CN102119220B - 使用柠檬残渣的pha(聚羟基链烷酸酯)的制备 - Google Patents
使用柠檬残渣的pha(聚羟基链烷酸酯)的制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种从柠檬残渣来获得生物可降解的聚合物的获得方法，该柠檬残渣形成自橙汁的加工。所获得的聚合物是分类为聚羟基链烷酸酯的聚酯，其中包括聚(3-羟基丁酸酯)和聚(3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基戊酸酯)。该生物可降解的聚合物获自分批培养方法或者补料分批培养方法，具有或者不具有细胞的再循环，并且使用预处理的榨出液和/或柠檬糖蜜作为碳源。此处所述的聚羟基链烷酸酯可以用作不同领域中的合成聚酯的替代品，包括食品，药物，医学，农业和其他领域。
Description
本发明涉及一种从柠檬残渣来获得生物可降解的聚酯的获得方法，该柠檬残渣形成自获取橙汁的加工。此处所述的聚酯是聚羟基链烷酸酯(PHA)，并且其可以用作许多领域中的合成聚酯的替代品，包括食品，药物，医学，农业和其他领域。
背景技术
目前，塑料的用途日益普遍。这种材料代替了常规的原材料例如纸张，纸板，玻璃和金属，这归因于它低的成本和大的耐久性。在它的制造中，使用合成聚合物例如聚丙烯，聚乙烯，聚氯乙烯，聚苯乙烯和其他聚合物。这些易于模塑的聚合物(包括纤维和半透明细丝)具有高的耐化学品性，并且它们是相对弹性的，能够用于一次性产品包装中，以及用于耐用品的生产中。
虽然它具有大的适用性，但是塑料成为了一种严重的环境问题。主要原因是它长的降解时间(在大约200年)，保持在环境中和破坏了有机物的分解方法，另外还导致了河流淤积过程和改变了河床的自然过程。在红树林区域中，它危害到动物和甲壳类的再生循环。
合成聚合物使用的增加已经导致了需要创造可选项，来使得它们所产生的环境问题最小。在这些可选项中，我们可以提到焚化，再循环，合适的存储和近年来用生物可降解的材料来替代合成聚合物。塑料焚化通常被用作一种回收能量的方式，这归因于它高的热值，但是它释放出由燃烧所形成的二氧化碳和其他成分，这危害了环境，增加了大气污染程度。合成聚合物的再循环是最普遍使用的可选项，因为与石油来源的合成聚合物的生产相比，它提供了高达70%的成本降低。在相关的生物可降解材料中，一个重要的选项是制造聚羟基链烷酸酯(PHA)。该聚羟基链烷酸酯具有类似于合成聚合物所具有的这些热塑性，其能够用于许多类型的产品中。
聚羟基链烷酸酯(PHA)是一种广泛使用的聚酯，因为它们是生物可降解的，因此它们具有较低的污染可能。聚羟基链烷酸酯具有非常令人感兴趣的特性，例如热塑性和理化性能非常类似于石化来源的塑料所具有的这些性能(主要与聚丙烯有关)。聚羟基链烷酸酯具有这样的优点，即，是完全生物可降解的和生物相容性的，是由可再生的原材料来生产的，其能够再循环和焚化，而不产生有毒产物，并且因此它们被认为具有比石化塑料高的适用性。
聚羟基链烷酸酯具有取决于它的单体组成的不同的性能。它们是亲脂性物质，积聚在产生PHA的微生物体内，被作为不溶物发现，并且以无气味粉末的形式提取。
聚羟基链烷酸酯的一般结构是通过下面通式的重复来给出的，
当基团R可以从仅仅1个氢原子变化到高达C12时，其可以具有不饱和的芳族基团或者还可以键合到元素例如氟，氯和铬上。
基团R的组成(与n值有关)决定了单体单元的同一性，这个重复单元的类型，数目和生物可降解聚合物的特性。
根据碳链长度和它的单体单元，该聚羟基链烷酸酯被分为三组：
1.由短链的羟基链烷酸(PHAssc)(即，具有3-5个碳原子构成的碳链的这些)的单元所构成的聚羟基链烷酸酯；
2.由中链的羟基链烷酸(PHAMCL)(即，具有6-14个碳原子构成的碳链的这些)的单元所构成的聚羟基链烷酸酯；
3.由长链的羟基链烷酸(PHALCL)(即，具有大于15个碳原子构成的碳链的这些)的单元所构成的聚羟基链烷酸酯；
大部分已知的聚羟基链烷酸酯(PHA)主要是聚(3-羟基丁酸酯)(P(3HB))和聚(3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基戊酸酯)(P(3HB-共聚-3HV))。
聚羟基链烷酸酯被认为是在作为生物可降解塑料和/或生物相容性塑料，用于不同应用领域时具有很大的工业益处。对于不同应用来说，塑料令人期望的性能是高熔点，低硬度，高抗压性，断裂前的抗伸长性和高的抗冲击性。
归因于它们所具有的特性，P(3HB)和P(3HB-共聚-3HV)最初用于制造瓶子，薄膜和纤维，用于生物可降解包装，以及植物保护袋。这些生物聚合物还被用于医学领域，例如人造骨材料和外科缝合线，血管复位和绷带。其他用途包括这样的事实，即，作为生物可降解载体，用于药剂，药物，杀虫剂，除草剂或者肥料和香味剂或者仍然作为包装，薄膜，袋和容器。
聚羟基链烷酸酯可以通过不同的单细胞微生物，以细胞类粒子的形式，作为碳和能量的保留而生产。能够产生和积聚PHA的微生物主要是细菌，其可以在大自然中发现，即，在土壤，海水，排出物等中发现。这样的微生物是属于不同类型的不同分类组的这些，例如甲基营养的微生物，Azobacter，Alcaligenes，Pseudomonas，Burkholderia，以及埃希氏菌属大肠杆菌重组细胞。
最常用的微生物是：Alcaligeneslatus，Pseudomonasoleovorans，Azobactervinelandii，Cupriavidusnecator，Burkholderiasacchari，许多的嗜甲基菌和埃希氏菌属大肠杆菌重组细胞菌株。PHA还可以通过转基因植物来生产。
为了使得该聚合物的提取方法不昂贵，菌株必须能够将至少60%的它的细胞质量积聚在聚合物中。这种方式消除了全部的革兰氏阳性细菌和对于工业生产来说具有低的聚合物合成和积聚能力的这些细菌。
自从Lemoigne在1926年发现了产生聚羟基链烷酸酯的细菌之后，革兰氏阴性细菌Cupriavidusnecator是这个组中最广泛研究的代表，和至今为止最大的PHA生产菌。在用这个名字分类之前，Cupriavidusnecator在以前被称作Hydrogenomonaseutropha，Alcaligeneseutrophus，Ralstoniaeutropha和Wautersiaeutropha。它广泛的用途归因于这样的高能力，即，能够从简单的碳源例如乙酸，果糖和葡萄糖来积聚大量的PHA的能力。
当微生物在失衡的培养条件中生长时产生了PHA。这些条件会与在过量的碳源或者物理限制例如温度和稀释氧浓度的存在下，营养物的受限(例如N，P，O2，K和Mg)有关。
在平衡的生长条件下，C.necator使用底物例如糖类，丙酮酸酯或者乙酸酯，通过乙酰基-CoA酶来开始调节机理。作为第一步骤，[β]-cetotiolase酶导致了两个乙酰基-CoA分子在乙酰并乙酰基-CoA中的缩合。在第二步骤，NADPH依赖性的乙酰并乙酰基-CoA还原酶通过立体选择性反应而导致了R-3-羟基丁酰基-CoA的转化。第三和最后的步骤是通过PHA合酶的催化聚合。通过C.necator的共聚物的生物合成仅仅当这里有单元3HV的前体底物时才发生，其能够在丙酰基-CoA或者3-羟基戊酰基-CoA中转化，作为丙酸，戊酸。
从这些代谢特性来说，聚羟基链烷酸酯的产生发生在两个阶段中：第一阶段是细胞在平衡的培养基中的生长，目标是增加生物量，第二阶段这里存在着基本营养物(非碳源，通常是氮，磷和氧)的限制，进行代谢来产生PHA。为了成比例生产共聚物，上述前体试剂之一的添加必须在第二加工阶段过程中进行。
用于提高生物聚合物的含量和减少生物塑料的总成本的P(3HB)生产策略是必需的。低成本底物的使用会占P(3HB)生产方法的40%的经济性。一个令人感兴趣的选择是使用农工业残渣。在低成本底物中，来源于食品加工植物的残渣例如淀粉，甘蔗和乳清是较高关注的这些。
关于PHA的工业生产，在几个文献中能够找到，通过使用农工业残渣形式的可再生碳源来获得它。所述残渣包括苹果渣，乳清，乳清混合物和转化糖，马铃薯加工工业中的残渣(水解淀粉)和其他。使用这些低成本残渣导致了这些生物聚合物最终价格的降低。
文献BRPI0501139-6(2006年11月28日公开)描述了由植物油，甘油，残留的单-，二-或者三甘油酸酯(来源于获自植物油的生物柴油的生产)来生产PHA的方法。
文献BRPI0504054-0(2007年5月22日公开)描述由植物油例如诸如大豆油来生产短链PHA，特别是聚(3-羟基丁酸酯)的方法。在所述方法中，植物油的浓度可以不超过油酸的0.3g.L-1，这归因于这样的事实，即，它造成了微生物生长的抑制。这种限制使得该方法非常受限。
文献US2006/0088921涉及到由有机垃圾来生产PHA的方法。该方法包括用引起酸化的微生物来预处理该有机残渣，随后通过培养方法，通过特定的微生物(包括R.eutropha，P.oleovorans及其它)来生产PHA。虽然在理论上可行，但是从这种有机物来生产PHA受限于所用底物的多样性和复杂性，这使得该方法不可行。
文献BRPI0207356-0(2004年9月8日公开)描述了由甘蔗渣来生产聚羟基丁酸酯和它的共聚物聚羟基丁酸酯-共聚-羟基戊酸酯的方法。虽然它是一种能够大量提供的原材料，但是甘蔗渣必须首先水解，来获得适于生产PHA的培养基。
标题为“VISINAFERM2007;PosterBAM0526”描述了由果胶和柠檬酸或者含有这些物质的粒化的农工业残渣来生产聚(3-羟基丁酸酯)(P(3HB)和聚(3-羟基十二烷酸酯)(P(3HDd)的方法。在所述方法中，所提取的聚合物的产率低于2％，这使得该方法非常受限制。
标题为“J.NaturalGasChemistry;2008年3月第103-109页”涉及高分子量聚-3-羟基丁酸酯的合成，使用甲烷和甲醇作为原料。将柠檬酸作为抑制剂加入，提高PHB的积聚。虽然在PHB生产中使用柠檬酸作为辅助剂，但是该文献没有报道使用农工业废料作为低成本残渣来源。
木质纤维素生物量的预处理的组成为除了影响所述方法前后阶段之外，在直接成本方面最相关的操作阶段之一。该预处理会产生抑制微生物的产物和大量悬浮固体，这使得该方法效率变低和/或具有低的生产率。
标题为“Productionofpoly(3-hydroxybutyrate)frominexpensivesubstrates”的文献(EnzymeandMicrobialTechnology第27卷，(10)，2000，第774-777页)描述了由淀粉和乳清蛋白来生产PHA(聚(3-羟基丁酸酯)P(3HB))，两种残渣是由食品工业加工形成的。该淀粉首先在两步方法(包括液化和糖化)中水解。所制备的底物使用A.chroococcum和埃希氏菌属大肠杆菌重组细胞进行生物技术方法。该论文进一步强调了使用所述原材料与降低P(3HB)的生产成本之间的关系。
虽然理论上可以由几种类型的农工业残渣来生产PHA，但是一些因素例如可发酵糖的可用性，抑制剂的存在和木质纤维素材料的处理会使得该方法不可行。
使用此处所述的这些残渣经常需要(作为一个预先的要求)对所用的原材料进行预先处理，包括长链糖的水解，目的是能够通过微生物来同化所述碳源，产生聚羟基链烷酸酯。这种水解方法通常包括长时间的制备，酶或者酸的使用，和经常产生培养的抑制剂成分，这导致了相关的PHA另外的生产加工成本。
此处所述的本发明通过使用一种从橙汁加工残渣来获得PHA的获得方法来解决了前述问题，该方法包含原材料简单的预处理，并且没有水解。本发明使得农工业残渣的使用变得可行，直到较少使用时为止，提高它的附加值，和因此使得该方法有利可图，此外还有生态学上的益处。
发明内容：
本发明涉及一种由柠檬残渣来获得聚羟基链烷酸酯(PHA)的方法，该柠檬残渣是由用于获得柑橘汁的加工所得到的。该相关的方法包含下面的步骤：
a)获得榨出液和/或柠檬糖蜜；
b)物理-化学处理步骤a所获得的材料；
c)制备用于生产PHA的培养基；
d)进行培养方法。
本发明还涉及柠檬残渣的用途，其用于根据本发明所述的方法来生产PHA。本发明还涉及通过本发明所述方法获得的PHA或者含有该PHA的聚合物组合物。
本发明还涉及一种固体人造制品，其包含获自本发明所述的生产PHA方法的PHA，以及涉及一种含有聚合物混合物的固体人造制品，该混合物包含根据本发明所述的生产PHA的方法所获得的PHA。
具体实施方式
本发明提出了一种简单的生产PHA的方法，其由丰富的农工业残渣来生产，并且易于操控。该相关的方法使用柑橘加工残渣(命名为柠檬残渣)，这显著降低了这种残渣对于环境的影响，以及增加了它的附加值。该橙汁提取物产生了作为残渣的大约52%的新鲜柠檬果肉，具有73%-83%的湿度。该柠檬果肉的组成为果皮(60%-65%)，所述的果肉(果渣，30%-35%)和种子(大约10%)。随着橙汁生产规模的增加和大体积残渣的产生，出现了环境污染这样首要的问题，这刺激了对于所产生的残渣的使用方案的开发。一种所开发的用于部分使用所产生的液体残渣(该液体残渣由蛋白质，香精油，果胶，糖，有机酸和盐组成)的选项是乙醇发酵来生产乙醇。虽然乙醇的生产使得由来自所述提取方法的残渣所导致的环境冲击变得最小，但是将更高的价值聚集到其中将代表了一种在该生产性情形中相当大的竞争性进步。
本发明提出了一种由柠檬残渣来获得PHA的方法，其包含下面的步骤：
a)获得榨出液和/或柠檬糖蜜；
b)物理-化学处理步骤a所获得的材料；
c)制备用于生产PHA的培养基；
d)进行培养方法。
本发明所述的柠檬残渣对应于柑橘压榨取汁所形成的果皮，果肉和种子。本发明的榨出液和/或柠檬糖蜜获自柠檬残渣。在获得之后，该柠檬残渣进行研磨方法，用氧化钙(CaO)处理和压榨，作为结果，获得了该榨出液。除了CaO之外，还可以使用其它试剂，该试剂具有水解果胶来释放水和促进压榨方法的性能。
所获得的榨出液还可以经历浓缩方法，随后是冷却方法，因此获得了柠檬糖蜜。优选的，该榨出液的浓缩通过蒸发来进行。前述的柠檬残渣，榨出液和柠檬糖蜜的获得步骤可以表示在图1中。
将PHA获得方法的步骤a中所获得的榨出液和/或柠檬糖蜜用作本发明的PHA生产方法中的微生物的培养基。对于将该榨出液和/或柠檬糖蜜用作培养基来说，初始时必需的是对这些原材料进行预先的物理-化学处理。榨出液和/或柠檬糖蜜所经历的物理-化学处理包含对它进行离心分离，随后是材料的杀菌或者巴氏杀菌步骤。在该杀菌或者巴氏杀菌之后，将该无微生物的材料进行滗析方法，随后除去上清液材料。该上清液材料然后用于制备培养基。任选的，在离心分离之前，榨出液和/或柠檬糖蜜可以经历pH校正。优选的，选择pH7.0用于校正。在本发明的一种优选的实施方案中，该榨出液和/或柠檬糖蜜的离心分离是在5℃的温度进行的，杀菌在121℃进行15分钟。在本发明另外一种优选的实施方案中，榨出液和/或柠檬糖蜜的离心分离在5℃的温度进行，巴氏杀菌在113℃进行2分钟。在本发明的另外一种优选的实施方案中，离心分离是无菌进行的，随后是无菌过滤。该无菌过滤的材料进行滗析方法，随后除去该上清液材料。该上清液材料然后用于制备培养基。在本发明另外一种优选的实施方案中，将该榨出液和/或柠檬糖蜜的初始pH校正到7.0，将所形成的材料在3500rpm离心分离5min。离心分离后，将该上清液在100℃加热，然后进行冷滗析，并且除去上清液。该上清液材料然后用于制备培养基。在本发明一种更优选的实施方案中，该榨出液和/或柠檬糖蜜在5℃进行离心分离，和在113℃巴氏杀菌2min。在巴氏杀菌后，榨出液和/或柠檬糖蜜然后进行冷滗析，该上清液重新在113℃进行巴氏杀菌方法2分钟。所形成的材料然后用于制备培养基。在本发明的其它优选的实施方案中，该榨出液和/或柠檬糖蜜的物理-化学处理的组成是将它在微滤或者超滤的隔膜中进行过滤，或者通过浮选法来进行悬浮固体的分离。
将该进行了物理化学处理的榨出液和/或柠檬糖蜜用于制备本发明PHA生产方法的培养基。培养基的制备最初如下来进行：向榨出液和/或柠檬糖蜜物理-化学处理所形成的上清液材料中加入培养方法的基本营养物，其选自氮，磷，硫，镁，钾，氧，微量营养物或者它们的混合物。优选的，在本发明培养基制备过程中补充的微量营养物选自钼，锰，钴，锌，镍，铜和硼。
可选择的，在加入营养物之后，培养基可以进行杀菌工艺，来保证无菌/进行该培养方法。在本发明一种优选的实施方案中，带有营养物的培养基的杀菌方法是在121℃进行15分钟。
榨出液和/或柠檬糖蜜的物理-化学处理阶段，以及前述的优选的实施方案可以表示在图2中。
用于本发明所述的生物技术方法的培养基必须包含10-60g.L-1初始量的糖还原剂。为了进行该生物技术方法，除了埃希氏菌属大肠杆菌重组细胞之外，还可以使用属于不同分类组的微生物：Azotobacter，甲基营养的微生物，Alcaligenes，Pseudomonas，Burkholderia。优选的，本发明所用的微生物选自Alcaligeneslatus，Pseudomonasoleovorans，Azobactervinelandii，Bacilluscereus，Cupriavidusnecator，Burkholderiasacchari，嗜甲基菌和埃希氏菌属大肠杆菌重组细胞。甚至更优选的，本发明的生物技术方法是通过使用Cupriavidusnecator来进行的。为了该生物技术方法的成功，在微生物生产和聚合物生产二者中，两种预接种体是必需的，来进行反应器方法。第一预接种体必须优选是如下来进行的：通过将微生物Cupriavidusnecator在含有营养液的培养基中进行繁殖，该营养液包含5g.L-1胨，3g.L-1肉类提取物。将这个预接种体在旋转摇动器中保持到适于所述方法的温度，旋转和时间。优选的，将该第一预接种体在150rpm的搅拌下在30℃保持24h。这个时间之后，将用于培养方法中10%的最终体积从第一预接种体转移到第二预接种体。该第二预接种体的特征在于含有天然盐和微生物生长的基本营养物。将这个预接种体保持在适于所述方法的特定的温度，搅拌和时间条件下。优选的，将该第二预接种体在30℃，150rpm保持24h。在这个时间之后，将足以进行该培养方法的预接种体体积加入到含有根据前述所述制备的培养基的反应器中。优选的，加入到该反应器的第二预接种体的体积大体上对应于用于培养方法的培养基体积的10%。
生产本发明的PHA的生物技术方法可以通过分批培养方法或者补料分批培养方法来进行。该方法可以具有或者不具有反应器的细胞再循环来进行，目的是获得高的细胞密度。该本发明的方法包含细胞生长阶段，随后是诱导来生产PHA的阶段。该培养方法是在25℃-40℃的温度进行的。在该培养方法过程中，pH可以在7.2-5.4之间变化，并且将培养基以200-1000rpm的速度搅拌。在该培养方法进行的过程中，稀释的氧的含量可以在用大气空气饱和的培养基的培养度的10%-100%之间变化，该条件不比10%差。
生产的诱导阶段是通过强制施加营养物(氮，磷，硫，镁，钾或者氧)的限制来进行的。这种限制发生在进行培养方法的过程中，并且必须优选在获得15g.L-1-60g.L-1(干重)的最小生物量浓度之后发生。培养基中所限制的营养物初始浓度的确定必须考虑细胞中营养物的转化因子。聚合物回收(PHA)可以通过适于本发明培养方法的不同的方法来进行。这些方法包括分离含有该聚合物的细胞材料，随后提取方法。
本发明还涉及柠檬残渣的用途，其用于使用前述的PHA获得方法来生产PHA。本发明另外一个目标是PHA本身，其获自本发明所述的方法。本发明还涉及一种聚合物组合物，其包含获自本发明所述方法的PHA。
本发明此后涉及一种固体人造制品，其包含获自本发明所述的PHA生产方法的PHA，以及一种含有聚合物混合物的固体人造制品，该混合物包含获自本发明所述的PHA生产方法的PHA。
下面描述与本发明有关的一些可能的实施方案。此处所述的实施例必须解释为本发明可能的实施方案，但是并不必用于限制它的保护范围。
实施例I
将第一预接种体在保持于旋转摇动器中的营养液中培养24小时。在这个时间之后，将等于用于培养方法中的10%的最终体积的体积从第一预接种体转移到第二预接种体，其是由对于所用微生物的细胞生长来说足够的天然盐介质和营养物构成。将该第二预接种体在旋转摇动器中在30℃和150rpm保持54h。在这个时间之后，将等于培养方法所用的10%的最终体积的体积从该第二预接种体转移到5L反应器中，该反应器含有包含榨出液和/或柠檬糖蜜的培养基。该榨出液和/或柠檬糖蜜包含大约60-80g.L-1的ART(总还原剂糖)，由于这个原因，它必须在蒸馏水中稀释，来获得C.necator生长限制的10-60g.L-1的还原剂糖浓度，加入用于生长的天然盐和营养物。使用预处理5(图2)来减少榨出液和/或柠檬糖蜜中存在的悬浮固体。该培养方法是在下面的条件下进行28小时的培养：总还原剂糖(ART)的初始浓度是10-40g.L-1，温度是25-40℃，pH是5.4–7.0，搅拌转速200-900rpm，氧浓度是大气空气饱和度的10-100%。所获得的底物在细胞中的转化因子(Yx/s)是大约0.54g.g-1，所获得的生长比速度是0.44h-1。当氮发生耗尽时，P(3HB)的产生从第十(第10)小时开始增加。总生物量是17.1g.L-1。在培养方法结束时，P(3HB)在细胞中的百分比是81%，并且在18小时的生产中，P(3HB)的平均生产率是0.49g.L-1.h-1。聚合物的回收是如下来进行的：在培养方法结束时，通过离心分离从液体中分离所述细胞。提取是如下来进行的：以1：2比例的细胞物质和溶剂体积，例如氯仿(“Optimizationofmicrobialpoly(3-hydroxybutyrate)recoveryusingdispersionsofsodiumhypochloritesolutionandchloroform”，BiotechnologyandBioengineering，第44卷第256-261页，1994)，在从20℃高到60℃的温度，使用磁搅拌在摇动器中搅拌或者不搅拌进行。回收百分率范围是80-98%。
实施例II
对柑橘渣的榨出液用于生产作为橙汁工业副产物的P(3HB)的用途进行试验，不使用热处理。将第一预接种体在保持于旋转摇动器的营养液中在30℃和150rpm培养24小时。在它活化之后，将等于用于培养方法中的10%的最终体积的体积从第一预接种体转移到第二预接种体，其是由对于所用微生物的细胞生长来说足够的天然盐介质和营养物构成。将该第二预接种体在旋转摇动器中在30℃和150rpm保持24h。在这个时间之后，将等于培养方法所用的10%的最终体积的体积从该第二预接种体转移到5L反应器中，该反应器包含具有大约10-60g.L-1的还原剂糖的榨出液。向该培养基中进一步加入用于生长的天然盐和营养物。
该培养方法进行32小时，培养方法温度保持在30℃，pH保持在5.4-7.0，搅拌速度是400-900rpm，氧浓度在培养方法过程中保持在用大气空气饱和度值的10-100%。在使用榨出液培养基时，生长比速度是大约0.24h-1。在该培养方法中氮耗尽发生在第12小时。生产阶段是大约20小时，并且细胞的P(3HB)I的最终浓度等于6.9g.L-1，平均生产率是0.21g.L-1.h-1，在生产阶段中的生产率是0.27g.L-1.h-1。细胞中的聚合物百分比是53%。聚合物的回收是如下来进行的：在培养方法结束时，通过离心分离从液体中分离所述细胞。提取是如下来进行的：以1：2高到1：20比例的细胞物质和溶剂体积，例如氯仿(“Optimizationofmicrobialpoly(3-hydroxybutyrate)recoveryusingdispersionsofsodiumhypochloritesolutionandchloroform”，BiotechnologyandBioengineering，第44卷第256-261页，1994)进行。提取时间是1-4小时，温度为从20℃高到60℃的温度，使用磁搅拌在摇动器中搅拌或者不搅拌进行。回收百分率范围是80-98%。
实施例III
将所述营养液用作在30℃和150rpm的旋转摇动器中的第一预接种体进行24小时。将等于用于培养方法中的10%的最终体积的体积从第一预接种体转移到第二预接种体，其是由对于所用微生物的细胞生长来说足够的天然盐介质和营养物构成。将该第二预接种体在旋转摇动器中在30℃和150rpm保持24h。在这个时间之后，将细胞转移到5L反应器中，该反应器包含用榨出液和/或柠檬糖蜜(大约60-80g.L-1的ART)，其用蒸馏水稀释来获得浓度为10-60g.L-1的还原剂糖，并且加入有用于生长的天然盐和营养物。使用的温度是35℃。pH保持在7.0，搅拌速度是400-900rpm，氧浓度保持在高于大气空气饱和度的20%，进行26小时的培养方法。要注意的是生产阶段是18小时，P(3HB)是9.76g.L-1，总生物量是18.16g.L-1。底物在细胞中的转化因子(Yx/s)是0.76g.g-1，细胞在产物中的转化因子(Yp/s)是0.41g.g-1，产生了0.46g.L-1.h-1的平均生产率。该试验最终观察的ART浓度值低于5g.L-1。在第八(第8)小时当氮耗尽时，P(3HB)的产生增加。在培养方法结束时P(3HB)在细胞中的百分率是54%。聚合物的回收是如下来进行的：在培养方法结束时，通过离心分离从液体中分离所述细胞。提取是如下来进行的：以1：2高到1：20比例的细胞物质和溶剂体积，例如氯仿(“Optimizationofmicrobialpoly(3-hydroxybutyrate)recoveryusingdispersionsofsodiumhypochloritesolutionandchloroform”，BiotechnologyandBioengineering，第44卷第256-261页，1994)进行。提取时间是1-4小时，温度为从20℃高到60℃的温度，使用磁搅拌在摇动器中搅拌或者不搅拌进行。回收百分率范围是80-98%。
Claims (10)
1.一种从柠檬残渣中获得PHA的获得方法，其中它包含下面的步骤：
a)通过对柠檬残渣进行研磨方法、用氧化钙处理和压榨而获得榨出液和/或柠檬糖蜜；
b)物理-化学处理步骤a所获得的材料；
其中在步骤b中，榨出液和/或柠檬糖蜜的物理-化学处理是通过下面的子步骤来进行的：
b1)离心分离该榨出液和/或柠檬糖蜜；
b2)杀菌该材料；
b3)滗析该已杀菌的材料，随后除去上清液材料；
c)如下制备包含初始含量为10-60g.L-1的还原剂糖的用于生产PHA的培养基：
将选自氮、磷、硫、镁、钾、氧、微量营养物或者它们的混合物的营养物加入到步骤b所获得的上清液中，其中该微量营养物选自钼、锰、钴、锌、镍、铜、硼或者它们的混合物，其中在向培养基中加入营养物之后，进行所述材料的杀菌步骤；
在150rpm的搅拌下在30℃保持24小时通过使用选自以下的微生物制备第一预接种体：Alcaligeneslatus、Pseudomonasoleovorans、Azobactervinelandii、Bacilluscereus、Cupriavidusnecator、Burkholderiasachhari、嗜甲基菌和埃希氏菌属大肠杆菌重组细胞；
在150rpm的搅拌下在30℃保持24小时用10%的最终体积的第一预接种体制备第二预接种体；
d)进行培养方法；
其中在步骤d中，该培养方法在下面的步骤中进行：
d1)细胞生长步骤；
d2)PHA的生产诱导步骤；
并且在步骤d中，该培养方法是在25℃-40℃的温度进行的，pH可以在7.2-5.4之间变化，将培养基以200-1000rpm的速度搅拌，以及稀释的氧浓度必须是培养基的大气空气饱和度的10%-100%；
在步骤d中，通过分批培养方法来进行该培养方法，其中该分批培养方法是用细胞再循环来进行的。
2.根据权利要求1的PHA的获得方法，其中该柠檬残渣对应于柑橘类压榨取汁所形成的果皮、果肉和种子。
3.根据权利要求1-2中任何一个的PHA的获得方法，其中在步骤a中，榨出液从柠檬残渣的使用氧化钙或者具有水解果胶性能的试剂的研磨/处理和压榨而获得。
4.根据权利要求1-2中任何一个的PHA的获得方法，其中在步骤a中，柠檬糖蜜是通过浓缩榨出液，随后冷却来获得的。
5.根据权利要求4的PHA的获得方法，其中榨出液的浓缩是通过蒸发来进行的。
6.根据权利要求1的PHA的获得方法，其中在步骤b1之前，进行榨出液和/或柠檬糖蜜的pH校正步骤。
7.根据权利要求1-2和5-6中任何一个的PHA的获得方法，其中在步骤d2中，PHA的生产诱导是通过限制非碳源营养物来开始的。
8.根据权利要求1-2和5-6中任何一个的PHA的获得方法，其中在诱导步骤开始时，最小生物量的浓度为15g.L-1-60g.L-1。
9.根据权利要求7的PHA的获得方法，其中该非碳源营养物选自氮、磷、硫、镁、钾或者氧。
10.将柠檬残渣用于生产PHA的用途，其中它是通过权利要求1-9中任何一个所述的方法来进行的。
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