CN102099687A - 使用调节剂治疗运动神经元疾病的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文所公开的发明描述了针对运动神经元疾病的新治疗靶点(在神经元中的微管动力学改变)；测量这种治疗靶点在已经罹患、早期或潜伏期的运动神经元疾病的受试者中的活性状态；发现调节患有运动神经元疾病的活体受试者中的神经元微管动力学的药物制剂；发现单独或组合施用这种药剂可以改善“货物”分子沿着以及通过轴突的MT介导的运输；发现这种对微管动力学改变的调节以及改善分子沿轴突的MT运输可以对患有运动神经元疾病的活体受试者提供显著的神经保护治疗，包括延缓症状和延长存活期；以及发现根据在患有运动神经元疾病的受试者中的治疗干预来监测神经元微管动力学使得诊断监测能够优化在个体受试者或在药物试验中的治疗方案和治疗策略。

Description

使用调节剂治疗运动神经元疾病的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本发明根据35U.S.C.§119(e)要求提交于2008年5月21日的美国临时专利申请No.61/128,522以及根据35U.S.C.§120要求提交于2007年1月5日的美国专利申请No.11650,020的优先权，后者根据35U.S.C.§119(e)要求提交于2006年1月5日的美国临时专利申请No.60/756,836和提交于2006年1月5日的美国临时专利申请No.60/756,952的优先权，在此将上述各专利申请的内容全文以引用的方式并入。

技术领域

本发明涉及影响运动神经元活性和动态性的新药物化合物。本发明还涉及这种新药物化合物在诸如肌萎缩性侧索硬化症之类的运动神经元紊乱的治疗中的用途。本发明还涉及筛选并监测试验受试者中这种运动神经元紊乱的存在。

背景技术

运动神经元疾病是一组损害或破坏运动神经元的进行性神经紊乱，运动神经元是控制随意肌活动(如说话、行走、呼吸和吞咽)的细胞。运动神经元疾病的典型症状包括进行性乏力、力量亏损和肌肉质量亏损(消瘦)、不自主运动(包括肌肉抽搐)、四肢痉挛或僵硬以及过度活跃的肌腱反射。运动神经元疾病的其它症状可以包括随意运动的放缓(运动迟缓)、活动不足(运动功能减退、面具脸)、刻板和重复的不自主运动(舞蹈手足徐动症)和呆板姿态或坐立不安(失静症)。在单纯性运动神经元疾病中，感觉、智力、记忆和个性不受影响。在诸如肌萎缩性侧索硬化症(ALS，一般称为路格里克氏病)的一些类运动神经元疾病中，肌肉无力是进行性的并最终导致死亡，通常与呼吸肌功能损失有关。其它类型的运动神经元疾病在许多年过程中缓慢恶化。

运动神经元疾病发生于成年人和儿童，并且在男性比女性中更常见。对于成年人，症状通常出现于40岁后，并且可以是不明确的，使诊断困难。对于儿童，特别是疾病的遗传形式来说，可以从出生时就存在症状。遗传形式的运动神经元疾病是由引起运动神经元退化的基因突变或基因缺失造成的。遗传性运动神经元疾病包括一组称为脊髓性肌萎缩的儿科疾病。非遗传性(也称散发性)运动神经元疾病是由未知因素造成的，虽然环境毒素或病毒可引发疾病。非遗传性运动神经元疾病包括ALS(虽然确实存在一些遗传形式)、进行性延髓麻痹、假性延髓麻痹、原发性侧索硬化症、进行性肌肉萎缩、帕金森氏症、糖尿病性神经病变、小儿麻痹症后期综合症和许多其它病症。还没有诊断运动神经元疾病的特定实验室试验。

ALS是周围神经系统的必然进行性不治之症。具体来讲，ALS是以轴突功能障碍为特征的运动神经元疾病。目前尚没有有效的治疗方法。FDA在1995年批准了利鲁唑(Rilutek

)的上市，但其仅仅起到适度延缓疾病恶化的作用。除了非遗传性ALS外，还存在遗传形式的ALS。高达20％的家族性ALS患者的超氧化物歧化酶(SOD1)基因存在突变。这一发现使得能够为ALS研发可靠的小鼠模型。此模型是SOD1-G93A转基因小鼠(“SOD1-G93A TGN小鼠”)，它出现模拟ALS的神经障碍，并导致在18-19周龄死亡。

在药物的临床前期发现和试验中，SOD1-G93A TGN小鼠已非常有用。该特定的ALS转基因小鼠模型显示出人突变Cu，Zn SOD的较高表达和较短病程(18-19周)。因此可以更快和更有效地评价潜在的治疗剂。另外，对此更激进的(即，高表达)小鼠模型的治疗效果的论证可以为临床预测成功提供最严格的标准。考虑到组织人体临床试验所需的费用和时间，只应该选用最具活性和疗效的候选药物在患者中进行评价。多种潜在的治疗剂已在SOD1-G93A TGN小鼠中进行了试验。在此模型中还进行了其它治疗方法的试验，如人神经干细胞移植。在此模型中，迄今已试验的所有治疗模式，包括利鲁唑和神经干细胞移植，仅可延缓疾病发作和死亡20到30天。

在SOD1-G93A TGN小鼠中，成功候选药物的相对缺乏反映了对运动神经元疾病的根本机理缺少基本的了解。如果知道涉及疾病恶化的基本分子靶和通道，那么就可以发现和研发对运动神经元疾病更有效的治疗方法。

在此将美国临时专利申请No.60/722,897、PCT/US2005/028069和美国专利申请No.10/279,399的内容全文以引用的方式并入。

发明内容

因此，在一个方面，本发明提供包含第一神经保护剂和第二神经保护剂的药物组合物。通常，至少一种神经保护剂是微管靶调节剂(MTMA)，如诺斯卡品。有时药物组合物仅包含一种神经保护剂，特别是微管靶调节剂(MTMA)，如诺斯卡品。有时药物组合物包含三种神经保护剂，特别是其中一种或两种神经保护剂为MTMA。神经保护剂选自：MTMA；抗炎剂，包括噻唑烷二酮和非噻唑烷二酮类过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂；离子通道调节剂，包括选择性和非选择性谷氨酸盐受体拮抗剂，如用于电压门控离子通道(包括电压门控钠通道(VGNH)和电压门控钙通道(VGCH))的拮抗剂，如N-甲基-D-天冬氨酸盐(NMDA)受体；α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPA)拮抗剂；神经胶质调节剂；低压敏感性钙通道(L-VSCCS)阻滞剂；N-型和P/Q-型电压依赖性钙电流抑制剂；CB1受体和CB2受体激动剂，如大麻素(包括内源性大麻素)和大麻素受体激动剂；AEA运输、水解和再摄取抑制剂，包括脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)抑制剂；抗氧化剂，如诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂、自由基捕捉剂/清除剂和金属离子螯合剂(包括铜(II)和锌(II)螯合剂)；神经营养因子；和凋亡抑制剂。组合物的每种神经保护剂可放在小瓶中与其它药剂分开。

在另外方面，本发明提供治疗运动神经元疾病的方法，包括施用含有一种、两种、三种或更多种神经保护剂的药物组合物。药物组合物可以还包含药物载体。

在另一方面，本发明提供治疗ALS的方法，包括施用含有一种、两种、三种或更多种神经保护剂的药物组合物。药物组合物可以还包含药物载体。这种治疗可以起到延缓ALS症状发作或减轻ALS症状严重程度的作用。

在另外方面，本发明提供缓解患者ALS症状的方法，包括给患者服用MTMA和药物载体。

在另一方面，本发明提供治疗运动神经元疾病的方法，包括给需要服药的患者服用治疗有效剂量的MTMA和药物载体。

在另一方面，本发明提供监测患有运动神经元疾病的受试者体内药剂疗效的方法。该方法包括使试验活体系统接触一种或多种药剂，并在一时间段内对活体系统施用同位素标记的底物，该时间段足以使同位素标记的底物进入一个或多个微管蛋白亚基并从而进入一个或多个微管分子并对其进行标记。然后从活体系统中获得包含运动神经元的第一样本，并且对来自第一样本的微管的亚群的同位素富集进行量化。量化或提供来自对照组系统的微管的亚群的同位素富集，并且将活体系统微管中的富集比例与对照组活体系统中的该比例作对比，从而确定药剂对运动神经元中的微管标记的影响。

在另一方面，所述方法还包括计算标记微管的动态性，其中对比步骤包括计算微管中的同位素富集或动态性与游离微管蛋白的同位素富集的比例，并将该比例与对照组活体系统中的同一比例进行对比。

在另外的方面，所述方法包括将来自试验活体系统的生长锥微管中的微管的同位素富集或动态性与来自对照组活体系统的生长锥微管中的标记微管的同位素富集或动态性进行对比。

在另一个方面，该方法利用了试验活体系统中轴突微管的微管同位素富集或动态与活体控制系统中轴突微管的微管同位素富集的对比。

在另外的方面，试验活体系统接触的药剂是神经保护因子。该药剂可以单独施用或与其它药剂组合施用。

在另一方面，本发明提供通过施用改变神经元微管动态性的药剂治疗运动神经元疾病的方法。

在另外方面，本发明提供筛选对运动神经元疾病有效的药剂的方法，包括使神经元与改变微管动态性的药剂接触。

在另一方面，本发明提供诊断或监测患有运动神经元疾病的受试者体内疗效的方法，包括在一时间段内对活体系统施用同位素标记的底物，该时间段足以使同位素标记的底物进入一个或多个微管蛋白亚基并从而进入一个或多个微管聚合体分子并对其进行标记，以及从活体系统中获得包含运动神经元的第一样本。对来自第一样本的轴突间室中的微管的亚群的同位素富集进行量化，以及对来自轴突间室的未结合标记微管蛋白的亚群的同位素富集进行量化。将轴突间室中的微管的亚群的富集比例与所述来自轴突间室的未结合标记微管蛋白的亚群的比例作对比，从而确定运动神经元疾病的存在与否。

在另一方面，本发明提供诊断或监测患有运动神经元疾病的受试者体内疗效的非侵入方法，包括：在一时间段内对活体系统施用同位素标记的底物，该时间段足以使同位素标记的底物进入一个或多个由神经元运输、且通常由神经元分泌的神经元分子，所述神经元例如为生长因子、神经递质、神经肽、蛋白质(包括酶和糖蛋白等)或经由微管运输系统沿轴突行程运输的其它分子(“货物分子”或“货物”)；以及从活体系统的组织或体液中获得第一样本或定时系列样本。基于在取样的一个或多个体液或组织中分泌的分子中的同位素标记的时间进程测量沿轴突运输并穿过轴突的分泌的分子中的同位素富集的时间进程。将在个体中取样的分泌的分子中的富集时间进程与在比较受试者或响应治疗干预的同一个体中分泌的分子中的富集时间进程进行对比。通过这种方法可以在个体中评价涉及分泌的分子的受损微管(MT)介导轴突运输的运动神经元疾病的存在与否。类似地，通过比较在个体或一组受试者中进行干预之前和之后的运输速率可以评价对在这类情况下进行治疗的反应。从患者的脑脊髓液(CSF)、血、尿或组织样本中取样，由此可以对由神经元分泌的生长因子、神经递质、神经肽、分泌的酶、糖蛋白或其它“货物”分子的运输速率进行动力学分析，目的是评价是否在这些受试者的神经元中存在微管介导的轴突运输受损的情况。

在另一方面，本发明提供评价和监测试验候选药物在患有运动神经元疾病的受试者中进行临床试验时的疗效的方法，包括在一时间段内对活体系统施用同位素标记的底物，该时间段足以使同位素标记的底物进入一个或多个微管蛋白亚基，并从而进入一个或多个微管聚合体分子并对其进行标记，以及从活体系统中获得包含运动神经元的第一样本。对来自第一样本的轴突间室中的微管的亚群的同位素富集进行量化，以及对来自轴突间室的未结合标记微管蛋白的亚群的同位素富集进行量化。将轴突间室中的微管的亚群的富集比例与所述来自轴突间室的未结合标记微管蛋白的亚群的比例作对比，从而确定运动神经元疾病的存在与否。对不同的治疗组进行统计比较，从而评价所述候选药物的疗效，并可以进行重复测量和分析以监测所述候选药物在治疗期间内的治疗活性或疗效变化。

附图说明

图1A和图1B示出标记的氢(²H或³H)从同位素标记的水进入选定的游离氨基酸的交换途径。以示例的方式给出两种NEAA(丙氨酸、甘氨酸)和一种EAA(亮氨酸)。图1A示出丙氨酸和甘氨酸。图1B示出亮氨酸。缩写词：TA，转氨酶；PEP-CK，磷酸烯醇丙酮酸盐羧激酶；TCAC，三羧酸循环；STHM，丝氨酸四氢叶酸甲基转移酶。图1C示出通过用于蛋白质合成的H₂ ¹⁸O进行的游离氨基酸的¹⁸O标记。

图2示出了²H标记的微管蛋白二聚体向微管聚合体当中的结合。

图3.小鼠大脑中微管蛋白二聚体和微管的体内交换。(A)分离神经元微管(MT)群的策略的示意图。(B)通过抗-tau柱分离的输入的抗-tau和抗-MAP2免疫印记(泳道1)、tau非相关(泳道2)和tau相关(泳道3)部分显示tau相关MT的定量捕获；MAP2相关的MT在未结合部分。(C)从重水(²H₂O)进入微管蛋白二聚体和不同的MT部分当中的²H结合的动力学。小鼠在不同时间用体内水中大约5％的²H₂O标记，切除大脑并水解如(A)中分离的MT群。通过NCI-GC/MS测量²H到丙氨酸的C-H键当中的结合(平均值±S.D.；n＝3)，并表示为分数转换(在标记期间新合成的丙氨酸的％)。单指数曲线拟合显示，在皮质中t_1/2约5-6小时，在海马体中t_1/2约3小时，对于微管蛋白二聚体在约20％新丙氨酸时趋平，或者对于tau-和MAP2/STOP-MT分别为该值的一半或三分之一。

图4.在SOD-G93A TGN小鼠的进行性轴突功能障碍过程期间的微管动力学测量。分别在7周龄(A)、8.5周龄(B)和12.5周龄(C)时用²H₂O标记野生型和SOD1-G93A TGN小鼠(每组n＝3只)。切除坐骨神经，并水解纯化的不同微管群(生长锥和轴突柄)。通过NCI-GC/MS测量²H到丙氨酸的C-H键当中的结合，并表示为分数合成(在标记期间新合成的％；平均值±SD)。动物用²H₂O标记48小时(约5％的体内水富集)。

图5.基于步长测量，由野生型和SOD1-G93A TGN小鼠行走产生的足迹模式的定量分析。7周龄时，SOD1-G93A TGN小鼠的步长测量与由野生型小鼠产生的步长测量没有什么差别，但到8.0周龄时，与野生型对照组小鼠相比，SOD1-G93A TGN小鼠开始显示步长缩短。图中显示对于n＝3只小鼠每组在各周龄和每次测量时的平均值±SD。

图6.诺斯卡品-MK801组合延缓SOD1-G93A TGN小鼠的疾病发作和死亡。在疾病的早期(即，症状前期)阶段(7周)开始进行一种药物和两种药物的治疗。SOD1-G93A TGN小鼠用诺斯卡品(0.2mg/kg体重)和/或MK-801(12mg/kg体重/天)每周治疗3次。小鼠接收腹腔内给药的诺斯卡品，MK-801在饮用水中给药。在步长测量期间，用诺斯卡品-MK801组合治疗的小鼠的表现明显优于单独使用任一种化合物治疗的小鼠。与未治疗的SOD1-G93A TGN小鼠相比，诺斯卡品与MK-801的组合明显地延缓症状的发作(32天)并延缓死亡发作(21天)。图中显示对于n＝3只小鼠每组在各周龄和每次测量时的平均值±SD。

图7.诺斯卡品-MK801组合对12.5周龄SOD1-G93A TGN小鼠坐骨神经中的微管亚群中的相对动力学(²H标记结合)的影响。与未治疗的小鼠相比，SOD1-G93A TGN小鼠中的诺斯卡品-MK801组合使微管动力学特性的降低为，对生长锥为35％，对轴突柄为50％。动物用²H₂O标记48小时。图中显示对n＝3只小鼠每次测量的平均值±SD。

图8示出神经元内微管群的具体分布。

图9示出若干不同的NMDA受体拮抗剂。

图10示出对ALS的SOD1小鼠模型施用诺斯卡品-MK801的18周结果。

图11A、11B和11C示出采用本发明时，第一次出现症状的时间、临床发病的时间和死亡时间的差别。

图12示出不同治疗的存活期的总体统计。

图13是显示利用对神经元微管动力学的影响(即，通过本发明的方法收集的数据)作为决定继续或停止尝试的手段来进行药物发现、研发和批准(DDDA)过程的示意图。

图14示出本发明在药物发现过程中的用途。

图15显示单独使用诺斯卡品和单独使用MK801的结果。

图16.MTMA/KM-ID05有力地减少13周龄SOD1^G93A小鼠的中枢神经系统(CNS)和周围神经系统(PNS)中的高动力微管(n＝3；平均值±SD)。

图17.在SOD1^G93A小鼠中，MTMA/KM-ID05提高活动能力并延缓疾病发作。治疗始于症状期(10周龄)。使用步长测量对小鼠的活动能力异常进行记分(n＝20；平均值±SD)。

图18.在15周龄的SOD1^G93A小鼠中用MTMA/KM-ID05治疗的神经保护效果。(A)尼氏染色的脊髓截面，显示野生型(WT)未治疗和治疗的SOD1^G93A小鼠的坐骨运动神经池(箭头)中的运动神经元。(B)每个实验组中运动神经元的存活数(平均值±SD)。

图19.在有症状的SOD1^G93A小鼠中，使用微管动力学试验作为临床前新治疗药剂的药物发现平台。通过比较各种药剂使微管动力学恢复到在WT同窝仔中观察到的水平的能力来测量神经保护活性。将神经保护作用百分数定义为，相对于WT同窝仔来说，药剂稳定化未治疗的SOD1^G93A的高动力微管的能力。因此，较高的值(高达100％)表示较高的神经保护活性。治疗均始于10周龄的症状期(n＝3只小鼠/组)。在治疗3周(13周龄)后处死小鼠以测量脊髓运动神经元的神经元间室中的微管动力学(这里所有间室的平均值显示为平均值±SD)。

图20.(A)五种神经保护候选药物的存活图和存活统计分析。(B)对于不同的药剂，以微管动力学对比SOD1^G93A小鼠的存活结果(平均值±SD)作图表示生物标志物预测能力。

图21.由ALS-SOD1动物研究选定的潜在临床药剂与FDA批准的药物Rilutek

的对比。

图22示出诺斯卡品的结构。

图23.与正常野生型(WT)同窝仔相比，在转基因有症状的SDO1G93A的坐骨神经运动轴突中的2H标记的微管蛋白的MT介导慢速轴突运输减少。每个数据点表示30-35ml/kg ²H₂O的单剂量注射在21天之后处死的13周龄鼠L5根部和坐骨神经处的连续2-mm片段。然而，用MTMA治疗3周后，²H-微管蛋白的微管动力学和慢速轴突运输大大恢复，而利鲁唑则没有明显效果。

图24示出测量健康(对比退化)的运动神经元的神经元突触小泡货物分子的分泌速率的一个示例性动力学技术模型。目标是提供在受疾病影响的神经元中的受损MT介导运输的具体、实时指标。基于MT的运输系统是主要的细胞骨架系统之一，驱动蛋白和动力蛋白沿着该系统运送产生力并带动许多细胞组分(突触小泡)运输的蛋白质。MT介导的轴突运输是主要的神经元沟通和运输网络，其用作分泌的小泡状货物(如生长因子、神经递质、酶和糖蛋白)的通路。这里试验的基本策略是，经干扰MT动力学，使运输并然后分泌的2H标记的小泡状“货物”的速率(即，从在细胞体中的合成到从突触中释放的时间)受MT运输系统的影响，并可通过CSF的收集进行体内测量。经脉冲剂量的重水(²H₂O)之后，基于在CSF和在脊髓运动神经元中并发的滞留中出现的延迟动力学，基于在退化的运动神经元中的2H标记的小泡状货物分子，MT介导的快速轴突运输减慢。

图25示出，(A)对转基因SOD G93A小鼠(代表ALS的动物模型)供给重水(²H₂O)以标记运动神经元中分泌的分子(n＝总共30只小鼠)。对于以最快速度移动的由160-nm小泡组成且基于MT-介导的轴突运输的运输物质来说，从反面高尔基体网络(TGN)到质膜(轴突末梢)的记录速度为约250毫米/天或约3μm/s。因此，预计小泡在约1.2天内从细胞体移动到3cm轴突的末梢(在具有1m轴突的人体受试者中，这可能需要约4到5天)。在小鼠中(n＝6/时间点)，在系列时间点(24小时、48小时、72小时、5天和10天)收集CSF(5-7微升/小鼠)和血浆(100微升/小鼠)。使用市售的抗体，通过免疫沉淀反应从CSF中分离运动神经元分泌的小泡生长因子(例如，神经调节蛋白-1[NueR-1])和糖蛋白嗜铬粒蛋白B[Chr-B]。(B)经30-35ml/kg ²H₂O的腹腔内脉冲剂量之后，在标记后24、48和72小时、5天及10天从13周的野生型(WT)和有症状的SOD1 G93A小鼠中收集CSF。CSF样本首先用蛋白A/G珠进行IgG免疫耗竭，然后通过相继与神经调节蛋白-1抗体珠的结合进行分级。通过在110C用6N HCl处理16小时来水解洗脱液。蛋白质衍生的氨基酸被衍生成五氟苄基衍生物，并通过GC/MS测量由神经调节蛋白-1释放的丙氨酸中的²H结合。采用相同的方案，通过相继与嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]抗体结合从神经调节蛋白-1[NeuR-1]未结合物质中捕获糖蛋白嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]。(C)显示在13周正常野生型(WT)和转基因有症状的SOD1 G93A小鼠的CSF神经调节蛋白-1[NeuR-1]和嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]中出现²H标记的时间进程，分泌的蛋白质(神经调节蛋白-1[NeuR-1]和嗜铬粒蛋白B[Chr-B])在从CSF和血液中分离后，通过在110℃用6N HCl处理16小时进行水解。蛋白质衍生的氨基酸衍生成五氟苄基衍生物，并且通过GC/MS测量²H从²H₂O向衍生的丙氨酸当中的结合，如在别处所详述的那样[Fanara，P.等，In vivo mea surement of microtubule dynamics using stable isotope labeling with heavy water.Effect of taxanes.J.Biol.Chem.279，49940-49947(2004)；Fanara P.等，Stabilization of hyperdynamic microtubule is neuroprotective in ALS.J.Biol.Chem.282，23465-23472，(2007)，上述内容均以引用的方式并入本文]。²H富集计算为丙氨酸衍生物的(M+1)质量同位素异位体比天然丰度的百分比增加。这些结果与转基因SOD1 G93A小鼠显示MT-介导的快速轴突运输减慢的模型一致。

图26显示以脉冲²H₂O标记方法测量含突触小泡的神经调节蛋白-1[NeuR-1]和嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]从正常野生型(WT)和转基因有症状的SOD1 G93A小鼠脊髓腰部区运动神经元中由MT-运输介导的分泌速率。(A)使用突触小泡分离试剂盒(SIGMA公司)从脊髓腰部区分离突触小泡。首先利用使用抗突触小泡蛋白抗体的免疫印迹试验检查富集的突触小泡部分的存在并确认富集步骤，抗突触小泡蛋白抗体对小泡膜结合蛋白质突触小泡蛋白是特异性的[Gingel.等，The synaptic vesicle protein Synaptophasyn：purification and characterization of its channel activity.Biophys.J.，83，3223-3229，(2002)，其内容以引用的方式并入本文]。(B)经30-35ml/kg ²H₂O的腹腔内脉冲剂量，在标记后24、48和72小时从13周的野生型(WT)和有症状的SOD1 G93A小鼠(n＝3，平均值±SD)中收集脊髓腰部区。通过相继与神经调节蛋白-1抗体珠结合对从脊髓腰部区富集的突触小泡部分分级。通过在110C用6N HCl处理16小时来水解洗脱液。蛋白质衍生的氨基酸被衍生成五氟苄基衍生物，并通过GC/MS测量由神经调节蛋白-1释放的丙氨酸中的²H结合。采用相同的方案，通过相继与嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]抗体结合从神经调节蛋白-1[NeuR-1]未结合物质中捕获糖蛋白嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]。显示含突触小泡的²H-标记神经调节蛋白-1[NeuR-1]和²H-标记嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]从13周野生型(WT)和转基因有症状的SOD1 G93A小鼠的脊髓腰部区滞留的动力学的时间进程。这些结果与出现同样的货物分子²H-标记神经调节蛋白-1[NeuR-1]和²H-标记嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]进入CSF的动力学延迟一致。这些数据证实了转基因SOD1 G93A小鼠显示出MT-介导的快速轴突运输的减慢。

图27示出用MTMA诺斯卡品治疗后，含突触小泡的²H标记神经调节蛋白-1[NeuR-1]和²H-标记嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]的由MT介导的快速轴突运输速率正常化。用MTMA诺斯卡品治疗3周(100mg/kg/d和200mg/kg/d)后，供给30-35ml/kg ²H₂O CSF的腹腔内脉冲剂量，分别在24、48和72小时从13周野生型(WT)和有症状的SOD1 G93A小鼠中收集CSF以及脊髓腰部区。CSF分泌速率和含突触小泡的²H-标记神经调节蛋白-1[NeuR-1]或²H-标记嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]的滞留神经元动力学的测量如上所述(图23和24)。这些结果与转基因SOD1 G93A小鼠显示出快速轴突运输的减慢和诺斯卡品改善转基因SOD1 G93A小鼠中的这种延迟的快速轴突运输的模型一致。通过比较使在取样的体液或组织中出现标记的分泌突触小泡“货物”分子的时间进程、程度或模式正常化的能力来评价药剂的神经保护作用。

具体实施方式

运动神经元及运动神经元疾病的生物化学和细胞生物学

高度不对称的神经元形态的特征在于存在着轴树突触过程，这种过程可以达到细胞体直径的若干数量级的长度，这种神经元形态是通过细胞骨架在很长的距离上持续这种过程并支持细胞器、小泡或蛋白质亚基及复合体(“货物”)运输的能力确定的。主要细胞骨架系统之一是基于微管的运输系统，驱动蛋白和动力蛋白沿着该系统运送产生力并带动许多细胞组分(突触小泡)运输的蛋白质。微管(MT)介导的轴突运输是主要的神经元通讯和运输网络，所述网络充当包括生长因子(例如神经调节蛋白-1[NueR-1])、神经递质(例如乙酰胆碱[Ach])、神经肽(例如乙酰胆碱[Ach])、酶(例如乙酰胆碱酯酶[AChE])和糖蛋白(例如嗜铬粒蛋白B[Chr-B])在内的各种类型分泌的神经递质的通路。“货物”分子从作为它们初生位点的运动神经元的细胞体移动到神经末梢，在那里它们被释放到突触间隙里。脑脊髓液(CSF)是由神经元分泌的神经肽、酶和糖蛋白的介质。分泌的生长因子(例如神经调节蛋白-1[NueR-1])、神经递质(例如乙酰胆碱[Ach])、神经肽(例如乙酰胆碱[Ach])、酶(例如乙酰胆碱酯酶[AChE])和糖蛋白(例如嗜铬粒蛋白B[Chr-B])也可以被释放出来并在血液中循环。血液或腰椎CSF中的生长因子、神经递质、神经肽、酶或糖蛋白的体内动力学测量可以被用作MT功能的直接指标，使得能够监测治疗引起的快速轴突运输的改善和神经系统中的分泌功能。运动神经元疾病(像ALS)、包括糖尿病性神经病变在内的各种神经病变和帕金森氏症是共有诸如轴突运输受损和分泌功能改变之类的变化的病症。

神经元中有大量的微管(“MT”)，它们在神经元中促进神经突起(轴突和树突)的形成并对其赋予稳定性。它们是神经元形态的首要决定因素，促进神经突起(轴突和树突)的形成并对其赋予稳定性。轴突微管的组装和去组装过程(称为“微管动力学”)构成它们确定和保持神经元形态的能力的基础。对神经元的结构稳定性至关重要的这一过程也代表了神经元内的信号通路。微管动力学主要由微管相关蛋白(MAP)调节。神经元MAP具有特定的极性分布，并且在微管的稳定化方面发挥突出的作用。

神经元(如运动神经元)具有若干不同的神经元微管群体，所述群体通常按它们结合的MAP进行分类。“神经元微管”是指由在活细胞中单独、成对、三个一组或成束出现的微管蛋白的聚合体组成的蛋白质结构。“微管蛋白”是指微管的主要蛋白质组分。微管蛋白是由两种球状多肽，即阿尔法-微管蛋白和贝它-微管蛋白(α-和β-微管蛋白)组成的二聚体。微管由二聚体α-和β-微管蛋白组装。

神经元微管存在于不同的神经元间室中(例如，胞体、树突和轴突)并与不同的MAP相结合(例如tau、MAP2和STOP)。微管需要建立并保持神经元分化和神经递质物质沿轴突向远端突触的长程运输。

一般来说，主要有三类神经元微管：生长锥(亦称“轴突末梢”或“轴突尖端”)微管(在本文及附图中也称为“tau-MT”)；树突微管(在本文中也称为“MAP-2MT”)和小丘及轴突柄微管(在本文及附图中也称为“STOP-MT”)。一般来说，所述术语源于与各个种类结合的微管相关蛋白。“MAP”或“微管相关蛋白”是经与微管结合后改变其功能和/或特性的蛋白质。因此，举例来说，生长锥和轴突末梢微管的捕获是通过利用与tau抗体的亲和结合完成的。然后通过与MAP2抗体的亲和结合捕获tau-非结合材料(树突微管)，在MAP2-非结合部分只留下小丘与轴突柄微管(STOP-MT)。或者，可以通过利用STOP-MT相对于其它MT亚群的独特能力将其予以直接隔离，从而抵抗在低温和毫摩尔CaCl₂浓度下的解聚。

用在本文中的“tau”或“tau蛋白”或“tau MAP”是从大脑中分离的主要类别的微管相关蛋白(MAP)。在神经细胞中，tau高度富集于轴突生长锥。Tau蛋白促进微管蛋白体外聚合的成核(引发)过程。已知Tau是动态轴突生长锥微管在大脑中转换/组装的调节剂。化学改性的tau蛋白似乎还涉及见于阿尔茨海默症的神经原纤维缠结和神经纤维网线的形成和/或构造。

用在本文中的“MAP2”或“微管相关蛋白-2”是高度富集于神经元树突微管中的高分子量的微管相关蛋白。在某些情况下，需要MAP2用于微管蛋白组装成微管并稳定组装的微管，调节它们的动力学。

用在本文中的“STOP”或“稳定性小管惟一多肽”是神经元Ca²⁺-钙调蛋白调节的微管相关蛋白。STOP针对由低温、毫摩尔钙或药物引起的体外去组装而长期地稳定微管。

“神经元冷稳定微管”是指大量的轴突微管的亚群，它们对于由药物和低温两者引起的去组装是稳定的。对药物和低温所致的微管去组装的抵抗性主要是由于聚合体与STOP的结合。

发明内容

本文中公开的发明涉及：(1)通过利用新的同位素标记技术直接测量微管动力学发现运动神经元疾病的新治疗靶点-即，神经元微管的动态性(即由微管蛋白二聚体组装和去组装微管的特定亚群的速率)。(2)发现可以通过利用同位素标记技术以活的动物或人体受试者测量神经元微管的动态性，并且这种动态性在诸如ALS之类的运动神经元疾病中有显著的改变，甚至在动物或人体受试者表现出身体症状或神经功能损失之前即如此。(3)发现可以通过服用某些药物来调节诸如ALS之类的运动神经元疾病中的神经元微管的动态性改变，所述的药物包括但不限于诺司卡品、诺考达唑、紫杉烷类以及单独或与靶向其它神经元系统、受体或通路的药剂结合给予的其它药剂。(4)发现给已经罹患或具有早期运动神经元疾病(如ALS)的动物或人体受试者单独或与药剂结合服用调节神经元中微管动力学的药剂可以显著地延缓或阻止运动神经元疾病中的神经功能损失，包括延缓运动神经元疾病体征和症状的发作、拖延体征和症状的发展和推迟死亡时间(即延长存活期)，从而提供成功的神经保护治疗；(5)发现作为对服用旨在提供神经保护治疗的药剂的反应，对已经罹患或具有早期运动神经元疾病(如ALS)的动物或人体受试者监测神经元微管动力学可使得能够确定最佳剂量、药物、药物组合、用药方案、治疗时机、治疗持续时间或在个体受试者或患有运动神经元疾病的受试者药物试验中的最佳治疗策略的其它方面(即诊断监测)。

总的来说，本文公开的发明叙述了运动神经元疾病(神经元中微管动力学的改变)的新治疗靶点；测量这种治疗靶点在已经罹患、具有早期或潜伏的运动神经元疾病的受试者中的活性状态的方法；调节患有运动神经元疾病的活体受试者中的神经元微管动力学的药剂的发现；发现单独或组合服用这种药剂可以对患有运动神经元疾病的活体受试者提供显著的神经保护治疗，包括延缓症状和延长存活期。以及发现作为对治疗干预的反应，对患有运动神经元疾病的受试者监测神经元微管动力学可使得能够对个体受试者或者对药物试验诊断监测最佳化的治疗方案和策略。

在ALS中应用神经保护策略具有相当大的吸引力。然而迄今为止，这种方法存在着固有的问题，包括缺乏确定患者对ALS的危险性的手段；缺少反映临床前期疾病活动的实验室指标；缺少行之有效的神经保护剂；以及无法知道治疗的最佳时机、剂量或用药方案。对散发性及大多数类型的家族ALS缺乏具体的生化指标也排除了对处于危险状态的个体进行临床前期确定的可能性。本发明公开了对公认的ALS动物模型(SOD1-G93A TGN小鼠)中的异常微管动力学进行的生化测量，该测量首次表明真正生化上的疾病发作早于临床缺损的发展。因此，神经元微管动力学的测量为神经保护化合物的应用提供了“治疗窗”，用以防止最后发生导致神经元死亡的一连串后果。由于是多因素的下游致病途径刺激的运动神经元疾病(ALS)，可能有必要采取组合的方法拖延疾病恶化的速度和延长存活期。

本发明涉及下述的发现，在诸如ALS之类的运动神经元疾病中，神经元微管动力学发生了显著的变化，并且通过调节小丘及轴突柄(结构性)微管的微管动力学可以使具有早期、已罹患或潜伏的运动神经元疾病的受试者的运动神经元功能损失最小化。这样导致了多种应用，包括用于治疗运动神经元疾病的组合物，以及为了能够调节微管、运动神经元和运动神经元疾病而筛选候选药物并优化治疗方案(例如通过诊断监测)。此外，本发明涉及使用多种组合物调节运动神经元功能和疾病，所述多种组合物在运动神经元生理学上的不同点起作用，并因此协同地起到保护运动神经元功能的作用。

因此，本发明还涉及组合物和为了能够调节运动神经元中的微管动力学而筛选候选药物的方法。此外，本发明提供用以治疗、减轻或预防运动神经元疾病的组合物，既有单一化合物，也有化合物的组合。

本发明第一次基于对在患有运动神经元疾病的活体动物或人体受试者的周围神经中存在的大量伸展和稳定的微管聚合体的组装和破裂速率进行测量。不受理论的约束而言，看起来有些运动神经元疾病由细胞内对负责营养物质及其它关键元素沿轴突运输关键性的细胞骨架成分的功能障碍引起。本文中公开了通过利用新型的同位素/质谱技术直接测量患有运动神经元疾病的动物的周围神经中的神经元微管动力学发现，在轴突中微管聚合体的转换(即不断的裂解和重构状态)显著增加，这似乎干扰分子(包括营养物质和为保持轴突本身的稳定性所必需的其它成分)的流动。因此申请人在此公开了一个新的基本性机制的首次发现，见于患有运动神经元疾病的活体受试者中的导致轴突(或“轴突突起”)稳定性的微管的转换增加-轴突的不稳定性以及由此产生的与运动神经元疾病相关的症状。

在正常小鼠中，坐骨神经中的结构性微管显示出微管蛋白二聚体的极低组装和去组装或转换速率(见图1和3)。相反，SOD小鼠显示出坐骨神经中同样的结构性微管的极端不稳定性或动态性(见图4)。重要的是，这种坐骨神经中的结构性微管的稳定性损失在可以观察到这些动物的行为体征或症状之前就存在，这证实了其在疾病的发病机制中起主要而不是次要的作用。ALS的轴突功能障碍先于并随后导致了后来的SOD小鼠运动神经元中的轴突运输的损失，因此ALS的轴突功能障碍似乎是由于正常地保持轴突微管聚合体在这些神经元中稳定的控制过程的失灵所致。

因此，通过调节微管的组装和去组装的速率(即，它们的“动态性”)来对其进行调节的药物有可能针对ALS及其它运动神经元疾病的核心发病机制进行治疗。微管调节剂是已知的，但它们从来没有被视为对诸如ALS、帕金森氏症和糖尿病性神经病变之类的运动神经元疾病具有潜在的治疗用途。申请人对ALS的SOD转基因小鼠模型中的轴突功能障碍的动力学基础进行了确认，由此对潜在的微管动态性调节剂赋予了新治疗作用的可能性。

随后给活体动物单独或与作用于其它神经元受体、通道或系统的药物结合服用已知与微管系统相互作用的药物，其结果证实了微管动态性提供了运动神经元疾病中的新的基本性治疗靶点的发现。特别是，给SOD1^G93ATGN小鼠服用诺斯卡品-MK801组合不仅推迟了病征的发作并延长了存活期(见图6)，而且也使神经元微管动态性向着正常的方向降低(见图7)。异常微管动态性的部分正常化(生化量度)与临床疾病的部分好转(功能性神经病学结果)之间的相关性支持微管动力学与运动神经元疾病之间的病因性联系，并且还建议了进一步改进治疗的余地(即，如果可以确定出使变化了的微管动力学完全正常化的药剂)。

利用本文中述及的SOD转基因小鼠坐骨神经中的微管动力学试验作为药物活性的生物标记还可以为包括ALS、帕金森氏症和糖尿病性神经病变在内的运动神经元疾病快速优化新的治疗类型。通过一般性筛选或者通过特定药物类别的筛选可以为症状发生前的SOD转基因小鼠快速测试出最佳剂量、化合物、用药方案等(例如在数日或数周内)，而不是不得不等到症状评分或者死亡。

本发明进一步提供对患有神经病变或运动神经元疾病(如ALS、帕金森氏症和糖尿病性神经病变)的患者进行微管动力学试验的方法。I/II期临床试验原则上可以包括用于微管动力学的量化的坐骨神经活检。因此，运动神经元疾病(如ALS)的可靠性生物标记的可得性-即，患有ALS的患者所共有、且在疾病中起到病因作用并因此提供药物干预靶点及药效量度的可测量的生化异常-为测试ALS(以及其它运动神经元疾病)药物的类型提供了若干独特的优点。无效的药剂被快速地确定出来，从而避免浪费宝贵的临床试验时间、资金和患者资源。剂量优化、患者分级和亚组分析是在运动神经元疾病的临床试验中动力学生物标记提供的一些其它的应用。

施用同位素标记的前体

作为本发明方法的第一步，对活体系统施用同位素标记的前体。“活体系统”包括但不限于细胞、细胞系、疾病的动物模型、豚鼠、兔、狗、猫、其它宠物动物、小鼠、大鼠、非人的灵长类动物和人。“个体”是脊椎动物，通常是哺乳动物，特别是人，而“哺乳动物”是指分类上属于哺乳纲的任何成员，包括但不限于：人以及非人的灵长类动物，如黑猩猩及其它猿和猴物种；家畜，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，如狗和猫；实验动物，包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠和豚鼠等。所述术语不指示具体的年龄和性别。因此，不论是雄性还是雌性的成年和新生的受试者以及胎儿均认为包括在内。一般来说，用在本文中的“试验受试者”是正在进行脊髓运动神经元微管动力学变化和/或运动神经元疾病症状变化评价的个体。

虽然试验活体系统中可以采用各种生物样本，但通常在本文中使用的是运动神经元样本。运动神经元样本的例子包括但不限于坐骨神经或周围神经组织以及来自大脑运动皮层的样本。

测量分子流率的第一步涉及对活体系统施用同位素标记的前体分子。同位素标记的前体分子的施用方式可以根据同位素标记的前体分子的吸收性质和每种化合物靶向其中的具体生物合成库而有所不同。可以直接对包括实验动物和人在内的生物体施用前体供体内分析。

一般地，适当的施用方式能至少在短暂的时段内在生物合成库以内和/或在提供这种库的储囊中产生稳态水平的前体。通常采用血管内或口服给药途径给包括人在内的生物体施用这种前体。任选当与缓释前体组合物配合使用时，诸如皮下或肌内给药的其它给药途径也是合适的。通常在无菌药用辅料中制备注射用组合物。选择采取哪种途径施用同位素标记的前体分子是现有技术范围内已知的。

同位素标记的前体分子可以是稳定同位素或放射性同位素。可以使用的同位素标记包括但不限于²H、¹³C、¹⁵N、¹⁸O、³H、¹⁴C、³⁵S、³²P、¹²⁵I、¹³¹I或存在于器官系统中的元素的其它同位素。

在一个实施例中，同位素标记为²H。

前体分子可以是具有结合到所关注的“单体”或“亚基”当中的同位素标记的任何分子，或者可以是单体本身。同位素标记可用于修饰本文中公开的所有前体分子以形成同位素标记的前体分子。“同位素标记的底物”包括能结合到在活体系统中所关注的分子当中的任何同位素标记的前体分子。同位素标记的底物的例子包括但不限于²H₂O、³H₂O、²H-葡萄糖、²H-标记的氨基酸、²H-标记的有机分子、¹³C-标记的有机分子、¹⁴C-标记的有机分子、¹³CO₂、¹⁴CO₂、¹⁵N-标记的有机分子和¹⁵NH₃。

整个前体分子可以结合到一个或多个微管蛋白二聚体亚基当中。或者，前体分子的一部分可以结合到微管蛋白二聚体亚基当中。

蛋白质前体分子可以是现有技术中已知的任何蛋白质前体分子。这些前体分子包括但不限于CO2、NH3、葡萄糖、乳酸盐、H2O、醋酸盐和脂肪酸。

蛋白质的前体分子还可以包括一种或多种氨基酸。所述前体可以是任何氨基酸。前体分子可以是单或多氘化的氨基酸。例如，前体分子可以是一种或多种¹³C-赖氨酸、¹⁵N-组氨酸、¹³C-丝氨酸、¹³C-甘氨酸、²H-亮氨酸、¹⁵N-甘氨酸、¹³C-亮氨酸、²H₅-组氨酸和任何氘化的氨基酸。可以施用(例如)未稀释的标记氨基酸或以非标记的氨基酸稀释的标记氨基酸。所有同位素标记的前体均可商购，例如购自剑桥同位素实验室(安多弗，马萨诸塞州)。

蛋白质前体分子还可以包括翻译后或翻译前修饰的氨基酸的任何前体。这些前体包括但不限于：甲基化作用的前体，如甘氨酸、丝氨酸或H₂O；羟基化作用的前体，如H₂O或O₂；磷酸化作用的前体，如磷酸盐、H₂O或O₂；异戊烯化作用的前体，如脂肪酸、醋酸盐、H₂O、乙醇、酮体、葡萄糖或果糖；羧化作用的前体，如CO₂、O₂、H₂O或葡萄糖；乙酰化作用的前体，如醋酸盐、乙醇、葡萄糖、果糖、乳酸盐、丙氨酸、H₂O、CO₂或O₂；糖基化作用以及现有技术中已知的其它翻译后修饰的前体。

游离氨基酸中存在的标记度可以用实验方法予以确定，或者可以根据氨基酸中标记位点的数目进行假设。例如，当使用氢同位素为标记时，可以确定在暴露于体内水中的²H₂O期间在游离氨基酸的C-H键中(或者更具体地说，在tRNA-氨基酸中)存在的标记。每种非必需的氨基酸中的C-H键的总数是已知的，例如丙氨酸中4个，甘氨酸中2个，等等。

蛋白质的前体分子可以是水(例如重水)。C-H键上的氢原子是对测量由²H₂O进行蛋白质合成有用的氨基酸上的氢原子，因为蛋白质的O-H和N-H键在水溶液中不稳定。如此，在没有由游离氨基酸合成蛋白质的情况下发生²H-标记从²H₂O进入到O-H或N-H键当中的交换。在特异性酶催化的中间代谢反应期间，C-H键经历从H₂O进入到游离氨基酸当中的结合。因此施用²H₂O后在蛋白结合的氨基酸的C-H键上存在²H-标记意味着蛋白质由在²H₂O暴露期间呈游离形式的氨基酸组装—例如，蛋白质是新合成的。从分析上来说，使用的氨基酸衍生物必须包含所有的C-H键，但必须消除所有潜在污染性的N-H和O-H键。

来自体内水中的氢原子(例如氘或氚)可以结合到游离氨基酸当中。标记水中的²H或³H可以通过中间代谢的反应进入到细胞中的游离氨基酸当中，但²H或³H不能进入到存在于肽键或与转移RNA结合的氨基酸当中。游离的必需氨基酸可以通过快速可逆的转氨基反应将体内水中的单个氢原子结合到α-碳C-H键当中。游离的非必需氨基酸含大量可代谢交换的C-H键，这是当然的，因此预计由新合成的蛋白质中的²H₂O会显示出每个分子较高的同位素富集值。

本领域技术人员将会意识到，体内水中的标记氢原子可以经由其它生化途径结合到其它氨基酸当中。例如，现有技术中已知的是，水中的氢原子可以经由柠檬酸循环中的前体α-酮戊二酸盐的合成结合到谷氨酸盐当中。已知谷氨酸盐又是谷氨酸、脯氨酸和精氨酸的生物化学前体。作为另一个例子，体内水中的氢原子可以结合到翻译后修饰的氨基酸当中，如3-甲基-组氨酸中的甲基、羟脯氨酸或羟赖氨酸中的羟基等。其它氨基酸合成途径是本领域技术人员已知的。

氧原子(H₂ ¹⁸O)也可以通过酶催化的反应由¹⁸O₂结合到氨基酸当中(包括羟脯氨酸、羟赖氨酸或其它翻译后修饰的氨基酸)。例如，在酶催化的反应期间可发生氧交换到氨基酸的羧酸部分当中。标记的氧结合到氨基酸当中是本领域技术人员已知的。

标记水中的氢和氧标记也可以通过翻译后修饰结合到氨基酸当中。在一个实施例中，翻译后修饰可能已经通过翻译后修饰之前的生物合成途径包括了标记的氢或氧。在另一实施例中，无论是在翻译后修饰步骤(例如，甲基化、羟基化、磷酸化、异戊烯化、硫酸化、羧化、乙酰化、糖基化或其它已知的翻译后修饰)之前或是之后，翻译后修饰都可以结合涉及体内水中自由交换标记的氢的代谢衍生物中标记的氢、氧、碳或氮。

除了见于如上所述的蛋白质中的标准氨基酸以外，适合给受试者施用的蛋白质前体包括但不限于H₂O、CO₂、NH₃和HCO₃。

水是蛋白质以及其它生物分子的前体(参见美国专利申请No.10/279,399，在此以引用的方式将其全文并入)。如此，标记的水可以充当本文中教导的方法中的前体。“同位素标记的水”包括用氢或氧的一种或多种特定重同位素标记的水。同位素标记的水的具体例子包括²H₂O、³H₂O和H₂ ¹⁸O。

对于细胞中的生物合成反应来说，H2O的可获得性可能总是没有限制的(因为H2O占细胞内物质的近70％或＞35摩尔浓度)，但H2O中的氢和氧原子对涉及生物合成途径的许多反应的贡献是化学计量的，例如：R-CO-CH2-COOH+NADPH+H2O→R-CH2CH2COOH(脂肪酸合成)。

因此，使以H-或O-同位素标记的水的形式提供的同位素标记结合到生物分子当中作为合成途径的一部分。氢结合的发生可以有两种方式：进入分子中的不稳定位置(即，可迅速交换的，不需要酶催化的反应)或者进入稳定位置(即，不能迅速交换，需要酶催化)。氧结合发生于稳定位置。

一些从细胞液进入生物分子中的C-H键的氢结合步骤只发生在生物合成反应顺序中明确确定的酶催化步骤期间，一旦存在于成熟的最终产物分子中并不是不稳定的(可与组织中的溶剂水交换)。例如，葡萄糖上的C-H键在溶液中是不可交换的。相反，在特定酶反应的逆转过程中，以下C-H位置各与体内水进行交换：C-1和C-6，在克雷伯氏循环中的草酰乙酸盐/琥珀酸盐顺序中和在乳酸盐/丙酮酸盐反应中；C-2，在葡萄糖-6-磷酸盐/果糖-6-磷酸盐反应中；C-3和C-4，在甘油醛-3-磷酸盐/二羟基丙酮-磷酸盐反应中；C-5，在3-磷酸甘油酸盐/甘油醛-3-磷酸盐和葡萄糖-6-磷酸盐/果糖-6-磷酸盐反应中。

因此共价结合到分子的特定稳定性位置的水中的标记氢或氧原子揭示了“生物合成历史”—即，标记结合意味着在同位素标记水存在于细胞液期间的分子的合成。

这些生物分子中的不稳定氢(非共价键合或存在于可交换的共价键上的)不揭示分子的生物合成历史。通过以非标记水(H₂O)进行培养可以很容易地消除不稳定的氢原子(即，通过²H或³H借以首先结合的同一非酶交换反应的逆转)，然而：

因此，在实践中通过以天然丰度H₂O进行培养可以很容易地消除并不反映生物合成历史、但是经由非合成交换反应结合的潜在污染性氢标记。

图1描述标记的氢(²H或³H)从同位素标记的水进入选定的游离氨基酸的交换途径，其然后结合到作为微管的亚基的微管蛋白二聚体当中。图2显示微管蛋白二聚体结合到微管当中。图3描述分离和测量神经元微管群的实验策略。

可供的分析方法有对标记的氢原子结合到生物分子当中进行定量测量(例如，对于³H的液体闪烁计数法；对于²H和¹⁸O的质谱、激光光谱、NMR光谱法或现有技术中已知的其它方法)。有关同位素标记水结合理论的进一步讨论，参见例RL.Biochemistry.19687：3708-17，其内容以引用的方式并入本文。

标记的水可以很容易地商购获得。例如，²H₂O可购自剑桥同位素实验室(安多弗，马萨诸塞州)，³H₂O可购自例如新英格兰核公司(New England Nuclear，Inc.)。“氘化水”是指结合了一个或多个²H同位素的水。一般来说，²H₂O是非放射性的，因此对其毒性的担心比放射性的³H₂O要少。可以按为总体内水的(例如)百分比的量施用²H₂O，例如为消耗的总体内水的1％(例如，对于每日消耗3升水来说，消耗的²H₂O是30微升)。如果利用³H₂O，则应施用达不到毒性的量，这是本领域技术人员容易确定的。

采用本发明的技术可以相对低成本地实现相对较高的²H₂O体内水富集(例如，总体内水的1-10％被标记)。这种水富集是相对恒定和稳定的，因为这种水平在人和实验动物中保持数周或数月并未显示有任何毒性。在大量人体受试者(超过100人)当中的这种发现与先前对高剂量²H₂O下的前庭毒性的担心相反。申请者之一发现，只要能防止体内水富集的快速变化(例如，通过开始时施加小的分次剂量)就可以在没有毒性的情况下维持高的²H₂O体内水富集。例如，市售²H₂O的低费用允许以相对较低的成本长期维持1-5％范围内的富集(例如，计算结果显示2个月，较低的成本在2％²H₂O的丰富的标记的，从而7-易制毒化学丙氨酸8％浓缩池，比12小时对²H-亮氨酸标记的的在10％的免费亮氨酸富集，从而在7-8％，这期间易制毒化学亮氨酸池浓缩)。

也可以实现施用H₂ ¹⁸O的相对较高且相对恒定的体内水富集，因为¹⁸O同位素是无毒的，因此并不构成重大的健康风险。

可以通过连续的同位素标记水施用、不连续的同位素标记水施用或者在单次或多次同位素标记水施用之后进行同位素标记水的施用。在连续的同位素标记水施用当中，对个体施用同位素标记的时段应足以在个体中随时间的推移维持相对恒定的水富集。对于连续的方法来说，最好是标记水的施用期的持续时间足以达到稳态浓度(例如，人体为3-8周，啮齿类动物为1-2周)。

在非连续的同位素标记水施用当中，量取一定量的同位素标记水，然后进行一次或多次的施用，然后停止接触同位素标记水，使得发生从体内水库中洗脱同位素标记水。然后可以监测去标记的时间进程。最好是水施用期的持续时间足以达到在生物分子中的可检测的水平。

可以按现有技术中已知的各种方式给个体或组织施用同位素标记水。例如，可以通过口服、肠道外给药、皮下给药、血管内给药(例如静脉注射、动脉内给药)或腹腔内给药的方式施用同位素标记水。²H₂O和H₂ ¹⁸O有若干商业来源，包括Isotec公司(迈阿密斯堡，俄亥俄州)和剑桥同位素公司(安多弗，马萨诸塞州)。施用的同位素标记水的同位素含量范围可以是约0.001％至约20％，取决于测量生物分子同位素含量所用的仪器的分析灵敏度。在一个实施例中，口服施用饮用水中的4％的²H₂O。在另一实施例中，给人体口服施用50mL的²H₂O。

接收施用标记水的个体可以是哺乳动物。在一个变化形式当中，该个体可以是实验动物，包括但不限于啮齿类动物、灵长类动物、仓鼠、豚鼠、狗或猪。在涉及施用药物、候选药物、药物前导物或它们的组合的变化形式当中，所述个体可以是哺乳动物，如实验动物，包括接受的疾病的动物模型，或者是人。在涉及施用食品添加剂、工业或职业性化学物质、环境污染物或化妆品的变化形式当中，所述个体可以是任何实验动物，例如但不限于啮齿类动物、灵长类动物、仓鼠、豚鼠、狗或猪。

获得所关注的一种或多种靶向微管蛋白或微管聚合体分子

在实践本发明的方法中，一方面，根据现有技术中已知的方法由活体系统获取蛋白质。一般来说，样本包括运动神经元，这可以从试验受试者的许多部位获得(例如，大脑、坐骨神经、周围神经中的运动皮层)，坐骨神经是特别有用的。

许多微管聚合体和/或游离的微管蛋白二聚体亚基是利用神经生物学领域中熟知的技术从活体系统中获得的。一种或多种生物学样本可以是一种或多种生物体液或组织，如神经组织。蛋白质可得自特定的细胞组，如神经元或其它生长或不生长的细胞。也可以利用现有技术中已知的标准生化方法从生物学样本中获取以及任选部分地纯化或分离蛋白质。特别是，PCT/US2005/028069中述及了不同微管片段(tau-MT、STOP-MT等)的分离。

生物取样的频率可根据不同的因素而变化。这些因素包括但不限于取样的难易程度和安全性、蛋白质的合成及分解/去除速率以及给细胞、动物或人施用的治疗候选剂的半衰期。

根据检测要求，可以从一个或多个生物学样本中部分地纯化和/或分离蛋白质。一般来说，可以根据样本中存在的其它组分情况，按照本领域技术人员已知的多种方式分离或纯化微管聚合体和/或微管蛋白二聚体亚基。标准纯化方法包括电泳、分子免疫和色谱技术，包括离子交换、疏水、亲和及反相HPLC色谱法、快速液相色谱法(FPLC)、化学萃取、薄层色谱法、气相色谱法和色谱聚焦。例如，一些蛋白质可以利用标准抗体柱进行纯化。超滤和渗滤技术结合蛋白质浓度也是有用的。关于合适纯化技术的一般指导，参见Scopes，R.，Protein Purification，Springer-Verlag，NY(1982)。所需的纯化度根据检测及系统的组分而有所不同。在一些情况下没有纯化的必要。

在另一实施例中，蛋白质可以水解或以另外的方式降解形成较小的分子。水解方法包括现有技术中已知的任何方法，包括但不限于化学水解(如酸水解)和生化水解(如肽酶降解)。在纯化和/或分离蛋白质之前或之后均可以实施水解或降解。也可以通过常规的纯化方法部分地纯化或任选分离蛋白质，这些方法包括HPLC、FPLC、气相色谱法、凝胶电泳和/或本领域技术人员已知分离化学和/或生化化合物的任何其它方法。

分析

可以通过现有技术中已知的多种方法测定蛋白质中的同位素富集，如NMR、激光光谱法、液体闪烁计数、盖革计数器和质谱法。对于应用质谱的方法，有若干不同类型的质谱仪可应用于本发明，包括但不限于气相色谱-质谱法(GC-MS)、同位素比值质谱法、GC-同位素比值-燃烧-MS、GC-同位素比值-裂解-MS、液相色谱-MS、电喷雾离子化-MS、基质辅助激光解吸-飞行时间-MS、傅立叶变换-离子-回旋-共振-MS和摆线质谱。

质谱仪把诸如蛋白质之类的分子转换成快速移动的气体离子并根据它们的质荷比对它们进行分离。因此离子的同位素或同位素异数体或离子碎片的分布可用于测量许多蛋白质中的同位素富集。

一般来说，质谱仪包括离子化装置和质量分析器。许多不同类型的质量分析器是现有技术中已知的。这些包括但不限于扇形磁场分析器、电喷雾离子化、四极、离子阱、飞行时间质量分析器和傅里叶变换分析器。

质谱仪中也可以包括许多不同的离子化方法。这些包括但不限于：气相离子化源，如电子冲击、化学离子化和场离子化，以及解吸源，如场解吸、快速原子轰击、基质辅助激光解吸/离子化和表面增强激光解吸/离子化。

此外，可以首先连接两个或更多个质量分析器(MS/MS)以分离前体离子，然后分离和测量气相碎片离子。这些仪器产生初始系列的蛋白质离子碎片，然后产生初始离子的二次碎片。

不同的离子化方法也是现有技术中已知的。一个关键性的进展是包括蛋白质在内的大型非挥发性大分子的离子化技术的研发。这类技术包括电喷雾离子化(ESI)和基质辅助激光解吸。这些都使得MS能够与诸如液相色谱法和毛细管区电泳之类的高效样本分离引入技术结合应用。

此外，质谱仪可以连接至诸如气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)之类的分离装置。在气相色谱质谱(GC/MS)法当中，气相色谱仪的毛细管柱直接连接至质谱仪，任选使用射流分离器。在这种应用当中，气相色谱(GC)柱分离样气混合物中的各组分，经分离的组分在质谱仪上进行离子化及化学分析。

一般来说，为了确定蛋白质的基准质量同位素异位体频率分布，在同位素标记的前身的灌注之前选取这种样本。这种测量是在细胞、组织或生物体内建立蛋白质的质量同位素异位体的天然频率的一种手段。当细胞、组织或生物体属于具有类似环境史的受试者群体时，群体同位素异位体频率分布可用于这种背景测量。另外，利用同位素的已知平均天然丰度可以估计这种基准同位素异位体频率分布。例如，在自然界中，存在于有机碳中的¹³C的天然丰度是1.11％。下面要讨论到确定这种同位素异位体频率分布的方法。通常情况下，在施用同位素标记的前体之前和在其后选取蛋白质样本。

在一个实施例中，测量相对及绝对的质量同位素异位体丰度。测得的质谱峰高或者是峰下的面积可表示为对母体同位素异位体(零质量同位素)的比例。可以理解的是，为了本发明的目的，可以利用能提供样本中的同位素异位体丰度的相对及绝对值的任何计算方式对这种数据进行描述。

在一个实施例中，计算诸如微管聚合体之类的蛋白质的标记：未标记比例。然后计算所关注的标记和未标记的分子(例如微管蛋白二聚体、微管聚合体)的比例。专业人员首先确定测得的分子的分离同位素异位体物种的过量摩尔比。然后专业人员比较测得的过量比例的内部模式与理论模式。这种理论模式可以利用二项式或多项式分布关系进行计算，如5,338,686、5,910,403和6,010,846号美国专利中所述，在此将上述专利的内容以引用的方式全文并入。计算可以包括质量同位素异位体分布分析(MIDA)。在本领域技术人员已知的许多不同原始资料中讨论到了质量同位素异位体分布分析(MIDA)组合算法的变化形式。由Hellerstein和Neese(1999)以及Chinkes等(1996)、Kelleher和Masterson(1992)以及在美国专利申请No.10/279,399中进一步讨论了所述方法，在此将所有上述的内容以引用的方式全文并入。

除了上文引用的参考文献外，执行所述方法的计算软件可由加州大学伯克利分校的Marc Hellerstein教授公开提供。

可以使用为所关注的分子生成的表格或者以图表的方式利用确定的关系进行过量摩尔比与理论模式的比较。由这些比较确定一个值，如值p，其描述亚基的质量同位素富集在前体亚基库中的概率。然后利用这种富集确定一个值，如值A_X ^*，其描述对每种质量同位素异位体新合成的蛋白质的富集，从而显示同位素异位体过量比，如果所有同位素异位体是新合成的话，预计应该出现该同位素异位体过量比。

然后计算丰度分数。个别同位素(对于元素)或质量同位素异位体(对于分子)的丰度分数是由该具体的同位素或质量同位素异位体所代表的总丰度的分数。这有别于相对丰度，在后者中，将最丰富的物种的值定为100，所有其它的物种相对于100进行标准化，并表示为百分比相对丰度。对于质量同位素异位体Mx，

其中0至n是相对于其中存在丰度的质量同位素异位体的最低质量(M0)的名义质量范围。

其中下标e指富集丰度，b指基准或自然丰度。

为了确定在施用前体的一段时期当中实际上新合成的聚合体的分数，比较测得的过量摩尔比(EM_X)与计算的富集值A_X*，该值描述对每种质量同位素异位体新合成的生物聚合体(例如微管)的富集，从而显示同位素异位体过量比，如果所有同位素异位体是新合成的话，预计应该出现该同位素异位体过量比。

在一个实施例中，计算分子流率。确定微管的聚合和/或解聚速率的方法包括计算微管的质量同位素标记的亚基在前体库中的比例，并使用此比例计算含有微管的至少一个质量同位素标记亚基的微管的期望频率。然后比较此期望频率与实际用实验方法确定的同位素异位体频率。由这些值可以确定在选定的结合时期由加入的同位素标记前体形成的微管的比例。如此也确定了在这种时段期间的合成速率。在处于稳态浓度的系统中，或者当在所述时段期间系统中的任何浓度变化是可测量的或可以另外的方式已知的时候，由此利用现有技术中已知的计算也可以知道去组装的速率。然后应用前体-产物关系。对于连续标记法，比较同位素富集与渐进(例如，最大可能的)富集，由前体-产物方程式计算动力学参数(例如合成速率)。通过应用连续标记的前体-产物公式可以确定分数合成速率(ks)：

k_s＝[-ln(1-f)]/t

其中f＝分数合成＝产物富集/渐近前体/富集，且t＝在所研究的系统中进行接触的标记施用时间。

对于不连续的标记方法，计算同位素富集减少的速率，并且由指数衰减方程式计算亚基的动力学参数。在实施所述方法时，微管富集了质量同位素异位体，通常含多个微管的质量同位素标记亚基。在没有外源性前体(例如²H₂O)的情况下，微管(例如，含3或4个质量同位素标记的微管蛋白二聚体的蛋白质)的这些较高质量的同位素异位体的形成量是微不足道的，因为天然质量同位素标记前体(例如²H₂O)的丰度相对较低，但在前体结合时期(例如，在对细胞、组织、器官或生物体施用²H₂O期间)形成的量很大。微管在相继的时间点上取自细胞、组织、器官或生物体，并且通过质谱分析法确定高质量同位素异位体的相对频率或者确定微管中的亚基的高质量同位素异位体的相对频率。因为高质量同位素异位体几乎完全是在第一时间点之前合成的，其在两个时间点之间的衰变提供了亚基衰变速率的直接量度。也可以通过本文中所述的方法计算和使用不含多个质量同位素标记亚基的质量同位素异位体的衰变速率。

通常情况下，第一时间点为停止施用前体(例如²H₂O)后至少2-3小时，这取决于施用的方式，以确保施用前体之后，所述比例的质量同位素标记亚基(例如，微管聚合体的标记微管蛋白二聚体)已经基本上从其最高水平衰变。在一个实施例中，接下来的时间点通常是第一时间点后1-4小时，但此时机取决于生物聚合体库的更新速率。

由同位素标记亚基的衰变曲线确定微管的衰变速率。在此衰变曲线由若干时间点确定的情况下，可以通过将曲线与指数衰减曲线拟合确定衰变动力学，并由此确定衰变常数。

可以根据指数衰变曲线或其它动力学衰变曲线计算分解速率常数(kd)：

k_d＝[-ln f]/t

运动神经元疾病调节剂的筛选方法

本发明提供筛选运动神经元疾病的调节剂的方法(参见图4-7、10)。“调节剂”在这里是指活性的激动剂和拮抗剂，其中拮抗剂是特别适用的。选择调节剂使功能失调的活性受到抑制，并使任何相关的载体副作用最小化。

本发明部分地涉及发现由影响运动神经元中微管动力学的生化途径导致对运动神经元疾病的治疗。因此，在一个实施例中，本发明提供筛选候选药物的方法，用以确定改变轴突微管动态性的药剂，并因此可以治疗、预防或缓解运动神经元疾病的症状。

一般来说，有三类候选药物可应用于本发明。第一类由针对调节微管动力学的能力、特别是区分轴突柄微管及生长锥和/或MAP2微管的能力评价的一般性候选药物组成。也就是说，如本发明所述及，这两个微管库显示出非常不同的交换动力学，其中优先稳定轴突微管的药剂是特别有用的。因此针对改变(例如，改进)微管动力学并因此改变运动神经元功能障碍的药剂进行候选药物库的筛选。

其次，可以试验通路特异性的候选药物。在此实施例中，如本文中所述及的那样，对运动神经元系统试验推测可能或已知能影响微管交换动力学的药剂。

另外，已知有许多生物化学现象与运动神经元疾病有关，但据信一般是作用于除微管以外的神经元系统。在一些情况下，这些生物化学现象是在运动神经元层面上起作用；在其它情况下，这些现象与后期可影响CNS及周围神经系(PNS)疾病进展的现象有关。例如，在后期的帕金森氏症中，运动神经元活动可受到破坏。类似地，在后期ALS中，发生小胶质细胞激活。因此包括本文中述及的联合治疗方法可以是非常有用的。因此，本发明利用微管动力学作为神经保护活性的读数，提供对已知涉及这些疾病状态的药剂和药剂组合的评价。这些额外的途径包括与小胶质细胞激活相关的炎症和与氧化应激相关的途径以及现有技术中已知的其它途径。

一般性候选药物

在一个实施例中，根据调节运动神经元中的微管活性的能力筛选候选药物。用在本文中的“候选药物”或“候选药”说的是可以如本文中所述及的那样按照活性筛选出来的任何分子，例如：蛋白质，包括生物治疗药物(包括抗体和酶)，有机小分子，包括已知药物和候选药物，多糖，脂肪酸，疫苗，核酸等。在此，“一般性”候选药物为不是已知与微管、运动神经元和/或运动神经元疾病相关的候选药物。

候选药物包括许多化学制剂类。在一个实施例中，候选药物是有机分子，通常是分子量超过100且不到约2,500道尔顿的小有机化合物。特别有用的是分子量超过100且不到约2,000道尔顿、更有用的是不到约1500道尔顿、更有用的是不到约1000道尔顿、更有用的是不到500道尔顿的小有机化合物。候选药物包含与蛋白质(特别是氢键)发生结构相互作用所必需的官能团，通常包括胺、羰基、羟基或羧基中的至少一种，一般至少两个化学官能团。候选药物经常包含环碳或杂环结构和/或被一个或多个上述官能团取代的芳香族或多芳香核结构。候选药物也可见于生物分子，包括肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、它们的衍生物、结构类似物或组合。

候选药物有多种获得来源，包括合成或天然化合物库。例如，许多方法可用来随机和定向地合成多种有机化合物和生物分子，包括随机化寡核苷酸和肽的表达和/或合成。或者，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库是可利用的或容易建立的。另外，天然或合成产生的库和化合物容易通过常规的化学、物理和生物化学手段进行修饰。可以使已知的药理学药剂经受定向或随机的化学修饰(如酰化、烷基化、酯化、酰胺化(amidification))以制备结构类似物。

候选生物活性剂可以是蛋白质。本文中所谓的“蛋白质”是指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。蛋白质可以由天然氨基酸和肽键或合成的拟肽类结构组成。因此用在本文中的“氨基酸”或“肽残基”表示天然及合成的氨基酸两者。例如，为了本发明的目的，高-苯丙氨酸、瓜氨酸和正亮氨酸被认为是氨基酸。“氨基酸”也包括亚氨基酸残基，如脯氨酸和羟脯氨酸。侧链可以为(R)或(S)构型。在特别有用的实施例中，氨基酸为(S)或L-构型。如果要用非天然侧链，则可以使用非氨基酸取代基(例如)以防止或延缓体内降解。

候选生物活性剂可以是天然蛋白质或天然蛋白质的碎片。因此，举例来说，可以使用含蛋白质的细胞提取物或者蛋白细胞提取物的随机或定向消化物。按这样的方式可以建立用于在本文中所述的系统中进行筛选的原核及真核蛋白质库。此实施例中有用的是细菌、真菌、病毒和哺乳动物蛋白质的库，其中后者是特别有用的，人体蛋白质尤其有用。

候选药物可以是抗体、一类蛋白质。术语“抗体”包括完整长度以及抗体片段，如现有技术中已知的那样，包括Fab、Fab2、单链抗体(例如Fv)、嵌合抗体、人化抗体和人体抗体等(通过整个抗体的修饰产生的或利用重组DNA技术从头合成的抗体)以及它们的衍生物。

候选生物活性剂可以是核酸。本文中所谓的“核酸”或“寡核苷酸”或语法上等同的术语表示共价连接在一起的至少两个核苷酸。本发明的核酸通常含有磷酸二酯键，虽然在某些情况下，如下面所述及的那样，可具有供替代选择的主链的核酸类似物是包括在内的，所述供替代选择的主链包括：例如，磷酰胺(Beaucage等，Tetrahedron，49(10)：1925(1993)和其中的参考文献；Letsinger，J.Org.Chem.，35：3800(1970)；Sprinzl等，Eur.J.Biochem.，81：579(1977)；Letsinger等，Nucl.Acids Res.，14：3487(1986)；Sawai等，Chem.Lett.，805(1984)；Letsinger等，J.Am.Chem.Soc.，110：4470(1988)；和Pauwels等，Chemica Scripta，26：141(1986))、硫代磷酸酯(Mag等，Nucleic Acids Res.，19：1437(1991)；和美国专利No.5,644,048)、二硫代磷酸酯(Briu等，J.Am.Chem.Soc.，111：2321(1989))、O-甲基亚磷酰胺键(参见Eckstein，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，Oxford University Press)以及肽核酸主链和键(参见Egholm，J.Am.Chem.Soc.，114：1895(1992)；Meier等，Chem.Int.Ed.Engl.，31：1008(1992)；Nielsen，Nature，365：566(1993)；Carlsson等，Nature，380：207(1996)，所有上述内容以引用的方式并入))。其它类似的核酸包括具有以下主链的核酸：正主链(Denpcy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：6097(1995))；非离子型主链(美国专利5,386,023；5,637,684；5,602,240；5,216,141；和4,469,863；Kiedrowshi等，Angew.Chem.Intl.Ed.English，30：423(1991)；Letsinger等，J.Am.Chem.Soc.，110：4470(1988)；Letsinger等，Nucleoside & Nucleotide，13：1597(1994)；第2和3章，ASC Symposium Series 580，“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”.Ed.Y.S.Sanghui and P.Dan Cook；Mesmaeker等，Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.，4：395(1994)；Jeffs等，J.Biomolecular NMR，34：17(1994)；Tetrahedron Lett.，37：743(1996))和非核糖主链，包括美国专利5,235,033和5,034,506以及第6和7章，ASC Symposium Series 580，“Carbohydrate Modificationsin Antisense Research”，Ed.Y.S.Sanghui and P.Dan Cook中描述的主链和肽核酸。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义以内(参见Jenkins等，Chem.Soc.Rev.，(1995)pp.169-176)。若干核酸类似物描述在Rawls，C & E News(1997年6月2日，第35页)中。在此明确地将所有这些参考文献的内容以引用的方式并入。可以进行核糖-磷酸盐主链的这些修饰以便于增加另外的部分(如标记)，或者提高这种分子在生理环境中的稳定性和半衰期。此外，可以制备天然核酸与类似物的混合物。或者，可以制备不同核酸类似物的混合物以及天然核酸与类似物的混合物。按指定，核酸可以是单链或双链的，或者含有双链或单链序列部分两者，包括限制性片段、病毒、质粒、染色体等。核酸可以是DNA(基因组和cDNA两者)、RNA或其混合，其中核酸包含脱氧核糖-与核糖核苷酸的任意组合以及碱基的任意组合，所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤等。就本发明来说应当指出的是，除另有说明外，在本文中核苷(核糖加碱基)与核苷酸(核糖、碱基和至少一种磷酸盐)可互换使用。

如上面一般针对蛋白质所述的那样，核酸候选生物活性剂可以是天然核酸、随机和/或合成的核酸。例如，可以使用原核或真核基因组的消化物，如上文针对蛋白质所述及的那样。此外，RNAis包括在本文中。

基于途径的候选药物的筛选

如上文所述及，除了一般性候选药物外，本发明可应用于筛选微管活性、运动神经元功能障碍和/或运动神经元疾病的调节剂。本文中所谓的“微管活性”是指多种微管生物学活性中的一种，包括但不限于微管聚合和/或解聚的速率、维持细胞组分从一个细胞位置向另一细胞位置运输的能力、微管的细胞骨架功能等。

一般来说，筛选的基于途径的候选药物有两类：已知或推测可能涉及微管活性的候选药物，以及涉及与运动神经元疾病相关联的其它生化现象的候选药物。

因此，本发明的一些实施例利用基于途径的候选药物的筛选。

微管靶调节剂(MTMA)

在一个实施例中，试验微管靶调节剂。本文中所谓的“微管靶调节剂”或“MTMA”是指先前已确认或建议用来影响微管聚合和/或解聚速率、特别是减少或减慢微管不稳定性(即动态性)的药剂。

在一个实施例中，MTMA是阿片类药物和阿片衍生物。阿片类药物有四大类：在体内产生的内源性阿片肽；鸦片生物碱，如吗啡(原型阿片类药物)和可待因；半合成阿片类药物，如海洛因和羟考酮；和全合成的阿片类药物，如结构与鸦片生物碱无关的哌替啶和美沙酮。

在一个实施例中，MTMA是鸦片生物碱。在一个实施例中，该鸦片生物碱是诺斯卡品或诺斯卡品衍生物，如美国专利No.6,376,516中述及，在此将其全文以引用的方式并入。诺斯卡品是一种缺乏止痛或抗惊厥活性的鸦片生物碱，并且与其它阿片类药物(例如吗啡)相反，是非麻醉性或成瘾性化合物。此外，与诸如紫杉醇、诺考达唑、长春花碱和秋水仙碱之类的其它微管相互作用药剂相反，诺斯卡品改变微管动力学，但不影响总微管蛋白聚合体质量，并且不改变体外和在活细胞中的微管组装的稳态二聚体/聚合体平衡。诺斯卡品穿透血脑屏障，在CNS组织(大脑和脊髓)中具有长半衰期，并且在PNS中也是这样。因此我们确定诺斯卡品为对于与细胞骨架异常相关的CNS和PNS紊乱的潜在性微管相互作用化学治疗剂，这种细胞骨架异常如微管动力学的改变，如我们已经发现的那样(见图4-7)。诺斯卡品目前可供人作为止咳剂使用。如MTMA一样有用的其它鸦片生物碱是菲、异喹啉和罂粟碱。

此外，大麻素单独或与其它药剂结合可应用于筛选。大麻素是激活身体内源性大麻素受体(包括CB1和CB2受体)的一组化学物质。目前，有三种一般类型的大麻素：草本大麻素仅见于大麻植物；内源性大麻素产生于人和其它动物体内；以及合成的大麻素是在实验室中制备的类似化合物。合适的药剂包括但不限于：花生四烯乙醇胺和花生四烯乙醇胺的类似物、docosatetraenylethanolamide和homo-γ-linoenylethanolamide；内源性大麻素，如2-花生四烯酰甘油(2-AG)、十六酰胺乙醇和油酰胺；四氢大麻酚(THC)，特别是屈大麻酚(Δ⁹-THC)、大麻二酚(CDB)；大麻醇(CBN)；大麻萜酚；大麻环萜酚；大麻环酚；三甲基丙基二苯并吡喃醇；四氢次大麻酚；次大麻二酚；Cannabichromevarin；Cannabigerovarin；大麻萜酚单乙基醚，CP-55940；HU-210 100；SR-144526和大麻隆。

其它基于途径的候选药物是针对离子(特别是钙和钠)的细胞内浓度的药物。已知钙的细胞内浓度涉及微管形成及稳定性，因此调节细胞内钙(特别是通过减少细胞内钙浓度)的药剂对于筛选而言是特别有意义的。

离子通道拮抗剂

有三个主要类型的配体门控性离子通道(促离子型受体)涉及L-谷氨酸盐(一种主要的兴奋性神经递质)途径。它们是NMDA、AMPA和红藻氨酸盐受体，它们每种调节剂均可应用于本发明中的途径筛选。

NMDA受体拮抗剂

NMDA受体是通过由N-甲基-D-天冬氨酸盐(NMDA)的选择性激活首次确认的。NMDA受体是由NR1亚基和NR2亚基的组装构成的，后者可以是四个独立的基因产物(NR2A-D)之一。需要两亚基的表达以形成功能性通道。在NR1与NR2亚基的会合处形成谷氨酸盐结合域(因此两亚基需要表达)。除了谷氨酸盐外，NMDA受体需要共激动剂甘氨酸进行结合以使受体起作用。甘氨酸结合位点见于NR1亚基。NR2B亚基也具有多胺的结合位点，后者是调节NMDA受体功能的调节分子。除了谷氨酸盐(NMDA)结合位点外，NMDA受体上还有对于调节化合物的多个结合位点。高效的NMDA受体激活不仅需要NMDA，也需要甘氨酸。也可以通过多胺的结合调节激活。每个结合位点(谷氨酸盐、甘氨酸、多胺)已被用作研发受体及亚型选择性化合物的潜在靶。

NMDA抑制剂可以是竞争性或非竞争性抑制剂，并且可以结合到任意的结合位点上。因此，合适的NMDA受体拮抗剂包括但不限于：金刚烷胺；氯胺酮；右美沙芬(3-甲氧基-17-甲基-9(α)，13(α)，14(α)-氢溴酸吗啡喃一水合物)；地卓西平(也称MK-801)；AP-7(2-氨基-7-膦酰基庚酸)；APV(也称AP-5；2-氨基-5-膦酰基戊酸盐；DCKA(5，7-二氯犬尿喹啉酸；作用于甘氨酸位点)、拉克酰胺(乙酰氨基-N-苄基-3-甲氧基丙酸盐及其代谢物，H-209)；高奎宁酸，(R)-AP5；(R)-CPP-烯；PBPD；美金刚胺；氯胺酮；L-701-324；L-689,560；GV196771A；Ro 25-6981；艾芬地尔；Co-101676；GW468816(甘氨酸位点拮抗剂)。

这些抑制剂中的几个描绘于图6。

特别关注的是地卓西平；地卓西平作为钙离子通道阻滞剂已得到确认，其减少钙通过离子通道NMDA-受体进入神经元的过度流入。它也被归类为谷氨酸能NMDA-受体亚型的竞争性拮抗剂并穿透血脑屏障。谷氨酸盐诱导的兴奋毒性是复杂和多因性的，但它是介导神经元损伤和死亡的终端事件的主要部分。它涉及钙通过NMDA-受体的过度流入。

氧化应激的调节剂

除了MTMA和受体拮抗剂外，其它途径选择性的药剂包括影响运动神经元中的氧化应激的药剂。这些包括一般性的抗氧化剂，如维生素E、丙半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、硫辛酸和各种类型的硝酮。

小胶质细胞激活

神经炎症最近已占运动神经元疾病的重大比例。例如，ALS组织的特征在于在散发性及家族ALS中和在SOD转基因小鼠模型中观察到的炎性变化。它们包括大量激活的小胶质细胞和星形胶质细胞的积累。诸如肿瘤坏死因子(TNF)的促炎性细胞因子在ALS中强劲上调。肿瘤坏死因子(TNF-R1)的受体在后来的疾病症状发生前以及症状发生的阶段升高。TNF在ALS中是作为神经炎症的主要推动力，而一些共刺激的细胞因子和趋化因子的作用是强化TNF的影响。这些变化在其它运动神经元疾病中也观察到了，包括帕金森氏症和包括糖尿病性神经病变在内的各种周围神经病变。

被试验在ALS中的疗效的有几种候选的抗炎药物，包括但不限于米诺环素和沙利度胺。

因此，本发明提供对这些药剂与其它候选药物的试验，特别是其中一些在上面列出的微管靶调节剂(MTMA)、离子通道拮抗剂(其中一些也在上面列出)、抗氧化剂、铜螯合剂、氧化氮抑制剂和过氧化亚硝酸盐的清除剂以及神经营养因子。

杂类药剂

此外，抗谷氨酸盐剂、其它的抗炎剂以及其它的抗惊厥剂都可以进行试验。当然，本发明不限于化合物的任何具体类别的任何具体化合物。可设想在本发明的方法中使用任何化合物或化合物的任意组合。

药物组合物

如本文中述及，有多种药物组合物可用于治疗运动神经元疾病，特别是治疗ALS。在一个实施例中，药物组合物包含MTMA药剂和药物载体，如本文中述及。在此实施例中，可具体地应用诺斯卡品。

在许多实施例中，药物组合物包含两种不同的药物制剂。本文中述及的任何两种类型的神经保护剂的任意组合是可行的。在某些情况下，可以合并三种神经保护剂进行治疗。

在一个实施例中，药物组合物包含两种不同的MTMA；例如，诺斯卡品和大麻素(包括内源性大麻素)可应用于此实施例。

在替代性实施例中，药物组合物包含MTMA和不是MTMA的神经保护剂。

在一个实施例中，神经保护剂是电压门控性离子通道拮抗剂，包括电压门控性钠和钙通道拮抗剂。因此，可具体应用包含至少一种MTMA和通道拮抗剂的组合物。

在许多实施例中，药物组合物包含MTMA和NMDA受体拮抗剂。包含诺斯卡品和地卓西平的组合物可具体应用于一些实施例当中。在替代性实施例中，NMDA受体拮抗剂是美金刚胺。

在许多实施例中，药物组合物包含MTMA和过氧化物酶体增殖剂激活的受体γ(PPAR γ)激动剂。包含诺斯卡品和匹格列酮(Actos

)的组合物可具体应用于一些实施例当中。在替代性实施例中，除了别的以外，PPARγ激动剂可以是罗西格列酮(Avandia

)、L-796449、S5444或GI262570。

在许多实施例中，药物组合物包含MTMA和抗炎剂，如南蛇藤醇、尼美舒利或布洛芬。

在许多实施例中，药物组合物包含MTMA和抗氧化剂，特别是iNOS抗氧化剂。包含诺斯卡品和L-NMMA(Tilarginine)的组合物可具体应用于一些实施例中。在替代性实施例中，除了别的以外，抗氧化剂可选自头孢曲松、南蛇藤醇、CoQ10、维生素E或AEOL 10150。

在许多实施例中，药物组合物包含MTMA和自由基捕获剂/清除剂。除了别的以外，包含诺斯卡品和锰卟啉抗氧化剂的组合物可应用于一些实施例当中。

在许多实施例中，药物组合物包含MTMA和金属离子螯合剂，特别是铜(II)和锌(II)螯合剂。除了别的以外，包含诺斯卡品和金属离子螯合剂(如8-羟基喹啉；醋羟胺酸；或N，N-二甲基-2，3-二羟基苯甲酰胺(DMB))的组合物可应用于一些实施例当中。

在许多实施例中，药物组合物包含MTMA和低电压敏感的钙通道(L-VSCC)拮抗剂。包含诺斯卡品和尼莫地平的组合物可具体应用于一些实施例当中。

在许多实施例中，药物组合物包含MTMA和非竞争性α-氨基-3-羟基-5-甲基异噁唑-4-丙酸(AMPA)/红藻氨酸盐受体拮抗剂。包含诺斯卡品和GYKI 52466的组合物可具体应用于一些实施例当中。

在许多实施例中，药物组合物包含MTMA和选择性或非选择性谷氨酸盐受体拮抗剂。包含诺斯卡品和非选择性谷氨酸盐受体拮抗剂Sosei 51(NC-1200/MVL-6976)的组合物可具体应用于一些实施例当中。在替代性实施例中，选择性或非选择性谷氨酸盐受体拮抗剂可选自NBQX、尼美舒利、利鲁唑(Rilutek)、他仑帕奈、头孢曲松或Naaladase抑制剂。在其它实施例中，谷氨酸盐受体拮抗剂可以是诸如ONO-2506的神经胶质调节剂。

在许多实施例中，药物组合物包含MTMA和花生四烯乙醇胺(AEA)运输、水解或再摄取抑制剂。包含诺斯卡品和N-(4-羟苯基)-花生四烯酸酰胺(AM404)的组合物可具体应用于一些实施例当中。在替代性实施例中，AEA运输、水解或再摄取抑制剂可以是N-(5Z，8Z，11Z，14Z-花生四烯基-4-羟基苯甲酰胺(AM1172)或脂肪酸酰胺水解酶FAAH抑制剂，如URB597。此外，包含两种MTMA和AEA再摄取抑制剂的组合物也是有用的，如诺斯卡品、AEA和AM404。

在许多实施例中，药物组合物包含MTMA和神经营养因子。包含诺斯卡品和IGF1或IGF-1-AAV的组合物可应用于一些实施例当中。

在许多实施例中，药物组合物包含MTMA和凋亡抑制剂。包含诺斯卡品和米诺环素TCH346或它莫西芬的组合物可应用于一些实施例当中。

在一些实施例中，使用两种MTMA以及附加的神经保护剂。

本文中所谓的“与运动神经元有关的紊乱”或“运动神经元疾病”或“病症”是指可以通过施用药物组合物而好转的紊乱，所述药物组合物包含两种神经保护剂，通常包含至少一种MTMA，虽然也可以设想一种和两种以上的神经保护剂。在特别有用的实施例中，使用微管靶调节剂治疗肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。

在许多实施例中，对需要治疗的患者施用治疗有效剂量的神经保护剂。本文中所谓的“治疗有效剂量”表示能够产生施用的效果的剂量。确切的剂量取决于治疗的目标，术领域技术人员采用已知的技术能够确定这些剂量。在一个特别有用的实施例中，采用的剂量是约5.mu.g/kg，以静脉内给药或皮下给药的方式施用。现有技术已知的是，可能有必要针对药剂降解、全身或局部性传递和新蛋白酶合成速率以及年龄、体重、健康状况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用和病情的严重程度情况进行调整，本领域的技术人员通过进行例行实验便可对此进行确定。

针对本发明的目的，“患者”包括人和其它动物两者，特别是哺乳动物和生物体。因此所述方法适用于人体治疗和兽医应用。在一个具体有用的实施例中，患者是哺乳动物，而在一个特别有用的实施例中，患者是人。

本发明中的术语“治疗”意指包括针对疾病或紊乱的治疗法以及预防法或抑制措施。因此举例来说，在运动神经元疾病的情况下，在疾病发作之前成功地施用两种神经保护剂，通常包含至少一种MTMA，虽然也可设想一种及超过两种的神经保护剂，这样导致疾病的“治疗”。作为另一例子，在疾病的临床表现后成功地施用神经保护剂以对抗疾病的症状构成了疾病的“治疗”。“治疗”也包括在出现疾病之后施用神经保护剂，以便根除所述疾病。在临床症状发作之后以及恶化之后成功地施用药剂，可能使临床症状减少并或许使疾病好转，这构成了疾病的“治疗”。

“需要治疗”者包括已经患有疾病或紊乱的哺乳动物以及容易罹患疾病或紊乱的哺乳动物，包括要预防疾病或紊乱的哺乳动物。

本发明的组合物通常是至少两种神经保护剂的组合，因此可以以单剂型的形式一道施用组合物(例如，两种药物合并的口服制剂)，或者以下面述及的任何剂型的形式同时或顺序地单独施用。例如，一种药物可以口服施用，另一种则经腹腔内给药，两者共同或顺序地进行。此外，当分开服药时，可以在不同的时间或以不同的频度服用。或者，可以(例如)通过口服的方式分开服用至少两种药物，但剂型相同。

可以根据体外试验或动物模型决定适合人服用的初始剂量。例如，可以制订初始剂量，使得按体外试验测定时，达到的血清浓度包含所施用化合物的特定代谢活性剂的IC₅₀。或者，人的初始剂量可以基于发现对ALS的动物模型(如SOD小鼠)有效的剂量。作为一个例子，本文中述及的药物组合物的每种组分的初始剂量范围可以是约0.01毫克/千克/日至约200毫克/千克/日，或者也可以使用约0.1毫克/千克/日至约100毫克/千克/日，或者约1毫克/千克/日至约50毫克/千克/日，或者约10毫克/千克/日至约50毫克/千克/日。然而，可以根据患者的要求、接受治疗的病情严重程度以及所使用的化合物改变剂量。也将根据对具体患者服用具体化合物所伴随的任何不良副作用的存在与否、性质及程度来确定剂量的大小。针对具体情况决定适当的剂量是专业人员所掌握的范围以内的技能。一般来说，以较小的剂量开始进行治疗，该较小的剂量少于化合物的最佳剂量。其后以小增量的方式增加剂量，直到在环境条件下达到最佳效果。为方便起见，如果需要的话，每日总剂量可以分开，日间按次服用。

药物成分中的活性化合物浓度取决于药物的吸收、分布、失效和排泄速率以及本领域技术人员已知的其它因素。应该指出的是，剂量值也随待缓解的病情的严重程度而变化。需进一步了解的是，对于任何具体的受试者来说，随着时间的推移，应该根据个体的需要和服用组合物或监督服用组合物的人的专业判断来调整具体的给药方案，本文中给出的浓度范围只不过是示例性的，不是为了限制请求保护的组合物的范围或实际应用。活性成分可以一次服用，或者可以分成许多较小的剂量，以不同的时间间隔进行服用。

适合口服的制剂可以由以下组成：(a)液体溶液，如有效量的化合物悬浮在诸如水、盐水或PEG 400之类的稀释剂中；(b)胶囊、香囊或片剂，每种当中含预定量的作为液体、固体、颗粒或凝胶的活性成分；(c)适当液体中的悬浮液；和(d)合适的乳液。片剂形式可以包含乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸中的一种或多种以及其它的辅料、着色剂、填料、粘结剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和药物相容性载体。糖锭形式可以在调味剂(例如蔗糖)中包含活性成分，以及锭剂在惰性基料中包含活性成分，所述惰性基料如明胶和甘油或蔗糖以及阿拉伯胶乳液、凝胶剂等，所述锭剂除了活性成分外还含有现有技术中已知的载体。

口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用的载体。它们可以被封入明胶胶囊或压缩成片。为了进行口服给药治疗的目的，可以使活性化合物与辅料结合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。药物相容性粘结剂和/或辅助材料可以作为组合物的一部分包括在内。

可以施用活性化合物或其药学上可接受的盐作为酏剂、悬浮液、糖浆、干胶片、口胶等的组分。除了活性化合物外，糖浆可以含有作为甜味剂的蔗糖以及某些防腐剂、染料和着色剂及香精。

也可以使活性化合物或其药学上可接受的盐与不消弱所需作用的其它活性物质或者与对所需作用进行补充的物质混合。

用在本文中的术语“药学上可接受的盐”是指能保持上述确定的化合物的所需生物活性且显示出的毒性作用最小或没有毒性作用的盐。这种盐的例子包括但不限于与无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)形成的加成盐，以及与诸如醋酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、帕莫酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸和聚半乳糖醛酸之类的有机酸形成的盐。也可以本领域技术人员已知的药学上可接受的季盐的形式施用化合物，这些季盐具体包括式--NR+Z-的季铵盐，其中R是氢、烷基或苄基，Z是反离子，包括氯离子、溴离子、碘离子、--O-烷基、甲苯磺酸根、甲基磺酸根、磺酸根、磷酸根或羧酸根(如苯甲酸根、琥珀酸根、醋酸根、乙醇酸根、马来酸根、苹果酸根、柠檬酸根、酒石酸根、抗坏血酸根、苯甲酸根、肉桂酸根、扁桃酸根、二苯乙醇酸根和二苯乙酸根)。

可以把所选择的化合物单独或与其它合适的组分组合制成气雾剂制剂(即，可以使它们“雾化”)，通过吸入的方式施用。可以把气雾剂制剂放入可接受的加压推进剂(如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等)里。

用于直肠给药的合适制剂包括(例如)栓剂，它由用栓剂基质包裹的化合物组成。合适的栓剂基质包括天然或合成的甘油三酯或石蜡烃。此外，还可以使用明胶的直肠用胶囊，它由所选择的化合物与基质的组合构成，所述基质包括(例如)液体甘油三酯、聚乙二醇和石蜡烃。

适合肠外给药(例如通过关节内(在关节处)、静脉内、肌肉内、皮内、腹腔内和皮下给药途径)的制剂包括：水及非水等渗无菌注射液，它可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，所述溶质使制剂与预定接受者的血液等渗；和水及非水无菌悬浮液，它可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。在本发明的实践中，可以例如通过静脉输注、口服、局部给药、腹腔内给药、膀胱内给药或鞘内给药的方式施用组合物。肠外给药、口服给药、皮下给药和静脉内给药是特别有用的给药方法。合适溶液制剂的一个具体例子可以在水中包含约0.1-100mg/ml的化合物和约1000mg/ml的丙二醇。合适溶液制剂的另一具体例子可以在水中包含约0.1或约0.2至约100mg/ml的化合物和约800-1000mg/ml的聚乙二醇400(PEG 400)。

合适悬浮液制剂的一个具体例子可以在水中包含约0.2-30mg/ml的化合物和一种或多种辅料，所述辅料选自：约200mg/ml的乙醇、约1000mg/ml的植物油(例如玉米油)、约600-1000mg/ml的果汁(例如葡萄汁)、约400-800mg/ml的乳剂、约0.1mg/ml的羧甲基纤维素(或微晶纤维素)、约0.5mg/ml的苄醇(或苄醇与苯扎氯铵的组合)和约40-50mM的缓冲液(pH值为7)(例如磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，或者，可以使用5％的葡萄糖代替缓冲液)。

合适脂质体悬浮液制剂的一个具体例子可以在水中包含约0.5-30mg/ml的化合物、约100-200mg/ml的卵磷脂(或其它磷脂或磷脂的混合物)和可选的约5mg/ml的胆固醇。对于化合物的皮下给药，在水中包含5mg/ml化合物与100mg/ml卵磷脂以及在水中包含5mg/ml化合物与100mg/ml卵磷脂及5mg/ml胆固醇的脂质体悬浮液制剂得到了良好的效果。

可以在单位剂量或多剂量密封容器(如安瓿和小瓶)中提供化合物的制剂。可以由前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备注射液和悬浮液。

该药物制剂特别适用于单位剂型。在这种形式中，把制剂再分成含适当化合物量的单位剂量。单位剂型可以是被包装的制剂，包装中含不连续的制剂量，如在小瓶或安瓿中的包裹片剂、胶囊和粉末。另外，单位剂型可以是胶囊、片剂、扁形胶囊剂或锭剂本身，或者可以是适当数量包装形式的任何上述物质。如果需要的话，组合物还可以包含其它相容性治疗剂，下面要更详细地讨论。

在一个实施例中，制备活性化合物，带有保护化合物的载体，以免化合物从体内快速消除，例如包括植入物和微胶囊化给药系统的缓释型制剂。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。这类制剂的制备方法对本领域技术人员来说是显而易见的。材料也可以从阿尔扎公司(Alza Corporation，山景城，加利福尼亚州)和吉尔福德制药公司(Gilford Pharmaceuticals，巴尔的摩，马里兰州)商购获得。脂质体悬浮液也可以是药学上可接受的载体。这些制备可以根据本领域技术人员已知的方法进行，所述方法例如描述在美国专利No.4,522,811中(其内容全文以引用的方式并入本文)。例如，脂质体制剂的制备方式可以是，在无机溶剂中溶解适当的脂质(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰卵磷脂、花生四烯酰卵磷脂和胆固醇)，然后蒸发掉无机溶剂，在容器的表面上留下干脂质薄膜。然后把活性化合物或其衍生物的水溶液引入到容器当中。然后手动旋转容器以从容器的侧面释放脂质物质并分散脂质聚集体，从而形成脂质体悬浮液。

运动神经元疾病的诊断和受试者及临床试验中的药物活性监测

在一个实施例中，本发明的方法能够对运动神经元疾病进行早期诊断，这是因为使用本文中述及的生物化学标记，能够在症状出现之前检测到运动神经元疾病。因此，通过利用本发明的方法并检测(例如)小丘及轴突柄(STOP)微管中的过度动态性(例如，不稳定性、高转换速率)，可以检测到诸如ALS之类的运动神经元疾病的存在。由于一般来说，轴突微管是非常稳定的(在标准试验时期基本上没有微管蛋白交换)，就此而论的“不稳定性”是结合到运动神经元微管当中的新微管蛋白的百分比的增加。

在一相关的实施例中，本发明的方法能够通过检测(例如)小丘及轴突柄微管的动态性变化来监测患有运动神经元疾病的个体受试者对治疗干预的反应。

在另一相关的实施例中，本发明的方法能够对治疗运动神经元疾病的临床试验中的试验候选药物的疗效进行评价。可以在治疗组中评价(例如)用候选治疗剂进行治疗期间小丘及轴突柄微管的动态性变化并进行统计比较，从而确定治疗方案的生物化学疗效。

药物发现及研发

在一个实施例中，所述方法能够评价在活体系统接触化合物或化合物的组合之后对要被观察的微管动态性的影响。因此所生成及分析的数据在药物发现、研发和审批(DDDA)过程中是有用的，因为它有助于DDDA的决策过程，也就是说，它为决策者提供有用的信息，以便他们能决定对化合物或化合物的组合继续进行进一步的研发(例如，如果微管动态性稳定数据看起来希望不错的话)，或者决定停止进行所述尝试，例如如果微管动态性稳定数据似乎不利的话(参见图13对这一过程的图解描述)。

此外，所述方法使技术人员能够确定、选择和/或表征一类化合物中的“最佳选择”(即“同类最佳者”)。一经确定、选择和/或表征，技术人员可基于通过本发明的方法生成的信息决定进一步评价“最佳选择”，或者许可另一实体(如医药公司或生物技术公司)应用所述化合物(参见图14)。

图14示出本发明在药物发现过程中的用途。在步骤01，选出许多候选药物。在步骤03，通常按照本文中讨论的方法研究细胞或整体动物内的微管动态性。在替代性实施例中，当本发明用于(例如)靶标发现过程时，首先进行步骤03。在步骤05，确定相应的微管动力学数据。例如，如果期望减少微管动态性，则一般认为减少该动态性的化合物是更有用的，相反，一般认为增加该动态性的化合物是不理想的。在靶标发现过程中，一个具体的表型相对于另一表型具有增加或减少的微管动态性(例如患病的相对于没有患病的或对照的)，可以将前者视为是良好的治疗或诊断靶或能导致良好的治疗或诊断靶。在步骤07，选择所关注的化合物、所关注的靶或诊断法并进行进一步的使用和进一步的研发。就靶来说，这种靶可以是(例如)熟知的小分子筛选过程(例如，新化学实体的高处理量筛选)的受试者。或者，可以使用生物因子或已批准的药物或其它候选药物(或候选药物的组合和/或混合物)。在步骤09，出售或分发化合物或试剂。出售或分发的可以是通过本发明方法确定的“最佳选择”。当然应该意识到的是，在大多数情况下，为了获得最好的结果，将多次重复图14过程中的一步或多步。

实例

实例1：微管蛋白二聚体和聚合体的分离

通过对先前所述的方案(Fanara，P.，Oback，B.，Ashman，K.，Podtelejnikov，A.，Brandt，R.Identification of MINUS，a small polypeptide that functions as a microtubule nucleation suppressor.EMBO J.18，565-577(1999)；Fanara，P.等，In vivo measurement of microtubule dynamics using stable isotope labeling with heavy water.Effect of taxanes.J.Biol.Chem.279，49940-49947(2004))稍作修改来纯化微管蛋白。为进行离体纯化，用异氟烷麻醉小鼠并通过颈椎脱位实施无痛致死。切开坐骨神经并如下进行分离。回拉皮肤露出身体下半部的肌肉。用剪刀在位于腰部区的正下方且还是宽骶骨区的正上方的位置横切脊髓。沿脊柱的腰部区下滑部分张开的剪刀，直至剪刀触到髋部的宽髂骨部分附近。这样尽可能地靠近脊髓剪切坐骨神经。用镊子挑起腿的大腿部(股骨)上的肌肉层。然后仔细地剪切肌肉表层以露出肌肉层当间的白色神经。横切神经上方的肌肉，切口向着足部和髋部延伸。在髋部，神经转弯并落入盆骨当中。使小剪刀的尖端以与脊骨平行的方式朝着第一脊髓切口滑入肌肉当中。这样露出末段坐骨神经(神经肌肉接点处的生长锥)。用镊子抓紧白色神经并向上提。用较小的剪刀切除肌肉上留下来的少量附属物。然后立即将组织放入管内并轻轻地在MSB中均化。为了从微管聚合体中分离细胞内微管蛋白二聚体，在20℃下以190,000×g离心核后上清液35分钟。使上清液或非微管部分(含可溶性二聚微管蛋白)与球团或微管部分(含聚合微管蛋白)分离、速冻并保存于-20℃。微管球团通过相继的免疫亲和色谱步骤进一步分级。为了分离tau-相关微管，以0.25mg/ml的浓度使TAU5抗体共价连接于环氧活化的Sepharose珠(Amersham Pharmacia Biotech)。在室温下用TAU-5珠在0.5ml MSB中对大约0.2mg微管球团进行1小时的培养。除去未结合的材料，珠在0.5mlMSB中洗涤三次，结合的材料在含1M NaCl的0.5ml MSB中进行洗脱。在一些实验中，采用相同的方案在与MAP2抗体连接的环氧活化Sepharose珠上(每ml珠为0.5mg抗体)通过免疫亲和色谱从TAU5未结合材料中捕获MAP2相关微管。如前所述，通过免疫印迹法(Western blot)对每一制剂(微管蛋白二聚体和TAU5结合、MAP2结合及未结合微管部分)中的微管蛋白的相对丰度进行定量，并通过离子交换和体积排阻色谱法进一步纯化这些部分中的微管蛋白(Fanara，P.等，In vivo measurement of microtubule dynamics using stable isotope labeling with heavy water.Effect of taxanes.J.Biol.Chem.279，49940-49947(2004))。

实例2：冷稳定微管的分离

对先前所述的方案稍作修改来分离冷稳定微管(Pirollet，F.，Derancourt，J.，Haiech，J.，Job，D.，Margolis，R.L.Ca(²⁺)-calmodulin regulated effectors of microtubule stability in bovine brain.Biochemistry 31，8849-8855(1992))。简单来说，在含1.5mM CaCl₂的冰冷MSB(Fanara，P.，Obaek，B.，Ashman，K.，Podtelejnikov，A.，Brandt，R.Identification of MINUS，a small polypeptide that functions as a microtubule nucleation suppressor.EMBO J.18，565-577(1999))中制备细胞或组织粗匀浆，将缓冲液与细胞团或脑组织的比例设定为1.4∶1的比例(体积/重量)。在冰上2分钟后，加入EGTA达到3mM的最终浓度，另再在冰上均化混合物1分钟。在4℃以150,000×g对提取物离心30分钟并收集上清液。通过在30℃培养上清液启动微管组装。1小时后将提取物在4℃冷冻20分钟，并通过在微管稳定化缓冲液中的50％(重量/体积)蔗糖垫以200,000×g离心30分钟。将最终球团(冷稳定微管)在4℃的微管去稳定化缓冲液中悬浮后，如前所述纯化微管蛋白(Fanara，P.等，In vivo measurement of microtubule dynamics using stable isotope labeling with heavy water.Effect of taxanes.J.Biol.Chem.279，49940-49947(2004))。

实例3：微管蛋白的GC/MS分析处理

通过在110℃用6N HCl处理16小时来水解微管蛋白样本。使蛋白质衍生的氨基酸衍生成五氟苄基衍生物，并通过GC/MS测量²H向丙氨酸当中的结合，如他处详述的那样(Fanara，P.等，In vivo measurement of microtubule dynamics using stable isotope labeling with heavy water.Effect of taxanes.J.Biol.Chem.279，49940-49947(2004))。²H的富集计算为作为(M+1)质量同位素异位体存在的丙氨酸衍生物的百分数比天然丰度的增大百分比。

实例4：体内水中²H₂O富集的测量

如上文所述测量²H₂O富集和培养基的体内水富集。简言之，通过与碳化钙的反应使血浆水中的质子转移至乙炔。然后用3000系列摆线质谱仪(Monitor Instruments，宾夕法尼亚州切斯威克)分析乙炔样本，所述质谱仪被改型成记录m/z为26和27的离子(M₀和M₁)，并经由99.9％²H₂O与未标记水混合得到的标准曲线校准。体内水²H富集未受药物治疗的影响(数据未显示)。

实例5：SOD1-G93A TGN小鼠的诺斯卡品MK801治疗

雌性SOD-1 G93A TGN小鼠购自杰克逊实验室(Jackson laboratory，种系#2726)。对照组为匹配的同窝仔。治疗组为每组三只。按3次/周在股骨处腹腔内注射诺斯卡品(0.2mg/kg i.p.)，用饮用水连续服用MK801(12mg/kg/d)。按Wooley等(Muscle Nerve 2005 32(1)：43-50)和Carter等(J.Neurosci.，19(8)：3248-3257)的方法进行步态分析，在此将上述内容全文以引用的方式并入。

对于临床评价，终点计分的选择如下：

组分类：症状发生前

临床体征：能充分自由移动，观察不到与年龄匹配的对照组的行为差异(步态或步长分析)。

组分类：发作

临床体征：步态或步长分析异常，后肢虚弱：对比年龄匹配的同窝仔，步长缩短＞40％。

组分类：晚期(无痛致死)

临床体征：显著完全的后肢瘫痪(在此系中，发生于一个肢体上比发生于另一肢体上的情况更多)，并且在5秒的时间窗内自己不能恢复常态。此阶段通常开始于小鼠通不过步态分析试验，并进入晚期。因此，在显著完全的后肢瘫痪并在5秒的时间窗内自己不能恢复常态发作时对转基因SOD1-G93A TGN小鼠实施无痛致死。

未经治疗的转基因小鼠显示出完全后肢瘫痪，始于15周龄，疾病发作约17天后，并最终在16周龄实施无痛致死(表现出以下症状：大范围瘫痪，将一个肢体拉到最大步幅失败[步态分析的记分为“0”]，并且在5秒的时间窗内自己不能恢复常态。

一个经治疗的小鼠显示出完全后肢瘫痪，始于16周龄，疾病发作25天后，并最终在17周龄实施无痛致死(表现出以下症状：大范围瘫痪，将一个肢体拉到最大步幅失败[步态分析的记分为“0”]，并且在5秒的时间窗内自己不能恢复常态。

另2只经治疗的转基因小鼠在大致18周龄开始发生后肢虚弱(如通过步态分析记分)，然而在该时刻它们还没有发展出显著完全的后肢瘫痪。

表1

作为比较，早先在ALS SOD1 G93A小鼠中研究的利鲁唑ALS治疗，由ALS TDF或其它研究人员发表：

组	发病至死亡
		SOD1-G93A TGN未经治疗(对照组)	10-12天
SOD1-G93A TGN用利鲁唑治疗	14-20天

用诺斯卡品和/或MK-801治疗的SOD1-G93A TGN小鼠的运动缺陷发病和死亡率：

实例6：在有症状的SOD1^G93A小鼠中的治疗干预。

一种新型两药治疗的成功确定示于图16。给有症状的SOD1^G93A小鼠服用MTMA/KM-ID05药物(10周)，治疗进行3周(n＝3)。在治疗的后2天给其施用²H₂O(8％)，标记48小时后处死小鼠。切下脊髓的腰部区(L2与L5水平线之间)和整个长度的坐骨神经并小心地取出。在脊髓运动神经元和坐骨神经的所有神经元间室中测量微管动力学。

如图16中详细显示的那样，MTMA/KM-ID05治疗的SOD1^G93A小鼠显示出高动力微管的显著减少，下降到接近于野生型小鼠的水平。在所有的神经元间室中检测到MTMA/KM-ID05的积极效果。

为了确定MTMA/KM-ID05对SOD1^G93A小鼠中的疾病恶化的影响，我们进行了步长测量(图17)。通过用着食用色素的甘油涂爪子来确定步长。重复进行试验，直到小鼠走直线，并且可以测量到四个清楚连续的步长。步长是由同一爪子造成的爪印之间的距离，从一个爪印的中心到下一个爪印的中心量取。

分析总是在每天的同一时间进行，使用同一性别年龄匹配的转基因未治疗、治疗和对照组的动物(n＝20)。与对照组小鼠不同，SOD1^G93A小鼠显示出与年龄有关的运动机能衰退(图17)。疾病在SOD1^G93A小鼠中发作的特征在于，步长缩短40％(在12.5周龄)，接下来是迅速衰退阶段，由该阶段恶化到完全的后肢瘫痪阶段(17周)。注意，两药治疗明显延缓了疾病的发作，并在整个试验期间改善了SOD1^G93A小鼠的运动机能(图17)。MTMA/KM-I D05还使SOD1^G93A小鼠的失重显著地减少30％(数据未显示)。

为了评估MTMA/KM-ID05治疗是否减少了运动神经元的退化，我们对各脊髓的坐骨运动神经池的一段中的运动神经元数目进行计数。在15周龄的SOD1^G93A小鼠中评价治疗效果。

野生型对照组(WT)未治疗(SOD1^G93A)和治疗(SOD1^G93AMTMA/KM-ID05)小鼠的尼氏染色脊髓截面的例子示于图18A。在MTMA/KM-ID05治疗的SOD1^G93A小鼠中观察到的运动神经元存活的改善反映在运动神经元存活数的增加，结果归纳于图18B。在15周龄时，在未经治疗的SOD1^G93A小鼠中，坐骨神经池中的大量运动神经元已经死亡，只有197(±10.2)个运动神经元存活，相比的WT同窝仔中则有387(±6.2)个。然而，用MTMA/KM-ID05的治疗挽救了很大一部分运动神经元，这样有298(±4.4)个运动神经元存活。因此，与其未经治疗的SOD1^G93A同窝仔相比，在经MTMA/KM-ID05治疗的SOD1^G93A小鼠中，即使在15周也有50％以上的运动神经元存活。

接下来检查用MTMA/KM-ID05治疗对SOD1^G93A小鼠寿命的影响(n＝20)。未经治疗的SOD1^G93A小鼠平均活118.5(±4.2)天。这些实验中的晚期是由小鼠失体重15％时的龄数决定的，它们表现出完全的后肢瘫痪，仪态不整，并且它们不再能够自己恢复常态。

MTMA/KM-ID05将SOD1^G93A小鼠的存活期显著地延长了25.6天，寿命增加了22％。

总之，在症状期施用MTMA/KM-ID05能够有效力地减少微管的过度动态性。值得注意的是，MTMA/KM-ID05作用机理确实能缓解疾病症状，这在运动神经元的存活期和SOD1^G93A小鼠寿命的明显延长中得到反映。

慢速轴突运输的变化已经与突变SOD1转基因小鼠的发病机制相关联。先前已显示，基于移动速度而言，慢速轴突运输有两个组成部分：一者为约0.5毫米/天，另一者为约1-2毫米/天。运输的两组成部分均包括微管蛋白。为了确定MTMA/KM-ID05治疗是否能恢复受损的轴突运输，我们测量²H标记的微管蛋白在SOD1^G93A转基因小鼠的L5根和坐骨神经中的运输速率。在13周龄时，与WT同窝仔相比，在未经治疗的SOD1^G93A的L5根、小丘和近端轴突的起始段中发现大量²H-微管蛋白的积累。然而，用MTMA/KM-ID05治疗使²H标记的微管蛋白沿轴突的运输速率完全恢复正常。因此，与未经治疗的SOD1^G93A同窝仔相比，在MTMA/KM-ID05治疗的SOD1^G93A小鼠中，基于微管的轴突运输完全恢复。

总起来看，这些结果表明微管动力学是疾病活动的生物标记。因此，它们可用来评价新疗法并预测对ALS的临床疗效。

如图19中详细示出的那样，我们利用微管动力学试验来评价和比较体内研究的多种候选组合药剂的相对神经保护活性。评价对“强”与“弱”神经保护作用之间的临床疗效预测(图19)。选择五组两药剂组合，用于进一步评价在延缓疾病恶化和延长SOD1^G93A小鼠存活期方面的疗效(每组n＝20只小鼠)。(图20)治疗的SOD1^G93A小鼠的寿命延长了10％～32％，这取决于神经保护作用(微管稳定性)的有效性。我们记录了体内微管动力学的生化测量与硬性临床结果(步长和存活期)之间的显著密切关联。这些研究结果表明微管动力学是疾病活动和治疗反应的强效ALS生物指标(图21)。

实例6：MT-介导的慢速轴突的体内侵入式测量。如图23所示，与正常野生型(WT)同窝仔相比，在转基因有症状的SDO1 G93A的坐骨神经运动轴突中，2H标记的微管蛋白的MT介导慢速轴突运输减少。每个数据点表示30-35ml/kg ²H₂O的单剂量注射在21天之后处死的13周龄鼠L5根部和坐骨神经处的连续2-mm片段。然而，用MTMA治疗3周后，²H-微管蛋白的微管动力学和慢速轴突运输大大恢复，而利鲁唑则没有明显效果。

实例7：MT介导的快速轴突运输的体内非侵入式测量。测量健康(对比退化)的运动神经元的神经元突触小泡货物分子的分泌速率的一个示例性动力学技术模型示于图24。我们的目标是提供在受疾病影响的神经元中的受损MT介导运输的具体、实时指标。基于MT的运输系统是主要的细胞骨架系统之一，驱动蛋白和动力蛋白沿着该系统运送产生力并带动许多细胞组分(突触小泡)运输的蛋白质。MT介导的轴突运输是主要的神经元沟通和运输网络，其用作分泌的小泡状货物(如生长因子、神经递质、酶和糖蛋白)的通路。这里试验的基本策略是，经干扰MT动力学，使运输并然后分泌的2H标记的小泡状“货物”的速率(即，从在细胞体中的合成到从突触中释放的时间)受MT运输系统的影响，并可通过CSF的收集进行体内测量。经脉冲剂量的重水(²H₂O)之后，基于在CSF和在脊髓运动神经元中并发的滞留中出现的延迟动力学，基于在退化的运动神经元中的2H标记的小泡状货物分子，MT介导的快速轴突运输减慢。

如图25(A)中详细示出的那样，对转基因SOD G93A小鼠(代表ALS的动物模型)供给重水(²H₂O)以标记运动神经元中分泌的分子(n＝总共30只小鼠)。对于以最快速度移动的由160-nm小泡组成且基于MT-介导的轴突运输的运输物质来说，从反面高尔基体网络(TGN)到质膜(轴突末梢)的记录速度为约250毫米/天或约3μm/s。因此，预计小泡在约1.2天内从细胞体移动到3cm轴突的末梢(在具有1m轴突的人体受试者中，这可能需要约4到5天)。在小鼠中(n＝6/时间点)，在系列时间点(24小时、48小时、72小时、5天和10天)收集CSF(5-7微升/小鼠)和血浆(100微升/小鼠)。使用市售的抗体，通过免疫沉淀反应从CSF中分离运动神经元分泌的小泡生长因子(例如，神经调节蛋白-1[NueR-1])和糖蛋白嗜铬粒蛋白B[Chr-B]。(B)经30-35ml/kg ²H₂O的腹腔内脉冲剂量之后，在标记后24、48和72小时、5天及10天从13周的野生型(WT)和有症状的SOD1 G93A小鼠中收集CSF。CSF样本首先用蛋白A/G珠进行IgG免疫耗竭，然后通过相继与神经调节蛋白-1抗体珠的结合进行分级。通过在110C用6N HCl处理16小时来水解洗脱液。蛋白质衍生的氨基酸被衍生成五氟苄基衍生物，并通过GC/MS测量由神经调节蛋白-1释放的丙氨酸中的²H结合。采用相同的方案，通过相继与嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]抗体结合从神经调节蛋白-1[NeuR-1]未结合物质中捕获糖蛋白嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]。(C)显示在13周正常野生型(WT)和转基因有症状的SOD1 G93A小鼠的CSF神经调节蛋白-1[NeuR-1]和嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]中出现²H标记的时间进程，分泌的蛋白质(神经调节蛋白-1[NeuR-1]和嗜铬粒蛋白B[Chr-B])在从CSF和血液中分离后，通过在110℃用6N HCl处理16小时进行水解。蛋白质衍生的氨基酸衍生成五氟苄基衍生物，并且通过GC/MS测量²H从²H₂O向衍生的丙氨酸当中的结合，如他处所详述的那样[Fanara，P.等，In vivo measurement of microtubule dynamics using stable isotope labeling with heavy water.Effect of taxanes.J.Biol.Chem.279，49940-49947(2004)；Fanara P.等，Stabilization of hyperdynamic microtubule is neuroprotective in ALS.J.Biol.Chem.282，23465-23472，(2007)]。²H富集计算为丙氨酸衍生物的(M+1)质量同位素异位体比天然丰度的百分比增加。这些结果与转基因SOD1 G93A小鼠显示MT-介导的快速轴突运输减慢的模型一致。

如图26所示，我们采用脉冲²H₂O标记方法测量含突触小泡的神经调节蛋白-1[NeuR-1]和嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]从正常野生型(WT)和转基因有症状的SOD1 G93A小鼠脊髓腰部区运动神经元中由MT-运输介导的分泌速率。(A)使用突触小泡分离试剂盒(SIGMA公司)从脊髓腰部区分离突触小泡。首先利用使用抗突触小泡蛋白抗体的免疫印迹试验检查富集的突触小泡部分的存在并确认富集步骤，抗突触小泡蛋白抗体对小泡膜结合蛋白质突触小泡蛋白是特异性的[Gingel.等，The synaptic vesicle protein Synaptophasyn：purification and characterization of its channel activity.Biophys.J.，83，3223-3229，(2002)]。(B)经30-35ml/kg ²H₂O的腹腔内脉冲剂量，在标记后24、48和72小时从13周的野生型(WT)和有症状的SOD1 G93A小鼠(n＝3，平均值±SD)中收集脊髓腰部区。通过相继与神经调节蛋白-1抗体珠结合对从脊髓腰部区富集的突触小泡部分分级。通过在110C用6N HCl处理16小时来水解洗脱液。蛋白质衍生的氨基酸被衍生成五氟苄基衍生物，并通过GC/MS测量由神经调节蛋白-1释放的丙氨酸中的2H结合。采用相同的方案，通过相继与嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]抗体结合从神经调节蛋白-1[NeuR-1]未结合物质中捕获糖蛋白嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]。显示含突触小泡的2H-标记神经调节蛋白-1[NeuR-1]和2H-标记嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]从13周野生型(WT)和转基因有症状的SOD1 G93A小鼠的脊髓腰部区滞留的动力学的时间进程。这些结果与出现同样的货物分子2H-标记神经调节蛋白-1[NeuR-1]和2H-标记嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]进入CSF的动力学延迟一致。这些数据证实了转基因SOD1 G93A小鼠显示出MT-介导的快速轴突运输的减慢。

如图27中详细示出的那样，MTMA、诺斯卡品的施用通过调节高动力MT使含突触小泡的2H标记神经调节蛋白-1[NeuR-1]和2H-标记嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]的由MT介导的快速轴突运输速率正常化。用MTMA诺斯卡品治疗3周(100mg/kg/d和200mg/kg/d)后，供给30-35ml/kg 2H2O CSF的腹腔内脉冲剂量，分别在24、48和72小时从13周野生型(WT)和有症状的SOD1 G93A小鼠中收集CSF以及脊髓腰部区。CSF分泌速率和含突触小泡的2H-标记神经调节蛋白-1[NeuR-1]或2H-标记嗜铬粒蛋白-B[Chr-B]的滞留神经元动力学的测量如上所述(图23和24)。这些结果与转基因SOD1 G93A小鼠显示出快速轴突运输的减慢和诺斯卡品改善转基因SOD1 G93A小鼠中的这种延迟的快速轴突运输的模型一致。

Claims (9)

1.一种监测药剂对患有运动神经元疾病的受试者的作用的方法，包括：

a)使试验活体系统接触一种或多种药剂；

b)对所述活体系统施用同位素标记的底物，施用的时间足以使所述同位素标记的底物进入运动神经元的轴突中的一个或多个货物分子；

c)从所述活体系统中获得许多样本；

d)对从所述许多样本中分泌的突触小泡货物分子中的同位素富集的时间进程、模式或量进行定量；

e)测量在从对照组系统中的样本中分泌的突触小泡货物分子中的同位素富集的时间进程、模式或量；

f)比较在所述活体系统中的所述分离的突触小泡货物分子中的同位素富集的时间进程、模式或量与在对照组活体系统中的相同参数；以及

g)确定所述药剂对在运动神经元中的微管(MT)-介导的慢速和快速轴突运输的速率的影响。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分泌的突触小泡货物分子选自生长因子、神经递质、糖蛋白和分泌的酶。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述生长因子包括神经调节蛋白-1，所述神经递质包括乙酰胆碱，所述糖蛋白包括嗜铬粒蛋白B，所述分泌的酶包括乙酰胆碱酯酶。

4.根据权利要求1所述的方法，将在所述试验活体系统中的运动神经元中的分泌的突触小泡货物分子中的同位素富集的时间进程、模式或量以及由此MT-介导的轴突运输的效率与在所述对照组活体系统中的运动神经元中的分泌的货物分子中的同位素富集的时间进程、模式或量以及由此快速轴突运输的效率进行比较。

5.根据权利要求1至4所述的方法，其中单独或组合施用多种药剂。

6.根据权利要求1至5所述的方法，其中所述样本包括CSF、血液或组织样本。

7.根据权利要求1至6所述的方法，其中在多个时间点收集所述样本。

8.一种治疗运动神经元疾病的方法，包括施用改变在运动神经元中的MT-介导慢速及快速轴突运输的效率的药剂，由此治疗所述运动神经元疾病。

9.一种筛选对运动神经元疾病有效的药剂的方法，包括使神经元与改变在运动神经元中的MT-介导慢速及快速轴突运输的效率的药剂接触。

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