合物。所得的反应(利用方案7)提供化合物(6)的3种不同立体异构体，其可通过柱色谱分离并通过与之前由上述第一种合成方法制备的可靠立体异构体的1H-NMR和HPLC的比较以及通过如在美国专利No.6,290,973中描述的分离方法来确定结构。美国专利No.6,551,600；6,290,973和6,521,776公开了E6020和相关化合物的其它合成路线，提供了制备某些试剂和起始原料的有用的背景资料，将其通过引入并入本文。
实施例
在下述实施例中，当术语“惰性”用于描述反应器(例如反应容器、烧瓶、玻璃反应器等)时，其指反应器内的空气已经被基本上不含水或干燥的惰性气体(比如氮气、氩气等)替换。本文使用的术语“当量”(缩写：eq)描述了试剂或反应化合物与预定起始原料相比的化学计量(摩尔比)。本文使用的术语“重量”(缩写：wt)指物质或一组物质的质量与下述实施例中所具体提及的反应或纯化的特定化学成分的质量的比例。该比例计算为：g/g或Kg/Kg。本文使用的术语“体积”(缩写：vol)对应于给定物质或一组物质的体积与反应或纯化的预定化学成分的质量或体积的比例。在等式中使用的单位涉及匹配的数量级。例如，比例计算为：mL/mL、mL/g、L/L或L/Kg。本文使用下述缩写：
缩写       化学名
ACN        乙腈
Boc        叔丁氧羰基
CDI        羰基二咪唑
DMAP       4-(二甲基氨基)吡啶
DMF        二甲基甲酰胺
EDC        (N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐)
EtOH       乙醇
Et3N       三乙胺
Fmoc       9-芴基甲氧基羰基
NaHMDS     六甲基二硅基氮烷钠
HOAc       乙酸
IPA        异丙醇
iPr        异丙基
Pd/C       钯碳
Pd(PPh3)4  四(三苯基膦)钯(0)
PPh3          三苯基膦
PhSiH3        苯基硅烷
Py            吡啶
Py-TFA        三氟乙酸吡啶鎓
TBME          叔丁基甲基醚
TFA           三氟乙酸
TFFH          氟-N，N，N′，N′-四甲基甲脒鎓六氟磷酸酯
THF           四氢呋喃
TM            试验方法
TsCl          甲苯磺酰氯
实施例1：化合物22的制备
化合物15的制备(步骤1)
一般方法：如上述步骤1所示，可以如下制备化合物15。向惰性反应容器中加入化合物14(1wt，1eq)、Pd/C(优选约0.1-0.2wt，0.025-0.050eq)和合适的氢化溶剂(例如非水极性溶剂，比如THF，优选极性质子溶剂，更优选低分子量醇；最优选乙醇或异丙醇)(约6-7vol)。用氢气置换容器内的惰性气体(优选地，压力为约1大气压至约120psi)，在室温下搅拌反应混合物，直到反应基本完全(约3-8天)。然后，用惰性气体置换反应容器内的氢气，并过滤除去催化剂(例如使用硅藻土)。然后，浓缩滤液，得到作为浅黄色油的化合物15(约0.8wt)。下述方法描述了在乙醇和在异丙醇中将化合物14氢化为化合物15。
步骤1(a1)：在乙醇中氢化：向装有磁力搅拌装置的惰性圆底烧瓶中加入化合物14(3.00g，1.0wt，1.0eq)、10％的Pd/C(Degussa型E101NE/W，0.300g，0.10wt，0.024eq，Aldrich)和乙醇(20.0mL，6.7vol)。用氢气(1大气压)置换容器内的惰性气体氮气，并在室温下搅拌反应混合物直到用TLC分析发现反应完全(约4天)。然后，用氮气置换反应容器内的氢气，在硅藻土上过滤除去催化剂，并使用少量乙醇清洗。
步骤1(a2)通常可以原位使用化合物15来制备化合物22。为了表征的目的，浓缩化合物15/乙醇滤液，得到作为浅黄色油的化合物15(2.5g，0.83wt)，将其再溶解在最少量的10％甲醇/二氯甲烷中，加样到硅胶柱(KP-Sil，13.0wt)上，并用10％的甲醇/二氯甲烷洗脱。合并少量纯的级分，真空浓缩，得到经纯化的化合物15(0.1wt)。
经纯化的化合物15的分析数据：
                                              1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：5.03-5.10(m，1H)，3.63(dd，J＝10,5Hz，1H)，3.42-3.52(m，3H)，3.34-3.39(m，2H)，3.02-3.07(m，1H)，2.29(t，J＝7Hz，3H)，1.73-1.94(m，6H)，1.48-1.66(m，4H)，1.20-1.36(m，26H)，0.89(t，J＝7Hz，6H).
ESI-MS(M+H)+：C25H52NO4的理论值：430.4；实测值：430.4。
步骤1(b1)在异丙醇中氢化：向12升惰性玻璃烧瓶中加入化合物14(2.0kg，1.0wt)和异丙醇(8.0kg，4.0wt)，搅拌混合物直到化合物14溶解。向装有机械搅拌的5加仑惰性反应器中加入Pd/C(Johnson Matthey型A402028-10，10％Pd/C，50％湿气；0.411kg，0.206wt，0.05eq)和化合物14/异丙醇溶液。使用异丙醇(1.1kg，0.55wt)将残留化合物14冲洗到所述5加仑反应器中。然后，用氮气加压所述5-加仑反应器至10-15psi，同时以约750rpm搅拌。排出氮气，同时以约250rpm搅拌。再重复所述氮气加压-排出循环两次。用氢气(5.0级)使所述反应器加压至25psi，同时以约750rpm搅拌，然后排出氢气，同时以约250rpm搅拌。之后，用氢气使所述反应器加压至120psi，同时以约750rpm搅拌。然后，在环境温度下搅拌反应混合物65小时，之后排出氢气。接着，用氮气使所述反应器加压至10-15psi，之后，排出氮气。再重复所述氮气加压-排出过程两次。HPLC监测显示反应完全。然后，通过过滤经过两个CUNO过滤箱(一系列串联的CUNO CTG Klean 1.0μm滤筒和CUNO CTG Klean 0.2μm滤筒)除去催化剂，所述过滤箱已经用异丙醇(3.9kg，1.95wt)预先洗涤过。用异丙醇(5.0kg，2.5wt)洗涤所述反应器，将所得洗涤液过滤通过CUNO箱。合并滤液，得到化合物15/异丙醇无色澄清溶液(15.8kg，7.9wt)。将约15kg(7.5wt)(分别＝0.95×15.8和7.9)该溶液减压浓缩至6.55kg(3.28wt)，不经纯化而用于步骤2a。化合物22的制备(步骤2a)
一般方法：如上述步骤2所示，可以使用下述一般方法制备化合物22(所有的重量、当量和体积都以在步骤1中使用的化合物14的质量为基准)：向装有搅拌装置的惰性玻璃反应器中加入羰基二咪唑(CDI)(0.34wt，1.1eq)和无水乙睛(7.4wt)。开始搅拌，并将混合物冷却至约0℃。加入3-氧代-十四烷酸(0.514wt，1.1eq)并继续搅拌，同时保持温度在约0℃。用HPLC监测咪唑鎓的形成。当确定完成时，加入在步骤1中得到的化合物15/IPA溶液(3-8wt)，保持温度在约0℃。在约0℃搅拌反应混合物，并通HPLC监测。在完成后，加入冰醋酸(0.24wt，2.1eq)，同时保持反应温度≤15℃。使反应混合物达到约20℃，并且通过在20-25℃的真空中蒸发部分溶剂使其体积减少至约5-7.5vol，得到橙色澄清溶液。加入庚烷(8.5wt)，用NH4Cl(0.15wt)和水(5.2wt)组成的溶液洗涤得到的混合物。然后，用氯化钠(1.0wt)和水(3.2wt)组成的溶液洗涤庚烷层。在约25-30℃下，在真空中浓缩所述庚烷层至约2.2-4.4vol，然后加入乙酸异丙酯(9.0wt)，在约25-30℃于真空中浓缩所得到的溶液，得到橙色澄清油(2.2-5.6vol或2.0-5.0wt)。
具体实施例：下述方法描述了按一定规模制备化合物22，所述规模包括在步骤1(b1)中使用2.0kg化合物14制备的化合物15的量的95％。因此，对于该实施例，1.9Kg＝1.0wt。在装有机械搅拌器的50L惰性玻璃反应器中加入羰基二咪唑(CDI)(0.65Kg，0.34wt，1.1eq)和无水乙腈(14.1Kg，7.4wt)。开始搅拌，并将混合物冷却至0℃。然后，在继续搅拌下加入3-氧代-十四烷酸(0.98Kg，0.516wt，1.1eq.；购自DSMPharmaceutical Products，Parsippany，NJ)，同时保持温度在约0℃。用HPLC监测咪唑鎓的形成。当在约10.5小时后完成时，用1分钟加入在步骤1(b1)中获得的化合物15/IPA溶液(6.55kg，3.45wt)，并保持温度在约0℃。使用IPA(1.7Kg，0.89wt)作为洗涤溶剂。在0-3℃搅拌反应混合物过夜。HPLC证实反应完全。然后，加入冰醋酸(0.46Kg，0.24wt，2.1eq)，同时保持反应温度≤15℃。(在加入化合物15之后，加入乙酸进行约12.25小时)。使反应混合物达到20℃，并且通过在20-22℃的真空中蒸发部分溶剂使其体积减少至约13L(6.8vol)，得到橙色澄清溶液。加入庚烷(16.2Kg，8.53wt)，用NH4Cl(0.29Kg，0.15wt)和水(9.9Kg，5.2wt)组成的溶液洗涤所得的混合物，接着用氯化钠(1.9Kg，1.0wt)和水(6.1Kg，3.2wt)组成的溶液洗涤。在25-30℃于真空中将庚烷层浓缩至约7L(3.7vol)。然后，加入乙酸异丙酯(17.0Kg，8.95wt)，在25-30℃的真空中浓缩得到的溶液，得到橙色澄清油约7L(3.7vol，纯度(HPLC)：83.8面积％)。分析化合物22的HPLC条件(化合物22的HPLC TM1)：
HPLC柱      Waters Xterra RP18，150×4.6mm，5μm，Waters catalog 186000492
温度        35℃
流动相      A：在1L水中的28-30％的NH4OH水溶液2.0mL
            B：在1L CH3CN中的28-30％的NH4OH水溶液2.0mL
流速        1.0mL/min
梯度        时间，分钟        溶剂B％
            初始              93
            15                93
            18                100
            27                100
注射体积    10μL
检测(UV)    225nm
化合物22的保留时间    9.4分钟±10％
化合物22的结晶(步骤2b)
一般方法：化合物22可以从乙酸异丙酯/乙腈混合物中结晶。例如，在玻璃容器中，将化合物22(2.2-5.6vol，基于化合物14)溶于乙酸异丙酯(3.5wt)中。过滤所得的溶液，并用乙酸异丙酯调节总重量至约7.4wt。然后，将该溶液转移到合适尺寸的装有搅拌装置的夹套玻璃反应器中，并加入乙腈(5.0wt)。在惰性氮气氛下，将所得混合物冷却至约5-8℃以形成化合物22的晶体。将温度温热至约15℃以溶解较小的晶体。将温度保持在15℃约2小时，缓慢冷却至约-12℃，然后优选地在-12℃再保持1小时。过滤化合物22，并用乙酸异丙酯/乙腈(1∶1(v/v)，1-2wt)的冷(约-20℃)混合物洗涤该固体。干燥湿滤饼，得到作为白色固体的化合物22(约0.9-1.5wt)。
具体实施例：下述方法提供了如何按一定规模(所述规模包括1.9Kg化合物14起始原料(即1.9Kg＝1.0wt))结晶出化合物22：在玻璃容器中，将来自步骤2a的粗化合物22油状物(3.7vol，基于化合物14)溶于乙酸异丙酯(6.7Kg，3.5wt)中。过滤所得溶液，并在25-30℃下于真空中除去过量溶剂。然后将剩余溶液(7.23Kg，(3.8wt))转移到50L装有机械搅拌器的夹套玻璃反应器中，并通过加入乙酸异丙酯(6.27Kg，3.3wt)将质量调节至约14.0Kg(7.4wt)。然后，加入乙腈(9.6Kg，5.1wt)。在惰性氮气氛下，开始搅拌，并将所得混合物冷却至7.3℃，形成化合物22的晶体。然后，将温度升高至15.1℃以溶解较小的晶体。将温度保持在15℃约2小时，缓慢冷却至-11.7℃过夜，然后保持在约-12℃约1小时。过滤所得组合物，并用乙酸异丙酯/乙腈(1∶1(v/v)，2.6Kg，1.4wt)的冷(约-20℃)混合物洗涤该固体。在真空中干燥湿滤饼，得到白色固体的化合物22(1.83Kg，0.96wt；纯度：92.5面积％(化合物22的HPLCTM1)；产率：由化合物14计算为69％)。
化合物22的重结晶(步骤2c)
一般方法：在装有搅拌装置的合适尺寸的惰性夹套玻璃反应器中混合化合物22(1.0wt(基于化合物22))、乙酸异丙酯(4.4-4.9wt)和乙腈(3.9-4.5wt)。搅拌所得混合物，并温热至20-25℃，得到澄清溶液。将该澄清溶液冷却至5-10℃，形成晶体。然后，将温度温热至16-20℃以溶解较小的晶体，并保持在约17℃约2小时。经约10-11小时，将温度缓慢线性地冷却至约-3至-8℃。优选地，将温度在-3至-8℃再保持2小时。过滤固体，用乙酸异丙酯/乙腈(1∶1(v/v)，1-3wt)的冷(-20℃)溶液洗涤，并在真空中干燥，得到作为白色粉末的化合物22(约0.8-0.95wt)。
具体实施例：下述方法描述了化合物22的重结晶：在装有机械搅拌器的30L惰性夹套玻璃反应器中，混合1.79Kg来自步骤2b结晶的化合物22(92.5％纯度＝1.65Kg化合物；1.65Kg＝1.0wt)与乙酸异丙酯(8.0Kg，4.8wt)和乙腈(7.37Kg，4.5wt)。搅拌所得混合物，并温热至24.3℃，得到澄清溶液。将该澄清溶液冷却至10.4℃，形成晶体。然后，为了溶解较小的晶体，将温度温热至16.2℃，并保持在约16.2-17.3℃约2小时。使温度缓慢冷却至-3.4℃过夜。第二天，将温度在该温度下再保持20分钟。过滤固体，并用乙酸异丙酯/乙腈(1∶1(v/v)，4.6Kg，2.8wt)的冷(约-20℃)溶液洗涤，并在真空中干燥(18-25℃，5小时)，得到白色固体的化合物22(1.54Kg，0.93wt；纯度：99.4％(化合物22的HPLC TM1)；产率：92.8％)。
化合物22的分析数据：
                                    1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.24(d，J＝7Hz，1H)，5.05-5.14(m，1H)，4.03-4.11(m，1H)，3.72dd，J＝5,5Hz，2H)，3.42-3.60(m，3H)，3.41(s，2H)，3.26-3.38(m，1H)，2.53(t，J＝7Hz，3H)，2.29(t，J＝7Hz，3H)，1.79-1.89(m，1H)，1.48-1.77(m，7H)，1.19-1.38(m，42H)，0.88(t，J＝7Hz，3H).
C39H76NO6的理论值：654.6；实测值：654.6。
实施例2：晶体化合物22的固态表征
A.粉末X射线衍射
使用铜照射，在3-40度的2θ范围的标准粉末衍射条件下，收集在Scintag衍射仪上使用玻璃板得到的数据。未进行背景校正。图2显示了晶体化合物22的PXRD图。所述PXRD图显示出峰值在10.3±0.2°2θ、12.3±0.2°2θ、14.5±0.2°2θ、15.3±0.2°2θ、16.2±0.2°2θ、17.8±0.2°2θ、22.2±0.2°2θ、22.9±0.2°2θ、23.8±0.2°2θ、25.3±0.2°2θ和26.8±0.2°2θ。晶体化合物22特征可在于具有在图2中所示峰值的子集。例如，以下峰值是晶体化合物22的特征性峰值：12.3±0.2°2θ、14.5±0.2°2θ、16.2±0.2°2θ、17.8±0.2°2θ、22.2±0.2°2θ和23.8±0.2°2θ。所列出或显示在图2中的峰值的其它组合也可用于鉴定化合物22。
表1：测量条件
X射线衍射仪：Scintag
靶：Cu
检测器：闪烁计数器
管电压：40kV
管电流：20mA
狭缝：DS 1°，RS 0.3mm，SS 1°
扫描速度：2°/分钟
取样宽度：0.02°
扫描范围：3至40°
样品架：玻璃架
测角器：水平测角器
过滤器：未使用
B.DSC表征
通过差示扫描量热法(DSC，铝盘技术)测定晶体化合物22的固态表征。使用2.91mg晶体化合物22样品，在50ml/分钟的氮气吹扫下，在以10℃/分钟加热至150℃的具有铝盘的2920DSC V2.5F量热计上进行DSC。图3显示了熔点为41℃(初始温度)的晶体化合物22的热分析图。
还使用带有Fluke 51II数字温度计的电热熔点仪(ElectrothermalMel.Temp Apparatus)进行了熔点实验。将化合物22(2-3mg)装填到毛细管(1.5-1.8×90mm，Kimble Product KIMAX-51，部件编号34505)中。观察到的熔点为41-42℃。
实施例3：化合物25的合成和种晶形成
A.化合物25的合成和粗晶体的制备(步骤3a)
化合物25的合成：向装有机械搅拌器的惰性夹套玻璃反应器中加入化合物24(N，N′-双(2-羟乙基)脲；8.00g，1.00wt，1.00eq；购自供货商Mitsui&Co.(USA)，Inc.，New York，NY；制造商Yoyu Labs)、三氟乙酸吡啶鎓(0.5g，0.063wt，0.05eq)和乙腈(59.7g，7.5wt)。开始搅拌，加入四异丙基磷酰二胺烯丙酯(35.0g，4.4wt，2.24eq；购自DigitalSpecialty Chemicals，Inc.，Dublin，N.H.)。然后，在20-25℃搅拌所得的混合物过夜(17小时)。HPLC监测表明反应完全。将温度冷却至0℃，出现沉淀。经2小时，将温度缓慢温热至16℃以溶解已形成的大部分固体。然后，将该混合物在16℃搅拌1.5小时，按5℃/小时的速率冷却至-17.4℃，并在该温度下搅拌过夜，得到稠厚的悬浮液。然后，经2.3小时使温度上升至16℃，并在16℃保持2.25小时。经1.2小时，温度下降至3.5℃，然后迅速(约5-10分钟)温热至10℃。将温度在10℃保持2小时，并以约1.5℃/小时的速率冷却至最终温度-16℃过夜。过滤已形成的固体，用冷乙腈(2×6.3g，2×0.79wt)洗涤，并在真空下干燥。得到白色固体的化合物25(19.7g，2.46wt)。
B.化合物25的重结晶(步骤3b)
向装有机械搅拌器的惰性夹套玻璃反应器中加入来自步骤3a的化合物25(19.5g，1.00wt)和乙腈(55.0g，2.8wt)。将所得混合物在20-25℃下搅拌15分钟。将温度冷却至10℃，此时搅拌变得困难。将温度升高至20℃并保持2小时。以约2℃/小时的速率再次冷却至10℃。以约3℃/小时的速率继续冷却至1℃，然后以约5℃/小时的速率冷却至-19℃。过滤形成的固体，用冷乙腈(32g，1.6wt)洗涤，并在真空下干燥。得到白色固体的化合物25(16.06g，0.82wt)。
C.化合物25种晶的形成(步骤3c)
可以使用并且使用了下述方法来制备在步骤4a和步骤4b中提及的种晶：向装有机械搅拌器的惰性夹套玻璃反应器中加入来自步骤3b的化合物25(5.59g，1.00wt)和由庚烷与TBME(9∶1v/v，120mL，21.5vol)组成的溶液。将所得混合物在20-25℃搅拌，再加入TBME(3.0mL，0.54vol)以完全溶解化合物25。经约1.5小时使温度降低至10℃，形成白色沉淀。将温度温热至16℃并在该温度保持约2小时。以约2℃/小时的速率使反应器冷却至0℃，随后以约3℃/小时的速率冷却至-18.8℃，然后保持在约-18.8。进行该冷却过程过夜。过滤形成的固体，用由庚烷和TBME(9∶1(v/v)，16g，2.9wt)组成的冷溶液洗涤，并在真空下干燥。得到白色固体的化合物25(5.23g，0.936wt；纯度：94.7％(面积百分比))。分析化合物25的HPLC条件(化合物25的HPLC TM2)：
实施例4：化合物25的制备
步骤3：Py.TFA，ACN，结晶
化合物25的制备(步骤4a)
制备化合物25的一般方法：(注：此处1.0wt指用作制备批量化合物25的起始原料的化合物24的质量)。在装有搅拌装置的合适尺寸的惰性夹套玻璃反应器中，混合脲化合物24(1.0wt，1.0eq)、三氟乙酸吡啶鎓(0.07wt，0.05eq)和无水乙腈(7.0wt)。开始搅拌，加入四异丙基亚磷酰胺烯丙酯(4.4wt，2.3eq)。将反应在18-26℃搅拌几小时直到反应完全。将所得混合物冷却至约9-11℃，优选地用晶体化合物25(约0.005
wt；化合物25种晶的制备为在上述实施例3中所讨论的)引晶，并保持该温度约2小时。然后，以约1.5℃/小时的速率将混合物冷却至约0至-15℃，接着以约2.5℃/小时的速率冷却至约-20℃。在保持该温度稳定约2小时后，在氮气氛下过滤固体，用冷(-20℃)无水乙腈(2-3wt)洗涤，并在氮气下干燥。由此制得白色固体的化合物25(约2.3-2.5wt)。将化合物25优选贮存在低温(例如-20℃)下的干燥氮气中直到纯化。
具体实施例：下述方法描述了从化合物24(0.50Kg，本文中指1.0wt)开始合成化合物25：在装有机械搅拌器的合适尺寸的30L惰性夹套玻璃反应器中，混合脲化合物24(0.50Kg，1.0wt，1.0eq)、三氟乙酸吡啶鎓(0.035Kg，0.07wt，0.05eq)和无水乙腈(3.5Kg，7.0wt)。开始搅拌，并加入四异丙基亚磷酰胺烯丙酯(2.22Kg，4.4wt，2.3eq)。在18.4-25.6℃搅拌反应。通过HPLC监测反应，证实在18小时后反应完全。将所得混合物冷却至11.1℃，并将温度保持在9.3-11.1℃约50分钟。用晶体化合物25(1.9g，0.004wt；化合物25种晶的制备为在上述实施例3中所讨论的)引晶该混合物，并在9-11℃的温度范围保持约2小时。然后，以约1.5℃/小时的速率将该混合物冷却至-7.9℃。然后使冷却速率升高至约2.5℃/小时，并使温度达到-18℃。将温度保持在-18至-19.2℃约2小时，然后在氮气氛下过滤已形成的固体，用冷(约-20℃)无水乙腈(1.5Kg，3.0wt)洗涤，并在氮气流下干燥。获得白色固体的化合物25(1.18Kg，2.36wt；纯度：93.6％面积百分比(化合物25的HPLC TM2))，将其贮存在约-20℃的氮气下直到纯化。
化合物25的重结晶(步骤4b)
化合物25重结晶的一般方法：在装有搅拌装置的合适尺寸的惰性玻璃反应器中，将二亚磷酰胺脲化合物25(1.0wt，此处1.0wt指由制备其的反应沉淀的粗化合物25的质量)溶于TBME(1.5-2.0wt)中。通过过滤除去不溶性颗粒。将滤液转移到装有搅拌装置的合适尺寸的惰性夹套玻璃反应器中。加入庚烷(13.2wt)，将所得溶液冷却至约9-11℃，并在该温度下搅拌约1.5-2.5小时。形成白色悬浮液(引晶可有助于促进化合物25的结晶；化合物25种晶的制备为在上述实施例3中所讨论的)。以约1.5℃/小时的速率将该混合物冷却至约0至约-15℃，接着以约2.5℃/小时的速率将其冷却至约-20℃。在保持该温度稳定约2小时之后，过滤固体，用由庚烷和TBME(7∶1(vol/vol)，1.3-1.5wt)组成的冷溶液(约-20℃)洗涤，并在氮气流下干燥。获得白色固体的化合物25(约0.5-0.6wt)。在约20-30℃于真空中浓缩滤液，并根据上述方法重结晶。因而，也可以获得第二次收获的化合物25(0.2-0.3wt)。
具体实施例：下述方法描述了化合物25(1.18Kg，此处称为1.0wt)的重结晶。在氮气氛下的22L Rotavap玻璃球形容器(bulb)中，将来自步骤4a的二亚磷酰胺脲化合物25(1.18Kg，1.0wt)溶于TBME(1.81Kg，1.5wt)中。通过过滤除去不溶性颗粒，使用TBME(0.60Kg，0.50wt)作为洗涤剂。将滤液转移到装有机械搅拌器的30L惰性夹套玻璃反应器中。加入庚烷(15.54Kg，13.2wt)，将所得溶液冷却至10.3℃。约5分钟后，化合物25开始沉淀。在9-11℃继续搅拌约130分钟。然后，以约1.5℃/小时的速率，将混合物冷却过夜至约-15℃的温度。第二天，以约1.5℃/小时的速率继续冷却至-17.2℃的温度，之后，将温度保持在-17.0至-20℃约2小时。然后，过滤形成的固体，用由庚烷和TBME(7∶1(vol/vol)，1.56Kg，1.3wt)组成的冷溶液(约-20℃)洗涤，并在氮气流下干燥约22.5小时。获得白色固体的化合物25(0.675Kg，0.57wt，纯度：93.9％面积百分比(化合物25的HPLC TM2)；产率：36.0％，由化合物24计算)。在20-30℃于真空下浓缩滤液，并根据上述方法重结晶。由此获得白色固体的第二次收获的化合物25(0.225Kg，0.19wt，纯度：92.6％面积百分比(化合物25的HPLC TM2)；产率：11.8％，由化合物24计算)。
化合物25的分析数据：
                                           1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：5.90-6.01(m，2H)，5.30(d，J＝17Hz，2H)，5.16(d，J＝10Hz，2H)，4.79(1，J＝5Hz，2H)，4.06-4.26(m，4H)，3.66-3.79(m，4H)，3.54-3.66(m，4H)，3.33-3.47(m，4H)，1.18(d，J＝7Hz，24H)ESI-MS(M+Na)+：C23H48N4NaO5P2的理论计算值：545.3；实测值：545.4。
实施例5：晶体化合物25的固态表征
A.粉末X射线衍射
利用与如上在实施例2A中所述相同的方法获得粉末X射线衍射(PXRD)图。图4显示了重结晶的化合物25的PXRD图。所述PXRD图显示峰值在6.6±0.3°2θ、13.2±0.3°2θ、14.0±0.3°2θ、17.3±0.3°2θ、19.4±0.3°2θ、21.8±0.3°2θ、22.4±0.3°2θ、23.6±0.3°2θ和27.2±0.3°2θ。晶体化合物25可以通过图4中所示峰值的子集来表征。例如，下述峰值为晶体化合物25的特征峰：6.6±0.3°2θ、14.0±0.3°2θ、17.3±0.3°2θ、19.4±0.3°2θ。在图2中列出或显示的峰值的其它组合也可以用于鉴定化合物25。
B.DSC表征：
通过差示扫描量热法(DSC，毛细管技术)确定晶体化合物25的固态表征。使用1.88mg晶体化合物25样品，在氮气下，在以约10℃/分钟加热至100℃的具有铝盘的2920DSCV2.5F量热计上进行DSC。图5显示了晶体化合物25的热分析图，其中化合物25的样品在65℃(初始温度)熔融。
还使用带有Fluke 51II数字温度计的电热熔点仪进行了熔点实验。将化合物25(2-3mg)装填到毛细管(1.5-1.8×90mm，Kimble ProductKIMAX-51，部件编号34505)中。观察到的熔点为65-67℃。
C.单晶X射线衍射
在约25℃下，将150mg化合物25溶解在1mL乙腈中。经约425分钟将该溶液冷却至约0℃，然后保持约1000分钟。获得了适于X射线衍射的单晶。该晶体结构显示出尺寸为0.18×0.06×0.06mm的无色针状晶体结构。用少量巴拉东油(paratone oil)将该晶体固定在0.2nm尼龙环上。
用装有在约193°K下操作的Oxford Cryostream低温装置的基于Bruker SMART CCD(电荷耦合装置)的衍射仪采集数据。用每帧0.3°的ω扫描测量数据约45秒，以便采集到半球。总共采集到1271帧，最大分辨率为0.76在数据采集结束时重新采集最初的50帧以监测衰减。使用SMART软件(SMART V 5.625(NT)Software for the CCD DetectorSystem；Bruker Analytical X-ray Systems，Madison，WI(2001))获取晶胞参数，并使用SAINT对观测到的所有反射进行精修。使用用于校正Lp和衰减的SAINT软件(SAINT V 6.22(NT)Software for the CCDDetector System；Bruker Analytical X-ray Systems，Madison，WI(2001)进行数据简化。使用SADABS多扫描技术(参见SADABS，Program forabsorption corrections using Siemens CCD，Blessing，R.H.Acta Cryst.A511995，33-38)进行吸收校正。通过利用SHELXS-97程序(参见Sheldrick，G.M.SHELXS-90，Program for the Solution of CrystalStructure，University ofGermany，1990)的直接方法来解析结构，并通过最小二乘法对F2进行精修，SHELXL-97(参见Sheldrick，G.M.SHELXL-97，Program for the Refinement of Crystal Structure，University ofGermany，1997)，并入到SHELXTL-PC V 6.10中，(SHELXTL 6.1(PC-Version)，Program library for Structure Solutionand Molecular Graphics；Bruker Analytical X-ray Systems，Madison，WI(2000))。所述结构显示出有成对的、通过初始晶胞参数和峰特征证实的的迹象。使用程序Cell Now表明，存在两倍旋转的、较少的成对组分，其沿着倒易轴(reciprocal axis)-0.0101.000-0.040和实轴0.0011.000-0.002定位并围绕其旋转。整合并精修所述成对数据。发现成对精修的百分比小于1.5％。
在空间群P21/c(#14)中解析所述结构。各向异性地精修所有非氢原子。通过几何学方法计算氢，并作为riding模型精修。在数据采集过程中用于衍射研究的晶体显示出没有分解。所有图均在50％椭球下绘制。具有不同原子标记的晶体化合物25的ORTEP图显示在图6中。图7显示了沿着c-轴的晶胞堆积图。晶体数据和结构精修参数报告于表2中。
表2.晶体化合物25的晶体数据和结构精修
实验式                  C23H48N4O5P2
分子量                  522.59
温度                    193(2)°K
波长                    0.71073
晶系                    单斜晶系
空间群                  P2(1)/c
晶胞大小                a＝27.134(14)α＝90°
b＝12.135(6)β＝93.156(10)0°
c＝9.332(5)γ＝90°
体积                    3068(3)
Z                       4
密度(计算值)            1.131mg/m3
吸收系数                0.177mm-1
F(000)                  1136
晶体大小                0.18×0.06×0.06mm3
数据采集的e范围         1.50至22.60°
指数范围                -22≤h≤29，-13≤k≤13，-8≤1≤10
采集的反射              11908
独立反射                4010[R(int)＝0.1578]
到θ＝22.60°的完全度   99.0％
吸收校正                多次扫描
最大和最小透射率        0.9895和0.9689
精修方法                对F2的全矩阵最小二乘法
教据/约束/参数          4010/179/339
对F2的拟合度            0.970
最终R指数[I＞2δ(I)]    R1＝0.1031，wR2＝0.2584
R指数(所有数据)         R1＝0.1851，wR2＝0.3034
最大衍射峰和孔          0.347和-0.233e.
基于化合物25的单晶数据的模拟XRPD图显示在图8中。使用程序XPOW(XPOW，Simulated Powder Diffraction Pattern，Version 5.101，Bruker-AXS，1997-1998.)根据观察到的单晶强度数据模拟粉末衍射数据。计算的关键参数包括波长、所用的1.54的铜波长和从最终精修获取的晶胞参数。线宽(line width)和强度依赖于下式：
高度＝强度/[1+4＊x＊x(w＝v＊tan(θ))]
x＝2θ/2θ0，其中2θ0是反射的布拉格角。变量w和v是线形参数。对于这些计算，w和v都使用0.02。下表列出了具有最高强度的九个峰。
  峰   位置，°2θ
  A   13.9
  B   13.4
  C   17.4
  D   19.6
  E   9.8
  F   22.0
  G   13.1
  H   6.5
  I   23.5
实施例6：化合物26的制备
步骤4：ACN，庚烷，HOAc，H2O2，Na2S2O3，色谱法。化合物26的制备(步骤5a)
合成化合物26的一般方法：(注：此处1.0wt指作为制备批量化合物26的起始原料使用的化合物22的质量)。在装有搅拌装置的合适尺寸的惰性玻璃反应器中加入化合物22(例如从步骤2b-2c、优选步骤2c得到的化合物22(1.0wt，1.0eq))和化合物25(例如从步骤4a-4b中任一步骤、优选步骤4b得到的化合物25(0.42wt，0.52eq))。加入无水乙腈(5.0wt)和无水庚烷(1.4wt)，开始搅拌。将混合物温热至约20-25℃以便溶解所有固体。缓慢加入乙酸(0.12wt，1.3eq)，保持温度在约20-25℃。在约20-25℃搅拌反应几小时直至反应完全。向所述反应器中加入无水庚烷(8.0wt)，并将温度冷却至约0-5℃。经约0.5小时缓慢加入在水中的H2O230％(wt/wt)(0.17wt，1.1eq)，保持温度≤5℃。在≤5℃搅拌反应直至反应完全。然后，将该反应冷却至约0℃，并通过加入硫代硫酸钠五水合物的水溶液(1/1(w/w)，0.26wt，0.34eq)来淬灭残留的过氧化物。在约0-4℃继续搅拌直到庚烷层获得过氧化物阴性试验。使温度上升至室温，接着，过滤出盐，并用庚烷(2.3wt)洗涤。将所得滤液加入到新的玻璃反应器中，使层分离约15分钟。形成三层，排出下面两层(水和乙腈)并弃去。用乙腈(1.8wt)洗涤上部庚烷层两次，并在约18-25℃浓缩至干。得到稠厚的、浅琥珀色油状粗化合物26(1.2-1.5wt)。
具体实施例：下述方法描述了按一定规模制备化合物26，所述规模包括0.565Kg纯度为99.4％的化合物22。(在本实施例中的术语“1.0wt”指0.56Kg，其为作为制备化合物26的起始原料使用的化合物22的实际质量)。在装有机械搅拌器的30L惰性夹套玻璃反应器中加入来自步骤2c的化合物22(0.56Kg(＝0.565×0.994)，1.0wt，1.0eq)和来自步骤4b的化合物25(0.248Kg，纯度：93.9％，0.42wt，0.52eq)。加入无水乙腈(2.8Kg，5.0wt)和无水庚烷(0.79Kg，1.4wt)并开始搅拌。搅拌混合物，并温热至约20-22℃以溶解所有固体。经约5分钟加入乙酸(0.068Kg，0.12wt，1.3eq)，同时保持温度在约22-24℃。在约20-24℃搅拌反应约24小时，通过HPLC验证反应完全。将无水庚烷(4.49Kg，8.0wt)加入所述反应器中，并将温度冷却至约0-5℃。经约26分钟缓慢加入在水中的H2O230％(wt/wt)(0.106Kg，0.19wt，1.1eq)，保持温度在0-2℃。搅拌反应约3.5小时，同时保持温度在-1至2℃。通过HPLC证实氧化完成。在约0℃，通过加入硫代硫酸钠五水合物的水溶液(1/1(w/w)，0.146kg，0.26wt，0.34eq)淬灭残留的过氧化物。在约0-2℃继续搅拌过夜(17.25小时)。测试庚烷层中过氧化物的存在(EM Quan过氧化物试验，EMScience，Gibbstown，NJ)，获得阴性结果。使温度上升至约20℃。过滤出盐，并用庚烷(1.26Kg，2.25wt)洗涤。将所得滤液加入到新的玻璃反应器中，使层分离约15分钟。形成了三层，排出并弃去下面两层(水和乙腈)。用乙腈(1.0Kg，1.8wt)洗涤上部庚烷层两次，并在约18-23℃下于真空中浓缩至干。得到呈稠油状、浅琥珀色的粗化合物26(0.79Kg，＜1.4wt；纯度91.1％面积百分比)，其包含5.6％的残留庚烷。分析化合物26的HPLC条件(化合物26的HPLC TM3)：
  HPLC柱   Waters Symmetry 300TM C18，250×4.6mm 5μm
  温度   55℃
  流速   1.0mL/分钟
  流动相A   在1000mL水中的85％磷酸20mL
  流动相B   在1000mL乙醇中的85％磷酸20mL
  梯度   时间，分钟     溶剂B％初始           3015             9235             9245             10060             100
  注射体积   20μL
  检测   UV＝215nm
  化合物26的保留时间   33.1分钟±10％
化合物26的纯化(步骤5b)
纯化化合物26的一般方法：(注：此处1.0wt指用于制备粗化合物26使用的化合物22的量)。将例如从步骤5a得到的粗制化合物26(约1.2-1.5wt)溶于异丙醇和乙酸乙酯的混合物(1/99(vol/vol)，2wt)中，并将所得溶液装填到用异丙醇和乙酸乙酯的混合物(1/99(vol/vol)，约55wt)预平衡过的Biotage硅胶柱(约10wt的SiO2)上。先使用异丙醇/乙酸乙酯(3/97(vol/vol)，约80wt)，接着使用异丙醇/乙酸乙酯(10/90(vol/vol)，约110wt)进行分离。优选地，收集约4wt的约三十五种级分，包括例如含量≥化合物26理论产率的1％的级分(≥0.0127wt化合物26，(HPLC评价))。合并所期望的级分并在约20-30℃于真空中浓缩，得到澄清油。将该澄清油溶于庚烷(约7.0wt)中，并将所得溶液在约20-30℃下于真空中浓缩至干。再次重复庚烷处理，得到作为无色澄清油的化合物26(1.0-1.15wt；产率：75-85％)。
具体实施例：粗化合物26(0.79Kg)的纯化。注：此处1.0wt指用于制备粗化合物26的化合物22的量(0.56Kg)。将来自步骤5a的粗化合物26(0.79Kg，＜1.4wt)溶于异丙醇和乙酸乙酯的混合物(1/99(vol/vol)，1.18Kg，2.1wt)中，并将所得溶液装填到用异丙醇和乙酸乙酯的混合物(1/99(vol/vol)，31.5Kg，56.3wt)预平衡过的Biotage KP-Sil 150L(5.0Kg二氧化硅，8.9wt.)柱上。用异丙醇/乙酸乙酯(3/97(vol/vol)，43.9Kg，78.4wt)洗脱所述柱，接着用异丙醇/乙酸乙酯(10/90(vol/vol)，62.3Kg，111.3wt)洗脱。每次收集约2.3kg(约4.1wt)的三十六种级分。合并含有≥化合物26理论产率的1％(≥7.1g化合物26)的级分(在该情况下为级分7至31)，并在21-28℃于真空中浓缩成澄清油。将该澄清油溶于庚烷(3.9Kg，7.0wt)中，将所得溶液在24-30℃下于真空中浓缩至干。再次重复所述庚烷处理，得到作为无色澄清油的化合物26(0.60kg，1.07wt；纯度：93.4％(化合物26的HPLC TM3)；产率＝78.8％)。
化合物26的分析数据：
                                              1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.4-7.57(m，2H)，6.06(t，J＝5Hz，2H)，5.84-6.04(m，2H)，5.36(d，J＝17Hz，2H)，5.25(d，J＝10Hz，2H)，5.02(m，2H)，4.54(m，4H)，4.24(m，2H)，3.96-4.20(m，8H)，3.38-3.55(m，16H)，2.52(t，J＝7Hz，4H)，2.28(t，J＝7Hz，4H)，1.68-1.91(m，4H)，1.47-1.67(m，12H)，1.18-1.37(m，84H)，0.89(t，J＝7Hz，18H).
ESI-MS(M+Na)+：C89H168N4NaO19P2的理论计算值：1682.2；实测值：1682.3。
虽然已经参照其具体实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解的是，在不背离本发明真实精神和范围的情况下，可以做出各种变化和可以进行等同物替换。另外，可以对具体的条件、物质、物质组成、方法、方法步骤进行多种改变以使其适合本发明的精神和范围。所有这些改变都旨在落入附加于此的权利要求书的范围内。
以上引用的所有专利和出版物均通过引入并入本文。

Claims (25)

1.式(3)的化合物：
其中：
R1为C5-C15烷基、C5-C15烯基或C5-C15炔基；
R2为C5-C15烷基、C5-C15烯基或C5-C15炔基；和
R3为C5-C15烷基、C5-C15烯基或C5-C15炔基。
2.根据权利要求1的化合物，其中
R1为C5-C12烷基，
R2为C7-C14烷基，和
R3为C7-C14烷基。
3.根据权利要求2的化合物，其中
R1为C7烷基，
R2为C11烷基，和
R3为C11烷基。
4.根据权利要求3的化合物，其中
R1为正庚基；
R2为正十一烷基，和
R3为正十一烷基。
5.根据权利要求1的化合物，其中R1、R2和R3中至少一个与其它不同。
6.根据权利要求1、2、3、4或5的化合物，其具有式(3a)的立体化学：
7.根据权利要求6的化合物，其中所述化合物为化合物22：
8.一种通过使式(1)化合物与式(2)化合物反应制备式(3)化合物的方法，如下所示：
其中：
R1为C5-C15烷基、C5-C15烯基或C5-C15炔基；
R2为C5-C15烷基、C5-C15烯基或C5-C15炔基；
R3为C5-C15烷基、C5-C15烯基或C5-C15炔基；和
X为离去基团。
9.根据权利要求8的方法，其中
R1为C5-C12烷基，
R2为C7-C14烷基，
R3为C7-C14烷基，和
X为OH、Cl、F、咪唑烷基、三甲基乙酰氧基、碳酸乙酯基、碳酸甲酯基、碳酸异丁酯基或式Z的基团：
其中R7与式(2)中的R3相同，从而式(2)化合物是对称的β-酮酯酸酐。
10.根据权利要求9的方法，其中
R1为C7烷基；
R2为C11烷基；和
R3为C11烷基。
11.根据权利要求10的方法，其中
R1为正庚基；
R2为正十一烷基；和
R3为正十一烷基。
12.根据权利要求8的方法，其中R1、R2和R3中至少一个与其它不同。
13.根据权利要求8的方法，还包括在异丙醇中氢化式Y化合物以形成式(1)化合物的步骤：
14.一种用于制备式(6)化合物的方法，包括以下步骤：
i)如下所示使式(3)化合物与式(4)化合物反应以形成式(5)化合物：
ii)如下所示氧化所形成的式(5)化合物以形成式(6)化合物：
其中：
R1为C5-C15烷基、C5-C15烯基或C5-C15炔基；
R2为C5-C15烷基、C5-C15烯基或C5-C15炔基；
R3为C5-C15烷基、C5-C15烯基或C5-C15炔基；
R4在每次出现时独立地为保护基；
R5在每次出现时独立地为C1-C6烷基、C3-C6烯基或C3-C6炔基；和
R6在每次出现时独立地为C1-C6烷基、C3-C6烯基或C3-C6炔基；或者R5和R6与它们连接的氮一起形成5或6元杂环。
15.权利要求14的方法，其中
R1为C5-C12烷基；
R2为C7-C14烷基；
R3为C7-C14烷基；
R4在每次出现时独立地为C3-C5烯基、2-氰基乙基、2-(三甲基甲硅烷基)乙基或2，2，2-三氯乙基；
R5在每次出现时独立地为C3-C6烷基；和
R6在每次出现时独立地为C3-C6烷基。
16.权利要求14的方法，其中
R1为C7烷基；
R2为C11烷基；
R3为C11烷基；
R4为烯丙基；
R5为异丙基；和
R6为异丙基。
17.权利要求16的方法，其中
R1为正庚基；
R2为正十一烷基；
R3为正十一烷基；
R4为烯丙基；
R5为异丙基；和
R6为异丙基。
18.权利要求14的方法，其中R1、R2和R3中至少一个与其它不同。
19.权利要求14的方法，其中式(5)化合物的形成包括以下步骤：
i)在庚烷和乙腈的共溶剂混合物中一起搅拌式(3)化合物和式(4)化合物，直到所有固体都溶解；
ii)缓慢加入1.0至2.0当量的乙酸，同时保持温度为20至25℃；和
iii)搅拌所得的混合物，直到反应完全。
20.权利要求19的方法，其中所用庚烷的重量是所用式(3)化合物重量的4至6倍。
21.权利要求19的方法，其中所用乙腈的重量是所用式(3)化合物重量的1至2倍。
22.权利要求14-21中任一项的方法，其中氧化所形成的化合物(5)以形成式(6)化合物包括以下步骤：
i)向包含所形成的式(5)化合物的反应混合物中加入庚烷；
ii)将所得混合物冷却至-5℃至10℃；
iii)缓慢加入在水中的30％(wt／wt)的H2O2，加入速率使得反应混合物的温度保持在-5℃至10℃之间；和
iv)在-5℃至10℃的温度下搅拌所得混合物，直到反应完全。
23.权利要求22的方法，其中
使步骤ii)的混合物冷却至0至5℃；
使步骤iii)的混合物保持在0至2℃；和
使步骤iv)的混合物保持在-1至2℃。
24.晶体化合物22，其具有基本上如图2所示的X射线粉末衍射图
25.根据权利要求24的晶体化合物22，其进一步特征在于熔点为约41℃。
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