CN102143973A - 来自疟原虫属的msp-1蛋白质制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及恶性疟原虫的裂殖子表面蛋白质1(“MSP-1”)制剂，所述MSP-1制剂包含a)没有异源序列的来自疟原虫属的gp190/MSP-1的纯化片段p83/30，和b)没有异源序列的来自疟原虫属的gp190/MSP-1的纯化片段p38/42。

Description

来自疟原虫属的MSP-1蛋白质制剂
技术领域
本发明涉及来自疟原虫属的裂殖子表面蛋白质1(MSP-1)，编码其p83/30蛋白质亚基的修饰的核酸的制备方法，相应的修饰的核酸，包含其的载体，相应的MSP-1的p83/30亚基，制备异源二聚体的MSP-1的方法，用作疫苗的相应的异源二聚体的MSP-1，这些异源二聚体的MSP-1蛋白质用于制备预防和/或治疗疟疾的药物的用途以及包含任何上述核酸、载体或蛋白质产品的疫苗。
背景技术
疟疾是世界上最具毁坏性的传染病之一。根据来自世界卫生组织(WHO)的估计每年记录4至9亿疾病发生。根据来自抗疟疾多边自发组织(Multilateral Initiative against Malaria，(MIM))的信息，每年700,000至2百七十万人死于感染(MIM，2001)。在此方面99个国家40％的世界人口处于患疟疾的风险。该疾病由来自顶复(Apicomplexa)门疟原虫属(Plasmodium)的单细胞原生动物引起。感染人类的有四种：三日疟原虫(Plasmodium malariae)(引起三日疟)，间日疟原虫(Plasmodium vivax)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale)(两者引起间日疟)，和最后的恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)(热带疟(Malaria tropica)的病原体并引起几乎所有致命感染)。
当前疟疾的传播再次日益增强。这主要归因于疟疾病原体加强的抗性的形成，因为用于治疗的药物也被推荐和用于预防所以促进了该加强的抗性的形成。除了寻找新的化学疗法外，研究集中到了疫苗的开发上，因为人类疟疾感染过程中，采用免疫机制，这是一种表现为对疟原虫增强的抗性的事实，如同在疟疾流行病流行地区的人们在各种免疫性的发展过程中所表现的那样。
MSP-1作为潜在疫苗
MSP-1是裂殖子的主要表面蛋白质，疟疾病原体血分(blood phases)的侵袭形式。它作为通过糖基磷脂酰锚固定于寄生虫表面的190-220kDa的前体合成。该蛋白质在随后裂殖子发育过程中处理为较小的蛋白质片段，然而该较小的蛋白质片段在裂殖子表面保持非共价连接直至由寄生虫侵入红细胞。
各种恶性疟原虫(P.falciparum)菌株的MSP-1蛋白质的序列分成以两种代表性(原型性)分离物(isolates)Ki和MAD20命名的两个组。所有蛋白质由大量高度保守区、二形区(其允许MSP-1的给定变体排列为代表性原型之一)以及在蛋白质N端部的两个相对小的少数发育型嵌段(oligomorphic blocks)组成(本文中的图9；Tanabe等人，(1987)J.Mol.Biol.195，273-87)。
用从约氏疟原虫(P.yoelii)寄生虫纯化的蛋白质来免疫小鼠保护动物免受其它致命感染。此外，来自约氏疟原虫的抗MSP-1单克隆抗体的转化(transfer)在小鼠模型中也提供了保护。
除了在小鼠上的研究外，用天然的、免疫亲和纯化的MSP-1还免疫了松鼠猴(Saimiri monkeys)和夜猴(Aotus monkeys)。在这些试验中从恶性疟原虫获得的蛋白质部分地提供了或局部或全身对抗由寄生虫产生的感染的保护。
然而从疟原虫纯化天然物质是昂贵的，并且这种物质不能用于大规模生产。因此对疫苗的研究集中到了重组疫苗的开发上。
例如，用从大肠杆菌或酿酒酵母纯化的MSP-1-19(Daly和Long(1993)Infect.Immun.61，2462-7；Ling等人，(1994)Parasite Immun.16，63-7；Tian等人，(1996)J.Immunol.157，1176-83；Hirunpetcharat等人，(1997)J.Immunol.15，3400-11)以及用带有MSP-1-19的牛分支杆菌(Matsumoto等人，(1999)Vaccine 18，832-4)成功免疫了小鼠。可选择地用天然或重组蛋白质免疫，编码MSP-1-19的DNA也已用作疫苗并保护免疫小鼠抵抗夏氏疟原虫(P.chabaudi)的感染(Wunderlich等人，(2000)Infect.Immun.68，5839-45)。
在用MSP-1片段作为疫苗的I期和II期研究中，它们的免疫原性也显示在了人类中。在此方面涉及到来自恶性疟原虫的p19融合到破伤风毒素的T辅助细胞表位(Keitel等人，(1999)Vaccine 18，531-9)和MSP-1嵌段3和4(Saul等人，(1999)Vaccine17，3145-59；Genton等人，(2000)Vaccine 18，2504-11)。
有些地方性区域的流行病学研究显示出在成年人中抗MSP-1抗体滴度和抗疟疾免疫力之间的相关性(Tolle等人，(1993)Infect.Immun.61，40-7；Riley等人，(1992)Parasite Immunol.14，321-37；Riley等人，(1993)Parasite Immunol.15，513-24)。这些研究与动物免疫研究一起证明了MSP-1是用于开发疟疾疫苗的有希望的候选者。
通常，可以将这些研究分成两类方法。可以使用从寄生虫纯化的物质或者在异源系统中获得的物质。
为了功能研究以及为了作为疫苗都必须以良好产率和高质量重复地生产蛋白质。MSP-1可以从寄生虫中纯化，但这只有在小规模才可能并且费用昂贵，因此以这种方式不能根据所述标准获得MSP-1。
全长(190kD)MSP-1蛋白质的异源生产效率极低。虽然该全长蛋白质包含蛋白质酶处理后形成非共价结合的异源四聚体的四个主要处理片段p83、p30、p38和p42，但是极大的尺寸使得有效异源生产困难，严重制约了可获得的产率。特别地，各寄生虫基因76-78％的高AT含量阻止了良好产率的稳定克隆和异源表达。该问题已通过合成编码不同密码子组成的蛋白质的基因得到了解决。另外，以其适当构象从例如大肠杆菌中回收含有众多二硫键的190kD蛋白质在实验上是困难的，并且完全不适应将该蛋白质作为疫苗用途所需的工业规模制备。
由于MSP-1虽然有众多的潜在糖基化位点但在寄生虫内并不糖基化，所以原核表达系统对于工业规模制备将是有利的。然而，由于多种上述二硫键仍然存在折叠问题。Kauth等人(2003)(Journal of Biological Chemistry 278，2257-2264)描述了由重组生产的MSP-1蛋白质亚基组成的异源多聚MSP-1复合体的结构。此处，使用编码来自菌株3D7的恶性疟原虫的MSP-1复合体的亚基和处理片段的合成多聚核苷酸单独地以高度纯化和可溶的形式从大肠杆菌中产生四种单个MSP-1亚基。然后将这些亚基重装配以形成MSP-1异源四聚体。Kauth等人(2003)描述了MSP-1蛋白质亚基p83、p30、p38和p42以及两个合成的亚基“半(halves)”p83/30和p38/42的生产。亚基半(subunit half)p83/30含有连接到单个连续多肽的p83和p30亚基的氨基酸序列。同样地，亚基半p38/42含有连接到单个连续多肽的p38和p42的氨基酸序列。然而Kauth等人表明用于上述目的的MSP-1蛋白质的稳定生产可通过异源多聚体，特别是p83/30和p38/42亚基的异源二聚体的生产而最好地进行，Kauth等人(2003)获得的异源多聚体的蛋白质仍不适合所需要的作为疫苗的应用。
首先，Kauth等人的MSP-1亚基用或His6-或GST-标签标记以便它们能够有效纯化。需要这些标签来以高纯度分离足够量的亚基。从规范的角度，这样的标签是有问题的，并且表达后的蛋白质水解去除标签引起产物的巨大损失。因此，去掉蛋白质标签将遵从规范的要求，但将产生纯化(如果可以)困难的蛋白质。另一方面，保留蛋白质标签允许纯化，但排除了将所得蛋白质作为批准治疗剂/疫苗的任何用途。
当以严格类似于Kauth等人的方式构建p83/30和p38/42的异源二聚体时遇到的另外的问题是大肠杆菌中p83/30亚基的生产非常低效。即使使用分离标签，也仅回收非常低水平的p83/30。而且，首先生产的少量p83/30片段在活体内仍通过有效降解而进一步减毒。
因此存在对可有效生产的MSP-1的需求，该MSP-1是符合设定为治疗蛋白质的规范化要求，以在满足工艺制剂需要的高产率中保持可分离性并且允许抗恶性疟原虫的强烈免疫应答的产生。通过本发明满足了这样的需求。
发明内容
本发明的一个方面提供疟原虫属的裂殖子表面蛋白质1(“MSP-1”)制剂，所述MSP-1制剂包含
(a)没有异源序列的来自疟原虫属的gp190/MSP-1的纯化片段p83/30，和
(b)没有异源序列的来自疟原虫属的gp190/MSP-1的纯化片段p38/42。
本发明的另一个方面提供包含上述MSP-1制剂的组合物。
本发明的组合物可通过制备含疟原虫属MSP-1的组合物的方法来制造，所述方法包括：
(a)在宿主细胞中表达没有异源序列的来自疟原虫属的gp190/MSP-1蛋白质的片段p83/30；
(b)在宿主细胞中表达没有异源序列的来自疟原虫属的gp190/MSP-1蛋白质的片段p38/42；
(c)从宿主细胞回收片段p83/30和片段p38/42；和
(d)任选地在组合物中或作为结合制剂结合片段p83/30和p38/42。
本发明的另一个方面提供包含上述MSP-1制剂的药物组合物。
本发明的另一个方面提供用于制备编码疟原虫属MSP-1的具有如SEQ ID NO：1、2或3所述氨基酸序列的p83/30片段的修饰的核酸的方法，所述方法包括：
(a)提供mRNA序列，该mRNA序列编码来自疟原虫属的MSP-1的具有如SEQ ID NO：1、2或3所示氨基酸序列的p83/30片段；
(b)在电脑模拟中(in silico)分析步骤(a)的mRNA序列的起始密码子周围的区域，以测定所述mRNA序列的预测的二级结构；
(c)鉴定在步骤(b)所述的起始密码子周围的区域中的至少一个稳定的发夹样结构；
(d)修饰在步骤(b)所述的起始密码子周围的区域中的mRNA序列，其中至少一个核苷酸置换、插入、缺失和/或倒位使所述发夹样区域不稳定，和其中在电脑模拟中实现至少一个核苷酸置换、插入、缺失和/或倒位，以编码与所述未修饰的核酸序列编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列；
(e)在与步骤(b)所述的相同条件下，在电脑模拟中分析步骤(d)的区域；
(f)测定是否至少一个核苷酸置换、插入、缺失和/或倒位使得至少一个含有至少一个核糖体结合位点的发夹样区域不稳定；
(g)根据需要任选地重复步骤(d)-(f)直到在与步骤(b)所述的相同条件下的电脑模拟中的分析表明至少一个发夹样区域不稳定；
(h)制备相应的修饰的核酸。
本发明的另一个方面提供编码疟原虫属MSP-1的具有如SEQ ID NO：1、2或3所述氨基酸序列的p83/30亚基的修饰的核酸，其中所述修饰核酸是通过上述方法可得到的。
本发明的另一个方面提供包含上述修饰的核酸的载体。
本发明的另一个方面提供制备疟原虫属MSP-1的p83/30片段的方法，所述方法包括：
(a)提供上述修饰的核酸和/或上述载体；
(b)将步骤(a)的修饰的核酸和/或载体引入细胞，优选原核细胞；
(c)在允许表达MSP-1的p83/30亚基的条件下温育步骤(b)的细胞；和
(d)回收MSP-1的p83/30片段。
本发明的另一个方面提供通过上述相应制备方法可得的MSP-1的p83/30片段。
本发明的另一个方面提供从疟原虫属制备MSP-1制剂的方法，所述方法包括：
(a)提供MSP-1片段p38/42(例如，具有SEQ ID NO：4或5所示氨基酸序列)；
(b)将所述MSP-1的p38/42片段与如上所述的MSP-1的p83/30亚基(例如，具有SEQ ID NO：1、2或3所示的氨基酸序列)混合；和
(c)回收MSP-1制剂。
本发明的另一个方面提供上述MSP-1制剂、上述修饰的核酸、上述载体、上述MSP-1片段p83/30和/或MSP-1片段p38/42(例如，具有SEQ ID NO：4或5所示氨基酸序列)作为疫苗的用途。
本发明的另一个方面提供上述MSP-1制剂、上述修饰的核酸、上述载体、上述MSP-1片段p83/30(例如，如SEQ ID NO：1、2或3所示)和/或MSP-1亚基p38/42(例如，具有如SEQ ID NO：4或5所示的氨基酸序列)在制造用于预防和/或治疗疟疾的药物中的用途。
本发明的另一个方面提供疫苗，所述疫苗包含上述MSP-1制剂、上述修饰的核酸、上述载体、上述MSP-1亚基p83/30(例如，如SEQ ID NO：1、2或3所示)和/或MSP-1亚基p38/42(例如，具有SEQ ID NO：4或5所示的氨基酸序列)。
附图说明
图1：如在电脑模拟中预测的，在序列修饰前(A)和序列修饰后(B)MSP-1 p83/30的二级mRNA结构。该比较说明通过已知或推测的隐藏的核糖体结合位点的mRNA二级结构不稳定化完成预测的二级mRNA结构的标记的修饰。通过在电脑模拟中置换单个核苷酸分析不稳定作用。通过利用由美国纽约特洛伊的伦塞勒综合技术研究所(Rensselaer Polytechnic Institute，Troy，NY，USA)的网络服务器提供的祖克(Zuker)和特纳(Turner)的“mfold”程序(version 3.2)将p83/30mRNA的前150bp进行二级结构的电脑模拟分析(关于参考文献参见下文)。如图显示了核糖体结合位点(“RBS”)的核苷酸和碱基对序列，还显示了翻译起始位点(AUG)。
图2：大肠杆菌中粗蛋白质表达产物量的比较，其中所述粗蛋白质表达产物利用编码MSP-1片段p83/30的未修饰mRNA(左边，来自恶性疟原虫菌株3D7)和其中含有核糖体结合位点和/或翻译起始位点的二级发夹样结构区域已突变以使发夹样结构不稳定的mRNA(右边)获得。通过位于右侧远端的标记物梯度测量，对于天然和突变序列两者，MSP-1蛋白质亚基p83/30在凝胶的2小时和4小时泳道中在大约116kD的位置由黑色带表示。通过比较左边和右边板各个2小时和4小时泳道可以看出，与相应的未修饰序列(左)相比，MSP-1 p83/30片段的修饰产生更高量的表达蛋白质(右)。
图3：MSP-1半p83/30(左边，基于相应于SEQ ID NO：8或9的突变核酸序列)和p38/42(右边，基于相应于SEQ ID NO：10的核酸序列)生产的时间过程。泳道1和11(从左侧数)显示分子量标记物梯度。泳道2-5和12-15(从左侧数)各自地显示对于MSP-1的p83/30和p38/42片段的稀释系列，基于表达4小时后得到蛋白质的最高量。泳道6-10和16-20显示对于各MSP-1半p83/30和p38/420、1、2、3和4小时表达的时间过程。在每种情况下，相应于大约116kD的蛋白质表达产物的累积与所需的各个MSP-1半相对应。由4小时样品制备2倍稀释物直到原浓度的1/8。通过SDS-PAGE和考马斯染色分析样品。
图4：以W3110Z2-p38/42作为例子显示的15升发酵罐(Braun，Biostat)中的典型发酵过程。显示了15升发酵罐中的典型发酵过程。显示了培养物随时间的生长。MSP-1的p38/42片段的诱导表达发生在图中字母“i”指示的时间点。
图5：溶解的IB的电泳分析。在凝胶的侧面指示了两个MSP-1片段p83/30和p38/42的位置。在还原条件下用10％聚丙烯酰胺进行SDS-PAGE，随后进行考马斯染色。
图6：存在于MSP-1制剂中的蛋白质特征的总结。给15种最粗壮(abundant)的蛋白质条带编号，并通过以下方法的至少之一鉴定(表示于图右侧表的标题行中)：用对p83/30特异的兔血清(“抗p83/30”)的蛋白质印迹，用对p38/42特异的兔血清(“抗p38/42”)的蛋白质印迹，对p83或p42特异的单克隆抗体库(“p83+p42单克隆抗体库(mab pool)”)，通过N端测序直接鉴定(“N端测序”)和利用质谱作肽图(“作肽图”)。凝胶条带的数字对应于表中最左列的数字，表中用“x”表示在相应数字条带中的蛋白质采用了某种分析方法。可以看出，或通过N端测序、通过质谱作肽图或通过抗MSP-1的p83/30和/或p38/42片段的适当的单克隆/多克隆抗体可以鉴定所有可检测组分。
图7：用不同配方的MSP-1免疫后得到的小鼠血清中的抗体滴度。较高的柱形表示较高的抗体滴度，表示对各蛋白质较强(并因此更加期望)的免疫应答。通过使用由p83/30和p38/42组成的MSP-1异源二聚体蛋白质作为捕获抗原的ELISA测定所述滴度。A：PBS；B：氢氧化铝；E：磷酸铝；H：MPL(Sigma)；I：CpG(Qiagen)；L-Q：IC 31；R：PBS；S：Montanide ISA 720；T：Montanide ISA 51；U-W：病毒体；X、Y：FCA/FIA；IS.1-IS.3：来自第一、第二或第三次免疫的血清。
图8：用如此处所示生产的异源二聚体的MSP-1(在图右上方表示为“MSP-1D”)、p83、p30、p38和p42与各种佐剂一起免疫后的兔抗体滴度。较高的柱形表示较高的抗体滴度，表示对各蛋白质较强(并因此更加期望)的免疫应答。柱形表示来自ELISA研究的结果。向兔子给药等量的各蛋白质作为抗原(每次注射100μg)。与各种蛋白质一起使用的佐剂沿x轴表示于结果柱形的各组的下面。佐剂“X3”表示在保密协议下得到的佐剂。从结果柱形的第三个组中可以看出，MSP-1异源多聚体及其选择片段与montanide、ISA720一起给药在兔中产生明显高于当相同蛋白质与其它佐剂给药时观察到的抗体滴度。对于本文制备的MSP-1异源二聚体以及对于单个MSP-1蛋白质亚基p83、p30和p38特别符合这种情况。
图9：作为“MSP-1D”的源自恶性疟原虫菌株3D7的MSP-1(MAD20原型和已被重组生产的其各种片段的代表)的一级结构示意图。图下面的数字表示氨基酸位置。“SP”表示信号肽。“GA”表示糖基化磷脂酰肌醇部分。图9A上部的箭头表示前体蛋白质被正常切割为图9B所示的其主要亚基p83至p42的位点。次级蛋白质水解将p42切割为p33和p19。氨基酸位置勾画出异源生产的片段p83、p30、p38和p42。分离标签符号“g”、“h”和“s”分别表示GST、His6和Strep标签。MSP-1片段p83/30和p38/42分别显示于图9B的行2和4。在该图中，这些片段带有在本发明下可以有利地忽略不计的异源分离标签。
图10：SEQ ID NO：1。来自恶性疟原虫菌株3D7的p83/30的氨基酸序列。
图11：SEQ ID NO：2。来自恶性疟原虫菌株3D7的p83/30的氨基酸序列，具有两个氨基酸突变：E612K和Q767H。
图12：SEQ ID NO：3。来自恶性疟原虫菌株FCB-1的p83/30的氨基酸序列。
图13：SEQ ID NO：4。来自恶性疟原虫菌株3D7的p38/42的氨基酸序列。
图14：SEQ ID NO：5。来自恶性疟原虫菌株FCB-1的p38/42的氨基酸序列。
图15：SEQ ID NO：6。pZE23/d-83/30(编码相应于SEQ ID NO：1的来自恶性疟原虫菌株3D7的p83/30的质粒，即，在RBS中没有沉默突变并且没有氨基酸突变E612K和Q767H)的核苷酸序列。转录起始核苷酸A63用阴影黑体字指示；和起始密码子ATG带有下划线。
图16：SEQ ID NO：7。pZE23/d-83/30(编码相应于SEQ ID NO：2的来自恶性疟原虫菌株3D7的p83/30的质粒，在RBS中没有沉默突变，但具有氨基酸突变E612K和Q767H)的核苷酸序列。转录起始核苷酸A63用阴影黑体字指示，并且起始密码子ATG带有下划线。
图17：SEQ ID NO：8。pZE23/d-83/30(编码相应于SEQ ID NO：1的来自恶性疟原虫菌株3D7的p83/30的质粒，即在RBS中具有沉默突变但没有氨基酸突变E612K和Q767H)的核苷酸序列。转录起始核苷酸A63用阴影黑体字指示，起始密码子ATG带有下划线，并且核糖体结合位点区域的核苷酸修饰用小写黑体字表示。
图18：SEQ ID NO：9。pZE23/d-83/30(编码相应于SEQ ID NO：2的来自恶性疟原虫菌株3D7的p83/30的质粒，即在RB S中具有沉默突变并具有氨基酸突变E612K和Q767H)的核苷酸序列。转录起始核苷酸A63用阴影黑体字指示，起始密码子ATG带有下划线，并且核糖体结合位点区域的核苷酸修饰用小写黑体字表示。
图19：SEQ ID NO：10。pZE23/d-38/42(编码相应于SEQ ID NO：4的来自恶性疟原虫菌株3D7的p38/42的质粒)的核苷酸序列。转录起始核苷酸A63用阴影黑体字指示，并且起始密码子ATG带有下划线。
具体实施方式
如上所述，本发明的一个方面提供来自疟原虫属的裂殖子表面蛋白质1(“MSP-1”)制剂，所述MSP-1制剂包含
(a)没有异源序列的来自疟原虫属的gp190/MSP-1的纯化片段p83/30，和
(b)没有异源序列的来自疟原虫属的gp190/MSP-1的纯化片段p38/42。
根据本发明此方面的MSP-1制剂是有益的，因为它在宿主动物中引起强烈的免疫应答，使得它适于用作疟疾疫苗中的活化剂。同时，该蛋白质适应药品生产质量管理规范(GoodManufacturing Practice)(“GMP”)的要求，该药品生产质量管理规范的要求为用于给药的治疗蛋白质可能不含有分离标签，如His6，因为这样的标签在患者体内与螯合物相互作用。应强调的是没有分离标签，证明MSP-1正常将根本难以回收，更不用说以基于该蛋白质的疫苗制剂的所需量回收。如下文所述，本发明人已制定如何分离并回收足量MSP-1蛋白质作为用于药物的工业规模制剂的异源二聚体制剂，而符合用于设计为患者给药的治疗蛋白质的规范要求。如此，本发明的MSP-1制剂满足了未满足的需求。
作为本文此方面/实施方案和其它方面/实施方案所使用的术语“MSP-1制剂”包括含有两个结合，优选两个非共价结合的蛋白质亚基或片段(贯穿本申请“亚基”和“片段”互换使用)，其中两个蛋白质亚基是不一样的。术语“MSP-1制剂”因此包括异源二聚体MSP-1。例如，MSP-1亚基p83/30和p38/42是彼此自发地非共价结合形成具有免疫性的MSP-1异源二聚体(即，反映天然MSP-1异源四聚体那些性质的表位)的不同多肽。术语“MSP-1”也可以包括全MSP-1蛋白质的不完整部分，如异源二聚体的MSP-1的“半”p83/30或p38/42及其片段。在这些情况中，为了明确，各“半(half)”通常称作“MSP-1片段”或“MSP-1亚基”。为了可读性，下文将MSP-1制剂简称“MSP-1”，但理解意思是上面定义的“MSP-1制剂”。
作为本文此方面/实施方案和其它方面/实施方案所使用的术语“异源序列”指不是MSP-1序列的序列。例如，多肽部分，例如含有设计为特异地与预定结合对象相互作用的特定序列区域的所需多肽在N和/或C端的延伸可认为是“异源序列”。该“分离标签”通常用于蛋白质化学以帮助重组产生的蛋白质的分离/回收。通常使用的异源标签实例包括His6(其螯合二价镍)、谷胱甘肽S-转移酶(“GST”，其结合谷胱甘肽)和“strep”(8-氨基酸标签，其结合到工程化抗生蛋白质链菌素)。作为本文此方面/实施方案和其它方面/实施方案所使用的术语“异源序列”还指通过选择性结合方法实现能够回收蛋白质目的的表达蛋白质的任何化学修饰。本发明的MSP-1不包含这样的异源序列。
作为本文此方面/实施方案和其它方面/实施方案所使用的术语“纯化的片段”(参考p83/30)指含有疟原虫属MSP-1的p83部分和p30部分的单一多肽。优选地，MSP-1蛋白质包含来自疟原虫属F菌株或疟原虫属D菌株的p83/30片段。纯化的p38/42片段是包含来自疟原虫属MSP-1的p38部分和p42片段的单一多肽。p38/42片段可来源于任何疟原虫属菌株，例如，恶性疟原虫的D菌株或F菌株。
作为本文此方面/实施方案和其它方面/实施方案所使用的术语“p83/30片段”和“p38/42片段”还指修饰片段，该修饰片段与天然p83/30或p38/42片段在全长多肽上有至少90％，优选至少95％和更优选至少98％的同一性。该术语还包括与野生型多肽相比，可含有单个氨基酸和/或多达10个氨基酸，更优选多达5个氨基酸缺失的截断片段。P83/30片段优选具有至少800个氨基酸，更优选至少850个氨基酸的长度。另外，p83/30片段与恶性疟原虫F变种的p83/30片段(SEQ ID NO：3)或恶性疟原虫D变种的p83/30片段(SEQ ID NO：1或2)具有至少90％，更优选至少95％，和最优选至少98％的序列同一性。
本发明的MSP-1制剂以及包含本发明的MSP-1制剂的组合物有利不含有不是来源于MSP-1片段p83、p30、p38或p42的任何片段或其它多肽产物。
根据一个实施方案，异源序列是分离标签。
根据另一实施方案，纯化的p83/30片段是F片段，即，来源于疟原虫属F菌株，特别是来自恶性疟原虫菌株FCB-1又名FC或F的片段。已发现F片段比D片段(即，来源于疟原虫属D菌株，特别是来自恶性疟原虫菌株3D7又名NF54的片段)更稳定的抵抗蛋白质水解的降解。还发现了p83/30片段可能与异源或同源p38/42片段结合，例如与异源p38/42 D片段和/或p38/42F片段结合。
组分(a)和(b)优选重组多肽，即，在重组宿主细胞，例如真核宿主细胞，如酵母细胞，如酿酒酵母或毕赤酵母或在原核细胞，例如，革兰氏阴性细菌细胞如大肠杆菌中制造的多肽，优选地，重组宿主细胞是大肠杆菌细胞。更优选地，宿主细胞是大肠杆菌W3110Z2，如大肠杆菌W3110Z2-pZE23/d-83/30(DSM登录号16602)或W3110Z2-pZE23/d-38/42(DSM登录号16600)。DSM编号表示由在德国不伦瑞克(Braunschweig)的德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)指定的编号。
在一个优选实施方案中，p83/30片段优选包含SEQ ID NO：3所示的恶性疟原虫F菌株的氨基酸序列以及任选地N端信号肽序列或源自F菌株序列的修饰的F片段。可选地，p83/30片段包含恶性疟原虫D菌株的氨基酸序列和任选地修饰的D菌株序列的N端信号肽序列。SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列是源自D菌株并在位置612(E-＞K)和767(Q-＞H)包含2个氨基酸置换的氨基酸序列。作为另外可选的，p83/30片段包含SEQ ID NO：1所示的恶性疟原虫D菌株的氨基酸序列和任选地修饰的D菌株序列的N端信号肽序列。
p38/42片段可源自恶性疟原虫的F菌株，如例如SEQ ID NO：5所示和/或源自恶性疟原虫的D菌株，如SEQ ID NO：4所示。令人惊讶地发现F菌株的p83/30片段可与来自F菌株的同源p38/42片段或来自不同恶性疟原虫菌株，如D菌株的异源p38/42片段两者结合。
p38/42片段优选具有至少700个氨基酸并更优选至少750个氨基酸的长度。另外，优选的是与来自恶性疟原虫F菌株的p38/42片段(SEQ ID NO：5)和/或来自D菌株的p38/42片段(SEQ ID NO：4)相比，p38/42片段具有至少90％，更优选至少95％和最优选至少98％的序列同一性。
p83/30和p38/42特别优选的实施方案的氨基酸序列示于SEQ ID NO：1-5，MSP-1的p83/30片段与MSP-1的p38/42片段形成异源二聚体的MSP-1的优选的结合如下表1所示：
表1
  p83/30片段   p38/42片段
  SEQ ID NO：1   SEQ ID NO：4
  SEQ ID NO：1   SEQ ID NO：5
  SEQ ID NO：2   SEQ ID NO：4
  SEQ ID NO：2   SEQ ID NO：5
  SEQ ID NO：3   SEQ ID NO：4
  SEQ ID NO：3   SEQ ID NO：5
在本发明的此方面/实施方案和其它方面/实施方案，优选的疟原虫属种类是恶性疟原虫。
本发明的另一方面提供用于制备编码来自疟原虫属的MSP-1的具有如SEQ ID NO：1、2或3所示的氨基酸序列的p83/30片段的修饰的核酸的方法，所述方法包括：
(a)提供mRNA序列，该mRNA序列编码来自疟原虫属的MSP-1的具有如SEQ ID NO：1、2或3所示氨基酸序列的p83/30亚基；
(b)在电脑模拟中分析步骤(a)的mRNA序列起始密码子周围的区域，以测定所述mRNA序列的预测的二级结构；
(c)鉴定在步骤(b)所述的起始密码子周围的区域中的至少一个稳定的发夹样结构；
(d)修饰在步骤(b)的所述起始密码子周围的区域中的mRNA序列，其中至少一个核苷酸置换、插入、缺失和/或倒位使所述发夹样区域不稳定，和其中在电脑模拟中实现至少一个核苷酸置换、插入、缺失和/或倒位，以编码与所述未修饰的核酸序列编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列；
(e)在与步骤(b)所述的相同条件下，在电脑模拟中分析步骤(d)的区域；
(f)测定是否至少一个核苷酸置换、插入、缺失和/或倒位使得至少一个含有至少一个核糖体结合位点的发夹样区域不稳定；
(g)根据需要任选地重复步骤(d)-(f)直到在与步骤(b)所述的相同条件下的电脑模拟中的分析表明至少一个发夹样区域不稳定；
(h)制备相应的修饰的核酸。
以前，包含MSP-1蛋白质亚基p83/30和p38/42的足量异源二聚体的MSP-1的制备受限于p83/30亚基的低表达。本发明人通过确定并消除观察到的低表达来源，已有效地除去了在制备包含p83/30和p38/42亚基的MSP-1中的这种瓶颈。具体地，发明人已确定编码MSP-1的p83/30亚基(如，具有SEQ ID NO：1、2或3所示的氨基酸序列)的未修饰的mRNA中的起始密码子周围的区域含有二级结构的多个区域，如妨碍翻译所需的通过核糖体机构识别的发夹样区域。通过测定mRNA的哪个区域存在于稳定的二级结构，如发夹样结构中，本发明人已确定可实现核酸序列的这些区域的靶向修饰以使二级结构不稳定化，并使核糖体有效识别以前不能接近的mRNA区域。由于蛋白质表达水平很大程度上取决于核糖体对其mRNA上的结合位点的适当识别，使这些位点更易接近核糖体导致相应蛋白质表达水平的巨大增加，因此，消除了以前MSP-1重组生产中的限制步骤。
作为本文此方面/实施方案和其它方面/实施方案中所使用的术语“修饰的”指在起始核酸(starting nucleic acid)的编码核苷酸序列中进行的至少一个变化的事实，所述变化导致该核酸相应mRNA中二级发夹样结构的确定的或推测的区域不稳定化，然而修饰的核酸需要不是mRNA本身。而术语“修饰的核酸”包括mRNA，它还包含DNA序列，当转录为mRNA时，与修饰前的相应核酸序列相比，该DNA序列将在相应于核糖体结合位点的区域内没有或至少具有减少的或不同的二级发夹样结构。另外，当实现的修饰位于编码p83/30 MSP-1蛋白质亚基的ORF内时，所述修饰优选产生以下核苷酸三联体：由于遗传密码子的简并性，该核苷酸三联体被翻译为与由未修饰形式的相应三联体(triplet)翻译产生的氨基酸相同的氨基酸。在此方面/实施方案和其它方面/实施方案中，这称为“沉默修饰”或“沉默突变”。
作为本文在此方面/实施方案和其它方面/实施方案中使用的术语“起始密码子周围的区域”指起始于转录起始位点，并延伸越过AUG起始密码子约100-150个核苷酸进入编码区，以包含约150-200个核苷酸的总窗(window)长度的核苷酸窗。
作为本文在此方面和其它方面中使用的术语“约”典型地表示多达并包括±15％的差异(明确的包括0-15％之间的整数或小数数值的所有中间值)，该差异的结果四舍五入到最近的适合的整数。
作为在此方面/实施方案和其它方面/实施方案中使用的术语“核糖体结合位点”指已知由核糖体结合的作为翻译mRNA为氨基酸序列的部分的核苷酸的延伸。技术人员明白如何识别这些序列。例如，在原核生物中核糖体结合位点也称为“Shine-Dalgarno序列”或“Shine-Dalgarno框”(Shine & Dalgarno(1975)Nature 254，34-8之后)，其由起始密码子上游的约10个核苷酸的富含嘌呤的序列组成。本发明下的用于MSP-1的p83/30片段的表达的核糖体结合位点序列相当于Shine-Dalgarno共有序列，此前已描述了其驱动大肠杆菌中的基因表达的能力(Lutz& Bujard(1997)Nucleic Acids Res.25，1203-10)。
作为本文在此方面/实施方案和其它方面/实施方案中所使用的术语“在电脑模拟中(in silica)”指电子地分析，如使用用于核酸及其预测二级结构分析的适当软件在计算机上完成的分析。用于核酸序列分析的适当软件平台对技术人员是已知的，如由美国纽约特洛伊的伦塞勒综合技术研究所(Rensselaer Polytechnic Institute，Troy，NY，USA)的网络服务器提供的祖克和特纳的“mfold”程序(version 3.2)(Zuker(2003)Nucleic Acids Res.31(13)，3406-15；Mathews等人，(1999)J.Mol.Biol.288.911-40)。可选的来源是“Vienna RNA package”(在网上从以下网址可得到的：http://www.tbi.univie.ac.at/～ivo/RNA/)或在耶那的分子生物应用研究所(IMB Jena)的“RNA世界”(在网上从下面的网址可得到：http://www.imb-jena.de/RNA.html)。由这些服务器使用的预测程序使用基于计算多聚核糖核苷酸分子的自由最小能的运算法则的相同的结构预测策略(参见：Stiegler & Zuker(1981)Nucleic Acids Res.9，133-48)。然而不同的在线资源可采用此运算法则的不同优化包，使用MSP-1p83/30片段的mRNA序列通过不同的服务器进行结构预测得到的分析结果在预测的RB S二级结构方面彼此并没有明显不同。因此，任一这些程序/运算法则可以等同使用，得到相似结果。在上述在线资源中，可使用默认值预测RNA二级结构。设计这些默认值以反映活体内的情况。与用于预测DNA中二级结构的参数相比，用于RNA折叠的参数不能用“mfold”服务器的用户界面调整。
作为本文在此方面/实施方案和其它方面/实施方案中所使用的术语“不稳定化”或“不稳定”等指稳定性降低，以及因此mRNA中二级结构如发夹样结构的持久性(persistence)与当没有进行核苷酸修饰时的相同区域中的二级结构的持久性相比而降低。例如，修饰核酸序列以使两个各自的核苷酸或核苷酸延伸之间的杂交受到破坏并与未修饰状态相比在修饰状态发生的可能性较小，这样将构成“不稳定化”。同样地，“不稳定”并不仅仅是预测的分子的较低自由能的结果。相反地，它集中到核糖体结合位点的二级结构上，通过涉及比非结构的区域更“稳定”的确定的二级结构。例如，然而没有被理论所束缚，本发明人假设未修饰的序列中的参与发夹样结构的部分核糖体结合位点将比修饰的序列中的更不容易被核糖体结合，从而减少该区域内确定的结构的程度。
作为本文在此方面/实施方案和其它方面/实施方案中所使用的术语“发夹样区域”表示其中在mRNA 5′-＞3′方向的第一亚区域与mRNA 3′-＞5′方向的第二亚区域形成稳定杂交的结构的区域。其中第一和第二亚区域各自形成mRNA相同连续链的部分。在典型“发夹”或“茎环”结构中，非常少，典型地5-6个核苷酸存在于参与发夹的杂交的第一和第二亚区域之间。然而，对于可能存在于编码MSP-1p83/30片段的mRNA的“发夹样区域”的第一和第二杂交亚区域之间的核苷酸数量并没有特别限定。从附图1可以看出，在参与发夹样区域的mRNA的第一和第二亚区域之间可存在许多核苷酸。
本发明的另一方面提供包含上述MSP-1的组合物，所述MSP-1包含
(a)没有异源序列的来自疟原虫属的gp190/MSP-1的纯化片段p83/30，和
(b)没有异源序列的来自疟原虫属的gp190/MSP-1的纯化片段p38/42。
根据一个实施方案，本发明组合物中的组分(a)和(b)优选以等摩尔量，如以组分(a)与组分(b)从1.5∶1至1∶1.5，更优选从1.2∶1至1∶1.2和最优选从约1∶1的摩尔比存在。优选地，在组合物中至少70％，更优选至少80％和最优选至少90％的片段以非共价结合二聚体存在。
在优选实施方案中，本发明的组合物具有至少95％，和更优选至少97.5％的纯度(通过SDS凝胶电泳和银染色测量)。作为在此方面和实施方案以及其它方面和实施方案中所使用的术语“纯度”指没有异源多肽，即非MSP-1多肽，如分离标签。
在另外的优选实施方案中，组合物具有小于30％，更优选小于20％和最优选小于15％的降解产物含量(通过SDS凝胶电泳和免疫染色测量)。在上下文中，术语“降解产物”指由上述p83/30片段或p38/42片段的降解产生的多肽分子。
本发明的另一方面提供包含上述MSP-1的药物组合物，所述MSP-1包含
(a)没有异源序列的来自疟原虫属的gp190/MSP-1的纯化片段p83/30，和
(b)没有异源序列的来自疟原虫属的gp190/MSP-1的纯化片段p38/42。
在一个实施方案中药物组合物可另外地包含药物学可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。
本发明的另一方面提供编码来自疟原虫属的MSP-1的具有如SEQ ID NO：1、2或3所述氨基酸序列的p83/30亚基的修饰的核酸，其中修饰的核酸通过上述方法可得。
本发明的另一方面提供包含上述修饰的核酸的载体。
在一个实施方案中，载体是多聚核苷酸载体，例如质粒，如pZ系质粒(Lutz & Bujard(1999)Nucleic Acids Res.25，1203-10)。其它适当的质粒载体对于本领域普通技术人员是已知的。优选多聚核苷酸载体还包含可操作地连接到编码MSP-1的p83/30片段的修饰的核酸的启动子以驱动其转录。在另一个实施方案中多聚核苷酸载体可包含可诱导启动子如PAllacO-1。
在另一个实施方案中，载体是病毒载体，例如牛痘病毒载体，如修饰的牛痘载体Ankara(MVA)，腺病毒，如腺病毒血清型5或麻疹病毒如来自埃德蒙顿分离株(Edmonton isolate)的减毒株。正如技术人员所熟知的，病毒载体例如MVA适于制造安全基因疫苗，在该安全基因疫苗中编码想要免疫受试者的抗原多肽的一个核酸或多个核酸被导入受试者身体，然后表达该抗原多肽，被受试者免疫系统识别，并导致抗表达多肽的固有和/或适应性免疫应答的的提高(mounting)。可选地，载体可以是例如减毒的结核分支杆菌。
本发明的另一方面提供制备疟原虫属MSP-1的p83/30片段的方法，所述方法包括：
(a)提供上述修饰的核酸和/或上述载体；
(b)将步骤(a)的修饰的核酸和/或载体引入细胞，优选原核细胞；
(c)在允许表达疟原虫属MSP-1的p83/30片段的条件下温育步骤(b)的细胞；和
(d)回收疟原虫属MSP-1的p83/30片段。
发明人已确定利用上文所述的编码p83/30的修饰的核酸序列(例如，如SEQ ID NO：8或9所示)导致疟原虫属MSP-1的p83/30片段表达的巨大增加，允许该蛋白质片段在宿主细胞内非常有效的产生。没有被理论所束缚，发明人相信蛋白质水平在转染有上述修饰的核酸序列的宿主中的迅速增加导致在翻译的蛋白质进行胞内蛋白质水解降解之前，该蛋白质作为包涵体迅速聚集并沉淀。因此，相信产生的p83/30蛋白质迅速转变为包涵体形式，其中所述蛋白质保持防止由宿主细胞的内源性蛋白质水解酶而降解。
没有被理论所束缚，发明人因此相信回收时得到的p83/30片段蛋白质的量比以前多，可能因为两个原因：第一，上述修饰的核酸(如，SEQ ID NO：8或9)的使用能够比未修饰的核酸(其中核糖体识别位点保持埋于二级结构区域中)可能的被核糖体识别和起始翻译更有效。这能够使翻译更有效的起始。第二，一旦p83/30亚基的翻译完成，该蛋白质似乎迅速转变为包涵体，其中所述蛋白质保持防止被宿主细胞降解直到其被回收。
作为本文此方面/实施方案和其它方面/实施方案中所使用的术语“允许表达的条件”表示技术人员已知的从所选宿主表达系统，即所选的宿主细胞菌株中生长和/或促进蛋白质表达的任何环境条件。这些条件可包括如，已知的促进在所选宿主细胞类型内蛋白质表达的温度、光照、摇动速度、培养基的pH、培养基的营养成分以及生长因子、氨基酸和维生素等的有无。如，使用大肠杆菌作为宿主细胞用于疟原虫属MSP-1的p83/30片段的异源制备，合适的条件可以如所附实施例，如实施例3所示。
在一个实施方案中，回收步骤包含从在宿主细胞内形成的包涵体溶解MSP-1蛋白质亚基。作为本文在此方面/实施方案和其它方面/实施方案中所使用的术语“包涵体”指在由异源表达基因形成的细菌的细胞质内的蛋白质聚集体。对于许多重组蛋白质，原核细胞质内的环境不适于正确的蛋白质折叠，特别是当由于过表达而蛋白质以高浓度存在时。蛋白质沉淀并形成称为“包涵体”的大的蛋白质聚集体，所述“包涵体”可作为细菌内高分子量结构在显微镜下识别蛋白质。包涵体内的蛋白质通常不以其天然构象存在，因此在其能够适当地发挥作用之前，必须从包涵体在活体外被重折叠。由于用于重折叠的信息包含于蛋白质的氨基酸序列中，重折叠步骤对于每种蛋白质不同，并需要基于每种情况详细地确立，如作为包涵体被表达和存在的特定蛋白质所示。然而，已确定了对于多种蛋白质折叠有利的某些基本参数(参见如Rudolph等人，(1997)protein function：Apractical approach.Ed.T.E.Creighton)。本领域普通技术人员明白如何应用这些一般参数(如，复性缓冲液的选择)以分离和重折叠包涵体形式的蛋白质。
发明人已发现用于复性溶解的MSP-1蛋白质(其p83/30和p38/42片段两者)包涵体的一种特别有效的方法包括脉冲(pulsing)包含溶解的包涵体的溶液。在这种意义上，“脉冲”指各蛋白质溶液向发生重折叠的复性缓冲液的添加。该过程称为“脉冲复性”并且之前已有描述(Rudolph & Lillie(1996)FASEB J.10，49-56)。简而言之，将少量变性蛋白质以时间间隔(如至少一小时)添加(即“脉冲”)到单独的等分的复性缓冲液中。在各间隔过程中，可在低浓度发生蛋白质折叠，从而降低聚集的可能性。例如，代替立即向复性溶液添加1mg蛋白质，可以有利的以较少量或“脉冲”，如各脉冲之前不久、过程中和之后不久搅拌来逐渐添加蛋白质。以这种方式，每次0.1mg蛋白质的10次单独添加可以在如10个小时内添加；搅拌的短暂之前和之后每小时一次脉冲，并在下次各蛋白质添加之前允许溶液温育静止。重折叠的蛋白质并不妨碍还没有重折叠的其它蛋白质的复性。
在疟原虫属MSP-1的p83/30和p38/42片段复性中，发明人已发现以约一小时的间隔(以前已显示允许多种蛋白质重折叠的时间段)添加蛋白质是特别有利的。对于蛋白质的施加或“脉冲”，可以使用任何允许规定溶液量添加的设备，如，自动化移液器。发明人已发现在各蛋白质添加之前约一分钟、过程中和之后约一分钟搅拌溶液是特别有利的。之前已描述了这些步骤设置以及在各蛋白质添加之间的约一小时的时间间隔(Rudolph& Lillie(1996)FASEB J.10，49-56)。
这种脉冲复性技术特别适用于疫苗制造所需的大量MSP-1亚基的制备所需的类型的大规模制备工艺。另外，在宿主细胞转染仅编码p83/30MSP-1蛋白质亚基的核酸的情况下，则包涵体应当仅包含该蛋白质，意味着它可以通过标准物理分离技术(如离心)从细胞裂解液有效的分离。由发明人开发并实施的高产率包涵体形成方法因此允许p83/30 MSP-1蛋白质亚基以完全避免任何依赖分离标签的方式有效的分离。
本发明的另一个方面提供通过相应的上述制备方法可得的MSP-1蛋白质的p83/30亚基。如上所述，以前试图制备足量用于工业规模疫苗制备的MSP-1蛋白质片段p83/30由于以下原因而失败：a)低异源表达水平和b)少量的表达被宿主细胞蛋白质水解降解。本发明MSP-1亚基p83/30产率的极大改善是发明人认识到需要在编码该蛋白质亚基的核酸中实现哪种修饰的结果。这些修饰允许更有效、快速的表达p83/30蛋白质产物。该蛋白质在宿主细胞中的快速生产导致包涵体(以该形式p83/30亚基保持防止被宿主细胞降解)的累积。由于p83/30亚基以容易分离的包涵体大量存在，因此利用标准物理分离技术如离心它可以以高纯度形式分离，避免需要依赖用于蛋白质回收的分离标签。
发明人对在编码MSP-1的p83/30亚基的核酸内需要特定表达-增强修饰的认识因而有效消除了迄今妨碍工业规模制备包含该亚基的MSP-1异源二聚体的一个步骤。同时，得到适于GMP的蛋白质，该蛋白质可以提交到适当的管理机构用于批准作为可给药的蛋白质治疗剂。
本发明的另一方面提供制备含有疟原虫属MSP-1的组合物的方法，所述方法包括：
(a)在宿主细胞中表达没有异源序列的来自疟原虫属的gp190/MSP-1蛋白质的片段p83/30；
(b)在宿主细胞中表达没有异源序列的来自疟原虫属的gp190/MSP-1蛋白质的片段p38/42；
(c)从宿主细胞回收片段p83/30和片段p38/42；和
(d)任选地在组合物中或作为结合制剂结合片段p83/30和p38/42。
片段p83/30和p38/42的表达可以在单个宿主细胞或独立地在第一宿主细胞和在第二宿主细胞中进行。优选使用独立的第一和第二宿主细胞。宿主细胞可以通过转染编码各MSP-1片段的核酸来提供。优选地，编码p83/30片段的核酸和编码p38/42片段的核酸可位于适于各宿主细胞，例如革兰氏阴性细菌细胞如大肠杆菌细胞的表达载体上。表达载体可以是附加型载体如质粒，或染色体整合载体。表达载体包含可操作地连接有适当表达控制序列的核酸，如，其可包含组成性或可诱导的启动子。表达载体还可包含遗传元件，如复制起点、筛选标记物等。适当克隆载体的实例公开于Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press以及其它标准教科书中。
当宿主细胞是细菌细胞，如大肠杆菌细胞时，优选以不溶形式，如上文所述的包涵体来表达片段。优选地，片段作为可以独立溶解(如在离液序列高的盐如盐酸胍的存在下)和随后重折叠(如在精氨酸和硫醇试剂如谷胱甘肽的存在下)的包涵体独立地回收。可选择地，p83/30和38/42片段可以以适当摩尔比在溶解之前、溶解之后或重折叠后结合。关于此方面可以使用上述脉冲复性技术。如果需要，重折叠后，将片段转移到可包含非离子型表面活性剂如吐温80、吐温20或TritonX-100的适当缓冲液中。片段可通过包括至少一个以下步骤的后续处理步骤独立地纯化：过滤，阴离子和/或阳离子交换色谱如Q-琼脂糖HP-色谱或SP-琼脂糖HP-色谱，调节(conditioning)和浓缩，如通过超滤。
根据步骤(d)，结合片段。优选地，片段以如上所述的大约等摩尔量结合。各片段的量可以通过在还原条件下定量SDS-PAGE来进行测定。特别优选片段在没有异源多肽如白蛋白质时结合。
结合后，片段可进一步如通过尺寸排阻色谱，如利用Sephacryl S 300-HR/GE纯化。进一步的处理可包含过滤、浓缩和灭菌，如通过无菌过滤。
编码片段p83/30和p38/42的核酸与WO 98/14583(其并入本文作为参考)所述的野生型序列相比可以具有降低的AT含量。
通常，p38/42片段(如具有SEQ ID NO：4或5所示的氨基酸序列)的有效生产并没有遇到当从未修饰的核酸生产p83/30时观察到的相同的低产率问题。作为本文使用的“未修饰的核酸”表示这样的核酸，该核酸就单个多肽链中的独立的MSP-1亚基p83和p30的编码序列而言，相应于疟原虫属中，优选恶性疟原虫中的各亚基的天然核酸序列(或之前如WO 98/14583和Pan等人，(1999)Nucleic Acids Res.27(4)，1094-103所公开的已修饰以增强稳定性的天然核酸序列)。通常，因此可以使用包含编码p38和p42亚基的天然、未修饰的序列的核酸以有效生产MSP-1片段p38/42。然而，如果需要、有益或必要，可以以类似于上述用于p83/30片段的方式进行编码MSP-1的p38/42片段的核酸的相应修饰。对于MSP-1的p83/30片段的上述优点，如以包涵体形式的有效生产和省略任何异源序列，如分离标签，因此也适用于p38/42亚基。
发明人已确定两个MSP-1亚基片段p83/30和p38/42在适宜条件下自发地重折叠和结合。当片段之前已从包涵体形式中再增溶(resolubilized)时特别是这种情况。在此详细地描述这些条件。同样地，有可能在单个共同过程中有效地构造包含合成的MSP-1亚基p83/30和p38/42的异源二聚体的MSP-1蛋白质，而不需要用于单个亚基的在先降低产率的重折叠步骤(yield-lowering refolding procedures)。所得MSP-1蛋白质的产率因此最大化。另外，由于MSP-1的重折叠和重装配同时发生，传统的柱类蛋白质分离步骤在多数情况下可以省去，以及与它们一起省去对上述的任何类型的分离标签的需要。当然，如果需要，仍可采用本文上述的这样的柱纯化方法。
作为本文在此方面/实施方案和其它方面/实施方案中所使用的“混合”或“结合”表示使MSP-1的p83/30和p38/42亚基片段在促进异源二聚体形成的条件下彼此接触。将为了该目的的适宜条件描述如下。
本发明此方面的一个非常有利的特征是MSP-1的两个“半”，即p83/30和p38/42片段可以作为溶解的但非重折叠的包涵体结合在一起以形成完整MSP-1。因此该实施方案避免了单个p83/30和p38/42亚基在彼此混合之前的分别重折叠的需求。然后可处理含有溶解但仍未折叠的两个蛋白质亚基的溶液以使单个亚基逐渐地复性或彼此“重折叠”，如它们应当的那样自发地重装配完整、正确折叠的MSP-1异源二聚体。如上所述，以化学计量或接近化学计量的量(即以1∶1或接近于1∶1的比)结合两个亚基是有利的。同样地，在混合前应当测定各MSP-1片段的包涵体制备物的蛋白质浓度。在由仍不溶的包涵体开始的一个共同步骤中重建MSP-1异源二聚体的能力因此消除了对于在混合(可引起产物损耗的过程)前分别复性每个亚基的任何需要。如此，除了回收包涵体(和它们任选的在先溶解)之外没有任何其它在先处理步骤而混合单个蛋白质亚基的可能性因此使得对于通过适当核酸修饰的p83/30亚基和对于通过使用天然或修饰的疟原虫属序列的p38/42得到的高蛋白质产率达到最大程度的可能。
在一个实施方案中，可将MSP-1异源二聚体的成分p83/30和p38/42亚基引入相同或不同的细胞，优选原核细胞中。然而，在一个实施方案中优选上述结合步骤如此进行，以使p83/30和p38/42亚基彼此之间以大约1∶1的化学计量比混合。为了该目的，优选将MSP-1异源二聚体的p83/30和p38/42亚基从不同的细胞表达。这能更大程度的实验控制调整随后混合蛋白质亚基的化学计量比蛋白质，以使该比率尽可能的接近于1∶1。
在一个实施方案中，将单个亚基包涵体分别溶解，即在混合重装配之前溶解于不同溶液中。然后可以测定溶液中它们各自的量，并结合适当量的每种溶液以重建完整的MSP-1。在一个优选实施方案中，如上所述，含有p83/30和p38/42亚基的两种溶液可以以测量的等分，即“脉冲”添加到一种混合溶液。在一个特别优选的实施方案中，发明人已发现MSP-1异源二聚体从其各自的p83/30和p38/42半的重建，即重装配可以通过在持续约2分钟的搅拌时间的大约中间时刻定时分别添加来促进。也就是说，在各温育(在该过程中允许发生蛋白质复性)之后，轻轻搅拌溶液约1分钟。在蛋白质添加过程中继续搅拌，并且继续搅拌约另外的一分钟。这期间之后，停止搅拌并有利的允许溶液静置温育预定时间。该静置期之后，重复该过程直到添加完所有可得蛋白质。
在另外的实施方案中，p83/30和p38/42亚基在混合步骤之前不复性，而是如上已经描述的那样以变性形式彼此添加。例如，变性形式可包括从细胞裂解液通过离心回收并在混合步骤之前重悬(但不复性)的包涵体。在一个实施方案中，将含有变性p83/30和p38/42的混合物溶液进行如上所述的相同类型的脉冲处理。
在另一实施方案中，MSP-1异源二聚体的两个蛋白质亚基之一在与两个亚基的另一个混合之前重折叠，混合时后者仍是变性的和可溶或不溶的。这里，如上所述，可采用脉冲处理以溶解还不可溶的亚基(如果需要)，并同时促进两个蛋白质亚基结合为正确折叠的MSP-1。
在一个实施方案中，MSP-1异源二聚体的实际回收可例如通过将盐交换为任何所需缓冲液的渗滤或透析来完成，而不需要包含稳定组分如BSA或HSA。根据后续纯化和配方工序的需要，可使用一系列的不同缓冲液。
本发明的另一方面提供上述来自疟原虫属的MSP-1、上述修饰的核酸、上述载体、上述MSP-1片段p83/30(例如，SEQ ID NO：1、2或3的任一)或MSP-1亚基p38/42(例如，具有SEQ ID NO：4或5的任一)作为疫苗的用途。
如上所述，完全重建的MSP-1异源二聚体及其单个p83/30和p38/42蛋白质亚基当与宿主的免疫系统，如动物或人的免疫系统接触时能够引起免疫应答。为此目的，特别优选的是使用包含p83/30和p38/42两个亚基的MSP-1异源二聚体，因为异源二聚体将提供宿主的免疫系统与天然MSP-1异源二聚体的表位最密切匹配的表位。然而，为此目的，另外优选的是使用或者蛋白质亚基p83/30或者p38/42，因为这些将提供宿主免疫系统相当于异源二聚体的MSP-1的表位的某些表位。
在一个实施方案中，疫苗包含药物学可兼容的载体，即佐剂。在此方面药物学可兼容的佐剂是本领域内已知的用于增强免疫应答的所有载体和试剂。优选的这种佐剂包含氧化铝和磷酸铝载体，每种具有或没有另外的刺激化合物如MPL、来自Seppich SA的ISA 720和ISA 51、来自Intercell的IC31或MF59。
在一个实施方案中，疫苗适于通过如皮内、肌内或皮下注射给药。然而，通常可使用已知导致疫苗给药中的免疫应答的任何给药途径来给药本发明的疫苗。
可将疫苗制备为可重建的冻干粉、液体，如为溶液或悬浮液，或乳状液，如油包水乳状液。应用于人类药品的优选的疫苗剂量包括1-500μg，更优选20-100μg。疫苗可以单剂量或多剂量给药。优选多剂量给药。特别优选100μg的剂量。
本发明的另一个方面提供上述来自疟原虫属的MSP-1、上述修饰的核酸、上述载体、上述MSP-1片段p83/30(例如，SEQ ID NO：1、2或3的任一)和/或MSP-1亚基p38/42(例如，SEQ ID NO：4或5的任一)在制备用于预防和/或治疗疟疾的药物中的用途。
在一个实施方案中，药物制备为与佐剂一起给药，其中示例性佐剂如上所述。示例性给药路径和量也如上所述。
在优选的实施方案中，药物制备为与ISA720一起给药。发明人惊讶的发现包含蛋白质亚基p83/30和p38/42(各自没有异源序列)的MSP-1给药到动物导致异乎寻常高的抗体滴度，这通过以下得到证明：a)与使用弗氏完全/不完全佐剂(已知最有效的佐剂)得到的滴度相比，和b)测试得到的抗体的特异性(得到高滴度抗体也抗低免疫原性区p30和p38)。因此，在p83/30编码核酸中的修饰不仅允许第一次以可接受的产率和无任何分离标签生产相应亚基，而且还发现有益的抗原/佐剂组合产生与佐剂ISA720一起的来自疟原虫属的MSP-1有希望的配方。
在药物学可兼容的载体/佐剂/稀释剂以及给药途径和量的上下文中的上述实施方案已通过必要的修正适用于本发明的此方面。
本发明的另一个方面提供疫苗，该疫苗含有上述来自疟原虫属的MSP-1、上述修饰的核酸、上述载体、上述MSP-1片段p83/30(例如，SEQ ID NO：1、2或3的任一)和/或MSP-1片段p38/42(例如，SEQ ID NO：4或5的任一)。
本发明的另一方面涉及包含来自疟原虫属F菌株的gp190/MSP-1蛋白质的纯化片段p83/30的组合物。p83/30片段优选包含如SEQ ID NO：3所示的序列或上述修饰的序列。该组合物优选用作药物制剂，如作为上述疫苗。关于优选的特征，如该组合物的纯度和/或该组合物降解产物的含量，参考上述公开。
在药物学可兼容的载体/佐剂/稀释剂以及给药途径和量的上下文中的上述实施方案已通过必要的修正适用于本发明的此方面。
通过以下非限定性实施例将说明本发明。
实施例
实施例1：编码MSP-1蛋白质亚基的核酸序列的突变
在原核生物中核糖体结合位点也称作“Shine-Dalgarno序列”，由起始密码子上游大约10个核苷酸的富含嘌呤的序列组成。在质粒pZE23/d-83/30中用于表达重组MSP-1蛋白质的核糖体结合位点序列相当于“Shine-Dalgano”共有序列(Shine &Dalgarno(1975)Nature 254，34-8)，之前已描述其在大肠杆菌中驱动基因表达的能力(Lutz & Bujard(1997)Nucleic Acids Res.25，1203-10)。由于原核生物中mRNA翻译为蛋白质在转录仍在进行时发生的事实，mRNA的二级结构可能影响核糖体识别mRNA以及因此可能影响蛋白质合成速率。
根据上述，mRNA结构在电脑模拟中的分析通过向作为在线资源由纽约特洛伊的伦塞勒综合技术研究所提供的RNA结构预测程序“mfold”(version 3.2)(Zuker(2003)Nucleic Acids Res.31(13)，3406-15；http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/)提交编码p83/30的mRNA的约前150-200bp(即SEQ ID NO：6或7任一的前150-200bp)而进行。使用默认值以预测RNA二级结构。这些默认值设计为反映活体内的条件。与用于预测DNA中二级结构的参数相比，用于RNA折叠的参数不能用“mfold”服务器的用户界面调整。SEQ ID NO：6和7分别示于图15和16。
发现预测的核糖体结合位点的结构包含发夹样结构，其可能限制核糖体接近(access)(参见图1)。假设通过修饰mRNA的二级结构以使核糖体结合位点不再是结构上良好确定(well-defined)区域的部分，如发夹样结构，可能有利于核糖体接近到mRNA，因此，促进重组MSP-1在细菌中的合成。
为了该目的，将若干突变引入与核糖体相互作用的序列中以使发夹样结构不稳定化。将修饰的序列再次进行计算机分析并显示突变的预期效果，即核糖体结合位点的结构不再是发夹样结构的部分。
这种计算机预测之后，通过位点特异性突变将两组不同的计算的突变引入编码的p83/30核酸。最终克隆具有突变组之一的序列以及包含两组突变的序列，与原始序列相比全部导致改善的MSP-1表达。证明包含两组突变的序列最有效和然后用于p83/30的表达。两组突变以等同形式存在于SEQ ID NO：8和9中(参见图17和18)。分别相对于SEQ ID NO：6和7的双亲核酸序列的这些突变是沉默突变，意味着它们不导致氨基酸水平上的修饰。在相对于SEQ ID NO：6和7突变的SEQ ID NO：8和9中的核苷酸分别在SEQ ID NO：8和9中用小写黑体字突出表示，起始密码子ATG带有下划线(参见图17和18)。
实施例2：非突变的与突变的MSP-1亚基表达的比较
将含有pZE23/d-83/30(对应于SEQ ID NO：6或7的p83/30片段的未修饰序列，其中核糖体结合位点是等同的)或pZE23/d-mut83/30(对应于SEQ ID NO：8或9的p83/30片段的修饰序列，其中核糖体结合位点已被等同修饰)的大肠杆菌W3110-Z2在37℃的Superbroth培养基中生长至细胞密度OD500＝0.5。通过添加IPTG(1mM)诱导MSP-1表达并使细菌生长另外的4小时。诱导时(0h)和之后的2(2h)和4小时(4h)分别取出全部细菌提取物的等份。通过SDS-PAGE和考马斯染色分析全部细胞提取物。得到的结果示于图2。
实施例3：由p83/30和p38/42生产异源二聚体的MSP-1
实施例3a：翻译优化的P83/30和P38/42的宿主细胞的生产
用质粒pZE23/mut-d-83/30和pZE23/d38/42转化CaCl2-感受态大肠杆菌W3110Z2。分开但在相同的条件下：在37℃的Superbroth中使大肠杆菌宿主菌株W3110Z2-pZE23/d83/30和W3110Z2-pZE23/d38/42生长。在细胞密度OD600＝7时，通过添加异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(“IPTG”，终浓度1mM)诱导MSP-1亚基的合成。在OD＝18-24时通过离心收获细胞并且或在-80℃保藏或立即进一步处理。分别来自突变和非突变的核酸序列的p83/30和p38/42片段的表达结果示于图3。
实施例3b：p83/30和p38/42亚基的表达
分开但在相同条件下：在37℃的Superbroth中进行两种大肠杆菌宿主菌株W3110Z2-pZE23/d83/30和W3110Z2-pZE23/d38/42的发酵。在细胞密度OD600＝7时通过添加IPTG(终浓度1mM)诱导MSP-1片段的合成。在OD＝18-24时通过离心收获细胞并且或在-80℃保藏或立即进一步处理。发酵结果示于图4。
实施例3c：来自包涵体的P83/30和P38/42亚基的回收和溶解
将来自发酵或来自冷冻生物质的细胞悬浮在4℃的裂解缓冲液中，并通过流化装置在1.034×105-1.379×105kPa(15,000-20,000psi)开裂(open)。在27000g下进行离心20分钟。粒状沉淀(pellet)含有包涵体。将粒状沉淀重悬于裂解缓冲液(PBS，pH 7.4，溶菌酶，脱氧核糖核酸酶)中，并重复离心。收获粒状沉淀并进行另外的重悬和离心循环。包涵体的终浓度为500mg/L细菌培养物。室温下搅拌10小时的同时在溶解缓冲液(6M盐酸胍，50mM磷酸钠，pH 8.0，10mM DTT，1mM EDTA)中溶解集中于粒状沉淀的包涵体。在27,000g下离心40分钟清除溶解的包涵体的溶液。图5示出溶解的包涵体的电泳分析。
实施例3d：p83/30和p38/42的混合和复性以形成重装配的MSP-1 异源二聚体
MSP-1片段p83/30和p38/42在其各自溶解的包涵体制备物中的含量通过两种制备物稀释系列的电泳分析来测定。这些测定对于计算在脉冲复性过程中将要结合的两种制备物的体积是重要的。以十个相等的等分将两种亚基添加到复性缓冲液(500mM精氨酸，50mM磷酸钠，pH 8.0，1mM EDTA，0.1mM谷胱甘肽)中，以使复性处理结束时复性的异源二聚体的终浓度为0.5mg/mL。
用以下方式向复性缓冲液中添加单个等分：在每次添加(即蛋白质的“脉冲”)之前、之中和之后搅拌溶液1分钟。一次添加之后的停止搅拌和下一次各添加之前的开始搅拌之间允许经过约1小时。在最终添加之后，将溶液温育另外的10小时。整个过程温度控制在10℃。温育之后，将蛋白质溶液在4℃离心或渗滤。由渗滤交换缓冲液。蛋白质回收率为99％。
实施例3e：重建的MSP-1异源二聚体蛋白质的纯化
将包含p83/30和p38/42两种片段没有异源多肽序列例如分离标签的复性的MSP-1异源二聚体进行三次色谱分离处理：HP-Q琼脂糖色谱(AP Biotech)、羟基磷灰石色谱，macroprep Type I(BioRad)和HP-SP琼脂糖色谱(AP Biotech)。
每100L发酵体积的MSP-1异源二聚体的总产率和纯度为8gm MSP-1。这是足够用于每100μg的80,000剂量的MSP-1的量。终产物含有每1mg MSP-1小于1ng的大肠杆菌蛋白质。
约85％的终物质由完整的MSP-1异源二聚体蛋白质组成。终产物包含约15％的所谓的产物衍生杂质。这些杂质是对蛋白质酶敏感的产物。两种片段p83/30和p38/42之中，主要是p83/30亚基显示出对蛋白质酶的这种敏感性。降解产物(参见图6)似乎构成不完整异源二聚体的部分，因为它们不能从复合体中分离。通过使用对MSP-1的p83/30和p38/42片段特异的合适抗体的测定，纯化的MSP-1制剂的所有可检出组分可鉴定为MSP-1的降解产物(图6)。
实施例4：免疫原性研究
抗原的免疫原性强烈的取决于(1)其配制方式，即其与哪种佐剂组合；(2)免疫用药法，即其给药的方式(例如，皮下s.c.或肌内i.m.)；(3)进行免疫的次数；和(4)免疫的时间顺序。
在本研究中，佐剂的测试限于适合于人类使用的那些。将在人类中使用不被接受的非常有效的佐剂，弗氏完全和不完全佐剂(FCA，FIA)用作阳性对照。另外的对照是磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的纯抗原。
第一组免疫是在小鼠模型中进行的。随后在兔中测试通过高滴度MSP-1特异性抗体证实在这些动物中显示高免疫原性的抗原/佐剂组合。
实施例4a：Balb c小鼠中的免疫
用每剂量含有5μg抗原的抗原/佐剂组合注射有七只动物的几个组。三个皮下注射在0、21和42天进行，在63天，将动物放血并收获最终的血清。通过ELISA利用MSP-1异源二聚体作为捕获蛋白质测定抗体滴度。
用以下佐剂进行免疫：氢氧化铝；磷酸铝；MPL(Sigma)；CpG(Qiagen)；IC31(Intercell，维也纳，奥地利)；Montanide ISA720(Seppich，巴黎，法国)；Montanide 51(Seppich)；Virosomes(Berna Biotech，伯尔尼，瑞士)；和FCA/FIA。
该研究的结果示于图7。数据柱形A-Y的单个组的特征如下文图7的相应说明中所述。重要的是，数据组A表示在PBS中给药的抗原，数据组X、Y表示在FCA/FIA中给药的抗原。从图7能看出，数据组K(相当于佐剂X3)，S(相当于佐剂MontanideISA 720)和T(相当于佐剂Montanide ISA 51)产生所有试验配方的最高抗体滴度。基于这些结果，随后将MSP-1和MSP-1有关的抗原与这三种佐剂的每种给药到兔。
实施例4b：兔的免疫
将四个剂量的配方抗原(每剂量100μg)肌内注射到有五只兔的几个组。在0、28、42和56天进行免疫。在70天将动物放血并收获血清。通过ELISA利用MSP-1异源二聚体以及4种亚基p83、p30、p38和p42作为捕获蛋白质测量MSP-1特异性抗体的滴度。结果示于图8。
如图7和8各自所示，存在几个有希望的抗原/佐剂组合，进一步的研究可能揭示另外的候选者。然而，现有数据表明MSP-1异源二聚体与Montanide ISA 720的组合是特别有希望的，因为两个令人惊讶的原因：
(1)兔中得到的抗体滴度超过MSP-1与弗氏佐剂的组合。
(2)当利用MSP-1的四种亚基分析时抗体滴度显示最有趣的图谱。抗p30和p38的滴度与对p83和p42特异的那些滴度相比异乎寻常的高。因为两种亚基p30和p38引起在预防寄生虫生长中特别有效的抗体，所以该研究的结果是特别有希望的。
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Claims (18)

1.一种恶性疟原虫的裂殖子表面蛋白质1(“MSP-1”)制剂，所述MSP-1包含
(a)没有异源序列的来自疟原虫属的gp190/MSP-1的纯化片段p83/30，和
(b)没有异源序列的来自疟原虫属的gp190/MSP-1的纯化片段p38/42。
2.根据权利要求1所述的MSP-1制剂，其中所述疟原虫属是恶性疟原虫的3D7菌株。
3.根据权利要求1或2所述的MSP-1制剂，其中所述MSP-1制剂以包含MSP-1片段p83/30和p38/42的异源二聚体提供。
4.权利要求3所述的异源二聚体MSP-1制剂，其中所述MSP-1蛋白质亚基p83/30包含如SEQ ID NO：1、2或3所示的氨基酸序列和所述MSP-1蛋白质亚基p38/42包含如SEQ ID NO：4或5所示的氨基酸序列。
5.一种用于制备编码来自疟原虫属的MSP-1的具有如SEQID NO：1、2或3所示氨基酸序列的p83/30亚基的修饰的核酸的方法，所述方法包括：
(a)提供mRNA序列，所述mRNA序列编码来自疟原虫属的MSP-1蛋白质的具有如SEQ ID NO：1、2或3所示氨基酸序列的p83/30亚基；
(b)在电脑模拟中分析步骤(a)的mRNA序列起始密码子周围的区域，以测定所述mRNA序列的预测的二级结构。
(c)鉴定在步骤(b)所述的起始密码子周围的区域中的至少一个稳定的发夹样结构；
(d)修饰在步骤(b)所述的起始密码子周围的区域中的mRNA序列，其中至少一个核苷酸置换、插入、缺失和/或倒位使所述发夹样区域不稳定，和其中在电脑模拟中实现至少一个核苷酸置换、插入、缺失和/或倒位，以便编码与所述未修饰的核酸序列编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列；
(e)在与步骤(b)所述的相同条件下，在电脑模拟中分析步骤(d)的区域；
(f)测定是否至少一个核苷酸置换、插入、缺失和/或倒位使得至少一个含有至少一个核糖体结合位点的发夹样区域不稳定；
(g)根据需要任选地重复步骤(d)-(f)直到在与步骤(b)所述的相同条件下的电脑模拟中的分析表明至少一个发夹样区域不稳定；
(h)制备相应的修饰的核酸。
6.一种修饰的核酸，所述修饰的核酸编码疟原虫属MSP-1蛋白质的具有如SEQ ID NO：1、2或3所述氨基酸序列的p83/30亚基，其中所述修饰的核酸通过权利要求5所述的方法得到。
7.根据权利要求6所述的修饰的核酸，其中所述核酸包含如SEQ ID NO：8或9任一所示的核苷酸序列。
8.一种载体，所述载体包含权利要求6或7所述的修饰的核酸。
9.根据权利要求8所述的载体，其中所述载体是多聚核苷酸载体或病毒载体。
10.一种制备来自疟原虫属的MSP-1的p83/30片段的方法，所述方法包括：
(a)提供根据权利要求6或7所述的修饰的核酸和/或根据权利要求8或9所述的载体；
(b)将步骤(a)的修饰的核酸和/或载体引入细胞，优选原核细胞；
(c)在允许表达MSP-1蛋白质的p83/30片段的条件下温育步骤(b)的细胞；和
(d)回收MSP-1蛋白质的p83/30片段。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述回收步骤包括从包涵体溶解所述MSP-1蛋白质的p83/30亚基。
12.一种MSP-1蛋白质的p83/30亚基，所述p83/30亚基通过权利要求10或11的方法得到。
13.一种制备含有疟原虫属MSP-1的组合物的方法，所述方法包括：
(a)在宿主细胞中表达没有异源序列的来自疟原虫属的gp190/MSP-1蛋白质的片段p83/30；
(b)在宿主细胞中表达没有异源序列的来自疟原虫属的gp190/MSP-1蛋白质的片段p38/42；
(c)从所述宿主细胞回收片段p83/30和片段p38/42；和
(d)任选地在组合物中或作为结合制剂结合所述片段p83/30和p38/42。
14.根据权利要求13所述的方法，其中进行所述结合步骤(d)以使所述p83/30片段和所述p38/42片段以相对于彼此大约1∶1的化学计量比混合。
15.根据权利要求1-4任一项所述的MSP-1制剂，权利要求6或7所述的修饰的核酸，权利要求8或9所述的载体，权利要求12所述的MSP-1片段p83/30和/或具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的MSP-1片段的p38/42作为疫苗的用途。
16.根据权利要求1-4任一项所述的MSP-1制剂，权利要求6或7所述的修饰的核酸，权利要求8或9所述的载体，权利要求12所述的MSP-1片段p83/30和/或具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的MSP-1片段的p38/42在制备用于预防和/或治疗疟疾的药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中制备所述药物用于与选自由以下组成的组中的佐剂一起给药：氢氧化铝/MPL、磷酸铝/MPL、ASO2、ISA51、IC31、明矾、ISA720和/或MF59。
18.一种疫苗，所述疫苗包含根据权利要求1-4任一项所述的MSP-1制剂，权利要求6或7所述的修饰的核酸，权利要求8或9所述的载体，权利要求12所述的MSP-1片段p83/30和/或具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的MSP-1片段p38/42。
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