BRPI0801845A2 - processo de obtenção de pha a partir de resìduo cìtrico, pha obtido a partir de resìduo cìtrico, composição polimérica contendo pha, artefato sólido contendo pha, artefato sólido contendo composição polimérica compreendendo pha, uso de resìduo cìtrico para a obtenção de pha - Google Patents

Abstract

PROCESSO DE OBTENçãO DE PHA A PARTIR DE RESìDUO CìTRICO, PHA OBTIDO A PARTIR DE RESìDUO CìTRICO, COMPOSIçãO POLIMéRICA CONTENDO PHA, ARTEFATO SóLIDO CONTENDO PHA, ARTEFATO SóLIDO CONTENDO COMPOSIçãO POLIMéRICA COMPREENDENDO PHA, USO DE RESìDUO CìTRICO PARA A OBTENçãO DE PHA. A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de polímeros biodegradáveis a partir de resíduo cítrico proveniente do processamento de suco de laranja. Os polímeros obtidos são poliésteres classificados como polihidroxialcanoatos incluindo, entre estes, o poli(3-hidroxibutirato) e poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato). O pol imero biodegradável é obtido a partir de cultivo do tipo batelada ou batelada alimentada com ou sem recirculação de células, utilizando como fonte de carbono o licor de prensagem e/ou melaço cítrico pré-tratados. Os poíihidroxialcanoatos, aqui descritos, podem ser utilizados como substitutos dos polímeros sintéticos em diversas áreas incluindo a área de alimentos, farmacêutica, médica, agrícola e outras.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSODE OBTENÇÃO DE PHA A PARTIR DE RESÍDUO CÍTRICO, PHA OBTIDOA PARTIR DE RESÍDUO CÍTRICO, COMPOSIÇÃO POLIMÉRICA CON-TENDO PHA, ARTEFATO SÓLIDO CONTENDO PHA, ARTEFATO SÓLI- DO CONTENDO COMPOSIÇÃO POLIMÉRICA COMPREENDENDO PHA,USO DE RESÍDUO CÍTRICO PARA A OBTENÇÃO DE PHA".

A presente invenção refere-se a um processo de obtenção depoliésteres biodegradáveis a partir de resíduo cítrico resultante do proces-samento de laranjas para a obtenção de suco. Os poliésteres aqui descritos são os polihidroxialcanoatos (PHA) e podem ser utilizados como substitutosdos poliésteres sintéticos em diversas áreas incluindo a área de alimentos,farmacêutica, médica, agrícola e outras.Descrição do Estado da Técnica

Atualmente, o uso de material plástico é cada vez mais freqüen- te. Este material substitui matérias-primas convencionais como papel, pape-lão, vidros e metais devido a seu baixo custo e grande durabilidade. Em suafabricação, são utilizados polímeros sintéticos como polipropileno, polietile-no, policloreto de vinila, poliestireno e outros. Estes polímeros são facilmentemoldados (inclusive em fibras e finos fios transparentes), possuem alta resis- tência química e são relativamente elásticos podendo ser utilizados na fabri-cação de embalagens de produtos de descarte rápido como também na pro-dução de bens duráveis.

Apesar de sua grande aplicabilidade, os plásticos se tornaramum sério problema ambiental. O principal motivo é o seu longo tempo de de- gradação, em torno de 200 anos, permanecendo no meio ambiente e preju-dicando o processo de decomposição da matéria orgânica, além de contribu-ir para o processo de assoreamento de rios e alteração do curso natural doleito fluvial. Em regiões de manguezal, prejudica o ciclo reprodutivo dos ani-mais e crustáceos.

O aumento do uso de polímeros sintéticos resultou na necessi-

dade da criação de alternativas para minimizar os problemas ambientais ge-rados pelos mesmos. Dentre essas alternativas, podem-se citar a incinera-

PI0801845-6ção, reciclagem, acondicionamento apropriado e, recentemente, a substitui-ção dos polímeros sintéticos por materiais biodegradáveis. A incineração dosplásticos geralmente é usada como forma de recuperação de energia devidoao alto poder calorífico, porém, a liberação de gás carbônico e outros com- ponentes resultantes da queima prejudicam o meio ambiente, aumentando onível de poluição atmosférico. A reciclagem de polímeros sintéticos é a alter-nativa mais utilizada porque proporciona uma redução de custos de até 70%quando comparada à produção do polímero sintético derivado do petróleo.Com relação aos materiais biodegradáveis, uma importante opção é a fabri- cação de polihidroxialcanoatos (PHA). Os polihjdroxialcanoatos possuempropriedades termoplásticas semelhantes àquelas apresentadas pelos polí-meros sintéticos, sendo passíveis de aplicação em vários tipos de produtos.

Polihidroxialcanoatos (PHA) são poliésteres de uso amplo que,por serem biodegradáveis, possuem um menor potencial poluidor. Os polihi- droxialcanoatos apresentam características muito interessantes como pro-priedades termoplásticas e físico-químicas muito similares àquelas apresen-tadas pelos plásticos de origem petroquímica, principalmente em relação aopolipropileno. Os polihidroxialcanoatos apresentam vantagens de seremcompletamente biodegradáveis e biocompatíveis, serem produzidos a partir de matérias-primas renováveis, poderem ser reciclados e incinerados sem ageração de produtos tóxicos e, portanto, são considerados de grande aplica-bilidade em relação aos plásticos petroquímicos.

Os polihidroxialcanoatos compartilham diferentes propriedadesde acordo com sua composição monomérica. Eles são substâncias lipofílicas acumuladas dentro de microorganismos produtores de PHA, encontrando-secomo inclusões insolúveis e sendo extraídos sob a forma de um pó inodoro.

A estrutura geral dos polihidroxialcanoatos é dada pela repeti-ção da seguinte fórmula geral,

<formula>formula see original document page 3</formula>com o radical R podendo variar de um único átomo de hidrogênio até C12,podendo conter instaurações, grupos aromáticos ou ainda ligações a ele-mentos como flúor, cloro e cromo.

A composição do radical R, associado ao valor de n, determina a identidade da unidade monomérica, o tipo, o número de repetições destaunidade e as propriedades do polímero biodegradável.

De acordo com o comprimento das cadeias carbônicas e de su-as unidades monoméricas, os polihidroxialcanoatos são classificados emtrês grupos:

1. Polihidroxialcanoatos constituídos por unidades de ácidos

hidroxialcanóicos de cadeia curta (PHAssc). ou seja, aqueles que possuemcadeia carbônica constituída de 3 a 5 átomos de C;

2. Polihidroxialcanoatos constituídos por unidades de ácidoshidroxialcanóicos de cadeia média (PHAmcl), ou seja, aqueles que possuem

cadeia carbônica constituída de 6 a 14 átomos de C;

3. Polihidroxialcanoatos constituídos por unidades de ácidoshidroxialcanóicos de cadeia longa (PHAlcl). ou seja, aqueles que possuemcadeia carbônica constituída de mais de 15 átomos de C.

Os polihidroxialcanoatos (PHA) mais conhecidos são, principal- mente, o poli(3-hidroxibutirato) (P(3HB)) e o poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (P(3HB-co-3HV)).

Os polihidroxialcanoatos são considerados de grande interesseindustrial como plásticos biodegradáveis e/ou biocompatíveis para diversasáreas de aplicação. As propriedades desejáveis às diferentes aplicações de um material plástico são: ponto de fusão elevado, baixa rigidez, alta resis-tência à pressão, resistência ao alongamento antes da ruptura e forte resis-tência ao impacto.

Devido às características que possuem, o P(3HB) e o P(3HB-co-3HV) foram inicialmente utilizados na fabricação de garrafas, filmes e fibras para embalagens biodegradáveis, bem como sacos de proteção para plan-tas. Estes biopolímeros também possuem aplicação na área médica, comomateriais osteossintéticos e suturas cirúrgicas, reposição de vasos sangüí-neos e curativos. Outras aplicações incluem o fato de serem utilizados comoveículo biodegradável para a aplicação de drogas, medicamentos, insetici-das, herbicidas ou fertilizantes e fragrâncias ou ainda como embalagens,filmes, bolsas e recipientes. Os polihidroxialcanoatos podem ser produzidos por diversos mi-

croorganismos unicelulares na forma de grânulos intracelulares como reser-va de carbono e energia. Os microorganismos capazes de produzir e acumu-lar PHA são principalmente bactérias que podem ser encontradas na nature-za, isto é, no solo, água do mar, efluentes, etc. Tais microorganismos são

pertencentes a diferentes grupos taxonômicos de diferentes gêneros como:microorganismos metilotróficos, Azobacter, Alcaligenes, Pseudomonas, Bur-kholderia além de Escherichia coli recombinante.

Os microorganismos mais utilizados são: Alcaligenes latus,Pseudomonas oleovorans, Azobacter vinelandii, Cupriavidus necator, Bur-

kholderia sacchari, várias cepas de metilótrofos e Escherichia coli recombi-nante. Os PHA também podem vir a ser produzidos por plantas transgêni-cas.

Para que o processo de extração do polímero não seja dispen-dioso, é necessário que a cepa seja capaz de acumular pelo menos 60% de

sua massa celular em polímero. Dessa forma, são eliminadas todas as bac-térias Gram-positivas e aquelas com baixa capacidade de síntese e acúmulode polímero para a produção industrial.

Desde a descoberta de bactérias produtoras de polihidroxialca-noatos por Lemoigne em 1926, a bactéria Gram-negativa Cupriavidus neca-

toré a representante mais bem estudada desse grupo, e a maior produtorade PHA até hoje. Antes de ser classificada com esse nome, Cupriavidus ne-cator foi descrita anteriormente como Hydrogenomonas eutropha, Alcalige-nes eutrophus, Ralstonia eutropha e Wautersia eutropha. Seu emprego di-fundido deve-se a grande habilidade de acumular grandes quantidades de

PHA a partir de fontes simples de carbono, como ácido acético, frutose eglicose.

A produção de PHA ocorre quando o microorganismo cresce emcondições desbalanceadas de cultivo. Estas condições podem estar associ-adas à limitação de nutrientes (como N, P, 02, K e Mg) na presença em ex-cesso da fonte de carbono ou limitações físicas, como temperatura e con-centração de oxigênio dissolvido. Em condições de crescimento balanceado, C. necator utiliza

substratos como carboidratos, piruvato ou acetato, iniciando o mecanismode regulação pela enzima acetil-CoA. Como primeiro passo, a enzima B-cetotiolase leva à condensação de duas moléculas de acetil-CoA em aceto-acetil-CoA. No segundo passo, uma acetoacetil-CoA redutase NADPH-

dependente leva a conversão a R-3-hidroxibutiril-CoA, por uma reação este-reosseletiva. O terceiro e último passo é a polimerização catalisada pelaPHA sintase. A biossíntese do copolímero por C. necator somente ocorrequando houver substratos precursores de unidade 3HV, que possam serconvertidos em propionil-CoA ou 3-hidroxivaleril-CoA, como ácido propiôni-

co, ácido valérico ou ácido pentanóico.

A partir destas características metabólicas, a produção de poli-hidroxialcanoatos ocorre em duas fases: uma primeira fase de crescimentocelular em um meio de cultivo balanceado visando o aumento da biomassa euma segunda fase, onde ocorre a limitação de um nutriente essencial não

fonte de carbono, em geral nitrogênio, fósforo e oxigênio direcionando o me-tabolismo para a produção de PHA. Para proporcionar a produção do copo-límero, deve ser realizada, durante a segunda fase do processo, a adição deum dos agentes precursores citados anteriormente.

Estratégias de produção de P(3HB) para elevar o conteúdo de

biopolímero e diminuir o custo total dos bioplásticos são necessárias. A utili-zação de substratos de baixo custo pode representar 40% de economia noprocesso de produção de P(3HB). Uma alternativa interessante é a utilizaçãode resíduos agroindustriais. Entre os substratos de baixo custo, os resíduosprovenientes de plantas de processamento de alimentos como o amido, ca-

na-de-açúcar e soro de leite são os de maior destaque.

No que se refere à produção industrial de PHA, diversos docu-mentos são encontrados abrangendo a sua obtenção através da utilizaçãode fontes de carbono renováveis na forma de resíduos agroindustriais. Osresíduos descritos incluem bagaço de maçã, soro de leite, mistura de sorode leite e açúcar invertido, resíduo da indústria processadora de batatas (a-mido hidrolisado) e outros. A utilização destes resíduos de baixo custo con- tribui para a redução do preço final destes biopolímeros.

O documento PI0501139-6 descreve o processo de produção dePHA a partir de óleos vegetais, glicerol, mono-, di- ou triglicerídeos residuais,provenientes da produção de biodiesel obtido a partir de óleos vegetais.

O documento PI0504054-0 descreve o processo de produção de

PHA de cadeia curta e, em especial do poli(3-hidroxibutirato) a partir de óleovegetal como, por exemplo, óleo de soja. No processo descrito, a concentra-ção de óleos vegetais não pode ser superior a 0,3 g.L"1 de ácido oléico pelofato de causar inibição do crescimento do microorganismo. Essa limitaçãotorna este processo bastante restrito.

O documento US 2006/0088921 se refere a um método de pro-

dução de PHA a partir de lixo orgânico. O método inclui um prè-tratamentodos resíduos orgânicos com microorganismos acidogênicos, seguido de cul-tivo para produção de PHA por microorganismos específicos incluindo R.eutropha, P. oleovorans e outros. Embora teoricamente viável, a produção de PHA a partir desta matéria orgânica é dificultada pela diversidade e com-plexidade do substrato utilizado tornando o processo não viável.

O documento PI0207356-0 descreve o processo de produção depolihidroxibutirato e seu copolímero polihidroxibutirato-cohidroxivalerato apartir de bagaço de cana-de-açúcar. Embora seja uma matéria-prima que apresenta grande oferta, o bagaço de cana-de-açúcar deve ser primeiramen-te hidrolisado para a obtenção de um meio de cultivo adequado para a pro-dução e PHA.

O pré-tratamento de biomassa lignocelulósica consiste em umadas etapas operacionais mais relevantes em termos de custo direto além de influenciar as etapas anteriores e subseqüentes do processo. O pré-tratamento pode gerar produtos inibidores ao microorganismo e uma grandequantidade de sólidos suspensos, tornando o processo ineficiente e/ou apre-sentando baixa produtividade.

O documento intitulado "Production of poly(3-hydroxybutyrate)from inexpensive substrates" (Enzyme and Microbial Technology Vol. 27,(10), 2000, Páginas 774-777) descreve a produção de um PHA, o Poli(3- hidroxibutirato) P(3HB) a partir de amido e soro protéico de leite, ambos re-síduos resultantes de processos industriais de alimentos. O amido é previa-mente hidrolisado em um processo de duas etapas incluindo liquefação esacarificação. O substrato preparado é submetido a processo biotecnológicoutilizando A. chroococcum e E. coli recombinante. O artigo ainda ressalta a relevância do uso das duas matérias-primas como forma de diminuir o custode produção de P(3HB).

Embora, teoricamente seja possível produzir PHA a partir de di-versos tipos de resíduos agroindustriais, alguns fatores como disponibilidadede açúcar fermentescível, presença de inibidores e tratamento do material lignocelulósico, podem tornar o processo não viável.

A utilização de resíduos, como aqueles aqui descritos exige,muitas vezes, como pré-requisito, tratamento prévio da matéria-prima utili-zada, incluindo a hidrolise dos açúcares de cadeia longa para possibilitar aassimilação da fonte de carbono pelos microorganismos produtores de poli- hidroxialcanoatos. Este processo de hidrolise normalmente envolve um lon-go tempo de preparo, utilização de enzimas ou ácido e, muitas vezes geracomponentes inibidores do cultivo, causando custos adicionais ao processode produção de PHA em questão.

A invenção aqui descrita contorna os problemas anteriormente citados através da utilização de um processo de obtenção de PHA a partir deresíduos do processamento de suco de laranja, compreendendo um pré-tratamento simplificado da matéria-prima e isento de hidrolise. A invençãotorna viável a utilização de um resíduo agroindustrial até então pouco apro-veitado aumentando seu valor agregado e, conseqüentemente, tornando o processo rentável além de ecológico.Breve Descrição da Invenção:

A presente invenção refere-se a um processo de obtenção depolihidroxialcanoatos (PHA) a partir de resíduo cítrico resultante do proces-samento de laranjas para a obtenção de suco. O processo em questão com-preende as seguintes etapas:

a) obtenção de licor de prensagem e/ou melaço cítrico; b) tratamento físico-químico dos materiais obtidos na etapa a;

c) preparação do meio de cultivo para produção de PHA;

d) condução do cultivo.

A invenção, também se refere ao uso do resíduo cítrico para aprodução de PHA, de acordo com o processo descrito na invenção. A inven-

ção se refere, ainda, a PHA ou a uma composição polimérica contendo PHAobtido a partir de processo descrito na invenção.

A presente invenção refere-se também a um artefato sólidocompreendendo PHA obtidos a partir do processo para a produção de PHAdescrito na invenção, bem como, a um artefato sólido contendo uma mistura

polimérica que compreende PHA obtido de acordo com processo para aprodução de PHA descrito na invenção.Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção apresenta um processo simples de produ-ção de PHA a partir de um resíduo agroindustrial abundante e de fácil mani-

pulação. O processo em questão utiliza o resíduo do processamento de la-ranjas, denominado resíduo cítrico, contribuindo consideravelmente para aredução do impacto ambiental deste resíduo, bem como aumenta o valoragregado do mesmo. A extração de suco de laranja gera, como resíduo,cerca de 52% de polpa cítrica fresca, com 73% a 83% de umidade. A polpa

cítrica é constituída por pele (60% - 65%), a polpa propriamente dita, o ba-gaço (30% - 35%) e as sementes (ao redor de 10%). Com o aumento de es-cala produtiva de suco de laranja e a geração de grandes volumes de resí-duos, iniciaram-se os primeiros problemas de contaminação do ambiente, oque estimulou o desenvolvimento de estratégias do uso do resíduo gerado.

Uma alternativa desenvolvida para a utilização parcial do resíduo líquido ge-rado, constituído por proteínas, óleos essenciais, pectinas, açúcares, ácidosorgânicos e sais; foi a fermentação alcoólica para a produção de etanol. Em-bora a produção de etanol tenha minimizado o impacto ambiental causadopela geração de resíduos do processo de extração, a agregação de um mai-or valor ao mesmo representaria um ganho de competitividade consideráveldentro do contexto produtivo. A presente invenção apresenta um processo de obtenção de

PHA a partir de resíduo cítrico compreendido pelas seguintes etapas:

a) obtenção de licor de prensagem e/ou melaço cítrico;

b) tratamento físico-químico dos materiais obtidos na etapa a;

c) preparação do meio de cultivo para produção de PHA; d) condução do cultivo.

O resíduo cítrico descrito na invenção corresponde à casca,polpa e sementes resultantes após prensagem das laranjas para extração dosuco.

O licor de prensagem e/ou melaço cítrico da presente invenção é obtido a partir do resíduo cítrico. O resíduo cítrico, após obtido, é submeti-do a um processo de moagem, tratamento com oxido de cálcio (CaO) eprensagem obtendo-se, como resultado, o licor de prensagem. Outros agen-tes, além do CaO, que possuem a propriedade de hidrolisar a pectina para aliberação de água e facilitar o processo de prensagem também podem ser utilizados.

O licor de prensagem obtido pode, ainda, passar por um pro-cesso de concentração seguido de resfriamento obtendo-se, então, o melaçocítrico. Preferencialmente, a concentração do licor de prensagem ocorre a-través de evaporação. As etapas de obtenção de resíduo cítrico, licor de

prensagem e melaço cítrico como anteriormente descritas, podem ser visua-lizadas na Figura 1.

O licor de prensagem e/ou melaço cítrico obtidos na etapa a doprocesso de obtenção de PHA são utilizados como meio de cultivo de micro-organismos no processo de produção de PHA da presente invenção. Para a

utilização do licor de prensagem e/ou melaço cítrico como meio de cultivo énecessário, inicialmente, que estas matérias-primas sejam submetidas a tra-tamento físico-químico prévio. O tratamento físico-químico pelo qual o licorde prensagem e/ou melaço citrico é submetido compreende a centrifugaçãodo mesmo seguida de uma etapa de esterilização ou pasteurização do mate-rial. Após a esterilização ou pasteurização, o material livre de microorganis-mos passa por um processo de decantação seguido de retirada do materialsobrenadante. O material sobrenadante é então utilizado para a preparaçãodo meio de cultivo. Opcionalmente, licor de prensagem e/ou melaço citricopode sofrer correção do pH anterior à centrifugação. Preferencialmente, opH 7,0 é escolhido para correção. Em uma concretização preferida da inven-ção, a centrifugação do licor de prensagem e/ou melaço citrico ocorre àtemperatura de 5QC e a esterilização ocorre a 121eC por 15 minutos. Em ou-tra concretização preferida da invenção, a centrifugação do licor de prensa-gem e/ou melaço citrico ocorre à temperatura de 5-C e a pasteurização o-corre a 1139C por 2 minutos. Em mais uma concretização preferida da in-venção a centrifugação ocorre de forma asséptica e é seguida por uma filtra-ção de forma asséptica. O material filtrado assepticamente é submetido aum processo de decantação seguido de retirada do material sobrenadante.O material sobrenadante é então utilizado para a preparação do meio decultivo. Em outra concretização preferida da invenção, o pH inicial do licor deprensagem e/ou melaço citrico é corrigido para 7,0 e o material resultante écentrifugado a 3500 rpm por 5min. Após a centrifugação, o sobrenadante éaquecido a 1009C e então submetido à decantação a frio com a retirada dosobrenadante. O material sobrenadante é então utilizado para a preparaçãodo meio de cultivo. Em mais uma concretização preferida da invenção, o li-cor de prensagem e/ou melaço citrico é submetido à centrifugação a 59C epasteurização a 1139C por 2 min. Após pasteurização, o licor de prensageme/ou melaço citrico é então submetido à decantação a frio e o sobrenadanteé submetido novamente ao processo de pasteurização a 1139C por 2 minu-tos. O material resultante é então utilizado para a preparação do meio decultivo. Em outra concretização preferida da invenção, o tratamento físico-químico do licor de prensagem e/ou melaço citrico consiste na filtração domesmo em membrana de micro filtração, ou ultra filtração, ou submetido àseparação dos sólidos suspensos por flotação.O licor de prensagem e/ou melaço cítrico submetido a tratamen-to físico-químico é utilizado para a preparação do meio de cultivo do proces-so de produção de PHA da presente invenção. A preparação do meio decultivo ocorre, inicialmente, através da adição, ao material sobrenadante re-sultante do tratamento físico-químico do licor de prensagem e/ou melaçocítrico, de nutrientes essenciais ao cultivo selecionados dentre nitrogênio,fósforo, enxofre, magnésio, potássio, oxigênio, oligonutrientes ou misturados mesmos. Preferencialmente, os oligonutrientes adicionados durante apreparação do meio de cultivo da invenção, são selecionados dentre molib-dênio, manganês, cobalto, zinco, níquel, cobre e boro.

Alternativamente, após a adição dos nutrientes, o meio de culti-vo pode ser submetido a um processo de esterilização para garantir a as-sepsia/condução do cultivo. Em uma concretização preferida da invenção, oprocesso de esterilização do meio de cultivo com nutrientes ocorre a 121eCpor 15 minutos.

As etapas de tratamento físico-químico do licor de prensageme/ou melaço cítrico, bem como as concretizações preferidas anteriormentedescritas, podem ser visualizadas na Figura 2.

O meio de cultivo, utilizado no processo biotecnológico descritona presente invenção, deve compreender um teor inicial de açúcares reduto-res de 10 a 60 g.L"1. Para a condução do processo biotecnológico, podemser utilizados microorganismos pertencentes a diferentes grupos taxonômi-cos: Azotobacter, microorganismos metilotróficos, Alcaligenes, Pseudomo-nas, Burkholderia além de Escherichia coli recombinante. Preferencialmente,os microorganismos utilizados na presente invenção são selecionados den-tre Alcaligenes latus, Pseudomonas oleovorans, Azobacter vinelandii, Bacil-lus cereus, Cupriavidus necator, Burkholderia sacchari, metilótrofos e Esche-richia coli recombinante. Ainda mais preferencialmente, o processo biotecno-lógico da presente invenção é conduzido através da utilização de Cupriavi-dus necator. Para que o processo biotecnológico tenha êxito, tanto na pro-dução de microorganismos como de polímero, são necessários dois pré-inóculos antecedendo o processo em reator. O primeiro pré-inóculo, devepreferencialmente, ser realizado através da propagação do microorganismoCupriavidus necator em meio de cultivo contendo caldo nutriente compreen-dendo 5g.L"1 de peptona, 3 g.L"1 de extrato de carne. Este pré-inóculo émantido em agitador rotatório à temperatura, rotação e tempo compatíveiscom o processo. Preferencialmente, o primeiro pré-inóculo é mantido a 309Csob agitação de 150 rpm por 24h. Após esse período, 10% do volume final aser cultivado é transferido do primeiro pré-inóculo para o segundo pré-inóculo. O segundo pré-inóculo se caracteriza por conter sais minerais e nu-trientes essenciais ao crescimento do microorganismo. Este pré-inóculo émantido em condições específicas de temperatura, agitação e tempo compa-tíveis com o processo. Preferencialmente, o segundo pré-inóculo é mantidoa 30SC, 150 rpm por 24h. Após esse período, um volume de pré-inóculo, su-ficiente para a condução do processo, é adicionado ao reator contendo omeio de cultivo preparado conforme descrito anteriormente. Preferencial-mente, o volume do segundo pré-inóculo que é adicionado ao reator, corres-ponde a aproximadamente 10% do volume a ser cultivado.

O processo biotecnológico para produção de PHA da presenteinvenção pode ser conduzido através de cultivo em batelada ou em bateladaalimentada. O processo pode ser realizado com ou sem recirculação de cé-lulas para o reator, a fim de se obter alta densidade celular. O processo dapresente invenção compreende as etapas de crescimento celular seguido daetapa de indução à produção de PHA. O cultivo é conduzido à temperaturade 25eC a 40eC. Durante o cultivo, o pH pode variar entre 7,2 e 5,4 e o meiode cultivo é agitado a uma velocidade de 200 a 1000 rpm. Durante a condu-ção do cultivo, o teor de oxigênio dissolvido pode variar entre 10% e 100%da saturação do meio de cultivo com ar atmosférico sendo que, esta condi-ção não pode ser inferior a 10%.

A etapa de indução à produção ocorre através da imposição dalimitação de um nutriente (nitrogênio, fósforo, enxofre, magnésio, potássio ouoxigênio). Essa limitação ocorre durante a condução de cultivo e deve ocor-rer preferencialmente após a obtenção de uma concentração de biomassamínima entre 15 g.L*1 a 60 g.L"1 (peso seco). A determinação da concentra-ção inicial do nutriente limitante no meio de cultivo deve considerar os fato-res de conversão dos nutrientes em células. A recuperação do polímero(PHA) pode ser realizada por diferentes métodos compatíveis com o cultivoem questão. Esses métodos incluem a separação do material celular con-tendo o polímero seguido de um processo extrativo.

A presente invenção refere-se, também, ao uso de resíduo cítri-co para a produção de PHA utilizando o processo de obtenção de PHA des-crito anteriormente. Ainda objeto da presente invenção é o próprio PHA obti-do a partir de processo descrito na invenção. A invenção se refere também auma composição polimérica compreendendo PHA obtido a partir de proces-so descrito na invenção.

A presente invenção refere-se, ainda, a um artefato sólido, com-preendendo PHA obtido a partir do processo para a produção de PHA des-crito na invenção, bem como, a um artefato sólido contendo uma misturapolimérica que compreende PHA obtido de acordo com processo para aprodução de PHA descrito na invenção.

A seguir são descritos algumas possibilidades de concretizaçãoda invenção em questão. Os exemplos aqui descritos devem ser interpreta-dos como possibilidades de concretização da invenção e não devem ser uti-lizados, entretanto, para limitar o escopo de proteção da mesma.EXEMPLO I

O primeiro pré-inóculo foi cultivado em caldo nutriente (NutrientBroth) mantido em um agitador rotatório por 24 horas. Após este período, umvolume equivalente a 10% do volume final a ser cultivado foi transferido doprimeiro para o segundo pré-inóculo que é constituído de meio de sais mine-rais e nutrientes próprios para o crescimento celular do microrganismo em-pregado. Este segundo pré-inóculo foi mantido em agitador rotatório, a 30BCe 150 rpm por 54 horas. Após este período, um volume equivalente a 10%do volume final a ser cultivado foi transferido do segundo pré-inóculo para oreator de 5 litros contendo o meio composto por licor de prensagem e/oumelaço cítrico. O licor de prensagem e/ou melaço cítrico contém cerca de 60a 80 g.L"1 de ART (açúcares redutores totais), por este motivo, deve ser dilu-ido em água destilada para obtenção de uma concentração de açúcares re-dutores entre 10-60 g.L"1 (limite de crescimento para C. necatot), adicionadode sais minerais e nutrientes para o crescimento. O pré-tratamento 5 (figura2) foi empregado para redução dos sólidos suspensos presentes no licor deprensagem e/ou melaço cítrico. O cultivo foi realizado com concentraçãoinicial de açúcares redutores totais (ART) entre 10 e 40 g.L"1, temperaturaentre 25 e 409C, pH variando de 5,4 - 7,0, agitação de 200 a 900rpm, con-centração de oxigênio entre 10 a 100% da saturação com ar atmosférico,durante 28 horas de cultivo. O fator de conversão de substrato em célula(Yx/s) obtido, foi de 0,54 g.g"\ a velocidade específica de crescimento obtidafoi de 0,44 h"1. A produção de P(3HB) teve um aumento a partir da 10§ (dé-cima) hora quando a exaustão de nitrogênio ocorreu. A biomassa total foi de17,1 g.L"1. A porcentagem de P(3HB) na célula ao final do cultivo foi de 81%,com uma produtividade média de P(3HB) de 0,49 g.L'1.h"1, em 18 horas deprodução. A recuperação do polímero foi realizada com a separação dascélulas do líquido ao término do cultivo através de centrifugação. A extraçãofoi realizada com uma relação da massa de células e volume do solvente,por exemplo, clorofórmio ("Optimization of microbial poly(3-hydroxybutyrate)recovery using dispersions of sodium hypoclorite solution and chloroform" -Biotechnology and Bioengineering, v. 44, pp. 256-261, 1994) variando de1:2 nas temperaturas de 20°C até 60°C com agitação magnética, agitaçãoem agitador ou sem agitação. A porcentagem de recuperação variou de 80 a98%.

EXEMPLO II

O uso de licor de prensagem do bagaço da laranja foi testadopara a produção de P(3HB) como um subproduto da indústria de suco delaranja, sem aplicação de tratamento térmico. O primeiro pré-inóculo foi cul-tivado em caldo nutriente, mantido em um agitador rotatório a 30°C e 150rpmpor 24 horas. Após sua ativação, um volume equivalente a 10% do volumefinal a ser cultivado foi transferido do primeiro para o segundo pré-inóculoque é constituído de meio de sais minerais e nutrientes próprios para o cres-cimento celular do microorganismo empregado. Este segundo pré-inóculo foimantido em agitador rotatório, a 309C e 150rpm por 24 horas. Após este pe-ríodo, um volume equivalente a 10% do volume final a ser cultivado foi trans-ferido do segundo pré-inóculo para o reator de 5 litros contendo licor deprensagem apresentado cerca de 10 e 60 g.L"1 de açúcares redutores. Estemeio, ainda, foi adicionado de sais minerais e nutrientes para o crescimento.O cultivo foi realizado durante 32 horas, a temperatura de cultivo foi mantidaem 30BC, o pH foi mantido entre 5,4 e 7,0, agitação variou de 400-900rpm, aconcentração de oxigênio ficou entre 10 e 100% do valor da saturação comar atmosférico durante o cultivo. A velocidade específica de crescimento foide 0,24h"1, para o cultivo com licor de prensagem. A exaustão de nitrogêniono cultivo ocorreu na 12a hora. A fase de produção foi de 20 horas, comconcentração final de P(3HB) na célula igual a 6,9 g.L"1, com produtividademédia de 0,21 g.L"1.h"1 e produtividade na fase de produção de 0,27 g.L'1.h"1.A porcentagem de polímero na célula foi de 53%. A recuperação do polímerofoi realizada com a separação das células do líquido ao término do cultivoatravés de centrifugação. A extração foi realizada com uma relação da mas-sa de células e volume de solvente, por exemplo, clorofórmio ("Optimizationof microbial poly(3-hydroxybutyrate) recovery using dispersions of sodiumhypoclorite solution and chloroform" - Biotechnology and Bioengineering,v. 44, pp. 256-261, 1994) variando de 1:2 até 1:20. O tempo de extração va-riou de 1 a 4 horas nas temperaturas de 209C até 609C com agitação mag-nética, agitação em agitador ou sem agitação. A porcentagem de recupera-ção variou de 80 a 98%.EXEMPLO III

Caldo Nutriente (Nutrient Broth) foi utilizado como primeiro pré-inóculo realizado em um agitador rotatório a 309C e 150rpm por 24 horas. Ovolume equivalente a 10% do volume final a ser cultivado, foi transferido doprimeiro pra o segundo pré-inóculo que é constituído de meio de sais mine-rais e nutrientes próprios para o crescimento celular do microorganismo em-pregado. Este segundo pré-inóculo foi mantido em agitador rotatório, a 309Ce 150rpm por 24 horas. Após este período, as células foram transferidas pa-ra o reator de 5 litros contendo o licor de prensagem e/ou melaço cítrico(cerca de 60 a 80 g.L"1 de ART) diluído em água destilada para a obtençãode uma concentração de açúcares redutores entre 10-60 g.L"1e adicionadode sais minerais e nutrientes para o crescimento. A temperatura de 359C foiaplicada. O pH foi mantido em 7,0 e a agitação variou de 400-900rpm, a concentração de oxigênio se manteve superior a 20% da saturação com aratmosférico durante 26 horas de cultivo. Observou-se uma fase de produçãode 18 horas, com 9,76 g.L"1 de P(3HB) e 18,16 g.L"1 de biomassa total. Ofator de conversão do substrato em células (Yx/S) foi de 0,76 g.g-1 e de célulaem produto (Yp/S) foi de 0,41 g.g"1 resultando em uma produtividade média

de 0,46 g.L"1.h"1. O experimento teve seu final observado pelo valor da con-centração de ART inferior a 5g.L"1. A produção de P(3HB) teve seu aumentoa partir da 8ã (oitava) hora quando a exaustão de nitrogênio ocorreu. A por-centagem de P(3HB) na célula ao final do cultivo foi de 54%. A recuperaçãodo polímero foi realizada com a separação das células do líquido ao término

do cultivo através de centrifugação. A extração foi realizada com uma rela-ção da massa de células e volume do solvente, por exemplo, clorofórmio("Optimization of microbial poly(3-hydroxybutyrate) recovery using disper-sions of sodium hypoclorite solution and chloroform" - Biotechnology andBioengineering, v. 44, pp. 256-261, 1994) variando de 1:2 até 1:20. O tem-

po de extração variou de 1 a 4 horas nas temperaturas de 209C até 60QCcom agitação magnética, agitação em shaker ou sem agitação. A porcenta-gem de recuperação variou de 80 a 98%.

Claims (28)

1. Processo de obtenção de PHA a partir de resíduo cítrico ca-racterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:a) obtenção de licor de prensagem e/ou melaço cítrico; b) tratamento físico-químico dos materiais obtidos na etapa a;c) preparação do meio de cultivo para produção de PHA;d) condução do cultivo.

2. Processo de obtenção de PHA de acordo com reivindicação1, caracterizado pelo fato de que o resíduo cítrico corresponde à casca, pol- pa e semente resultantes da prensagem de laranjas para a extração de su-co.

3. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que na etapa a, o licorde prensagem é obtido a partir da moagem/tratamento com oxido de cálcio e prensagem do resíduo cítrico.

4. Processo de obtenção de PHA de acordo com reivindicação`3, caracterizado pelo fato de que agentes que possuem a propriedade dehidrolisar a pectina são utilizados em substituição ao oxido de cálcio.

5. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que na etapa a, o mela-ço cítrico é obtido a partir de concentração do licor de prensagem seguido deresfriamento.

6. Processo de obtenção de PHA de acordo com reivindicação`5, caracterizado pelo fato de que a concentração do licor de prensagem é realizada através de evaporação.

7. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que na etapa b o trata-mento físico-químico do licor de prensagem e/ou melaço cítrico ocorre atra-vés das seguintes subetapas: b1) centrifugação do licor de prensagem e/ou melaço cítrico;b2) esterilização ou pasteurização do material;b3) decantação do material esterilizado ou pasteurizado, segui-da de retirada do material sobrenadante.

8. Processo de obtenção de PHA de acordo com reivindicação7, caracterizado pelo fato de que, opcionalmente, uma etapa de correção depH do licor de prensagem e/ou melaço cítrico é realizada antes da etapa b1,

9. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que na etapa c, o meiode cultivo é preparado através de adição ao material sobrenadante obtidoem b3, de nutrientes essenciais ao cultivo.

10. Processo de obtenção de PHA de acordo com reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que, os nutrientes adicionados são seleciona-dos dentre nitrogênio, fósforo, enxofre, magnésio, potássio, oxigênio, oligo-nutrientes ou mistura entre os mesmos.

11. Processo de obtenção de PHA de acordo com reivindicação10, caracterizado pelo fato de que os oligonutrientes são selecionados den- tre molibdênio, manganês, cobalto, zinco, níquel, cobre e boro ou misturados mesmos.

12. Processo de obtenção de PHA de acordo cóm qualquer umadas reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que, opcionalmente,uma etapa de esterilização ou pasteurização do material ocorre após a adi- ção de nutrientes ao meio de cultivo.

13. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que na etapa c, o meiode cultivo compreende um teor inicial de açúcares redutores de 10 a 60 g.L"1

14. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que na etapa d, o culti-vo é conduzido através de cultivo em batelada ou batelada alimentada.

15. Processo de obtenção de PHA de acordo com reivindicação14, caracterizado pelo fato de que o cultivo em batelada ou batelada alimen- tada é realizado com recirculação de células.

16. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que na etapa d, o culti-vo ocorre nas seguintes etapas :d1) etapa de crescimento celular;d2) etapa de indução a produção de PHA.

17. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que na etapa d, o culti-vo é conduzido à temperatura de 25QC a 409C.

18. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que na etapa d, o pHpode variar entre 7,2 e 5,4.

19. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que na etapa d, o meioé agitado a uma velocidade de 200 a 1000 rpm.

20. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que na etapa d, a con- centração de oxigênio dissolvido deve estar entre 10% e 100% da saturaçãodo meio de cultivo com ar atmosférico.

21. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a etapa d2 a indu-ção à produção de PHA é iniciada através da limitação de nutrientes não fontes de carbono.

22. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que no início da etapade indução a concentração de biomassa mínima corresponde de 15 g. L"1 a60 g.L1

23. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer umadas reivindicações 21 a 22, caracterizado pelo fato de que os nutrientes nãofontes de carbono, são selecionados dentre nitrogênio, fósforo, enxofre,magnésio, potássio ou oxigênio.

24. Uso de resíduo cítrico para a produção de PHA, caracteriza- do pelo fato de que ocorre através de processo como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 23.

25. PHA, caracterizado pelo fato de que são obtidos a partir deprocesso como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23.

26. Composição polimérica, caracterizada pelo fato de que com-preende PHA obtido a partir de processo como definido em qualquer umadas reivindicações 1 a 23.

27. Artefato sólido, caracterizado pelo fato de que compreendePHA como definido na reivindicação 25.

28. Artefato sólido, caracterizado pelo fato de que compreendecomposição polimérica como definida na reivindicação 26.