CN102105179B - 骨替代物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可以用作骨替代物的材料及其制备方法。所述材料包含有机相(I)，其包含由胶原I三螺旋构成的条纹胶原原纤维，以及它们未有序化的各向同性结构域，所述原纤维是根据联合了排列成行的结构域和胆甾型结构域的3D几何形状在一大段距离上有序化的；以及矿物相(II)，其包含具有六方晶体结构的磷灰石晶体，空间群6/m，所述晶体包含至少钙离子和磷酸根离子；所述矿物相的磷灰石晶体的c轴与所述有机相的条纹胶原原纤维的纵轴共排列；并且所述材料的胶原含量为至少75mg/cm3。制备所述材料的方法包括制备所述有机相(I)的前体的胶原的初始酸性水溶液，以及至少一种所述矿物相(II)的前体的水溶液；并且通过将pH升高到至少7来沉淀所述胶原。根据该方法：胶原在所述酸性水溶液中的浓度为至少75mg/ml，并且在所述pH升高时保持恒定；所述矿物相前体包含至少一种钙盐和至少一种磷酸盐；所述矿物相(II)的沉淀通过使所述矿物相前体溶液与所述有机相(I)接触来进行；所述接触在所述有机相(I)沉淀之前或之后进行。

Description

骨替代物及其制备方法
技术领域
本发明涉及骨替代物及其制备方法。
背景技术
骨是主要由细胞；构成有机蛋白网络的I型胶原；以及由纳米大小的羟基磷灰石晶体所组成的矿物相构成的混杂材料。这种三维的大规模有机/矿物的结合赋予骨组织弹性和硬度，使得其经受住施加于其上的力。因此，骨是坚硬的、致密的和非常强壮的。
Weiner & Wagner(Ann.Rev.Mater.Sci.28，271-298，1998)提供了各个尺度下分级结构的描述，其可以分成下文所述并由附图1示例的七个级别：
-级别1(图1a)：骨的两个主要构成基本组分，即羟基磷灰石小板和条纹胶原原纤维构成结构的第一等级。在纳米尺度内，这是结构的最低级别。特别地，磷灰石相的特征在于存在特征晶面(plans inter réticulaires)，如(002)和(300)。在该结构级别上，磷灰石晶体不具有特定的取向。胶原原纤维的特征在于电子显微镜可见的周期性条纹，其来自胶原I分子组装，从而诱导67nm的周期位移；
-级别2(图1b)：羟基磷灰石小板根据它们的c轴，沿条纹胶原原纤维主轴的共排列(coalignement)构成第二级别，即磷灰石的晶面(002)与原纤维的主轴垂直，并因此根据胶原原纤维(条纹＝67nm)的轴向周期(即根据条纹)取向。使用了术语矿化的胶原原纤维(宽度100至300纳米)。级别2也在纳米尺度内；
-级别3(图1c)：一些矿化的胶原原纤维在平行束中并排组装，从而形成矿化的胶原纤维(宽度1至3微米)。结构级别3达到微米尺度；
-级别4(图1d)：其是复杂的，因为矿化的胶原原纤维或纤维可以在三维上有序化。特别地，在该级别中，可以区分结构域的共存，其中原纤维/纤维在优选方向上在一大段距离上排列成行和/或根据“胆甾型”几何结构形成它们堆叠的拱形结构特征。也可以区分原纤维/纤维未有序化的结构域(“各向同性”结构域)。该尺度从微米到毫米变化；
-级别5(图1e)：密质骨具有毫米大小的平行圆柱结构排列，表示为“骨单位”。在截面中，这些骨单位表现为由同心胶原薄片组成；
-级别6(图1f)：长骨的富细胞中心部分称为“松质骨”。在这种骨中，骨片形成薄且不规则行的大孔网络。密质骨/松质骨组合构成结构级别6。该尺度大于一毫米；
-级别7(图1g)：最终级别很明显是全骨。
现有技术提出了几类合成材料(表示为“植入材料”)或天然材料(表示为“移植物”)。植入材料通常为生物惰性的，即被有机体容易耐受；或生物相容的，即它们完美地整合入宿主有机体。移植物为取自其用于本人的人(同体移植)或第三者(异源移植)的骨组织，并且其通常为骨传导的(ostéo-conducteur)，即其能够引导骨再生长。
然而，能够诱导骨重建的骨诱导性骨替代物构成了理想的替代物。这样的材料的开发是复杂的。使用这样的材料要求使用具有特殊晶相和化学性质的组分以优化其在人体或动物体中的完美整合，并且因而避免排斥。必须重建该材料的三维结构以提供适，首先，机械性质；以及其次，适合于宿主组织对所述替代物定植(colonisation)的多孔性。使有机骨网络(20％质量比)有序化的方法及其与组织中矿物相(70％质量比)的结合在体外非常难再现。
已经进行了许多研究以合成骨替代物，特别是涉及胶原矿化的研究。W.Traub et al.[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989，86，9822-9826]研究了火鸡骨腱胶原的矿化，但获得的材料没有表现出类似于骨的结构。已经进行了使用体外纯化胶原的其他测试，但在进行测试的强稀释条件未能获得具有在活骨组织中发现的骨密度和三维胶原结构的材料[参见D.Lickorish et al.(J.Biomed.Mat.Res.2004，68A，19-27)；S.Yunoki et al.(Mat.Lett.，2006，60，999-1002)；D.A.Wahl et al.(Eur.Cell.Mat.2006，11，43-56)]。
L.Addadi et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1987，84，2732-2736)描述了来自在由(NH4)CO3粉末于环境温度下热分解所产生的氨气氛下的CaCl2溶液的方解石CaCO3结晶。
同样已知的是通过升高pH从酸溶液沉淀胶原。R.L.Ehrman et al.(J.Nat.Cancer Inst.1956，16，1375-1403)描述了使胶原在乙酸中的溶液与NH3蒸气接触的方法。其转化为含有细粒的凝胶。没有描述所得材料的结构。
M.M.Giraud-Guille et al.(J.Mol.Biol.1995，251，197-202)和(J.Mol.Biol.1992，224，861-873)描述了利用胶原的浓溶液而获得的“液晶”结构和通过从酸到碱升高pH而获得的溶胶-凝胶转变。
G.Mosser，M.M.Giraud-Guille et al.(Matrix Biol.2006，25，3-13)描述了这样的方法，其中将胶原的酸性溶液(5mg/mL)在玻璃微室中逐渐浓缩以获得胶原分子的长久螺旋结构以及浓度梯度。然后使溶液与氨蒸气接触，以形成胶原原纤维并实现液相中的稳定结构。
B.A.Harley et al.(Biomaterials 2006，27，866-874)描述了也含有糖胺聚糖的胶原结构基质的生产。将胶原微原纤维与硫酸软骨素在4℃下均匀混合。然后将溶液在模具中离心分离，超速冷冻，冷冻干燥；然后于105℃下，在50mTorr的真空下交联24小时。没有描述胶原的纤维状性质。
C.Guo et al.(Biomaterials 2007，28，1105-1114)描述了磁性小珠在排列胶原原纤维溶液中的用途。使维持于4℃下、在磷酸盐缓冲液中制备的浓度为2.5mg/ml的胶原溶液与磁性小珠接触。还在细胞的存在下制备了最终胶原浓度为1.2mg/ml的相同样品。在两种情况下，在通过将温度升高至37℃以诱导原纤维生成期间，将样品置于小于1G的磁场中。当将细胞整合入基质时还使用CO2气氛。基质是非常松散的，并且没有提及胶原的纤维性质。M.J.Olsza et al.(Calcif.Tissue Int.2003，72，583-591)描述了存在或不存在聚(天冬氨酸)型聚合物的条件下的胶原海绵的钙化作用。胶原海绵由获得自牛腱的I型胶原构成。矿物为碳酸钙而不是磷酸钙，因此没有获得磷灰石相。没有证明条纹纤维的存在，并且胶原纤维是无取向的。J.H.Bradtet al.(Chem.Mater.1999，11，2694-2701)描述了在4℃下制备两种溶液的方法，第一种为用HCl酸化并含有CaCl2的1mg/mL胶原溶液(小牛真皮I型胶原)，第二种为含有磷酸根离子的缓冲溶液。然后将磷酸盐溶液与胶原溶液混合，使得可以实现6.8的pH，并将整体混合物加热到30℃。共沉淀得到含有磷酸钙、羟基磷灰石和磷酸八钙的混合物相。另外，胶原纤维为分离的无取向纤维，并且不构成致密基质。N.Gehrke，N.Nassif et al.(Chem.Mater.2005，17，6514-6516)描述了在存在或不存在聚(天冬氨酸)型聚合物的条件下，用碳酸钙将预先去矿化的珍珠母的有机网络再矿化。
目前没有已知的合成方法使得可以获得这样的骨替代物，其再现在天然骨中所观察到的与磷灰石晶体矿物相结合的胶原的级别4的三维结构。
发明内容
本发明的目的是提供合成材料及其制备方法，所述合成材料可以用作结构非常接近活骨(级别4)结构的生物相容性骨替代物。
本发明的合成材料包含有机相(I)和矿物相(II)。
所述有机相(I)包含由胶原I三螺旋构成的条纹胶原原纤维，以及它们未有序化的各向同性结构域，其中所述条纹的周期为约67nm，所述原纤维是根据联合了排列成行的结构域和胆甾型结构域的3D几何形状在一大段距离上有序化的。
所述矿物相(II)包含具有六方晶体结构的磷灰石晶体，空间群6/m，所述晶体包含至少钙离子和至少磷酸根离子。
在本发明的材料中，所述矿物相的磷灰石晶体的c轴与所述有机相的条纹胶原原纤维的纵轴共排列。
所述材料的胶原含量为至少75mg/cm3。
在所述材料中，各种结构域(胆甾型、线型和各向同性)的数量级为约50微米。
根据一具体实施方案，矿物相由纯羟基磷灰石晶体组成。对本申请的目的而言，术语“纯羟基磷灰石”旨在表示不含诸如透钙磷石的其他结晶磷酸盐相的羟基磷灰石。
在本发明的一具体实施方案中，矿物相由化学计量的下式(I)的羟基磷灰石晶体组成：
Ca10(PO4)6(OH)2              (I)
根据本发明的一具体实施方案，式(I)的羟基磷灰石晶体的Ca/P原子比为1.67。
根据本发明的另一实施方案，矿物相包含磷灰石晶体，其还包含至少氢氧根离子，其中磷酸根离子(B型)和/或氢氧根离子(A型)部分地由碳酸根离子代替。
在这些羟基磷灰石中，晶体结构的一个或多个位置可以不含离子。在这种情况下，它们为包含称为一个或多个离子间隙的非化学计量羟基磷灰石。
在另一实施方案中，矿物相包含磷灰石晶体，其包含Ca2+离子、PO4 3-离子和OH-离子，其中Ca2+、PO4 3-或OH-离子的至少一种部分地由其他离子代替。
在能够部分地代替Ca2+离子的离子中，可以提及Mg2+、Cu2+、Sr2+、Ba2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+、Na+、K+和Eu3+离子。
在能够部分地代替PO4 3-离子的离子中，可以提及CO3 2-、SiO4 3-、AsO4 3-、MnO4 3-、VO4 3-、CrO4 3-和HPO4 2-离子。
在能够部分地代替OH-离子的离子中，可以提及CO3 2-、F-、Cl-、Br-、I-、S2-和O2-离子。
本发明的材料还可以含有少量的蛋白聚糖、糖胺聚糖和/或促进矿化的有机分子。术语“少量”意图表示小于2％的比例。
本发明材料的特征可以通过光学显微镜分析、扫描电子显微镜SEM分析、透射电子显微镜TEM分析和X-射线衍射分析确定。
通过偏振光光学显微镜观察到本发明材料的半薄部分显示出双折射的性质。在理想的情况下，在显微平台旋转期间，对与这些条纹的运动有关的交替亮带和暗带的观察表明了螺旋结构。
通过SEM分析，本发明材料的样品显示出包埋于矿化层中的定向原纤维，并且无约一毫米的单独晶体聚集。
对本发明材料所拍的小角X-射线散射照片显示出胶原原纤维的各向异性信号和D＝67nm的谐波周期。广角X-射线散射照片显示出磷灰石相的主峰。原纤维信号与矿物信号之间存在的共排列表征了本发明的材料。更特别地在原纤维排列成行的区域中局部地证实这一共排列。
本发明的材料可以通过以下方法获得：制备作为有机相(I)的前体的胶原的初始酸性水溶液，以及至少一种矿物相(II)的前体的水溶液；并且通过将pH升高到至少7来沉淀该胶原。其特征在于：
-胶原在酸性水溶液中的浓度为至少75mg/ml，并且在所述pH升高时保持恒定；
-矿物相前体包含至少一种钙盐和至少一种磷酸盐，
-矿物相(II)的沉淀通过使矿物相前体溶液与有机相(I)接触来进行，所述接触在所述有机相(I)沉淀之前或之后进行。接触的持续时间根据沉淀速度和最终材料中预想的矿物填充物水平而设置。
在所述方法的第一实施方案中，将有机相(I)的胶原在使其与矿物相(II)的前体的中性溶液接触前沉淀。在这种情况下，矿物相(II)的前体的溶液包含至少所述钙盐和至少所述磷酸盐。最终材料中矿物相的比例通过引入溶液的离子的量来调节。在该实施方案中，胶原在使其与矿物相接触前要求其纤维结构。
在所述方法的第二实施方案中，使有机相(I)的前体的酸性溶液与(II)的前体的酸性溶液接触。然后升高混合物的pH，这导致胶原与磷灰石的共沉淀。在该实施方案中，特别重要的是保持胶原的初始浓度恒定。避免稀释的第一种方法是在模具中含有有机相(I)的前体的浓酸性溶液，该模具的形状适合于期望的用途，并且封入渗析膜中。第二种方法是将浓胶原溶液引入由渗析膜构成的柔性包膜(enveloppe)中。然后将模具或所述包膜浸入矿物相(II)的前体的溶液中。
当本发明的材料的矿物相II由纯羟基磷灰石的晶体组成时，所述方法优选在密闭室中进行，该密闭室中放置了：
-至少一个第一容器，其含有至少一种磷酸盐和至少一种钙盐的水溶液，其是矿物相II的前体，其中将至少一个渗析袋浸入该溶液中，所述渗析袋含有作为有机相(I)的前体的胶原的初始酸性水溶液，
-至少一个第二容器，其含有氨水溶液或(NH4)2CO3粉末；
应当理解：
-(矿物相I前体溶液的体积)/(密闭室内部体积)比为约2×10-3，
-包含于第一容器中的矿物相I前体溶液的高度为约3cm至5cm，所述容器的直径为约2cm至5cm；
-(氨水溶液的体积)/(密闭室内部体积)比为8×10-3，或者((NH4)2CO3粉末的体积)/(密闭室内部体积)比为约6×10-3。
当具备这些条件时，获得了其中矿物相II由纯磷灰石组成、不含任何其他类型磷酸钙相的材料。
胶原的初始酸性水溶液优选具有下列特征：
-其胶原浓度为75mg/mL至1000mg/mL，优选100mg/mL至400mg/mL，
-在酸的存在下，其pH小于4，优选小于3，优选0.5M乙酸。
矿物相(II)的前体的溶液优选具有下列特征：
-诸如CaCl2的钙前体的浓度小于溶度极限，优选2.5mM至1.5M，更优选11mM至550mM；
-诸如NaH2PO4的磷酸盐前体的浓度小于溶度极限，优选1.5mM至900mM，更优选66mM至330mM；
-前体的量是这样的：Ca/P摩尔比为1.5至1.8，优选约1.67。
作为示例，在20℃下，NaH2PO4的溶度极限为7.08M，而CaCl2的溶度极限为3.83M。
当期望材料的矿物相包含磷灰石晶体，其含有Ca2+离子、PO4 3-离子和OH-离子，并且其中Ca2+、PO4 3-或OH-离子的至少一种部分地由其他离子代替时，矿物相前体溶液还含有一种或多种盐，该盐的阳离子用于至少部分地代替Ca2+；和/或含有一种或多种盐，该盐的阴离子用于至少部分地代替PO4 3-和/或OH-。
意图代替Ca2+的阳离子的盐有利地选自含有单价或二价阳离子的盐，例如MgCl2、BaCl2、SrCl2、NaCl、KCl和NH4Cl。CO3 2-前体可以为NaHCO3。CO3 2-前体的量优选为这样的：NaH2PO4/NaHCO3比等于1。在碳酸盐的存在下，Ca/(P+C)的摩尔比为1.5至1.8，优选约1.67。
矿物相(II)前体溶液还可以含有蛋白聚糖、糖胺聚糖和/或促进矿化的有机分子，例如酸性氨基酸聚合物链，优选这样的聚(天冬氨酸)，其链长为5至150个氨基酸单元、优选约15个氨基酸单元，并且浓度为0.01μg/mL至1.5mg/mL，优选10μg/mL。
在一具体实施方案中，其中PO4 3-或OH-部分地由CO3 2-代替，pH的升高有利地借助于碱性气氛进行，特别是NH3气氛；或者(NH4)2CO3气氛。
在一具体实施方案中，所述方法包括额外的步骤，其中将通过共沉淀获得的材料用类似于生物体液的“SBF”(“模拟体液”)溶液浸渍，并且将介质的pH调节到7.4。
NaCl                 137mM至213mM(例如213.0mM)
NaHCO3               1.2mM至6.3mM(例如6.3mM)
KCl                  3mM至4.5mM(例如4.5mM)
K2HPO4·3H2O         1mM至1.5mM(例如1.5mM)
CaCl2                2.6mM至3.8mM(例如3.8mM)
Na2SO3Na2SO4         0.5mM至0.75mM(例如0.75mM)
MgCl2·6H2O          1.5mM至2.3mM(例如2.3mM)。
该SBF溶液的浓度为生物体液实际测量浓度的约1.5倍(参见ZhangL.-J.et al.，Mater.Lett.2004，58，719-722)。
在37℃下，pH可以用0.01mol/L三(羟甲基)氨基甲烷与0.01mol/L HCL的混合物调节至7.4。
具体实施方式
通过下列实施例更详细地描述本发明，然而本发明并不受下列实施例的限制。
在实施例中，使用了I型胶原，其根据下列方法制备自年幼Wistar大鼠尾。将大鼠尾腱在无菌层流罩超净台中切下，并在含有137mM的NaCl、2.68mM的KCl、8.07mM的Na2HPO4和1.47mM的NaH2PO4的磷酸缓冲盐溶液中洗涤，以除去细胞和痕量的血。然后将腱浸入4M NaCl溶液以除去残留的完整细胞并沉淀部分高分子量蛋白。用缓冲盐溶液再次洗涤后，将腱溶于含有500mM乙酸的水溶液中。通过以41000g离心2h使所得溶液澄清。将除了I型胶原以外的蛋白选择性地从300mM NaCl水溶液沉淀，随后通过以41000g离心3h除去。通过从600mM NaCl水溶液沉淀，随后以3000g离心45min从上清液回收胶原。将所得的团(culot)溶于500mM乙酸水溶液，然后在相同溶剂中小心地渗析以完全除去NaCl。
将溶液保持在4℃下，并在使用前以41000g离心4h。通过对高达50％(m/v)、溶于500mM乙酸水溶液中的聚乙二醇(35kDa，Fluka)进行反渗析，或者通过在层流罩超净台中缓慢地蒸发来制备各种浓度的胶原溶液。在原纤维生成之前通过测定羟脯氨酸的量来确定酸性溶液的胶原浓度。当然，也可以使用其他胶原来源。
实施例1
通过在40mL的水中溶解110mM的NaH2PO4、66mM的CaCl2、500mM的乙酸和0.40μg的聚(天冬氨酸)来制备矿物相前体溶液。将溶液在pH2.2下平衡。
用于该实施例的胶原溶液所含的胶原的量为约300mg/mL。其为部分纤维弹性凝胶的形式。
将胶原溶液引入渗析袋(MW＝3500Da)，该将袋置于敞口容器中的无机相前体溶液中。然后在20℃下，将所述容器置于氨气氛下直到盐完全沉淀。
氨气氛引起胶原与羟基磷灰石的共沉淀，这从3小时开始可见。可以将反应介质保留8天以熟化。
通过浸入溶液，有利地浸入PBS磷酸盐缓冲溶液来洗涤样品。
图2示出通过X-射线散射的材料分析。图2a表示SAXS照片，图2b表示WAXS照片。SAXS照片表示胶原原纤维的各向异性信号以及D＝67nm的谐波周期；这证明了沿原纤维主轴每67nm的条纹周期性。WAXS照片显示(002)反射面，其在与(a)中所观察到的原纤维信号相同的方向上增强，表征了磷灰石的存在。因此，这表明磷灰石晶体的c轴沿胶原原纤维的主轴取向。对应于原纤维中胶原分子的间距d侧面的信号与磷灰石的(002)反射面垂直，并与磷灰石的(300)反射面平行。因此，这些晶面优选地根据胶原分子的方向取向。这样的X-射线散射特征与在骨上发现的相当。
图3表示SEM显微图。其表示矿化的取向原纤维(排列成行的结构域)的存在。
图4表示通过偏正光光学显微镜在正交偏振棱镜(A，B)之间所观察的用充当材料的造影剂的甲苯胺蓝染色的半薄部分。4B表示与4A相同的区域，其也在正交偏振棱镜之间观察到，但相对于4A旋转了45°。在一方面，双折射是由于有机相的结构，而在另一方面，双折射是由于其用矿物相浸渍。偏振棱镜两个位置之间双折射带的变化表明下列不同结构域的共存：(i)排列成行的结构域，其特征在于4A与4B之间由于矿化的胶原原纤维相互排列成行而消失的双折射区域；以及(ii)胆甾型结构域，其特征在于4A与4B之间由于矿化的胶原原纤维规律地从一个平面朝另一平面旋转的朝向而亮与暗带反转交替的双折射区域。第三结构域与前两个共存，这是“各向同性”结构域，其中矿化的胶原原纤维在材料中随机地分布；因此，该结构域在4A与4B中未显示出双折射区域。
因此，根据纳米压痕(nanoindentation)技术还进行了材料的机械性质，特别是弹性模量的测量。该测量使用Ubi 1纳米机械压痕系统(Hysitron Inc.，Minneapolis，MN，USA)和Berkovich压头(indenter tip)，～10μm2进行。据发现，相对于胶原原纤维纵轴0°和90°的弹性模量的比率为1.43±1.18。该比率的数量级与天然密质骨所获得的比率相当，即1.50±0.315，这表明本发明材料的各向异性程度以及由此的其纤维结构与在骨中发现的类似。
实施例2
将胶原的稀释溶液(1mg/L)以这样的方式注入15μL玻璃微室中，从而抵消水蒸发。持续注射直到获得致密的液晶胶原相。将胶原在氨气氛下沉淀，然后将微室浸入调节至pH 7.4的矿物前体的溶液(所述溶液含有：213.0mM NaCl、6.3mM NaHCO3、4.5mM KCl、1.5mM K2HPO4·3H2O、3.8mMCaCl2、0.75mM Na2SO3Na2SO4和2.3mM MgCl2·6H2O)，并将该溶液在37℃下保持6个月的时间段。
然后通过浸入磷酸盐缓冲溶液(PBS)来洗涤沉淀的材料。
图5示出通过X-射线散射的材料分析。5a表示SAXS照片，5b表示WAXS照片。两张照片与实施例1的照片类似。
实施例3
将稀释至5mg/mL的胶原溶液以这样的方式注入15μL玻璃微室，从而抵消水蒸发，该胶原溶液预先对NaH2PO4(66mM)和CaCl2(110mM)的溶液进行渗析。持续注射直到获得致密的液晶胶原相。在敞口容器中，将微室浸入类似于实施例1的无机相前体的溶液。然后在20℃下，将所述容器放置于碳酸铵气氛下，直到盐完全沉淀。
氨和二氧化碳的气氛引起胶原与羟基磷灰石的共沉淀，这从3小时开始可见。可以将反应介质保留8天以熟化。
通过浸入磷酸盐缓冲溶液PBS来洗涤样品。
图6表示SEM显微图。其表示表现出螺旋结构(胆甾型结构域)的矿化纤维的存在。

Claims (17)

1.一种包含有机相(I)和矿物相(II)的合成材料，其特征在于：
-所述有机相(I)包含由胶原I三螺旋构成的条纹胶原原纤维，其中所述条纹的周期为67nm，所述原纤维是根据联合了排列成行的结构域和胆甾型结构域以及它们未有序化的各向同性结构域的3D几何形状在一大段距离上有序化的；
-所述矿物相(II)包含具有六方晶体结构的磷灰石晶体，空间群6/m，所述晶体包含至少钙离子和至少磷酸根离子；
-所述矿物相的磷灰石晶体的c轴与所述有机相的条纹胶原原纤维的纵轴共排列；
-所述材料的胶原含量为至少75mg/cm3。
2.如权利要求1所述的材料，其特征在于所述矿物相由纯羟基磷灰石晶体组成。
3.如权利要求1或2所述的材料，其特征在于所述矿物相由化学计量的下式(I)的羟基磷灰石晶体组成：
Ca10(PO4)6(OH)2  (I)。
4.如权利要求1所述的材料，其特征在于所述矿物相包含磷灰石晶体，所述晶体还包含至少氢氧根离子，其中磷酸根离子和/或氢氧根离子部分地由碳酸根离子代替。
5.如权利要求1所述的材料，其特征在于所述矿物相包含磷灰石晶体，所述晶体包含Ca2+离子、PO4 3-离子和OH-离子，其中Ca2+、PO4 3-或OH-离子的至少一种部分地由其他离子代替，其条件是：
能够部分地代替Ca2+离子的离子选自Mg2+、Cu2+、Sr2+、Ba2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+、Na+、K+和Eu3+离子；
能够部分地代替PO4 3-离子的离子选自CO3 2-、SiO4 2-、AsO4 3-、MnO4 3-、VO4 3-、CrO4 3-和HPO4 2-离子；以及
能够部分地代替OH-离子的离子选自CO3 2-、F-、Cl-、Br-、I-、S2-和O2-离子。
6.如权利要求1或2所述的材料，其特征在于其还含有少于2％的量的蛋白聚糖、糖胺聚糖和/或促进矿化的有机分子。
7.一种制备如权利要求1所述的材料的方法，所述方法在于制备作为所述有机相(I)的前体的胶原的初始酸性水溶液，以及至少一种所述矿物相(II)的前体的水溶液；并且通过将pH升高到至少7来沉淀所述胶原，其特征在于：
-胶原在所述酸性水溶液中的浓度为至少75mg/ml，并且在所述pH升高时保持恒定，
-所述矿物相前体包含至少一种钙盐和至少一种磷酸盐，
-所述矿物相(II)的沉淀通过使所述矿物相前体溶液与所述有机相(I)接触来进行，所述接触在所述有机相(I)沉淀之前或之后进行。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于将所述有机相(I)的胶原在使其与所述矿物相(II)的前体的中性溶液接触前沉淀，所述中性溶液含有至少所述钙盐和至少所述磷酸盐。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于使所述有机相(I)的前体的酸性溶液与所述矿物相(II)的前体的酸性溶液接触，并升高所得混合物的pH，这导致所述胶原与所述磷灰石的共沉淀。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于在封入渗析膜中的模具中含有所述有机相(I)的前体的浓酸性溶液，然后将整体浸入所述矿物相(II)的前体的溶液中。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于将浓胶原溶液引入由渗析膜构成的柔性包膜中，然后将所述包膜浸入所述矿物相(II)的前体的溶液中。
12.如权利要求7所述的方法，其用于制备其中所述矿物相(II)由纯羟基磷灰石晶体组成并且如权利要求2所定义的材料，其特征在于所述方法在密闭室中进行，所述密闭室中放置了：
-至少一个第一容器，其含有至少一种磷酸盐和至少一种钙盐的水溶液，其是所述矿物相(II)的前体，将至少一个渗析袋浸入其中，所述渗析袋含有作为所述有机相(I)的前体的胶原的初始酸性水溶液，
-至少一个第二容器，其含有氨水溶液或(NH4)2CO3粉末；
其条件是：
-(矿物相(II)前体溶液的体积)/(密闭室内部体积)比为2×10-3，
-包含于所述第一容器中的矿物相(II)前体溶液的高度为3cm至5cm，所述容器的直径为2cm至5cm；
-(氨水溶液的体积)/(密闭室内部体积)比为8×10-3，或者((NH4)2CO3粉末的体积)/(密闭室内部体积)比为6×10-3。
13.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述胶原的初始酸性水溶液具有下列特征：
-其胶原浓度为75mg/mL至1000mg/mL；
-在酸的存在下，其pH小于4。
14.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述矿物相(II)的前体的溶液具有下列特征：
-钙前体的浓度小于溶度极限；
-磷酸盐前体的浓度小于溶度极限；
-前体的量是这样的：Ca/P摩尔比为1.5至1.8。
15.如权利要求7所述的方法，其用于制备如权利要求6所述的材料，其特征在于所述矿物相的前体的溶液还含有一种或多种其阳离子用于至少部分地代替Ca2+的盐；和/或含有一种或多种其阴离子用于至少部分地代替PO4 3-和/或OH-的盐。
16.如权利要求7所述的方法，其用于制备如权利要求7所述的材料，其特征在于所述矿物相(II)的前体的溶液还含有蛋白聚糖、糖胺聚糖和/或促进矿化的有机分子。
17.如权利要求7所述的方法，其特征在于pH的升高借助于碱性气氛进行。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2960439B1 (fr) 2010-05-31 2012-06-15 Univ Paris Curie Matrices fibrillaires denses de collagene pour la reparation tissulaire et leur procede de preparation
CN103748450A (zh) 2011-08-19 2014-04-23 马尔文仪器有限公司 双模式微粒表征
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FR3011185B1 (fr) 2013-10-02 2016-10-28 Univ Pierre Et Marie Curie (Paris 6) Procede de preparation d'une matrice de collagene fibrille
BR102016012926B1 (pt) * 2016-06-06 2019-04-02 Brunella Sily De Assis Bumachar Processo de deposição nanométrica de fosfato de cálcio na superfície de implante de titânio anodizado
CN108926743B (zh) * 2018-08-20 2020-07-14 北京恒泽博泰生物科技有限公司 一种三维矿化胶原支架材料及其骨再生应用
CN113913961B (zh) * 2021-11-16 2023-05-16 清华大学 一种活性元素掺杂的矿化胶原纳米纤维及其制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4699759B2 (ja) * 2002-11-06 2011-06-15 独立行政法人物質・材料研究機構 自己組織化したアパタイト／コラーゲン複合体を含むアパタイト／コラーゲン架橋多孔体及びその製造方法
US20120114763A1 (en) * 2005-11-14 2012-05-10 Genoss Ltd Method for Producing Collagen/Apatite Composite Membrane for Guided Bone Regeneration

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Anna Tampirei et al..Design of graded biomimetic osteochondral composite scaffolds.《Biomaterials》.2008,第29卷3539-3546.
Design of graded biomimetic osteochondral composite scaffolds;Anna Tampirei et al.;《Biomaterials》;20080605;第29卷;3539-3546 *

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