CN102102133B - 棉花曲叶病毒检测用引物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种棉花曲叶病毒检测用引物，所述引物的核苷酸序列如序列表CLCuVf& CLCuVr所示。本发明还进一步提供了检测棉花曲叶病毒的方法，该方法以样品总DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果。本发明引物特异性好，检测方法快速简单，灵敏度高，为进出口安全提供了保证。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及棉花曲叶病毒检测用引物。
背景技术
棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl virus，CLCuV)为双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)成员，病毒粒体为双联体结构。该病毒自然寄主有海岛棉、咖啡、黄葵、黄麻、木槿等，侵染棉花导致棉花曲叶病(Cotton leaf curl disease，CLCuD)，造成严重的经济损失。在巴基斯坦，仅1992～1995年间CLCuD造成的经济损失就超过50亿美元。我国是世界上最大的棉花生产国和消费国，棉花生产对我国棉花产业发展意义重大。该病毒由烟粉虱传播，目前传播CLCuD的烟粉虱已遍及我国各棉区，危害呈逐年上升趋势，因而一旦该病毒传入我国，极有可能导致CLCuD的大发生，其后果不堪设想。鉴于该病毒对我国棉花生产已具有十分严重的潜在威胁，因此有必要开展该病毒的检测工作。
酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是植物病毒检测工作中使用最广泛的一种方法，不过该方法需要高质量的抗血清。然而粉虱传双生病毒在血清学上密切相关，即由一个成员制备的血清会与同一属的其它成员产生非特异性反应，因而难以采用ELISA方法来准确检测棉花曲叶病毒。近年来已经广泛应用于分子检测领域的聚合酶链式反应技术(polymerasechain reaction，PCR)为实现这一目标提供了解决方案。
本发明选择CLCuV保守区序列，设计用于PCR检测的特异性引物，通过PCR扩增建立了CLCuV的分子检测方法，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果。
发明内容
本发明目的在于提供用于棉花曲叶病毒PCR检测的引物序列。
本发明通过分析已报道的CLCuV保守区序列，设计检测用特异性引物。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表CLCuVf& CLCuVr所示。
本发明还进一步给出了应用上述引物的PCR检测方法，其以样品总DNA为模板，进行PCR扩增，反应结束后根据特异性扩增的1008bp DNA片段判定结果。
PCR扩增过程如下：
反应体系为20μL，即在0.2mL的PCR反应管中加入样品总DNA 2μL为模板，2μL 10×buffer(含Mg2+)、0.5μL dNTP、1对引物(10μmol/L)各0.5μL、2U/μL Taq DNA聚合酶1μL、DEPC水13.5μL。
反应程序为：94℃8min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，30个循环；72℃8min。
进一步，还可以将本发明引物及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。
本发明根据棉花曲叶病毒保守区序列设计引物，用于CLCuV的PCR检测。本发明检测方法具有特异性强和灵敏度高的特点，能够快速准确地判断样品是否有CLCuV，为该病毒的检测提供了保证。
附图说明
图1是应用PCR检测棉花曲叶病毒的结果，其中，M为DL2000DNA ladder，1为CLCuV发病棉花叶片，2为南瓜曲叶病毒(Squashleaf curl virus，SLCV)阳性材料，3为健康棉花叶片。
图2是本发明检测方法的灵敏度试验结果，其中，M为DL2000DNA ladder，1～6为发病样本，20μL反应体系中总DNA分别为3μL，2μL，1μL，0.5μL，0.25μL，0.125μL。
具体实施方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1引物设计和合成
根据CLCuV保守区(GenBank No.AJ00242)的公开序列，采用引物设计软件Primer 5.0设计引物，引物序列为：
CLCuVf(正向)：5’-ATTATGTCGAAGCGAGCTGC-3’
CLCuVr(反向)：5’-AGCTCTGGGAGTGCACAAGT-3’
实施例2总DNA的提取(CTAB法)：
1)取病叶1.5g于液氮中磨碎，加6mL 2-ME/CTAB抽提液混匀后转入50mL离心管中，于65℃温浴1hr，不时混匀；
2)用等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)抽提，10000rpm离心5min；
3)回收上相，加入等体积的CTAB沉淀液，颠倒混匀，于65℃温浴1hr；
4)10000rpm离心5min，移出上清，用1.5mL高盐TE缓冲液重悬沉淀，加2倍体积无水乙醇沉淀核酸；
5)12000rpm离心15min，70％乙醇洗涤；
6)37℃干燥后，溶于100μL MilliQ水中，-20℃保存备用。
实施例3PCR扩增方法的建立
以总DNA为模板，进行PCR反应。反应体系为20μL，在0.2mL的PCR反应管中加入样品总DNA 2μL为模板，2μL 10×buffer(含Mg2+)、0.5μL dNTP、1对引物(10μmol/L)各0.5μL、2U/μL TaqDNA聚合酶1μL、DEPC水13.5μL。
反应程序为：94℃8min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，30个循环；72℃8min。
实施例4 CLCuV PCR方法的特异性确定
以表现症状的棉花叶片总DNA为模板，以健康叶片和ToGMoV作为对照，通过PCR进行扩增。反应结束后根据CLCuV特异性扩增DNA片段(1008bp)的位置判定结果。
试验结果：
以表现症状的棉花叶片总DNA为模板，通过PCR检测可观察到1008bp的特异性扩增片段，而健康对照和ToGMoV则没有特异性扩增条带的出现。说明建立的PCR对CLCuV具有良好的特异性，可将CLCuV与其同属的ToGMoV区分开来，结果见图1。
实施例5 CLCuV RT-PCR方法的灵敏度确定
在20μL反应体系中，总DNA分别为3μL，2μL，1μL，0.5μL，0.25μL，0.125μL。检测结果如图2所示。表明建立的PCR方法可从0.25μL总DNA中成功检测出CLCuV，具有较高的灵敏度，符合检测的要求。
Claims (3)
1.一种棉花曲叶病毒检测用引物对，其核苷酸序列为：
CLCuVf：5’-ATTATGTCGAAGCGAGCTGC-3’
CLCuVr：5’-AGCTCTGGGAGTGCACAAGT-3’。
2.一种检测棉花曲叶病毒的方法，该方法以样品总DNA为模板，利用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果，其特征在于扩增的退火温度为56℃，延伸温度为72℃。
3.一种用于检测棉花曲叶病毒的试剂盒，其特征在于含有权利要求1所述引物对。
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| B D HARRISON et al..Detection and relationships of cotton leaf curl virus and allied whitefly-transmitted geminiviruses occurring in Pakistan.《Ann. appl. Bid.》.1997,第130卷第61-75页. |
| Detection and relationships of cotton leaf curl virus and allied whitefly-transmitted geminiviruses occurring in Pakistan;B D HARRISON et al.;《Ann. appl. Bid.》;19971231;第130卷;第61-75页 * |
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