CN102089442B - 涉及hmgcr蛋白的治疗预测 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种方法,该方法用于确定是否患有一种乳癌的哺乳动物受试者可能受益于一种内分泌治疗,该方法包括以下步骤:提供一种较早从所述受试者获得的样品;评价存在于至少部分的所述样品中的HMGCR蛋白的量,并且确定与所述量对应的一个样品值;将在步骤b)中获得的样品值与一个参考值相比较;以及,如果所述样品值是高于所述参考值的,则做出该受试者可能受益于一种内分泌治疗的结论。此外,提供了一种对应的治疗方法连同进一步的使用方法,以及可以与乳癌治疗或治疗预测结合使用的手段。
Description
技术领域
本披露涉及乳癌治疗以及治疗预测的领域。还涉及在这种治疗或治疗预测中可以采用的手段。
背景
癌症
癌症是在西方世界中疾病和死亡的最普通的原因之一。通常,对于癌症的大多数形式,发病率随着年龄而增加。随着人类种群持续活得更长,由于一般健康状态的增进,癌症可能影响个体数量的增加。虽然在环境因素(饮食、吸烟、紫外线辐射等等)连同遗传因素(“癌基因”如p53、APC、BRCA1、XP等的种系突变)与癌症的发生风险之间提供一种联系的知识体有增加,最普通癌症类型的病因大部分仍然是未知的。
从一种细胞生物学观点看没有完全令人满意的癌症的定义,尽管事实上癌症基本上是一种细胞疾病并且被定义为具有净细胞生长以及抗群体行为的一种转化细胞群体。恶性转化代表基于不可逆的遗传改变以向一种恶性表型的转变。虽然这还没有正式证明,恶性转化是被认为是发生在一个细胞中,随后从该细胞发展出的肿瘤开始了(“癌症的克隆性”教义)。致癌作用是通过它产生癌症的过程并且通常被认为包括最后导致恶性肿瘤生长的多个事件。这种多级过程包括若干限速步骤,如突变以及还可能的次生事件的加入,其导致在癌前期增殖阶段之后癌症的形成。这些分级改变涉及决定细胞分裂、不合群行为、以及细胞死亡的重要调节通路的错误(突变)的累积。与周围的细胞相比,每一种这些改变可以提供一种选择性达尔文生长优势,导致在肿瘤细胞群中的净生长。一种恶性肿瘤不仅必需由这些转化肿瘤细胞它们本身组成,而且周围正常细胞充当为一种支持性基质。这种募集的癌症基质包括结缔组织、血管、以及各种其他的正常细胞例如炎症细胞,它们一致地起作用从而为这些转化肿瘤细胞提供持续肿瘤生长必需的信号。
最常见的癌症的形式出现在体细胞中并且主要是上皮细胞起源的,如前列腺、乳房、结肠、尿道以及皮肤;随后是从造血系起源的癌症如白血病和淋巴瘤、从神经外胚层起源的癌症如恶性胶质瘤、以及软组织肿瘤如肉瘤。
癌症诊断和预测
取自肿瘤的一种组织切片的显微镜评价仍然是确定一种癌症的诊断的金标准。例如,对于显微镜诊断,收集来自可疑肿瘤的活组织检查材料并且在显微镜下检查。为了获得一个确定的诊断,将该肿瘤组织在福尔马林中固定、组织学处理、并且石蜡包埋。从该生成的石蜡块,可以产生组织切片并且使用组织化学(即苏木精-伊红染色)染色以及免疫组织化学法二者。然后用病理学技术(包括肉眼分析以及显微镜分析)评价该外科标本。这种分析通常形成用于给定一个特异性诊断的基础,即进行肿瘤类型的分类以及一种肿瘤的恶性程度的分级。
根据对于各癌症类型特异的分类法可以将恶性肿瘤分成若干阶段。用于实体瘤的最常见的分类系统是肿瘤-淋巴结-转移(TNM)分期系统。T阶段说明原发性肿瘤的局部范围,即该肿瘤已经侵袭并且强加地生长进入周围组织到什么程度,而N阶段以及M阶段说明该肿瘤已经怎样发生转移,N阶段说明该肿瘤扩散到淋巴结,并且M阶段说明在其他远隔器官中肿瘤的生长。早期包括:T0-1、N0、M0,表示具淋巴结阴性的局部性肿瘤。更晚期包括:T2-4、N0、M0,表示具有更广泛生长的局部性肿瘤,以及T1-4、N1-3、M0表示已经转移到淋巴结的肿瘤,并且T1-4、N1-3、M1表示具有在远隔器官中检出的转移的肿瘤。肿瘤的分期通常是基于检查的若干形式,包括外科、放射学以及组织病理学分析。除了分期之外,还有一种对大多数肿瘤类型的恶性级别进行分级的分类系统。该分级系统依赖于一种肿瘤组织样品的形态学评估,并且以在一种给定的肿瘤中发现的微观特征为基础。这些分级系统可以是基于肿瘤细胞的分化、增殖、以及非典型外观。通常采用的分级系统的实例包括用于前列腺癌的Gleason分级以及用于乳腺癌的Nottingham组织学等级(NHG)分级。
准确的分期以及分级对于一种正确的诊断是重要的,并且可以提供一种预测预后的工具。对于一种特异肿瘤的诊断和预测信息其后决定了一种对于给定的癌症患者的适当的治疗策略。除组织切片的组织化学染色之外,为了获得关于一种肿瘤的更多信息的一种通常使用的方法是免疫组织化学染色。IHC允许使用特异性抗体检测在组织和细胞中的蛋白质表达谱。除了从组织化学染色的肿瘤组织切片评估的关于组织结构和细胞形态学的信息之外,IHC在临床诊断学中的用途允许检测在不同的细胞群中的免疫反应性。IHC可以涉及支持准确的诊断,包括一种原发性肿瘤的分期和分级连同未知起源的转移的诊断。在当今临床实践中最通常使用的抗体包括对抗细胞类型“特异性”蛋白,例如PSA(前列腺)、MelanA(黑色素细胞)、以及甲状腺球蛋白(甲状腺)的抗体,以及识别中间丝的抗体(上皮细胞、间充质、神经胶质)、分化群(CD)抗原(造血细胞、淋巴样细胞的亚类)、以及恶性潜能的标志物(例如Ki67(增殖)、p53(通常突变的肿瘤抑制基因)以及HER-2(生长因子受体)。
除了IHC以外,用于检测基因扩增的原位杂交以及用于突变分析的基因测序的使用是癌症诊断内的展开技术。另外,所有转录物、蛋白质、或代谢物的整体分析增加了有关信息。然而,大多数的这些分析仍然代表基础研究并且对于在临床医学中的使用还有待评价和标准化。
乳癌
乳癌是全世界癌症的第二最常见的形式,并且到目前为止是女性最频繁发生的癌症。来自由Parkin等人提出的GLOBOCAM2002数据库的资料揭示在2002年有115万个新病例并且在同一期间有41万个死亡病例(Parkin DM etal.(2005)CA Cancer J Clin 55,74-108)。如果在一个早期检测出,则对于生活在一个发达国家中的患者预后是相对好的,与在一个发展中国家中的57%相比,具有73%的总体五年生存率。该发病率正在缓慢增加,并且在发达国家中大约每九个女性中有一个在她的一生中被认为患上乳癌。虽然与雌性类固醇激素相关的生活方式改变(包括暴露于外源性激素)影响发展乳癌的风险,这些因素仅仅构成了病因学的一小部分,并且预防操作的益处被认为是低的。死亡率的降低主要是由于通过乳房X线照相术筛选的早期检测以及现代辅助全身疗法的使用。
乳癌的治疗
自从在七十年代后期它的引进,保乳治疗(结合乳房保留手术以及手术后放射治疗)已经成为在女性中的第一位的治疗选择,其中肿瘤的根治性切除可以与一种好的美容结果相结合。乳房切除术在一些患者即具有小乳房、大肿瘤(>4cm)或多病灶/多中心疾病的女性中仍然是优选的。
腋窝切开主要是用于诊断目的而进行的,并且将至少10个淋巴结去除以给出一种具有97%至98%敏感性的好的分期指导(Axelsson CK et al.(1992)Eur JCancer 28A:1415-8;Recht A and Houlihan MJ(1995)Cancer 6(9):1491-1512)。然而,对于原发癌的治疗中的微创手术的下一步已经引进了具有腋窝淋巴结定位而不是腋窝淋巴结清扫(它与高的并发症相关)的前哨淋巴结活检技术。这种技术作为认识的结果而被引入,即认识到从乳房到腋窝的大多数淋巴引流最初通过一个(或少数)淋巴结(前哨淋巴结),其支持这个淋巴结可能是腋窝淋巴结状况的一种充分指示的分析(Veronesi U et al.(2003)New Engl J Med349(6):546-53)。
乳癌作为一种全身性疾病的概念,即在诊断时播散性微转移的存在可以解释在区域治疗后的治疗失败,为在七十年代辅助随机试验(包括内分泌疗法和化学疗法)铺平了道路。辅助的综合化学疗法是对于激素受体阴性的具有高复发风险的患者(不论淋巴结状况)的标准疗法。已经证明尤其是在绝经前期患者中对总生存率以及无复发生存率二者的有益效果(EBCTCG(1998)Lancet352(9132):930-42)。对于具有激素应答疾病(例如雌激素受体(ER)和/或孕酮受体(PR)阳性疾病)的患者,辅助的综合化学疗法已经与内分泌疗法相组合作为序贯化学内分泌疗法而给予。并且,辅助化学治疗通常引起闭经,引起除细胞毒性之外的二次内分泌效应(Pagani O et al.(1998)Eur J Cancer 34(5):632-40)。
内分泌疗法已经被推荐用于具有激素受体阳性肿瘤的患者(不论年龄、阶段以及绝经状况)。
在激素应答绝经前患者中,通过手术或照射去除卵巢或通过LHRH激动剂抑制卵巢是有效的辅助治疗方式(Emens LA and Davidson NA(2003)Clin Ca Res(1 Pt 2):468S-94S)。在绝经后患者中,卵巢去除没有位置,因为雌激素的原始来源不是从卵巢合成而是来自在包括乳房的外周组织中的雄甾烯二酮向雌酮和雌二醇的转变。
它莫西芬是一种具有对ER有拮抗作用的选择性雌激素受体调节剂(SERM),它促成了一种在绝经前以及绝经后女性二者中用于晚期乳癌的适当的治疗。研究已经显示在具有ER阳性(ER+)肿瘤的患者(不论淋巴结状况)中在初期手术后给予五年的它莫西芬作为辅助治疗减少了乳癌的死亡率(EBCTCG(1998)Lancet 351(9114):1451-67)。虽然它莫西芬具有一种免于心血管疾病的保护效应,由于对在子宫粘膜中的ER的拮抗作用,发展子宫内膜癌的风险增加了(EBCTCG(2005)Lancet 365(9472):1687-717)。
芳香酶抑制剂(AIs)通过抑制芳香酶而起作用,该酶将雄激素转换成雌激素。例如,AIs可以作为辅助治疗单独地或继它莫西芬治疗之后给予绝经后女性,并且已经显示它们显著降低了死亡率,如果单独给予可能更好(Howell A etal.(1995)Lancet 345(8941):29-30;Ellis MJ and Rigden CE(2006)Curr Med ResOpin 22(12):2479-87;Coates AS et al.(2007)J Clin Oncol 25(5):486-92)。然而,这种疗法是相对新的并且长期副作用还没有完全认识(Buzdar A et al.(2006)Lancet Oncol 7(8):633-43),但最重要的是心血管并发症以及骨质疏松症。
新近研制的完全阻滞ER的纯抗雌激素如氟维司群,目前仅仅用于晚期乳癌而不在该辅助方案中(Rutqvist LE(2004)Best Pract Res Clin Endocrinol Metab18(1):81-95)。
虽然一些研究表明一些ER阴性的即ERα阴性(ERα-)肿瘤对它莫西芬治疗有应答,辅助内分泌疗法被认为在激素受体阴性乳癌中没有位置(EBCTCG(1998)Lancet 351:1451-1467)。
在所有乳癌的约20%并且在低分化乳癌中高达70%过量表达HER2/neu基因(Berger MS等人(1988)Cancer Res 48(5):1238-43;Borg et al.(1990)CancerRes 50(14):4332-7)。具有HER2过量表达的肿瘤患者可能受益于用单克隆抗体曲妥珠单抗的治疗。
虽然临床资料是不一致的(Borget al.(1994)Cancer Lett 81(2):137-44,DePlacido S et al.(2003)Clin Ca Res 9(3):1039-46,Rydén L et al.(2005)J Clin Oncol23(21):4695-704),实验数据支持HER2过量表达与对内分泌治疗的抗性之间的一种关系(Shou J et al.(2004)J Natl Cancer Inst 96(12):926-35)。
乳癌诊断
形态学标准通常仍然被认为在确立乳癌诊断(原位癌以及浸润性癌二者)中是重要的。在浸润性乳腺癌中,浸润性导管癌是最常见的肿瘤类型(约80%),并且小叶癌是第二大实体(约10%到15%)。小管癌以及髓样癌是具有较低患病率的其他的独特类型(WHO,Histological typing of breast tumors,inInternational histological classification of tumors no:2,1981,WHO,Geneva)。
乳癌预后和治疗预测因素
肿瘤类型的正确组织学分类可以是预后关联性的,因为某些亚型如髓样癌总体上具有一种更好的预后。然而,使用Nottingham组织学分级(NHG)系统对组织学等级的评估仍然是一种预后的手段(Elston CW and Ellis IO(1991)19(5):403-10;Sundquist M et al.(1999)Breast Cancer Res Treat 53(1):1-8)。
大多数乳癌是激素受体应答的,即表达ER和/或PR。雌激素的作用是通过ERα和ERβ二种受体介导的。常规地评估ERα和PR以选择内分泌疗法的患者,并且根据一个标准,具有>10%核阳性的肿瘤被认为是阳性的。ERα当今被认为是它莫西芬应答的一种预报因子。然而,有研究表明PR阳性甚至可能是一种比ERα更强的它莫西芬应答的预报因子。将绝经前期患者随机化至它莫西芬或没有辅助内分泌治疗的一项研究揭示在它莫西芬治疗的患者中,PR的高表达(>75%核的部分)显著地与无复发总生存率的增加相关(不考虑ERα的状况)。在一个较低的PR水平(<75%),没有观察到来自它莫西芬治疗的正面效果(Stendahl M et al.(2006)Clin Cancer Res 12:4614-18)。Yu等人最近研究了PR对于辅助内分泌疗法的预测值,并且发现当具有ERα+/PR+肿瘤的年老的患者(≥60岁)用它莫西芬治疗时与没有接受辅助治疗的那些患者相比,具有一种显著较长的无瘤生存率。在较年轻的患者中(<60岁),没有观察到显著作用(Yu KD et al.(2007)The Breast 16:307-315)。有趣的是,来自ATAC试验(用瑞宁得、它莫西芬、或它们的组合治疗的绝经后的女性)的一个报告显示出与用它莫西芬治疗的患者相比,经过6年的随访期对于阿那曲唑治疗的患有ERα+/PR-肿瘤的患者其复发率减半(Dowsett M et al.(2005)J Clin Oncol23(30):7512-7)。
在乳癌中ERβ的作用仍然没有完全弄清楚,虽然最近的研究暗示ERβ表达可能与一种更好的它莫西芬应答相关(Borgquist S et al,(2008)J Clin Pathol61(2):197-203),特别是在ERα-肿瘤中(Gruvberger-Saal SK et al.(2007)ClinCancer Res 13:1987-1994)。然而,ERβ的测定当今通常认为是临床上不相关的。
当今主要的问题是30%-40%的ERα阳性(ERα+)患者不响应于它莫西芬治疗(Riggins RB et al.(2007)Cancer Letters 1:1-24,Gruvberger-Saal SK et al.(2007)Clin Cancer Res 13:1987-1994),这一问题导致了不必要的治疗。此外,一部分ERα-患者响应于它莫西芬治疗,并且对此的原因目前是未知的。Gruvberger-Saal提示ERβ表达可能是在ERα-患者中它莫西芬应答的一种阳性预报因子(Gruvberger-Saal SK et al.(2007)Clin Cancer Res 13:1987-1994)。
还常规评估(主要通过IHC)HER2状况,并且在具有适度表达(2+)的情形下,通过荧光原位杂交(FISH)分析确定基因扩增状况。具有一种HER2阳性肿瘤的患者可能受益于用曲妥珠单抗的治疗。
乳癌是一种真正的异质性疾病,并且尽管对其性质的了解增加,可用的预后性和治疗预测性标志物的武器库仍然是不足的并且一些患者可能因此接受不必要的治疗,而其他的患者可能得到不充分的或甚至无效的治疗。为了更好地定义不同的亚型的乳癌并且增加对于定制的疗法的选项,需要另外的分子标志。
终点分析
端点分析用于评价对于癌症的辅助治疗的试验,因为这给出这些患者怎样响应某一种疗法的信息。端点分析还可能对于潜在的生物标记的研究是有用的。
总生存数(OS)已经被认为是标准的主要的终点。OS考虑到死亡时间,而不论原因,例如是否该死亡是由于癌症或不是由于癌症。检查了失访,并且忽略了区域性复发、远处转移、第二原发乳癌、以及第二其他的原发癌。至今,在许多类型的癌症中可用的有效治疗的数量的增加已经导致对于替代性终点的需要以允许更好地评价辅助治疗的效果。因此,要求长得多的随访以证明辅助治疗改进OS通常与是其他的临床终点(对于治疗是如何成功给出一种较早的指示)互补的。对于这些观察,可以分析研究无复发生存率(RFS)以及乳癌特异性生存率(BCSS)。RFS包括与同样的癌症相关的任何事件的时间,即来自同样的所有癌症复发以及死亡是事件。考虑了远处、局部、以及区域转移连同乳癌特异性死亡。另一方面,忽略了第二原发的同样的癌症及其他原发癌连同对侧乳癌。由于其他的癌症的死亡、非癌症相关的死亡、治疗相关的死亡、以及失访是截尾观察。乳癌特异性生存(BCSS)包括由于最初肿瘤的乳癌引起的到死亡时间。二者的终点是相关的,因为相似或差异可以反映不同的肿瘤生物学行为。与一种局部侵袭行为相关的生物标志物可以例如对RFS(比BCSS)具有更大的影响,而与远处转移的发展相关的生物标志物可以反映在RFS和BCSS二者中。
说明书
本披露的一些方面的一个目的是提供关于患有一种乳癌的哺乳动物受试者的在治疗预测(尤其是乳癌治疗预测)中有用的手段、方法、和/或用途。
本披露的一些其他方面的一个目的是提供在这样一个受试者的治疗中有用的手段、方法、和/或用途。
因此,作为本发明的第一方面的一种第一构型,提供了用于确定是否患有一种乳癌的哺乳动物受试者可能受益于一种内分泌治疗的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供一种较早从所述受试者获得的样品;
b)评价存在于至少部分所述样品中HMGCR蛋白的量,并且确定一个与所述量对应的样品值;
c)将在步骤b)中获得的样品值与一种参考值相比较;以及,
如果所述样品值是高于所述参考值的,
d)则做出该受试者可能受益于一种内分泌治疗的结论。
关于本披露的这些方法的步骤b),HMGCR蛋白的量的增加典型地导致了样品值的增加而不是相反。然而,在一些实施方案中,该评价的量可以与离散样品值的任何一个预设的数量对应。在这类实施方案中,第一个量和第二个增加的量可以与该同样的样品值对应。无论如何,在本披露的情况下,HMGCR蛋白的量的增加将不会导致该样品值的减少。
虽然不便,但在一个等效的方式中,如果在步骤c)与d)之间的条件是“如果该样品量低于该参考值”,则该评价的量可能与样品值逆相关(见以上方法)。细节上作必要的修改,这应用于本披露的其他方法方面、构型、以及实施方案。
在本披露的情况下,“可能受益于一种内分泌治疗”是指如果经历一种内分泌治疗比如果不经历一种内分泌治疗具有一个更高的生存或恢复的机率。在这种情况下,“恢复”是指从一种乳癌状态返回一种无乳癌状态。该“生存率”可以是一种无复发生存率或一种乳癌特异性生存率。此外,该“恢复”可以是一种无复发的恢复。此外,该“更高的机率”可以是至少5%(如至少10%)的在五年、十年或15年的一种机率利益。
本披露的第一方面是基于以前未被认识的事实,即在获自患有一种乳癌的受试者的一种样品中,HMGCR蛋白的表达可以作为在该受试者中对内分泌治疗的应答的一种指示物。更特别的是,诸位发明人已经鉴定出在遭受乳癌的患者中,HMGCR蛋白的值(在一方面)与内分泌治疗后的生存率(在另一方面)之间的一种相关性。典型地,高HMGCR蛋白值在此显示出与内分泌治疗的应答有关。基于HMGCR蛋白表达作为一种乳癌治疗指示物,本披露提供了许多益处。首先,它提供了一种另外的或替代的用于预测是否一位患者可能应答于内分泌治疗的手段。其次它鉴别了激素受体阴性患者的一个亚群(与早期的信念相反,受益于内分泌治疗)。因此,本披露可以提供一种先前治疗不充分群体的准确治疗。第三,本披露鉴别了一个总体上不受益于内分泌治疗的乳癌患者的亚群。
传统上,具有激素受体阴性乳癌(尤其是ER-乳癌)的受试者没有接受到系统性内分泌治疗。然而,如本披露所示,用内分泌治疗提高了在具有激素受体阴性(如ER-或PR-、ER-、PR-、或ER-并且PR-)的具有高HMGCR值的乳癌受试者的亚群中的生存率。因此,诸位发明人已经鉴定出可以用一种内分泌治疗进行治疗的受试者的新的亚群。因此,本披露的不同方面可以是特别与患有激素受体阴性癌症的受试者相关的。
作为该第一方面的一个第二构型,提供了用于确定是否患有一种乳癌的哺乳动物受试者应该经历一种内分泌治疗的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供一种较早从所述受试者获得的样品;
b)评价存在于至少部分的所述样品中的HMGCR蛋白的量,并且确定与所述量对应的一个样品值;
c)将在步骤b)中获得的样品值与一种参考值相比较;以及,如果所述样品值是高于所述参考值的,
d)则做出该受试者应该经历一种内分泌治疗的结论。
作为一个本发明的第一方面的第三构型,提供了对于患有一种乳癌的哺乳动物受试者的一种非治疗策略的方法,该方法包括:
a)提供一种较早从所述受试者获得的样品;
b)评价存在于至少部分所述样品中的HMGCR蛋白的量,并且确定与所述量对应的一个样品值;
c)将在步骤b)中获得的样品值与一个参考值相比较;以及,
如果所述样品值是低于或等于所述参考值的,
d)则避免用一种内分泌治疗治疗所述受试者。
例如,步骤d)的避免可以是在至少距离完成步骤a)-c)的一个星期,如至少距离完成步骤a)-c)的一个月、如至少距离完成步骤a)-c)的三个月、如至少距离完成步骤a)-c)的六个月、如至少距离完成步骤a)-c)的一年、如至少距离完成步骤a)-c)的两年的期间避免。
可替代地,步骤d)的避免可以是直到下一次进行该方法或直到一种乳癌肿瘤的复发时避免。
在该第一方面的一个到三个构型的实施方案中,该乳癌可以是一种激素受体阴性乳癌,如一种ER-或PR-乳癌、一种ER-乳癌、一种PR-乳癌、或一种ER-并且PR-乳癌。例如,该乳癌可以是先前诊断为激素受体阴性的。
通常,激素受体状况如ER状况或PR状况,可以根据任何本领域熟练的技术人员已知的方法而评定,并且本领域的技术人员知道如何获得一个患者的ER和/或PR状况。例如,这类信息可以从使用可商购获得的ER/PR pharmDX试剂盒(DakoCytomation)的一个测试的结果而获得。作为另一个实例,可以用披露于Allred等人(1998)Mod Pathol 11(2),155)的方法获得总评分(Allred评分),并且对于ER和PR二者,比二者高的一个Allred评分被认为是阳性的,而比二者低的一个Allred评分被认为是阴性的。可替代地,当对于在一种样品作为对于ER或PR是阳性或阴性进行分类时,可以使用10%阳性细胞的一个截断值,其被认为是在本领域内的一个限度。
在本领域的普通技术人员知道如何获得一位患者的ER和/或PR状况。例如,这类信息可以从使用可商购获得的ER/PR pharmDX试剂盒(DakoCytomation)的一个测试的结果而获得。作为另一个实例,可以用披露于Allred等人(1998)Mod Pathol 11(2),155)的方法获得总评分(Allred评分),并且用于ER和PR二者,比二者高的一种Allred评分被认为是阳性的,并且比二者低的一种Allred评分被认为是阴性的。可替代地,当对于在一种样品作为对于ER或PR是阳性或阴性进行分类时,可以使用10%阳性细胞的一个截止值,其被认为是在本领域内的一个限度。
如果没有另外说明,在本披露的情况下“ER”是指“Erα”。
作为本发明的第一方面的一个第四构型,提供了用于确定是否患有一种乳癌的哺乳动物受试者可能受益于一种内分泌治疗的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供一种较早从所述受试者获得的样品;
b)评价存在于至少部分所述样品中HMGCR蛋白的量,并且确定与所述量对应的一个样品值;
c)将在步骤c)中获得的样品值与一个参考值相比较;以及由此确定所述受试者的HMGCR状况;
d)获得对于所述受试者的ER状况;以及
如果所述ER状况或所述HMGCR状况是阳性的,
e1)则做出该受试者可能受益于一种内分泌治疗的结论,或
如果所述ER状况以及所述HMGCR状况是阴性的,
e2)则做出该受试者不可能受益于一种内分泌治疗的结论。
然而由同样的概念的密切相关和覆盖,e1)和e2)提供了两个可替代的结论选项。因此,该第一方面的第四构型的方法可以回答是否患有一种乳癌的受试者可能受益于一种内分泌治疗的问题或者是否患有一种乳癌的受试者不可能受益于一种内分泌治疗的问题。因此,该第一方面的该第四构型的方法可以(但不是必需的)包括步骤e1)连同其所附的条件(“if短语”)以及步骤e2)连同其所附的条件(“if短语”)二者。
例如,在步骤c)中,如果该样品值是高于该参考值则该HMGCR状况可以被认为是阳性的,并且如果该样品值是低于或等于该参考值则该HMGCR状况可以被认为是阴性的。
来自受试者的一种单一样品可以例如借助于免疫组织化学提供ER状况和HMGCR状况二者。因此,在本披露的这些方法方面的实施方案中,该ER状况可以从步骤a)的样品获得。此外,该ER状况可以从一种组织材料获得,从该组织材料还获得了步骤a)的样品。因此,可以将来自该受试者的所需活组织检查的数量或生物材料的量保持较低。
作为本披露的第一方面的一个第五构型,提供了一种方法,该方法用于确定是否与存在于至少部分的一种样品(较早获自患有一种乳癌的一个哺乳动物受试者)中的HMGCR蛋白的量对应的一个样品值支持向该受试者施加一种内分泌治疗的决定,该方法包括以下步骤:
a)提供较早从所述受试者获得的样品;
b)评价存在于该样品的至少部分中的HMGCR蛋白的量,并且确定与该量对应的一个样品值;
c)将在步骤b)中获得的样品值与一个参考值相比较;以及,
如果所述样品值是高于该参考值的,
d1)则做出该样品值支持用一种内分泌治疗来治疗该受试者的决定的结论,和/或
如果该样品值是低于或等于该参考值的,
d2)则做出该样品值支持避免用一种内分泌治疗来对该受试者进行治疗的决定的结论。
然而由同样的概念的密切相关和覆盖,该第一方面的该第五构型的d1)和d2)提供了两个可替代的结论选项。因此,该方法可以回答是否该样品值支持避免用一种内分泌治疗对该受试者进行治疗的一个决定的问题,或是否该样品值支持用一种内分泌治疗对该受试者治疗的一个决定的问题。因此,该第一方面的该第五构型的方法可以(但不是必需的)包括步骤d1)连同其所附的条件(“if短语”)以及步骤d2)连同其所附的条件(“if短语”)二者。
在决定对于患有乳癌的患者的一个适当的治疗策略时,对于该治疗负责的医师可以考虑若干参数,如一种免疫组织化学评价的结果、患者年龄、激素受体状况、总体状况、医疗史(如乳癌史)以及遗传特征(如在该受试者的家族中是否存在乳癌的病史)。为在这种决定中被指导,该医师可以进行一个HMGCR蛋白试验,或根据该第一方面命令执行一个HMGCR蛋白试验。在这种情形下,根据该第一方面的第五构型的一种方法可能是特别相关的。
此外,该医师可以命令其他人,如实验室人员执行根据本披露的一种方法的部分,如步骤a)到c),并且由他亲自执行剩余部分如步骤d)或e)。
作为该第一方面的第六构型,提供了用于确定关于患有一种乳癌的哺乳动物受试者的一种内分泌治疗预测的方法:
a)提供来自所述受试者的一种样品;
b)评价存在于该样品的至少部分中的HMGCR蛋白的量,并且确定与所述量对应的一个样品值;
c)使步骤b)的该样品值与用于该受试者的内分泌治疗预测相关。
在以上方法的一个实施方案中,该样品可以是一种较早获得的样品。
步骤c)的相关性是指使生存率资料与获得的样品值相关联的的任何途径以建立该治疗预测。
在高HMGCR蛋白表达与对内分泌治疗的应答性之间的鉴定的相关性还可以形成一个用于对于该受试者的治疗的一个特异性方案的基础。因此,本披露的第二方面的第一构型提供了一种在对其有需要的哺乳动物受试者中的治疗方法,其中所述受试者患有一种乳癌,该方法包括以下这些步骤:
a)提供来自所述受试者的一种样品;
b)评价存在于所述样品的至少部分中的HMGCR蛋白的量,并且确定与所述量对应的一个样品值;
c)将在步骤b)中获得的样品值与一个参考值相比较;以及,
如果所述样品值是高于所述参考值的,
d)则用一种内分泌治疗方案治疗所述受试者。
在该第二方面的第一构型的实施方案中,该乳癌可以是一种激素受体阴性乳癌,如一种ER-或PR-乳癌、一种ER-乳癌、一种PR-乳癌、或一种ER-并且PR-乳癌。例如,该乳癌可以是先前诊断为激素受体阴性的。
作为该第二方面的第二构型,提供了一种对其有需要的哺乳动物受试者中的治疗方法,其中所述受试者患有一种乳癌,该方法包括以下这些步骤:
a)提供来自所述受试者的一种样品;
b)评价存在于所述样品的至少部分中的HMGCR蛋白的量,并且确定与所述量对应的一个样品值;
c)将在步骤c)中获得的样品值与一个参考值相比较;以及由此确定所述受试者的HMGCR状况;
d)获得对于所述受试者的ER状况;以及
如果所述ER状况或所述HMGCR状况是阳性的,
e1)则用一种内分泌治疗方案治疗所述受试者,或
如果所述ER状况以及所述HMGCR状况是阴性的,
e2)则用一种非内分泌治疗方案治疗所述受试者。
然而由同样的概念的密切相关和覆盖,该第二方面的第二构型的e1)和e2)提供了两个可替代的结论选项。因此,该方法可以涉及一种内分泌治疗方案或一种非内分泌治疗方案。因此,该第二方面的第二构型的方法可以(但不是必需的)包括步骤e1)连同其所附的条件(“if短语”)以及步骤e2)连同其所附的条件(“if短语”)二者。
通常关于本披露的治疗方面的方法,对该受试者的治疗负责的医师可以由他亲自执行步骤a)到c),或指示其他人如实验室人员去执行它们。
在本披露的情况下,一种“内分泌治疗”是指具有一种抗雌激素作用的一种全身疗法。此外,“抗雌激素作用”是指在身体内雌激素产生的抑制或雌激素效应的抑制。在本领域中,一种内分泌治疗有时被称为一种抗激素治疗。
本披露的“内分泌治疗”可以选自下组,其组成为:一种选择性雌激素受体调节剂(SERM)治疗、一种芳香酶抑制剂治疗、以及一种甾体雌激素受体拮抗剂治疗。该SERM治疗例如可以选自一种托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、阿佐昔芬、以及它莫西芬治疗。该芳香酶抑制剂治疗例如可以选自阿那曲唑、来曲唑、以及依西美坦治疗。此外,该甾体雌激素受体拮抗剂治疗可以是一种用氟维司群的治疗。
取决于该靶组织,一种SERM可能具有一种激动或拮抗作用。例如,一种SERM可以作为在乳房中的一种拮抗剂并且作为在子宫中的一种激动剂。
在本披露的实例部分中,提出了用SERM它莫西芬治疗的不同的结果。这些结果显示HMGCR蛋白表达的水平与预测这些受试者对它莫西芬治疗是否应答是相关的。因此,在本披露优选的实施方案中,该内分泌治疗是它莫西芬治疗。
例如,本披露的“非内分泌治疗”可以是选自化学疗法、放射疗法、以及它们的组合。这些化学疗法包括单一或综合化学疗法,如用CMF(环磷酰胺、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶)、FEC(氟尿嘧啶、表柔比星、环磷酰胺)、和/或紫杉烷类的治疗。此外,如果该乳癌是HER2阳性(HER2+)的,则该非内分泌治疗可以是一种抗HER2治疗,如用一种抗HER2抗体例如曲妥珠单抗的治疗
在本披露的情况下,“患有一种乳癌的哺乳动物受试者”是指患有一种原发或继发乳房肿瘤的哺乳动物受试者或已经从乳房去除肿瘤的哺乳动物受试者,其中该肿瘤的去除是指通过任何类型的手术或疗法杀死或去除该肿瘤。在这个后者实例中,该肿瘤例如可以已经在前一年内被去除。例如,已经通过手术将一种乳房肿瘤去除并且即将接受辅助治疗的一个受试者在本披露的情况下被认为是“患有一种乳癌”。“乳房肿瘤”包括导管原位癌(DCIS)。在本披露的方法和用途方面中,“患有一种乳癌的哺乳动物受试者”还包括其中该哺乳动物受试者在执行该用途或方法的时候被怀疑患有一种乳癌并且随后确立乳癌诊断的情形。
在本披露的这些方法方面的情况下,“较早获得”是指在执行该方法之前获得。因此,如果在一种方法中提供了较早从一个受试者获得的一种样品,该方法不涉及从该受试者中获得该样品,即该样品是在与该方法分离的一个步骤中从该受试者在先获得的。
因此,本披露的所有方法和用途可以完全在体外进行,除非另有说明。
以上方面的这些方法的步骤b)涉及评价存在于该样品的至少部分中的HMGCR蛋白的量并且确定与该量对应的一个样品值。该“该样品的至少部分”是指该样品的一个相关部分或多个相关部分,用于建立治疗预测或得出关于适当治疗的结论。本领域的技术人员了解在呈现当执行该方法的情况下哪个或哪些部分是相关的。例如,如果该样品包括肿瘤和非肿瘤细胞,该技术人员可以仅仅考虑这些肿瘤细胞,并且仅仅考虑该样品的这些肿瘤细胞的细胞质。
此外,在步骤b)中评价了一个量,并且确定了与该量对应的一个样品值。因此,用于获得该样品值不要求精确地测量HMGCR蛋白的量。例如,可以通过目测一种染色组织样品来评价HMGCR蛋白的量,并且然后可以将该样品值进行分类为高或低(例如基于该评价的量)。本领域的普通技术人员了解如何执行这类评价和测定。
仍然进一步在本披露的情形下,该“参考值”是指一个预定值,该值是与作出关于治疗或治疗预测的决定或结论相关的。
本披露的资料是基于人类女性的群体。因此,在本披露的实施方案中,该“哺乳动物受试者”可以是一个人。此外,在本披露的实施方案中,该“哺乳动物受试者”可以是一位女性如一位绝经前或绝经后的女性。将内分泌治疗给予绝经前或绝经后的受试者二者。通常认为绝经前的女性是更响应于它莫西芬治疗的。因此,在某些实施方案中,尤其是在它莫西芬被选为内分泌治疗的那些患者中,绝经前期人类女性受试者可以是一种特定相关的群体。
本披露的这些诊断的或治疗的肿瘤可以在任何期。然而,如说明在部分4的实例中的研究的这些受试者患有II期浸润性乳癌。根据TNM分期系统,II期是指pT2 N0 M0或pT1-2 N1 M0。因此,在本披露的实施方案中,该“乳癌”可以是一种II期乳癌。
此外,在本披露的实施方案中,该“乳癌”可以是一种淋巴结阴性或一种淋巴结阳性的乳癌(例如参见图4)。“淋巴结阴性癌症”和“淋巴结阳性癌症”分别是指已经和还未扩散到淋巴结的一种癌症。
如图4至图7以及图9所见,特别强调了在淋巴结阳性乳癌中HMGCR蛋白表达的治疗预测作用。因此,在本披露的实施方案中,该乳癌可以是淋巴结阳性的。
在以上方面的这些方法的实施方案中,该样品可以是一种体液样品,如血液、血浆、血清、脑脊液、淋巴液、尿液、或渗出液物的一种样品。优选地,该体液样品是血液、血浆、血清、脑脊液、或淋巴液的一种样品。可替代地,该样品可以是一种细胞学样品或一种粪便样品。
优选地HMGCR蛋白表达的水平可以是在细胞内测量的。因此,该体液、细胞学或粪便样品可以是例如包括细胞,如肿瘤细胞。
在以上方面的这些方法的进一步的实施方案中,该样品可以是一种组织样品,如一种肿瘤组织样品。作为一个实例,该组织样品可以来源于一种原发乳房肿瘤,如一种原位或浸润性癌或一种继发肿瘤(转移)。借助于免疫组织化学,这些组织样品促进HMGCR蛋白表达分析。
诸位发明人已经发现相关的HMGCR蛋白表达主要在细胞质。因此在本披露的这些方法的实施方案中,步骤b)的评价可能限于该样品的细胞(如肿瘤细胞)的细胞质。当该评价限于细胞质时,仅有细胞质的的特征如HMGCR蛋白表达考虑在该评价中。可以例如通过免疫组织化学染色来辅助这类评价。
诸位发明人已经发现遭受乳癌并且基本上没有HMGCR蛋白表达的受试者通常在内分泌治疗后具有差的生存(参见实例,部分4和图)。因此,确定是否该受试者是“HMGCR高”或“HMGCR低”的“截止值”可以是0。
因此,在本披露的这些方法的实施方案中,步骤b)的样品值可以是1(对应于在该样品中可检出的HMGCR蛋白),或0((对应于在该样品中没有可检出的HMGCR蛋白)。因此,在这类实施方案中,该样品的评价是数字的:HMGCR蛋白被认为是或者存在或者缺乏的。在本披露的情形下,“没有可检出的HMGCR蛋白”是指HMGCR蛋白的量是如此低以至于在正常的操作情况期间它通过执行根据以上方面的任一项的方法一个人或一个器具是不可检出的。该“正常的操作情况”是指本领域的技术人员将发现的用于完成本发明的实验室方法和技术。
因此,在本披露的这些方法的实施方案中,步骤c)的参考值可以是0。并且由此得出结论.,在本披露的这些方法的进一步的实施方案中,步骤c)的参考值可以与不具有可检出的HMGCR蛋白的一个参比样品相对应(见下文)。
一个比该参考值高的HMGCR蛋白的样品值或一个获得这样的样品值的受试者,有时在此称为“HMGCR蛋白高的”。此外,一个比该参考值低的或与之相等的HMGCR蛋白的样品值或一个获得这样的样品值的受试者,有时在此称为“HMGCR蛋白低的”。
在本披露的情况下,应当广义地解释术语“样品值”以及“参考值”。为了获得这些值的HMGCR蛋白的定量可以通过自动装置,通过一个基于样品的视觉或显微检查的评分系统,或通过它们的组合而完成。然而,对于一位技术人员如组织病理学领域的一位技术人员还可能的是,仅仅通过例如用于HMGCR蛋白表达的已经染色的组织切片的检查就确定该样品值和参考值。比该参考值高的该样品值的测定可以因此对应于在视觉或显微检验上的测定(比在一个参比组织切片的情况下样品组织切片染色更致密和/或展示了染色细胞的一个更大的部分)。还可以将该样品值与由一篇文字引用给予的一个参考值(如以文本编辑或由一个参考图像说明的一个参考值)相比。因此,该样品和/或参考值在一些情况下可以是技术人员在检查和比较上确定的精神值。
例如,这些技术人员可以将一个样品分类为HMGCR蛋白高或低,其中如果该样品含有比一个先前检查的参比样品更多的HMGCR蛋白,则该样品被分类为高;如果该样品含有比一个先前检查的参比样品少或与之几乎相等的HMGCR蛋白,则该样品被分类为低。可以通过染色该样品来辅助这样的评价,并且如果有必要,将一个参比样品用包括如对于HMGCR蛋白有选择性的抗体的一种染色液进行染色。
可以不同的方式来提供发现与作出关于乳癌受试者的治疗决定相关的一个参考值(用于与来自该受试者的样品值进行比较)。用本披露的这些传授内容的知识,技术人员可以在无需不适当的负担下提供用于执行本披露的这些方法的相关参考值。
执行以上方面的这些方法的人员例如可以使该参考值适应于所希望的信息。例如,可以使该参考值适应于产生最显著的治疗预测信息,例如在HMGCR蛋白高生存曲线与HMGCR蛋白低生存曲线之间的最大间距(参见例如图1)。可以产生一种大间距的一个参考值的一个实例是一种缺乏的细胞质强度。
在以上方面的这些方法的实施方案中,该参考值可以对应于在一种健康组织(如该方法的受试者的一种健康乳房组织或基质组织)中的HMGCR蛋白表达的的量。作为另一个实例,该参考值可以通过在来自另一个可比较的受试者的正常组织的一种标准样品中测量的HMGCR蛋白表达的量而提供。作为另一个实例,该参考值可以通过在一种包括肿瘤细胞的参比样品如一种包括肿瘤组织(例如乳癌组织)的参比样品中测量的HMGCR蛋白表达的量而提供。可优选地,该参比样品的蛋白表达的量是先前确定的。因此,该参考值可以通过在包括表达一种预定量的HMGCR蛋白的细胞的参比样品中测量的HMGCR蛋白的量而提供。
此外,该参考值例如可以通过在一种包括表达一个预定或控制量的HMGCR蛋白的细胞系(如癌细胞系)的参比样品中测量的HMGCR蛋白表达的量而提供。本领域的普通技术人员了解如何提供这类细胞系,例如由Rhodes等(2006)The biomedical scientist,p 515-520的披露引导。
因此,在本披露的这些方法的实施方案中,该参考值可以是与在一个参比样品中HMGCR蛋白表达的量相对应的一个预定值。
然而,如以下进一步论述的,在这个参比样品中HMGCR蛋白的量不必直接与该参考值相对应。该参比样品还可以提供一个HMGCR蛋白的量,这个量有助于一个执行该方法的人员评定不同的参考值。例如,该一种或多种参比样品可以有助于通过提供一个“阳性”参考值和/或一个“阴性”参考值来创造该参考值的一个精神图像(mental image)。
对于在一个样品(如从该受试者较早获得的样品或参比样品)中的HMGCR蛋白表达的定量的一个替代方案,是确定在显示出HMGCR蛋白表达超过某一水平的样品中的细胞的部分。该部分例如可以是:一种“细胞部分”,其中整个细胞的HMGCR蛋白表达被考虑;一种“细胞质部分”,其中仅仅这些细胞的细胞质的HMGCR蛋白表达被考虑;或一种“核部分”,其中仅仅这些细胞的细胞核的HMGCR蛋白表达被考虑。该细胞质部分可以分类为例如<2%、2%至25%、>25%至75%、或>75%的有关细胞群体的免疫反应细胞。该“细胞质部分”对应于在细胞质中显示出阳性染色的样品中的相关细胞的百分比,其中一种在细胞质中的中等的或显著而强烈的免疫反应性被认为是阳性的,并且在细胞质中没有或微弱的免疫反应性被认为是阴性的。病理学领域的技术人员了解存在于当执行该方法的条件下哪些细胞是有关的,并且可以基于他的常识和本披露的教导而确定一种细胞质部分。这些有关的细胞可以是例如肿瘤细胞。此外,技术人员了解如何采用该“细胞部分”或该“核部分”执行对应的测量。
对于在一个样品(如从该受试者较早获得的样品或参比样品)中的HMGCR蛋白表达的定量的另一个替代方案,是确定该样品的总的染色强度。该强度例如可以是:一种“细胞强度”,其中整个细胞的HMGCR蛋白表达被考虑;一种“细胞质强度”,其中仅仅这些细胞的细胞质的HMGCR蛋白表达被考虑;或一种“核强度”,其中仅仅这些细胞的细胞核的HMGCR蛋白表达被考虑。细胞质强度是依照临床组织病理学诊断上使用的标准而被主观评价的。一种细胞质强度测定的结果可以被分类为:缺乏的=在该样品的相关细胞的细胞质中没有总体免疫反应性,微弱的=在该样品的相关细胞的细胞质中微弱的总体免疫反应性,中等的=在该样品的相关细胞的细胞质中的中等的总体免疫反应性,或强的=在该样品的相关细胞的细胞质中显著而强烈的总体免疫反应性。本领域的普通技术人员了解存在于当执行该方法的条件下哪些细胞是有关的,并且可以基于他的常识和本披露的教导而确定一种细胞质强度。这些有关的细胞可以是,例如肿瘤细胞。例如可以如在以下部分4的实例中说明的“细胞质强度”的定义而进行细胞质强度的确定。此外,技术人员了解如何采用“细胞强度”或“核强度”执行对应的测量。
诸位本发明人已经发现HMGCR蛋白的细胞质表达特别与作出治疗预测有关。因此,在以上方面的这些方法的实施方案中,该参考值可以是一种细胞质部分、一种细胞质强度或它们的一种组合。因此,该样品值可以是一种细胞质部分、一种细胞质强度或它们的一种组合。
优选地,该样品值以及该参考值二者都是相同类型的值。
在以上方面的这些方法的实施方案中,用于在步骤d)中的结论的标准是HMGCR蛋白阳性细胞的细胞质部分的一个样品值,即一种“细胞质部分”,该细胞质部分高于0%,如高于1%,如高于2%,如高于5%,如高于10%,如高于15%,如高于20%,如高于25%,如高于30%,如高于35%,如高于40%,如高于50%,如高于60%,如高于70%,如高于75%,如高于80%,如高于90%。
在以上方面的这些方法的可替代的或补充的实施方案中,步骤c)的参考值是95%或更低,如90%或更低,如85%或更低,如80%或更低,如75%或更低,如70%或更低,如65%或更低,如60%或更低,如55%或更低,如50%或更低,如45%或更低,如40%或更低,如35%或更低,如30%或更低,如25%或更低,如20%或更低,如15%或更低,如10%或更低,如5%或更低,如2%或更低,如1%或更低,如0%的一种细胞质部分。
诸位发明人已经认识到低截止值(如为0的值)与治疗预测是特别有关的。然而,他们已经进一步注意到这些检查的肿瘤样品总体上显示出高于50%的一种细胞质部分或1%或更低的一种细胞质部分,其中前者组与对它莫西芬的应答相关联。因此,如果该参考值是一种细胞质部分,它优选是50%或更低,如25%或更低,如20%或更低,如15%或更低。最优选的是10%或更低,如5%或更低,如2%或更低,如1%或更低的,如0%。
此外,在以上方面的这些方法的实施方案中,用于在步骤d)中的结论的标准可以是对于一种样品的染色强度的一个样品值,即一种细胞质强度,该细胞质强度高于缺乏的细胞质强度,如高于微弱的细胞质强度,如高于中等的细胞质强度。在以上方面的这些方法的可替代的或补充实施方案中,步骤c)的参考值可以是HMGCR蛋白表达的中等或更低的细胞质强度,如HMGCR蛋白表达的一种微弱的或更低的细胞质强度,如一种缺乏的细胞质强度。
在这些实例部分中,采用了截止值“缺乏的”细胞质强度。因此,如果该参考值是一种细胞质强度,优选是低的如微弱的或更低的。最优选的是缺乏的。
此外,在以上方面的这些方法的实施方案中,该参考值可以由两个值组成,其中对于在步骤d)中的结论的标准是一个比该两个值的任何一个高的样品值。这样的一个参考值的一个实例是25%或更低的一种细胞质部分以及一种微弱的或更低的细胞质强度。
可替代地,在以上方面的这些方法的实施方案中,该参考值可以是一种部分值与一种强度值(如一种细胞质部分值与一种细胞质强度值)的组合。
此外,在以上方面的这些方法的实施方案中,该参考值可以是一种细胞质部分值与一种细胞质强度值的函数。例如,这样一种函数可以是一种染色评分。如在实例、部分3、以及以下表1中所说明计算该“染色评分”。例如,该参考值可以是2或更低(如1或更低的,如0)的一种染色评分。
本领域的普通技术人员认识到作为一种强度值或一种部分值的其他参考值也落在本发明的范围内。同样,本领域的一名普通技术人员认识到多个部分和强度的其他组合也落在本发明的范围内。因此,该参考值可以包括两个以及可能更多个标准。
总体上,作为该参考值的一种细胞质强度值和/或一种细胞质部分值可以取决于染色步骤,如取决于采用的抗HMGCR抗体以及取决于染色试剂。
由本披露指导,本领域的普通技术人员例如一位病理学家,了解如何执行该评价产生一种部分,如一种细胞的、细胞质的、或核的部分,或一种强度,如一种细胞的、细胞质的、或核的强度。例如,技术人员可以使用一个包括预定量的HMGCR蛋白的参比样品用于建立某些部分或强度的外观。
然而,一个参比样品可能不仅用于提供实际参考值,而且还被用于提供一种样品(具有比对应于该参考值的量更高的HMGCR蛋白的量)的一个实例。作为一个实例,在组织化学染色中(如在免疫组织化学染色中),技术人员可以使用一个参比样品用于建立具有高量的HMGCR蛋白的一种染色样品的外观,例如一个阳性参考。随后,技术人员可以评定具有较低量的HMGCR蛋白的样品的外观,如具有与该参考值对应的HMGCR蛋白的量的一种样品的外观。换言之,技术人员可以使用一个参比样品以创造对应于HMGCR蛋白的量(低于该参比样品)的一个参考值的精神图像。可替代的或作为一种补充的实例,技术人员可以使用具有一个低量的HMGCR蛋白或缺乏可检出的HMGCR蛋白的另一个参比样品,用于建立这种样品的外观,例如作为一种阴性对照。
例如,如果使用了10%细胞质部分的一个参考值,可以采用两个参比样品:一个不具有可检出的HMGCR蛋白的第一参比样品(并且因此对应于0的一种细胞质部分),其小于该参考值;以及一个第二参比样品(具有对应于75%或更高的一种细胞质部分的HMGCR蛋白的量),其大于该参考值。
因此,在评估中,技术人员可以使用一个参比样品用于建立具有高量的HMGCR蛋白的一种样品的外观。这类参比样品可以是一种样品,其包括表达一种高量的HMGCR蛋白的组织,如包括乳房肿瘤组织(具有一种预先建立的HMGCR蛋白的高表达)的一种样品。
因此,该参比样品可以提供一种强的细胞质强度(CI)的一个实例。用一种样品(具有强的CI)的外观的知识,技术人员然后可以将样品分成缺乏的、微弱的、中等的、以及强的CI类别。可以通过缺乏可检出的HMGCR蛋白的一个参比样品(阴性参考),即提供一种缺乏的细胞质强度的一个参比样品而进一步辅助这种区分。此外,该参比样品可以提供具有75%或更高的一种细胞质部分(CF)的样品的一个实例。用一种具有超过75%阳性细胞的样品的外观的知识,技术人员然后可以评价例如具有一个更低百分比的阳性细胞的其他样品的细胞质部分。可以通过缺乏可检出的HMGCR蛋白的一个参比样品(阴性参考),即提供一种低的CF(例如<5%,如<2%)或0的CF的一个参比样品而进一步辅助这种区分。
如上述,表达一种控制量的HMGCR蛋白的细胞系可以用作该参比,尤其是用作一种阳性参考。
还可以提供一个或多个图片作为“参比样品”。例如,这种图片可以是一种在显示某一细胞强度和/或部分的某些条件期间用某一抗体染色的肿瘤组织切片的一个实例。细节上作必要的修改,以上关于“参比样品”的讨论应用于图片。
此外,技术人员应当认识到的是根据以上方面的这些方法的有用性不局限于存在于所讨论的受试者中的HMGCR蛋白的任何具体的变体的定量,只要该蛋白是由有关的基因编码的并且呈现出表达的有关模式。作为一个非限制性实例,该HMGCR蛋白包括或其组成为选自以下的一个序列:
i)SEQ ID NO:1;以及
ii)一个与SEQ ID NO:1有至少85%相同的序列。
在一些实施方案中,以上序列ii)是与SEQ ID NO:1至少90%相同的、至少91%相同的、至少92%相同的、至少93%相同的、至少94%相同的、至少95%相同的、至少96%相同的、至少97%相同的、至少98%相同的、或至少99%相同的。
作为另一个非限制性实例,该HMGCR蛋白包括或其组成为选自以下的一个序列:
i)SEQ ID NO:2;以及
ii)一种与SEQ ID NO:2有至少85%相同的序列。
在一些实施方案中,以上序列ii)是与SEQ ID NO:2至少90%相同的、至少91%相同的、至少92%相同的、至少93%相同的、至少94%相同的、至少95%相同的、至少96%相同的、至少97%相同的、至少98%相同的、或至少99%相同的。
如在本披露的情况下使用的术语“%相同的”,是如以下计算的。使用CLUSTAL W算法(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.and Gibson,T.J.,Nucleic AcidsResearch,22:4673-4680(1994))将查询序列与靶序列比对。将在各位置的氨基酸残基进行比较,并且将在该查询序列中与在该靶序列中相同对应的位置的百分比报告为%相同。此外,该靶序列确定被比较的位置的数量。因此,在本披露的情况下,比该靶序列短的一个查询序列决不会与该靶序列100%相同。例如,一个85个氨基酸的查询序列至多可以是与一个100个氨基酸的靶序列85%相同的。
在以上方面的这些方法的实施方案中,可以通过对该样品应用一种可检出的和/或可以计量的亲和配体来检测和/或定量该HMGCR蛋白,该可以计量的亲和配体能够与该HMGCR蛋白选择性地相互作用。该亲和配体的应用是在能够使该亲和配体与在该样品中任何HMGCR蛋白相结合的条件下进行的。
为了具体化,在上述方面的这些方法的实施方案中,步骤b)可以包括:
b1)对所述样品应用一种能够选择性地与该有待评价的HMGCR蛋白相互作用的可以计量的亲和配体,所述应用是在能够使所述亲和配体结合至存在于所述样品中的HMGCR蛋白的条件之下进行的;
b2)去除未结合的亲和配体;以及
b3)定量该保持与所述样品缔合的亲和配体以评价所述量。
“保持与所述样品缔合的亲和配体”是指在步骤b2)中没有去除的亲和配体,例如结合到该样品的该亲和配体。在此,例如该结合可以是在抗体与抗原之间的相互作用。
然而,在一些实施方案中,根据b2)的未结合的亲和配体的去除(例如洗涤)可能不是必需的。因此,在以上方面的这些方法的一些实施方案中,步骤b)可以包括:
bI)对所述样品应用一种能够选择性地与该有待评价的HMGCR蛋白相互作用的可以计量的亲和配体,所述应用是在能够使所述亲和配体结合至存在于所述样品中的HMGCR蛋白的条件之下进行的;
bII)定量该与所述样品结合的亲和性以评价所述量。一旦通过本披露的教导了解了在HMGCR蛋白与对于乳癌治疗预测之间的关系,选择或制造适当的亲和配体并且选择用于检测和/或定量的适当形式和条件视为是在本领域的普通技术人员的能力范围之内的。尽管如此,为了说明,以下给出了可以证明有用的亲和配体的实例连同用于检测和/或定量的形式和条件的实例。
因此,在本披露的实施方案中,该亲和配体可以是选自下组,其组成为:抗体、其片段以及其衍生物,即基于一种免疫球蛋白支架的亲和配体。这些抗体以及它们的片段或衍生物可以是分离的和/或单特异性的。抗体包括任何起源的单克隆和多克隆抗体,包括鼠类的、兔的、人的、以及其他抗体,连同包括来自不同物种的序列的嵌合抗体,如部分人源化的抗体例如部分人源化的鼠抗体。通过用选择的抗原免疫动物生产了多克隆抗体。可以使用由和Milstein研制的杂交瘤技术生产限定特异性的单克隆抗体(G和MilsteinC(1976)Eur.J.Immunol.6:511-519)。本披露的这些抗体片段以及衍生物与产生这些抗体片段或衍生物的抗体对其抗原(例如HMGCR蛋白)是能够同样地进行选择性相互作用。抗体片段以及衍生物包括:Fab片段,包括一种完整的免疫球蛋白的重链的第一恒定域(CH1)、轻链的恒定域(CL)、重链的可变域(VH)、以及轻链的可变域(VL);Fv片段,包括两个可变抗体域VH和VL(Skerra A和Plückthun A(1988)Science 240:1038-1041);单链Fv片段(scFv),包括通过一种柔性肽接头连接在一起的两个VH和VL域(Bird RE和Walker BW(1991)Trends Biotechnol.9:132-137);Bence Jones二聚体(Stevens FJ et al.(1991)Biochemistry 30:6803-6805);骆驼科动物重链二聚体(Hamers-Casterman C et al.(1993)Nature 363:446-448)以及单可变域(Cai X和Garen A(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:6280-6285;Masat L et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:893-896),以及单域支架,像例如来自护士鲨(nurse shark)的新抗原受体(NAR)(Dooley H et al.(2003)Mol.Immunol.40:25-33)以及基于一种可变重链域的微型抗体(minibodies)(Skerra A和Plückthun A(1988)Science 240:1038-1041)。
将SEQ ID NO:1设计为用于免疫,例如设计成缺乏跨膜区域以确保在大肠杆菌中有效表达,以及缺乏任何信号肽,因为那些在成熟蛋白中裂开。因此,根据本披露的一种抗体或其片段或衍生物例如可以是通过一种方法可获得的一种,该方法包括用一种蛋白质(其氨基酸序列包括,优选包括序列SEQ IDNO:1)免疫一种动物(如一种兔)的一个步骤。例如,该免疫方法可以包括用在弗氏完全佐剂中的蛋白质的初次免疫。此外,该免疫方法可以进一步包括用在弗氏完全佐剂中的蛋白质以2-6星期的间隔增强至少两次。对抗一种给定的靶标的抗体或片段或它们的衍生物的生产方法在本领域中是已知的,并且可以与本披露的这个方面结合应用。
在本披露的情况下,一种“单特异性抗体”是多克隆抗体的群体的一种,其依靠自己的抗原已经亲合纯化,由此从其他的抗血清蛋白以及非特异性抗体分离这类单特异性抗体。这种亲和纯化产生了与其抗原选择性地结合的抗体。在本披露的情况下,这些多克隆抗血清是通过基于一种两步法免疫亲和性的科学试验计划而纯化的以获得对该靶蛋白选择性的单特异性抗体。使用固化标签蛋白作为捕获剂,在一个初次消耗步骤中将定向针对抗原片段的属类亲和标签的抗体去除。继该第一消耗步骤之后,将该血清荷载到第二亲和柱(具有该抗原作为捕获剂)上,以便富集对于该抗原特异性的抗体(还见Nilsson P et al.(2005)Proteomics 5:4327-4337)。
多克隆和单克隆抗体连同它们的片段和衍生物,代表了在要求选择性生物分子识别的应用中亲和配体的传统选择,如在根据以上方法方面的HMGCR蛋白的检测和/或定量中。然而,在本领域中的那些普通技术人员知道:由于选择性结合配体的高流通量产生以及低成本生产系统的要求增加,已经在近十年期间研发了新的生物分子多样性技术。这已经能够使免疫球蛋白连同非免疫球蛋白(已经证明作为结合配体在生物分子识别应用中同样有用,并且可以代替或与免疫球蛋白一起使用)二者起源的新类型的亲和配体的产生。
需要用于亲和配体选择的生物分子多样性可以通过多种可能的支架分子之一的组合工程而产生,并且然后使用一种适当的选择平台选择特异性和/或选择性亲和配体。该支架分子可以是免疫球蛋白起源的(Bradbury AR和Marks JD(2004)J.Immunol.Meths.290:29-49),非免疫球蛋白起源的(Nygren和Skerra A (2004)J.Immunol.Meths.290:3-28),或一种寡核苷酸起源的(Gold Let al.(1995)Annu.Rev.Biochem.64:763-797)。
在新颖的结合蛋白的研制中已经将许多非免疫球蛋白蛋白支架用作支持结构。对生成针对HMGCR蛋白的亲和配体有用的以用于根据本披露的用途的这类结构的非限制性实例是:葡萄球菌蛋白A和其域以及这些域的衍生物,如蛋白Z(Nord K et al.(1997)Nat.Biotechnol.15:772-777);脂质运载蛋白(Beste Get al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:1898-1903);锚蛋白重复域(BinzHK et al.(2003)J.Mol.Biol.332:489-503);纤维素结合域(CBD)(Smith GP etal.(1998)J.Mol.Biol.277:317-332;J et al.(2000)Proteins 41:316-322);γ晶型(Fiedler U和Rudolph R,WO01/04144);绿色荧光蛋白(GFP)(Peelle Bet al.(2001)Chem.Biol.8:521-534);人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)(Hufton SE et al.(2000)FEBS Lett.475:225-231;Irving RA etal.(2001)J.Immunol.Meth.248:31-45);蛋白酶抑制剂,如Knottin蛋白(Wentzel A et al.(2001)J.Bacteriol.183:7273-7284;Baggio R et al.(2002)J.Mol.Recognit.15:126-134)以及Kunitz域(Roberts BL et al.(1992)Gene 121:9-15;Dennis MS和Lazarus RA(1994)J.Biol.Chem.269:22137-22144);PDZ域(Schneider S et al.(1999)Nat.Biotechnol.17:170-175);肽适体,如硫氧还蛋白(Lu Z et al.(1995)Biotechnology 13:366-372;Klevenz B et al.(2002)Cell.Mol.LifeSci.59:1993-1998);葡萄球菌核酸酶(Norman TC et al.(1999)Science 285:591-595);淀粉酶抑肽(tendamistats)(McConell SJ和Hoess RH(1995)J.Mol.Biol.250:460-479;Li R et al.(2003)Protein Eng.16:65-72);基于纤连蛋白Ⅲ型域的trinectins(Koide A et al.(1998)J.Mol.Biol.284:1141-1151;Xu L et al.(2002)Chem.Biol.9:933-942);以及锌指结构(Bianchi E et al.(1995)J.Mol.Biol.247:154-160;Klug A(1999)J.Mol.Biol.293:215-218;Segal DJ et al.(2003)Biochemistry 42:2137-2148)。
以上提到的非免疫球蛋白支架的实例包括:呈现有用于新颖的结合特异性的产生的一种单随机化环(single randomized loop)的支架蛋白,具有一种刚性次级结构的蛋白支架,其中从该蛋白表面突出的侧链被随机化以用于新颖的结合特异性的产生,以及展示有用于新颖的结合特异性的产生的一种非邻接高可变环区域(non-contiguous hyper-variable loop region)的支架。
除非免疫球蛋白之外,寡核苷酸也可以用作亲和配体。单链核酸被称为适体或假目标(decoys),折叠成轮廓分明的三维结构并且以高亲合性和特异性结合至它们的靶标。(Ellington AD和Szostak JW(1990)Nature 346:818-822;BrodyEN和Gold L(2000)J.Biotechnol.74:5-13;Mayer G和Jenne A(2004)BioDrugs18:351-359)。这些寡聚核苷酸配体可以是RNA或DNA,并且可以结合至宽范围的靶分子类别。
为了从任何上述支架结构的变体的集合体(pool)选择所希望的亲和配体,许多选择平台可用于分离一种特异的新颖的配体(针对选择的一种靶蛋白)。选择平台包括但不局限于:噬菌体展示(Smith GP(1985)Science228:1315-1317)、核糖体展示(Hanes J和Plückthun A(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:4937-4942)、酵母双杂交系统(Fields S和Song O(1989)Nature 340:245-246)、酵母展示(Gai SA和Wittrup KD(2007)Curr OpinStruct Biol17:467-473)、mRNA展示(Roberts RW和Szostak JW(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:12297-12302)、细菌展示(Daugherty PS(2007)CurrOpin Struct Biol 17:474-480、Kronqvist N et al.(2008)Protein Eng Des Sel 1-9、Harvey BR et al.(2004)PNAS 101(25):913-9198)、微珠粒展示(Nord O etal.(2003)J Biotechnol 106:1-13、WO01/05808)、SELEX(System Evolutionof Ligands by Exponential Enrichment)(Tuerk C和Gold L(1990)Science249:505-510)、以及蛋白质片断互补测定(PCA)(Remy I和Michnick SW(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:5394-5399)。
因此,在本披露的实施方案中,该亲和配体可以是源自任何以上所列出的蛋白支架或一种寡核苷酸分子的一种非免疫球蛋白亲和配体。
该HMGCR蛋白SEQ ID NO:1被设计为包括一种独特的序列,该序列具有与其他人类蛋白低的同源性,并且使产生的亲和试剂的交叉反应性最小化。因此,在本披露的实施方案中,该亲和配体可以能够与由序列SEQ ID NO:1组成的一种多肽选择性地相互作用。
在以下实例中,采用了结合至一种具有序列SEQ ID NO:4的HMGCR表位的抗体。SEQ ID NO:4是指氨基酸序列CKDNPGENARQLAR(即EnsEMBL登录号ENSP00000287936的827-840氨基酸)。这种抗体导致了强染色。因此,在本披露的进一步的实施方案中,该可以计量的亲和配体可以能够与一种HMGCR蛋白选择性地相互作用的,该HMGCR蛋白包括或其组成为序列SEQID NO:4。
在本披露的一些实施方案中,可以与该HMGCR蛋白选择性地相互作用的一种亲和配体是可检出的和/或可以计量的。这种亲和配体的检测和/或定量可以按技术人员已知的用于在基于生物学相互作用的测定中的结合试剂的检测和/或定量的任何方式来完成。因此,如以上所说明的任何亲和配体可以用于定性或定量检测该HMGCR蛋白的存在。这些“第一”亲和配体可以用不同的标志物将它们自身标记或可以进而由第二标记的亲和配体检出,以允许检测、可视化和/或定量。这可以使用许多标记的任何一种或多种来完成,这些标记可以使用技术人员已知的许多技术的任何一种或多种(而不像涉及任何过度实验的那样)而被结合至能够与HMGCR蛋白相互作用的亲和配体或结合至任何第二亲和配体。
可以结合至第一和/或第二亲和配体的标记物的非限制性实例包括:荧光染料类或金属类(例如荧光素、若丹明、藻红蛋白、胺荧)、发色染料类(例如视紫红质)、化学发光化合物类(例如鲁米那、咪唑)、以及生物发光蛋白类(例如萤光素、荧光素酶)、半抗原类(例如生物素)。许多种其他的有用的荧光剂以及发色团说明于(Stryer L(1968)Science 162:526-533以及Brand L和Gohlke JR(1972)Annu.Rev.Biochem.41:843-868)中。还可以用酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-内酰胺酶)、放射性同位素(例如3H、14C、32P、35S、或125I)以及颗粒(例如金)来标记亲和配体。在本披露的情形下,“颗粒”是指适合于分子的标记的颗粒,如金属颗粒。此外,还可以用荧光半导体纳米晶体(量子点)来标记这些亲和配体。量子点具有优越的量子产率并且相比于有机荧光团是更耐光的,并且因此更容易被检出(Chan et al.(2002)CurrOpi Biotech.13:40-46)。可以使用不同的化学作用(例如胺反应或硫醇反应)将这些不同类型的标记物结合至一种亲和配体。然而,除了胺和硫醇外,可以使用其他的反应基团,例如醛、羧酸以及谷氨酰胺。
可以将以上方法方面使用在任何若干已知的形式和结构中,其中一种非限制性的选择在以下论述。
在基于组织学的一种结构中,结合到其HMGCR蛋白靶标上的一种标记的亲和配体的检测、定位、和/或定量可以包括可视化技术,如光学显微术或免疫荧光显微术。其他的方法可以包括经由流式细胞术或发光测定法的检测。
可以将一种生物样品,如一种肿瘤组织样品(活组织检查)例如来自已经从受试者移出的乳房组织用于HMGCR蛋白的检测和/或定量。该生物样品如该活组织检查,可以是一种较早获得的样品。如果在一种方法中使用一种较早获得的样品,没有该方法在人或动物体上实践的步骤。可以将亲和配体应用到该生物样品用于HMGCR蛋白的检测和/或定量。这种过程不仅使得能够检测HMGCR蛋白,而且可以另外显示其表达的相对水平以及分布。
在亲和配体上的标记的可视化的方法可以包括但不局限于荧光测定、发光测定和/或酶的技术。通过将荧光标记暴露于一种特定波长的光下而将荧光检测和/或定量,并且其后在一个特定波长区域中检测和/或定量发射的光。可以通过在一种化学反应期间发生的荧光而检测和/或定量一种荧光标记的亲和配体的存在。一种酶促反应的检测是由于在样品中起于化学反应的一种色移。在本领域中的那些普通技术人员知道可以改进许多种不同的科学试验计划以便用于适当的检测和/或定量。
在以上方面的这些方法的实施方案中,一种生物样品可以被固化到一种固相支持物或载体上,如硝酸纤维素或任何其他的能够固化存在于应用于它的生物样品中的HMGCR蛋白的固体支持基质。在本发明中有用的一些众所周知的固态支持材料包括:玻璃、碳水化合物(例如Sepharose)、尼龙、塑料、羊毛、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、右旋糖酐、淀粉酶、薄膜、树脂、纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖、氧化铝、辉长岩、以及磁铁矿。在该生物样品固定之后,可以应用对HMGCR蛋白特异性的第一亲和配体,例如在本披露的实例、部分3、4或5中所说明。如果该第一亲和配体没有完全地被标记,可以用在本领域中已知的一种或多种适当的缓冲液洗涤该支持基质,随后暴露于一种第二标记的亲和配体,并且再一次用缓冲液洗涤以除去未结合的亲和配体。其后,可以用常规方法将选择性亲和配体检测和/或定量。对于一种亲和配体的结合性质可能在一个固态支持物与另一个之间不同,但那些在本领域中的普通技术人员将能够通过常规实验确定对于每一测定有效的和最适的测定条件。
因此,在以上方面的这些方法的实施方案中,b1)的可以计量的亲和配体可以使用能够识别该可以计量的亲和配体的一种第二亲和配体进行检测。b3)的定量因此可以借助于一种第二亲和配体(具有对于该可以计量的亲和配体的亲合性)来进行。作为一种实例,该第二亲和配体可以是一种抗体或其一种片段或一种衍生物。
作为一种实例,用于该HMGCR蛋白的检测和/或定量的一个可用的方法是通过连接该亲和配体到一种酶,然后可以在一种酶免疫测定(如一种EIA或ELISA)中检测和/或定量该酶。很好地建立了这类技术,并且它们的实现对于技术人员不存在任何过度的困难。在这类方法中,使该生物样品与一种固体材料接触或与一种结合至针对该HMGCR蛋白的亲和配体的一种固体材料接触,然后用一种酶标记的第二亲和配体进行检测和/或定量。此后,加入一种适当的底物,在具有这种酶性标记的适当的缓冲液中反应以产生一种化学部分,例如使用一种分光光度计、荧光计、光度计或通过直观的方式将该化学部分检测和/或定量。
如上所述,可以用放射性同位素标记第一和任何第二亲和配体以使其能够检测和/或定量。在本披露中适当的放射性标记的非限制性的实例是:3H、14C、32P、35S或125I。该标记的亲和配体的比活性取决于该放射性标记的半衰期、同位素纯度、以及该标记如何已经结合进入该亲和配体中。优选地使用众所周知的技术将亲和配体标记(Wensel TG和Meares CF(1983)in:Radioimmunoimaging和Radioimmunotherapy(Burchiel SW and Rhodes BA eds.)Elsevier,New York,pp185-196)。一种如此放射性标记的亲和配体可用于通过在体内或体外放射性的检测来可视化HMGCR蛋白。放射性核素扫描,如用γ照相机、磁共振波谱学或发射断层术功能用于体内以及体外检测,同时还在体外使用γ/β计数器、闪烁计数器、以及放射线照相术。
作为本披露的第三方面,提供了一种用于进行根据以上方面的一种方法的试剂盒,该试剂盒包括:
a)能够与一种HMGCR蛋白选择性地相互作用的一种可以计量的亲和配体;以及
b)用于对该亲和配体的量进行定量必需的试剂。
根据第三方面的试剂盒的不同的组分可以结合以上本披露的方法方面的说明而选择并且限定。
因此,根据本披露的试剂盒包括针对一种HMGCR蛋白的一种亲和配体,连同其他的有助于定量该特异性的和/或选择性亲和配体(在它已经特异性和/或选择性地结合到该HMGCR蛋白之后)的手段。例如,该试剂盒可以包含一种第二亲和配体,用于检测和/或定量一种由该HMGCR蛋白与该亲和配体(能够选择性地与该HMGCR蛋白相互作用)形成的络合物。该试剂盒还可以包含除亲和配体以外的不同的助剂物质,以使该试剂盒能够容易并且有效地使用。助剂物质的实例包括:用于进行溶解或复原该试剂盒的冻干蛋白组分的溶剂、洗涤缓冲液、用于对酶活性进行测量(在一种酶被用作一种标记物的情况下)的底物、在使用石蜡或福尔马林固定组织样品的情况下为提高对抗原的可接近性的靶标恢复溶液、以及在免疫测定试剂盒中通常使用的物质如反应阻止剂,例如为降低背景染色的内源性酶封闭溶液和/或为增加染色对比的复染溶液。
在试剂盒方面的实施方案中,亲和配体可以选自结合如以上这些方法方面的说明。
此外,根据结合以上这些方法方面的说明,在该试剂盒方面的实施方案中该可检出的亲和配体可以包括一种选自下组的标记物,该组的组成为:荧光染料和金属、发色染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性同位素、颗粒以及量子点。可替代地,用于定量该亲和配体的量所必需的试剂包括一种能够识别该可以计量的亲和配体的第二亲和配体。作为一个实例,能够识别该可以计量的亲和配体的该第二亲和配体包括选自下组的一种标记物,该组的组成为:荧光染料和金属、发色染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性同位素、颗粒以及量子点。
根据该试剂盒方面的试剂盒还可以有利地包括用于提供或产生参考值(有待用于与样品值比较)的一种参比样品。例如,该参比样品可以包括一个预定量的HMGCR蛋白。这种参比样品例如可以由一种具有该预定量的HMGCR蛋白的组织样品组成。然后,在被研究的样品中的HMGCR表达状态的测定中,该组织参比样品可以被本领域中的一个普通技术人员通过手工使用(如用眼)或自动化比较在该参比组织样品与该受试者样品中的表达水平。作为另一个实例,该参比样品可以包括细胞系,如表达一个预定或控制量的HMGCR蛋白的癌细胞系。本领域的技术人员了解如何提供这类细胞系,例如按照Rhodes等披露的(2006)The biomedical scientist,p 515-520的指导。作为一种实例,可以用福尔马林将这些细胞系固定。此外,可以用石蜡将这类福尔马林固定的细胞系包埋。
术语“用于提供该参考值的参比样品”在本披露的情况下应当被宽泛地解释。该参比样品可以包括实际上与该参考值对应的量的HMGCR蛋白,但是它也可以包括与高于该参考值的一个值对应的一个量的HMGCR蛋白。在后者情况下,该“高”值可以被一个执行该方法的人员用作一个上参照(阳性参照)用于评定例如低于该“高”值的一个参考值的外观。免疫组织化学领域的技术人员了解如何做这样一种评定。此外,作为一种可替代的或一种补充的实例,该技术人员可以使用包括一个低量的HMGCR蛋白的另一个参比样品例如作为一个阴性参照用于提供在这样一种评估中的一个“低”值,。结合这些方法方面在以上进一步论述了这种情况。
因此,在该试剂盒方面的实施方案中,该参比样品可以包括与该参考值对应的量的HMGCR蛋白。作为一个实例,该参比样品可以包括与95%或更低(如90%或更低、如85%或更低、如80%或更低、如75%或更低、如70%或更低、如65%或更低、如60%或更低、如55%或更低、如50%或更低、如45%或更低、如40%或更低、如35%或更低、如30%或更低、如25%或更低、如20%或更低、如15%或更低、如10%或更低、如5%或更低、如2%或更低、如1%或更低、如0%)的一种细胞质部分对应的一个量的HMGCR蛋白。
如以上提及的,诸位本发明人已经认识到低截止值(如一个0的值)对于该治疗预测是特别相关的。然而,他们已经进一步注意到:这些检查的肿瘤样品通常显示一种高于50%的细胞质部分或一种1%或更低的细胞质部分,其中前者组与对它莫西芬的应答相关联。
因此,在优选的实施方案中,该参比样品可以包括与50%或更低(如25%或更低、如20%或更低、如15%或更低、如10%或更低、如5%或更低、如2%或更低、如1%或更低、如0%)的一种细胞质部分对应的一个量的HMGCR蛋白。
可替代地,或作为一种补充,该参比样品可以包括与一种中等或更低的HMGCR蛋白表达的细胞质强度(如一种微弱或更低的HMGCR蛋白表达的细胞质强度)对应的一个量的HMGCR蛋白。如这些附图所示,一种低细胞质强度(如一种缺乏的细胞质强度)是一个相关截止值。因此,在一个实施方案中,该参比样品可以包括与一种微弱或更低的细胞质强度(如一种缺乏的细胞质强度)对应的一个量的HMGCR蛋白。
此外,该参比样品可以包括与一个0、1或2(优选0)的染色评分对应的一个量的HMGCR蛋白。
结合方法方面以上论述了细胞质部分值或细胞质强度值的规定。
此外,在试剂盒方面的可替代的或补充的实施方案中,该试剂盒可以包括一个参比样品,该参比样品包括与高于该参考值的一个值对应的一个量的HMGCR蛋白。在这些实施方案中,该参比样品例如可以包括与75%或更高的一种细胞质部分和/或核表达的一种强的细胞质强度对应的一个量的HMGCR蛋白。
在该试剂盒方面的另一个可替代的或补充的实施方案中,该试剂盒可以包括一个参比样品,该参比样品包括与低于或等于该参考值的一个值对应的一个量的HMGCR蛋白,例如≤1%HMGCR蛋白阳性细胞(如0%HMGCR蛋白阳性细胞)的一种缺乏的细胞质强度和/或细胞质部分。
该试剂盒因此可以包括:一个包括与预定的参考值对应的一个量的HMGCR蛋白的参比样品;一个包括与高于预定的参考值的值对应的一个量的HMGCR蛋白的参比样品;和/或一个包括与低于或等于预定的参考值的值对应的一个量的HMGCR蛋白的参比样品。
因此,该试剂盒的实施方案可以包括:第一参比样品,该参比样品包括高于预定的参考值的一个量的HMGCR蛋白;以及第二参比样品,该参比样品包括低于或等于该预定的参考值的一个量的HMGCR蛋白。
在试剂盒方面的实施方案中,该参比样品可以是一种组织样品,如适合于用眼或显微镜评价的一种组织样品。作为一个实例,该组织参比样品可以被固定在石蜡或在缓冲福尔马林中和/或组织处理为装在显微载玻片上的μm薄切片。该组织参比样品可以进一步适应于用亲和配体(如针对HMGCR蛋白的抗体)染色。
因此,在试剂盒方面的实施方案中,该参比样品可以被适应于直接或间接提供任何相关的参考值,如任何一个以上论述的参考值。
因此,结合该参考值和这些方法方面的参比样品,以上论述了在该试剂盒方面的该参比样品的进一步的实施方案。
如以上进一步论述,HMGCR蛋白表达的一个水平与激素受体状况的组合可以提供用于做出关于一个乳癌受试者治疗预测的结论相关的信息。
由于以上说明的原因,在第三方面以及以下说明的进一步的方面中的“乳癌”可以是一种激素受体阴性乳癌,如一种ER-或PR-乳癌、一种ER-乳癌、一种PR-乳癌、或一种ER-并且PR-乳癌。例如,该乳癌可以是先前诊断为激素受体阴性的。
因此,该试剂盒还可以包括用于建立一个受试者的激素受体状况的手段。
因此,在该试剂盒方面的实施方案中,该试剂盒可以进一步包括:
a’)一种能够与雌激素受体选择性地相互作用的可以计量的亲和配体,b’)以及用于定量这种亲和配体的量必需的试剂;和/或
a”)一种能够与孕酮受体选择性地相互作用的可以计量的亲和配体,b”)以及用于定量这种亲和配体的量必需的试剂。
提供了a’)和a”)的可以计量的亲和配体用于分别测定该ER状况和PR状况。
b)、b’)以及b”)的试剂可以是相同或不同的。
分别适合于步骤a’)和a”)的可以计量的亲和配体是技术人员熟知的并且是可商购获得的。
因此,该试剂盒可以包括一些手段,这些手段用于提供根据本披露的这些方法方面的一些实施方案做出结论所必需的激素状态信息。
继以上提出的这些发现之后,诸位发明人已经认识到该HMGCR蛋白的若干用途。
因此,作为本披露的第四方面的第一构型,提供了HMGCR蛋白用作患有一种乳癌的哺乳动物受试者的内分泌治疗的指示标志物的用途。
在本披露的情况下,“内分泌治疗指示标志物”是指一种某材料,该材料的存在表明一种内分泌治疗的适合性。这种标志物因此可以是一种生物标志物,如一种人类蛋白。
作为第四方面的第二构型,提供了一种HMGCR蛋白或其一种抗原活性片段用于对于患有一种乳癌的哺乳动物受试者的内分泌治疗指示标志物的生产、选择、或纯化的用途。
在本披露的情况下,“内分泌治疗指示标志物”是指一种试剂,这种试剂具有至少一个性质,该性质在用于建立例如在患有一种乳癌的哺乳动物受试者的内分泌治疗的治疗预测中是有价值的。例如,该指示剂可以是能够与该指示标志物选择性地相互作用的。
该内分泌治疗指示标志物可以是一种能够与该HMGCR蛋白或其一种抗原活性片段选择性地相互作用的亲和配体。结合这些方法方面以上论述了这类亲和配体的实例。
根据本披露的教导,本领域的技术人员了解如何在内分泌治疗指示标志物的生产、选择、或纯化中使用HMGCR蛋白。例如,该使用可以包括在一种固相支持物(其上已经固定HMGCR蛋白)上的亲和纯化。例如可以将该固相支持物安排在一个柱中。此外,这种使用可以包括使用一种固相支持物(其上已经固化HMGCR蛋白)选择对HMGCR蛋白具有特异性的亲和配体。这样的固相支持物可以是孔板(如96孔板)、磁珠、琼脂糖珠粒、或琼脂糖凝胶珠粒。此外,这种使用可以包括在一种可溶基质上亲和配体的分析,例如使用一种右旋糖酐基质或在一种表面等离子共振仪(如一种BiacoreTM仪)中的使用,其中该分析例如可以包括监控许多种潜在亲和配体的固定的HMGCR蛋白的亲合性。
此外,对于生产内分泌治疗指示标志物或治疗预测试剂,该HMGCR蛋白可以用于免疫一种动物。
这种用途可以涉及一种方法,该方法包括以下这些步骤:
i)使用HMGCR蛋白作为抗原免疫一种动物;
ii)从该免疫的动物获得含有内分泌治疗指示标志物的血清;以及,任选地,
iii)从该血清分离该内分泌治疗指示标志物。
可替代地,该第一步骤后的步骤可以是:
ii’)从该免疫动物获得细胞,这些细胞包括编码该内分泌治疗指示标志物的DNA。
iii’)使这些细胞与骨髓瘤细胞融合以获得至少一个克隆,以及
iv’)获得由该克隆表达的内分泌治疗指示标志物。
在第四方面的实施方案中,该HMGCR蛋白的氨基酸序列可以包括一个选自以下的序列:
i)SEQ ID NO:1;以及
ii)一个与SEQ ID NO:1至少有85%相同的序列。
在一些实施方案中,序列ii)与SEQ ID NO:1是至少90%相同的、至少91%相同的、至少92%相同的、至少93%相同的、至少94%相同的、至少95%相同的、至少96%相同的、至少97%相同的、至少98%相同的、或至少99%相同的。
此外,在第四方面的实施方案中,该HMGCR蛋白的氨基酸序列可以包括一个选自以下的序列:
i)SEQ ID NO:2;以及
ii)一个与SEQ ID NO:2至少有85%相同的序列。
在一些实施方案中,序列ii)与SEQ ID NO:2是至少90%相同的、至少91%相同的、至少92%相同的、至少93%相同的、至少94%相同的、至少95%相同的、至少96%相同的、至少97%相同的、至少98%相同的、或至少99%相同的。
作为本披露的第五方面,提供了能够与一种HMGCR蛋白选择性地相互作用的一种亲和配体。
结合这些方法方面以上论述了这类亲和配体的实例。
该亲和配体可以用于体内诊断,如体内成像。
因此,作为第五方面的第一构型,提供了能够与一种HMGCR蛋白选择性地相互作用的亲和配体,用于在患有一种乳癌的哺乳动物受试者中用作一种内分泌治疗指示标志物的体内用途。
因此,在一个实施方案中,该亲和配体可以用于一种体内方法中,该方法用于建立对于患有一种乳癌(如ER阴性乳癌)的哺乳动物受试者的一种内分泌治疗(如它莫西芬治疗)结果的预测。一个受试者的内分泌治疗结果的预测的建立例如可以是是否该受试者可能受益于该内分泌治疗的一个确定。在这类实施方案中,可以标记该亲和配体以使之能够成像,即用一种可检出的标记物标记。用于标记亲和配体的适当标记物(如抗体)对技术人员是熟知的。用于建立对于患有一种乳癌的哺乳动物受试者的治疗预测的体内方法例如可以揭示在体内肿瘤中的HMGCR蛋白表达,进而可以形成一种治疗决定的基础。以上进一步论述了可以用于这种实施方案的情况下的不同的体内方法、标记物以及检测技术。
在第五方面的一种相似构型中,提供了一种能够与HMGCR蛋白选择性地相互作用的亲和配体,用于体内评估在患有一种乳癌的受试者中的HMGCR蛋白的量。例如,可以评估在乳癌肿瘤中HMGCR表达的水平。
作为本披露的第六方面,提供了根据该第五方面的一种亲和配体用于患有一种乳癌的哺乳动物受试者作为一种内分泌治疗指示标志物的用途。因此,该亲和配体可以用于指示是否患有一种乳癌的哺乳动物受试者将受益于一种内分泌治疗。这种用途例如可以在体外进行,如涉及在从该受试者较早获得的一种样品的至少部分中的HMGCR的量的测定。
在本披露中,内分泌治疗,尤其SERM治疗(如它莫西芬治疗)对那些HMGCR阳性受试者特别地显示出益处(参见实例,部分4以及图)。在内分泌治疗的情况下,HMGCR阳性乳癌受试者是一个先前未被识别的亚群。
因此,作为本披露的第七方面,提供了用于在患有一种乳癌的哺乳动物受试者的治疗中使用的一种内分泌治疗产品,其中所述受试者是HMGCR蛋白阳性的。
作为本披露的第八方面,提供了一种内分泌治疗产品在用于治疗患有一种乳癌的哺乳动物受试者的药物的制造中的用途,其中所述受试者是HMGCR蛋白阳性的。
如果来源于所述受试者的任何HMGCR蛋白参数表明该受试者可能受益于一种内分泌治疗,则该受试者是“HMGCR蛋白阳性”,。例如,如果已经发现来自该受试者的一种相关生物样品含有与一个样品值(高于一个相关参考值)对应的一个量的HMGCR蛋白,则该受试者可以被认为是HMGCR蛋白阳性的。结合这些方法方面以上论述了相关样品和相关值。因此,如果一种相关样品(如来自一种原发或继发瘤的一种组织样品)显示出在该样品的相关部分中(如在肿瘤细胞中)可检出的HMGCR蛋白表达,则该乳癌受试者例如可以被认为是HMGCR蛋白阳性的。此外,如果这种样品含有与一种高于缺乏的细胞质强度或一种高于1%的细胞质部分对应的一个量的HMGCR,则该乳癌受试者例如可以被认为是HMGCR蛋白阳性的。本领域的技术人员(如一位病理学家)从本披露了解如何确定该受试者是否HMGCR蛋白阳性。
在本披露的实施方案中,该“内分泌治疗产品”可以选自下组,其组成为:一种选择性雌激素受体调节剂(SERM)、一种芳香酶抑制剂、以及一种甾体雌激素受体拮抗剂。该SERM例如可以选自下组,其组成为:托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、阿佐昔芬、以及它莫西芬。该芳香酶抑制剂例如可以选自阿那曲唑、来曲唑、以及依西美坦。该甾体雌激素受体拮抗剂例如可以是氟维司群。在优选的实施方案中,该内分泌治疗产品是一种SERM,如它莫西芬。
即使HMGCR表达是在所有乳癌受试者组中对内分泌治疗应答的一种有力的(独立的)指示剂,它可能被认为是对于患有ER-乳癌的这些受试者特别相关的,因为它们已经惯例地被认为是对这样的治疗是无应答的。
因此,在第七和第八方面的实施方案中,该乳癌可以是ER-的。
它莫西芬最近25年来一直是辅助内分泌疗法的支柱,并且存在很多证据支持其在乳癌治疗中的作用,不论更年期状况。当与无辅助治疗进行比较时,一种荟萃分析的结果已经证明5年的它莫西芬治疗显著降低了疾病复发(41%)以及乳癌特异性死亡率(34%)二者(EBCTG:(2005)Lancet 365:1687-717)。
HMGCR蛋白作为一种限速酶在甲羟戊酸途径(mevalonate pathway)中起作用。虽然胆固醇代表这条通路的主要产物,它还产生许多非甾醇类异戊二烯副产物,已经它们是血管生成、增殖、以及迁移的重要调节剂(Liao JK(2002)JClin Invest 110:285-8,Wejde J,et al(1992)Anticancer Res 12:317-24)。
尽管不断增长的文献量说明了他汀的抗肿瘤性质,总体上关于它们的的防癌(尤其是抗乳癌)的效果的流行病学资料仍然是非结论性的。部分鉴于本披露的教导,诸位发明人相信甲羟戊酸途径在某些乳癌中(尤其是ER阴性和/或淋巴结阳性肿瘤中)起着关键作用。
体外研究已经证明了他汀诱导的甲羟戊酸酯耗竭导致了在中国仓鼠卵巢细胞(Goldstein JL和Brown MS(1990)Nature 343:425-30)中HMGCR蛋白表达的一种适应性诱导(Duncan RE,et al(2005)Cancer Lett 224:221-8)。用美伐他汀对MCF-7细胞的处理导致了HMGCR活性的10到15倍的诱导,其与HMGCRmRNA表达的2.5到3.5倍诱导相关联。
基于该事实和他汀已经显示出诱导了HMGCR蛋白的表达,以及在ER阳性以及ER阴性肿瘤二者中HMGCR表达水平的增加与改进的对它莫西芬的应答有关的发现,诸位发明人推断一种内分泌治疗产品与一种或多种他汀的组合是一种新的治疗选择。
因此,作为本披露的第九方面,提供了包括一种内分泌治疗产品以及一种他汀,作为一种组合制剂在治疗(如乳癌治疗)中同时、分开、或序贯使用。
这两个产品的组合可以被提供为一个“组件产品”或一种制造物品的形式,它可以包括用于在治疗(如乳癌治疗)中同时、分开、或序贯使用的说明书。
因此,作为本披露的第十方面,提供了包括一种内分泌治疗产品和一种他汀的组件产品。
例如,这种组件产品可以用于治疗中,如乳癌治疗。
在该第九或第十方面的实施方案中,该乳癌治疗可以是一种ER-和/或淋巴结阳性乳癌的治疗。
此外,作为本披露的第十一方面,提供了对其有需要的哺乳动物受试者的治疗方法,其中所述受试者患有一种乳癌,该治疗方法包括一种他汀和一种内分泌治疗产品的同时、分开、或序贯给药。
在本披露的该第十一方面,该乳癌可以是ER-和/或淋巴结阳性的乳癌。
本披露的他汀可以是选自下组,其组成为:亲脂性的/疏水性他汀以及疏水性他汀。该亲脂性的/疏水性他汀包括氟伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、以及西立伐他汀。该疏水性他汀包括普伐他汀和罗苏伐他汀。
附图简要说明
关于图1至图7,将肿瘤组织对于高或低HMGCR水平进行评分,其中一种高HMGCR水平是CI=微弱的、中等的和强的并且一种低HMGCR水平是一种CI=缺乏的。在图1至图2中、图4至图5以及图7中,一种实线代表HMGCR高的受试者,并且虚线代表HMGCR低的受试者。
图1显示了基于诊断为患有浸润性乳腺癌的受试者的免疫组织化学染色的生存率分析的结果。图1a显示了在用辅助它莫西芬治疗的患者中的无复发生存率。图1b显示了在未接受辅助内分泌治疗的患者中的无复发生存率。
图2显示了基于诊断为患有浸润性乳腺癌的ER阳性受试者的免疫组织化学染色的生存率分析的结果。ER>10%的部分评分被认为是阳性的。图2a显示了在用辅助它莫西芬治疗的患者中的无复发生存率。图2b显示了在未接受辅助内分泌治疗的患者中的无复发生存率。
图3显示如果用HMGCR蛋白表达状况与ER状况的不同的组合将受试者进行分组对生存率的影响。简要地,基于HMGCR状况以及ER状况将全部受试者分成四组,即HMGCR阳性并且ER阳性的受试者,HMGCR阳性并且ER阴性的受试者,HMGCR阴性并且ER阳性的受试者,或HMGCR阴性并且ER阴性的受试者。ER阳性=部分评分>10%并且ER阴性=部分评分<10%。图3a显示了在用辅助它莫西芬治疗的患者中的无复发生存率。图3b显示了在未接受辅助内分泌治疗的患者中的无复发生存率。
图4显示了基于诊断为患有浸润性乳腺癌的受试者的免疫组织化学染色的生存率分析的结果。图4a显示了在用辅助它莫西芬治疗的淋巴结阳性受试者中的无复发生存率。图4b显示了在用辅助它莫西芬治疗的淋巴结阴性受试者中的无复发生存率。
图5显示了基于诊断为患有浸润性乳腺癌的ER阳性受试者的免疫组织化学染色的生存率分析的结果。ER的部分评分>10%被认为是阳性的。图5a显示了在用辅助它莫西芬治疗的淋巴结阳性受试者中的无复发生存率。图5b显示了在用辅助它莫西芬治疗的淋巴结阴性受试者中的无复发生存率。
图6显示如果用HMGCR蛋白表达状况与ER状况的不同组合将受试者进行分组对生存率的影响。简要地,基于HMGCR状况以及ER状况将全部受试者分成四组,即HMGCR阳性并且ER阳性的受试者,HMGCR阳性并且ER阴性的受试者,HMGCR阴性并且ER阳性的受试者,或HMGCR阴性并且ER阴性的受试者。ER阳性=部分评分>10%并且ER阴性=部分评分<10%。图6a显示了在用辅助它莫西芬治疗的淋巴结阳性受试者中的无复发生存率。图6b显示了在用辅助它莫西芬治疗的淋巴结阴性受试者中的无复发生存率。
图7显示了基于诊断为患有浸润性乳腺癌的ER阴性受试者的免疫组织化学染色的生存率分析的结果。ER表达>10%的部分评分被认为是阳性的。图7a显示了在用辅助它莫西芬治疗的受试者中的无复发生存率。图7b显示了在用辅助它莫西芬治疗的受试者中的无复发生存率。
关于图8至图12,对于高或低HMGCR水平将组织核评分,其中一种高HMGCR水平是CI>缺乏的,并且一种低HMGCR水平是一种CI=缺乏的。此外,一种实线代表给予辅助它莫西芬的一组受试者,并且虚线代表未接受辅助内分泌治疗的患者。
图8显示了基于诊断为患有浸润性乳腺癌的受试者的免疫组织化学染色的生存率分析的结果。图8a显示了在高HMGCR患者中的无复发生存率。图8b显示了在低HMGCR患者中的无复发生存率。
图9显示了基于诊断为患有浸润性乳腺癌的HMGCR阳性并且ER阴性的受试者的免疫组织化学染色的生存率分析的结果。ER表达>10%的部分评分被认为是阳性的。图9a显示了无复发生存率。图9b显示了在淋巴结阳性患者中的无复发生存率。
图10显示了基于诊断为患有浸润性乳腺癌的受试者的免疫组织化学染色的生存率分析的结果。将受试者分为ER阳性或ER阴性的,其中部分评分>10%被认为是阳性的并且部分评分<10%被认为是阴性的。图10a显示了在在HMGCR阳性或ER阳性受试者中的无复发生存率。图10b显示了在HMGCR阴性并且ER阴性受试者中的无复发生存率。
图11显示了基于诊断为患有浸润性乳腺癌的受试者的免疫组织化学染色的生存率分析的结果。将受试者分为PR阳性或PR阴性的,其中部分评分>10%被认为是阳性的并且部分评分<10%被认为是阴性的。图10a显示了在HMGCR阳性或PR阳性受试者中的无复发生存率。图10b显示了在HMGCR阴性或PR阴性受试者中的无复发生存率。
图12显示了诊断为患有浸润性乳腺癌的HMGCR阳性以及PR阴性受试者的无复发生存率。PR表达>10%的部分评分被认为是阳性的。
实例
针对HMGCR的单特异性抗体的产生以及它们在正常和癌性样品中检出
HMGCR的用途
1.抗原的产生
a)材料和方法
用人基因组序列作为模板使用生物信息学工具选择了由EnsEMBL基因IDENSG 00000113161编码的靶蛋白的一种适当的片段(Lindskog M et al.(2005)Biotechniques 38:723-727,EnsEMBL,www.ensembl.org)。该片段用作用于生产与HMGCR蛋白(SEQ ID NO:2;EnsEMBL登陆号ENSP00000287936)的氨基酸742-881(SEQ ID NO:1)对应的一种140个氨基酸长度片段的模板。
通过一种SuperscriptTM一步RT-PCR扩增试剂盒(具有Platinum标签(Invitrogen))以及一种总的人RNA池组作为模板(Human Total RNA PanelIV,BD Biosciences Clontech)分离了含有EnsEMBL登录号ENST00000287936(SEQ ID NO:3)的核苷酸2274-2693的HMGCR基因转录产物的一种片段。通过PCR扩增引物将侧翼限制酶切位点NotI和AscI引入该片段以允许框内克隆进入表达载体(正向引物:ATGGCTGGGAGCATAGGAG,反向引物:TCCTTGGAGGTCTTGTAAATTG)。然后,生物素酰化下游引物以允许如前说明进行固相克隆,并且将该生成的生物素酰化的PCR产物固化在DynabeadsM280链霉亲和素上(Dynal Biotech)(Larsson M et al.(2000)J.Biotechnol.80:143-157)。通过NotI-AscI消化(New England Biolabs)使该片段从该固相支持物释放,连接进入框内pAff8c载体(Larsson M et al,supra),该载体具有一种双亲和标签,其组成为用于固定化金属离子层析(IMAC)纯化的六组氨酸标签以及来自链球菌G蛋白的一种免疫增强白蛋白结合蛋白(immunopotentiatingalbumin binding protein,ABP)(A et al.(1997)J.Immunol.Methods201:115-123;S et al.(1999)Encyclopedia of Bioprocess Technology:Fermentation,Biocatalysis和Bioseparation(Fleckinger MC和Drew SW,eds)JohnWiley和Sons Inc.,New York,pp 49-63),并且转化进入大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)。根据制造商的建议,使用TempliPhiDNA测序扩增试剂盒(GEHealthcare,Uppsala,Sweden),通过质粒DNA扩增的染料终止循环测序验证这些克隆的序列。
通过添加在相同培养基中的1ml的一种过夜培养物,将包含有该表达载体的BL21(DE3)细胞接种在100ml的30g/l大豆胰蛋白酶肉汤中,该大豆胰蛋白酶肉汤补充有5g/l酵母提取物(Merck KGaA)以及50mg/l卡那霉素(Sigma-Aldrich)。在37℃以及150rpm下将该细胞培养物在1公升摇瓶中孵育直到在600nm下的光密度达到0.5-1.5。然后通过添加异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷至一个1mM的终浓度诱导蛋白表达,并且在25℃和150rpm继续孵育过夜。通过在2400g离心收获细胞,并且将片状沉淀物再悬浮在5ml溶解缓冲液中(7M盐酸胍、47mM Na2HPO4、2.65mM NaH2PO4、10mM Tris-HCl、100mM NaCl、20mM β-巯基乙醇;pH=8.0),并且在37℃和150rpm下孵育2小时。在35300g下离心以后,收集包含变性并且溶解的蛋白的上清液。
使用一个自动化蛋白纯化步骤(Steen J et al.(2006)Protein Expr.Purif.46:173-178)在一种ASPEC XL4TM(Gilson)上,通过在具有1ml Talon金属(Co2+)亲合树脂的柱子(BD Biosciences Clontech)上进行固定化金属离子亲和层析(IMAC)纯化His6标签的融合蛋白。用20ml变性洗涤缓冲液(6M盐酸胍、46.6mM Na2HPO4、3.4mM NaH2PO4、300mM NaCl、pH 8.0-8.2)将该树脂平衡。然后,将澄清的细胞溶解产物加至该柱子上。其后,将该树脂在2.5ml洗脱缓冲液(6M脲、50mM NaH2PO4、100mM NaCl、30mM乙酸、70mM乙酸Na、pH 5.0)洗涤之前用不少于31.5ml的洗涤缓冲液洗涤。将洗脱的材料在500、700、以及1300μl的三个池中分离。将含有抗原的700μl部分、以及汇集的500μl以及1300μl的部分储存以用于进一步的使用。
将该抗原部分用磷酸盐缓冲盐水(PBS;1.9mM NaH2PO4、8.1mMNa2HPO4、154mM NaCl)稀释到1M脲的终浓度,随后使用具有7500Da截留分子量的Vivapore10/20ml浓缩器的一个浓缩步骤以增加该蛋白质的浓度(Vivascience AG)。根据制造商的推荐使用一种具有牛血清白蛋白标准品的一种双金鸡宁酸(BCA)微测定科学试验计划(Pierce)测定该蛋白质的浓度。使用蛋白50或200测定法(Agilent Technologies)在Bioanalyzer仪器上分析该蛋白质的质量。
b)结果
通过使用对于该蛋白片段特异的引物,通过RT-PCR从一个人RNA池成功分离了一种对应于该HMGCR基因的长转录物(SEQ ID NO:3)的核苷酸2274-2693并且编码一种肽(SEQ ID NO:1)的基因片段,该肽由该靶蛋白HMGCR(SEQ ID NO:2)的742至881位氨基酸组成。将该靶蛋白(SEQ ID NO:2)的140氨基酸片段(SEQ ID NO:1)设计成缺乏跨膜区域以确保在大肠杆菌中有效表达,并且缺乏任何信号肽,因为那些在成熟蛋白中被裂开。另外,将该蛋白片段设计成包括一种与其他的人蛋白具有低的同源性的单一序列,以将产生的亲合试剂的交叉反应性最小化,并且设计成一种适当的大小以允许构象表位的形成,并且仍然允许在细菌系统中的有效克隆和表达。
将编码该正确的氨基酸序列的一个克隆进行鉴定,并且在大肠杆菌中表达产生这种正确大小的一种单一蛋白质,并且随后使用固定化金属离子层析进行纯化。将该洗脱的样品稀释到1M脲的终浓度并且浓缩该样品到1ml以后,测定该蛋白片段的浓度为11.7mg/ml以及84.2%纯度(根据纯度分析)。
2.抗体的产生
a)材料和方法
根据国家指南(瑞典许可号A84-02)将如以上获得的纯化的HMGCR片段用作抗原以免疫一种兔。用在弗氏完全佐剂中的200μg的抗原肌肉注射免疫该兔作为初次免疫,并且用在弗氏不完全佐剂中的100μg的抗原以四星期的间隔加强三次。
通过一个三步骤的基于免疫亲和性的科学试验计划将来自该免疫的动物的抗血清进行纯化(Agaton C et al.(2004)J.Chromatogr.A 1043:33-40;Nilsson P etal.(2005)Proteomics 5:4327-4337)。在第一步骤中,将7ml的总的抗血清用10x PBS缓冲到1x PBS的终浓度(1.9mM NaH2PO4、8.1mM Na2HPO4、154mMNaCl),使用一种0.45μm孔径大小的过滤器过滤(AcrodiscLife Science)并且施加到一个亲和柱上,该亲和柱含有5ml的N-羟基琥珀酰亚胺活化的SepharoseTM4Fast Flow(GE Healthcare),其结合到表达自pAff8c载体的并且以如上说明的与用于该抗原蛋白片段同样的方式纯化的双亲和标签蛋白His6-ABP(一种六组氨酰标签以及一种白蛋白结合蛋白标签)。在第二步骤中,以一个0.5ml/min的流率将流经消耗该双亲和标签His6-ABP的抗体荷载到1ml Hi-TrapNHS活化的HP柱子(GE Healthcare)上,该柱子与用作抗原用于免疫的HMGCR蛋白(SEQ ID NO:1)结合。如制造商的推荐将该His6-ABP蛋白以及该蛋白片段抗原结合到该NHS活化的基质。用1x PBST(1x PBS、0.1%Tween 20、pH 7.25)将未结合的材料洗去,并且使用一种低pH甘氨酸缓冲液(0.2M glycine、1mM EGTA、pH 2.5)洗脱俘获的抗体。自动收集该洗脱的抗体部分,并且荷载到两个串联的5ml HiTrapTM脱盐柱子上(GE Healthcare)以用于在第三步骤中有效的缓冲液更换。在KTAxpressTM平台(GE Healthcare)上运行该第二以及第三纯化步骤。用PBS缓冲液洗脱该抗原选择性(单特异性)抗体(msAbs),该PBS缓冲液补充有用于在-20℃下长期存储的终浓度分别为40%和0.02%的甘油和NaN3(Nilsson P et al.(2005)Proteomics 5:4327-4337)。
在一种蛋白阵列装置中,通过针对该抗原本身以及针对383个其他的人蛋白片段的结合分析,分析了该亲合性纯化的抗体部分的特异性和选择性(Nilsson P et al.(2005)Proteomics 5:4327-4337)。在0.1M脲和1x PBS(pH7.4)中将这些蛋白片段稀释到40μg/ml,并且将50μl的各片段转移到一种96孔点滴板的孔中。使用一种针和环状阵列(pin-and-ring arrayer)(Affymetrix427)将这些蛋白片段一式两份点样并且固化在环氧树脂载玻片上(SuperEpoxy,TeleChem)。将该载玻片在1x PBS中洗涤(5分钟)并且然后将表面封闭(SuperBlockPierce)30分钟。在加入这些单特异性抗体(在1x PBST中按1∶2000稀释到大致50ng/ml)之前将一种粘性16孔硅酮掩模(Schleicher &Schuell)施加到该玻片上,并且在一种振荡器上孵育60分钟。将亲和标签特异性IgY抗体与这些单特异性抗体共孵育以量化在各点中的蛋白的量。将该载玻片用1x PBST和1x PBS洗涤两次,每次10分钟。将第二抗体(与Alexa647结合的羊抗兔抗体和与Alexa555结合的羊抗鸡抗体,Molecular Probes)在1xPBST中按1∶60000稀释到30ng/ml并且孵育60分钟。关于该第一次孵育,在相同的洗涤步骤之后,将该载玻片旋转干燥并且扫描(G2565BA阵列扫描仪,Agilent),其后使用图像分析软件将影像定量(GenePix 5.1,Axon Instruments)。
b)结果
已经证明多克隆抗体制品的质量取决于在该抗体纯化的严格程度,并且先前已经显示定向针对非起源于该靶蛋白的多种表位的抗体的耗尽是避免与其他的蛋白质以及背景结合交叉反应性所必需的(Agaton C et al.(2004)J.Chromatogr.A 1043:33-40)。因此,进行一种蛋白微阵列分析以保证高特异性的单特异性多克隆抗体已经通过耗尽定向针对该His6标签的抗体连同针对该ABP标签的抗体而产生。
为了对在该蛋白阵列的各点中的蛋白的量进行定量,使用了一种与第一以及第二抗体的一种组合的双色染料标记系统。用标记有Alexa 555荧光染料的一种第二羊抗母鸡抗体检测了在母鸡中产生的标签特异性IgY抗体。用一种荧光Alexa 647标记的羊抗兔抗体检测了该兔msAb对它的在该阵列上的抗原的特异性结合。该蛋白阵列分析显示出针对HMGCR的该亲合纯化的单特异性抗体对这种正确的蛋白片段是高度选择性的,并且对于在该阵列上分析的所有其他的蛋白片段具有一种非常低的背景。
3.通过免疫组织化学描绘组织轮廓
a)材料和方法
使用在实例部分2中获得的单特异性抗体分析研究了全部576个包含人类组织的石蜡核芯。按照当地伦理委员会的批准,将全部组织用作供体块用于组织微阵列(TMA)的产品从在Uppsala大学医院病理学系的档案中选出来。检查用于TMA分析的所有组织切片以确定诊断并且选择在供体块中的代表区域。将正常组织定义为显微镜正常(非肿瘤的)并且最通常是选自从外科手术移出肿瘤的附近收集的标本。检查癌组织用于诊断和分类。将所有组织用福尔马林固定、石蜡包埋、并且切片用于诊断目的。
基本上如先前的说明进行TMA的生产(Kononen J et al.(1998)Nature Med.4:844-847;Kallioniemi OP et al.(2001)Hum.Mol.Genet.10:657-662)。简要地,在接受TMA块中制作一种孔,并且从该供体块获得一种圆柱形芯组织样品并且放置在该接受TMA块中。在来自Beecher仪器(ATA-27,Beecher Instruments,Sun Prairie,CA,USA)的一种自动化组织阵列仪中重复这项操作直到产生一种完全的TMA设计为止。在进行切片之前将TMA受体块在42℃下烘焙2小时。
多种TMA:s的设计集中于从大范围的代表性的正常组织以及包括代表性的癌组织获得样品。这已经在先前详细地说明于Kampf C et al.(2004)Clin.Proteomics 1:285-300。简要地,选择了来自48个正常组织以及来自20个最常见的影响人类的癌症类型的样品。生产了总共八个不同设计的TMA块,每一个含有72个具有1mm直径的组织芯。这些TMA中的两个代表正常组织,其对应于来自不同个体的一式三份的48种不同的正常组织。其余的6种TMA代表了来自20种不同类型的癌症的癌组织。对于该20种癌症类型中的17种,将12个各不相同的肿瘤取样,并且对于剩余的3种癌症类型,将4个各不相同的肿瘤取样,来自相同肿瘤的全部为一式两份。使用一种waterfall切片机(Leica)按4μm厚度将这些TMA块切片,并且放置在SuperFrost(Roche AppliedScience)载玻片上用于IHC分析。
如先前的说明进行自动IHC(Kampf C et al.(2004)Clin.Proteomics 1:285-300)。简要地,在60℃下将这些载玻片孵育45分钟,在二甲苯中脱石蜡(2x15分钟),并且在梯度醇中水合。为了抗原恢复,将载玻片浸于TRS(靶标恢复溶液,pH 6.0,DakoCytomation)中并且在一种Decloaking chamber(Biocare Medical)中在125℃下煮沸4分钟。将载玻片放置于该Autostainer(DakoCytomation)中并且开始用H2O2(DakoCytomation)封闭内源性过氧化物酶。在室温下将这些载玻片与如在实例部分2中获得的第一抗体孵育30分钟,随后用结合Envision的羊抗兔过氧化物酶在室温下孵育30分钟。在所有步骤之间,将载玻片在洗涤缓冲液(DakoCytomation)中漂洗。最后,用二氨基联苯胺(DakoCytomation)作为色原体并且用Harris苏木精(Sigma-Aldrich)进行复染。用Pertex(Histolab)装上这些载玻片。
使用一种ScanScope T2自动化载玻片扫描系统(Aperio Technologies)扫描来自这八个不同的TMA的所有免疫组织化学染色切片。为了呈现这八个TMA的总含量,产生了576个数字图象。在20倍放大率下进行扫描。分离并且提取数字图象作为单独的标签图像文件格式(TIFF)文件用于原始资料的存储。为了能在一种基于网络的注解系统中处理这些图像,将这些单独的图像从TIFF格式压缩成为JPEG格式。在显微镜下人工评价免疫组织化学染色的组织的全部图像,并且由一位证明合格的病理学家或由专门教育的人员注解,随后由一位病理学家核实。
使用一种用于IHC结果分类的简化的方案对每一不同的正常组织以及癌组织进行注解。对每一组织的代表性和免疫反应性进行检查。对包含在每一正常组织类型中的不同的组织特异性细胞类型进行注解。对每一癌症的肿瘤细胞和基质进行注解。基本的注解参数包括i)亚细胞定位(细胞核和/或细胞质/膜),ii)染色强度(SI),以及iii)染色细胞的部分(FSC)的评价。根据临床上组织病理学诊断使用的标准主观地评价染色强度,并且将结果分类为:缺乏的=没有免疫反应性,弱的=微弱的免疫反应性,中等的=中等免疫反应性,或强的=显著的而强烈的免疫反应性。估计染色细胞的部分并且分类为:<2%、2%至25%、>25%至75%、或>75%的有关的细胞群的免疫反应性细胞。基于免疫反应性细胞的强度和部分二者,对于每一组织样品给出一种“染色评分”。0=阴性,1=微弱的,2=中等的,并且3=强的,N.R.表示不存在代表性的组织。详细地,根据以下标准给出染色评分:如果SI=缺乏的或微弱的,并且FSC≤25%,则给出0;如果SI=微弱的,并且FSC>25%或如果SI=中等的,并且FSC≤25%,则给出1;如果SI=中等的,并且FSC>25%或如果SI=强的,并且FSC≤25%,以及SI=中等的,则给出2;以及最后如果SI=强的,并且FSC>25%,则给出3。还参见表1。技术人员将会认识到该步骤与一种Allred评分的计算是相似的,例如参见Allred et al.(1998)Mod Pathol 11(2),155。
2 | 中等的 | >75% |
2 | 强的 | <2% |
2 | 强的 | 2-25% |
3 | 强的 | >25-75% |
3 | 强的 | >75% |
b)结果
在若干正常组织中,用单特异性抗体(对如在实例部分2中获得的人靶蛋白HMGCR的一种重组蛋白片段而产生)描绘的组织轮廓的结果显示出一种特定的免疫反应性。表2显示了在正常人组织中HMGCR蛋白的表达谱。使用IHC和TMA技术,对于HMGCR的表达筛选了代表正常组织的48个不同类型的144个点(直径1mm)。主要在大多数组织的细胞质中观察到免疫反应性。一些例子显示了另外的细胞核或细胞膜阳性。在腺上皮中发现了最强的染色。在少数例子中观察到了无代表性的组织(N.R.)。
腺细胞 | 3 | |
子宫体2 | 在子宫内膜基质中的细胞 | 1 |
腺细胞 | 3 | |
十二指肠 | 腺细胞 | 3 |
附睾 | 腺细胞 | 2 |
食道 | 鳞状上皮细胞 | 2 |
输卵管 | 腺细胞 | 2 |
胆囊 | 腺细胞 | 3 |
心肌 | 肌细胞 | 2 |
海马 | 神经胶质细胞 | 0 |
神经元细胞 | 2 | |
肾 | 在肾小球中的细胞 | 0 |
在小管中的细胞 | 2 | |
侧脑室 | 神经胶质细胞 | 0 |
神经元细胞 | 1 | |
肝 | 胆管细胞 | 1 |
肝细胞 | 1 | |
肺 | 肺泡细胞 | 2 |
巨噬细胞 | 1 | |
淋巴结 | 反应中心之外的淋巴样细胞 | 2 |
反应中心细胞 | 2 | |
鼻咽 | 呼吸上皮细胞 | 2 |
口腔粘膜 | 鳞状上皮细胞 | 2 |
卵巢 | 滤泡细胞 | N.R. |
卵巢基质细胞 | 1 | |
胰 | 外分泌腺细胞 | 3 |
胰岛细胞 | 1 | |
甲状旁腺 | 腺细胞 | 3 |
胎盘 | 蜕膜细胞 | 1 |
滋养层细胞 | 2 | |
前列腺 | 腺细胞 | 2 |
直肠 | 腺细胞 | 3 |
唾液腺 | 腺细胞 | 2 |
精囊 | 腺细胞 | 2 |
骨骼肌 | 肌细胞 | 2 |
皮肤 | 附属器细胞 | N.R. |
表皮细胞 | 2 | |
小肠 | 腺细胞 | 3 |
平滑肌 | 平滑肌细胞 | 0 |
软组织1 | 间充质细胞 | 2 |
软组织2 | 间充质细胞 | 2 |
脾脏 | 在红髓中的细胞 | 2 |
在白髓中的细胞 | 2 | |
胃1 | 腺细胞 | 3 |
胃2 | 腺细胞 | 3 |
睾丸 | 在输精管中的细胞 | 1 |
莱迪希细胞 | 3 | |
甲状腺 | 腺细胞 | 2 |
扁桃体 | 反应中心之外的淋巴样细胞 | 2 |
反应中心细胞 | 1 | |
鳞状上皮细胞 | 2 | |
膀胱 | 泌尿道上皮细胞 | 2 |
阴道 | 鳞状上皮细胞 | 1 |
外阴/肛门皮肤 | 鳞状上皮细胞 | 2 |
进一步评价在来自不同癌类型的组织样品中HMGCR蛋白的表达。表3显示了在12个不同乳腺癌组织样品中的HMGCR表达的水平。所有这些样品显示了代表性的组织,并且十个显示阳性,即高于0的染色评分。在细胞质中观察到了HMGCR表达。
4.随机化的绝经前队列TMA
a)材料和方法
在1984与1991年之间,使在瑞典南部和东南部地区的患有原发乳癌的564名绝经前女性加入了一项多中心临床试验,并且随机化分配至两年的辅助它莫西芬(n=276)组或对照组(n=288)。该对照组没有接受辅助内分泌治疗(即它莫西芬)。选择标准是绝经前期患者或患有Ⅱ期(pT2 N0 M0、pT1-2N1M0)浸润性乳癌的经过改良的乳房切除术或乳房保留手术(腋窝淋巴结切除)治疗的比50岁年轻的患者。在乳房保留手术后给予手术后放射治疗(50Gy),并且所有淋巴结阳性患者接受了区域放射治疗。少于2%的这些患者接受了辅助全身化学治疗。对于无乳癌事件患者的随访中位数是13.9年。在诊断时中位数年龄是45岁(25至57)。该研究设计更详细地说明在别处(Rydén L etal,Eur J Cancer,2005,41(2):256-64)。Lund和大学从当地伦理委员会获得伦理的许可。
来自这564位患者的500位的组织块可以回收用于TMA构建。所有病例已经在苏木精和伊红染色的载玻片上进行了组织病理学再评价。使用一种人工阵列装置(MTA-1,Beecher Inc,WI,USA),通过每个病例从代表浸润性癌的区域采样2x 0.6mm芯构建了TMA。使用PT连接系统(DAKO,Copenhagen,Denmark)将四μm的切片干燥、脱石蜡并且预处理,然后在一种具有按1∶250稀释的多克隆抗HMGCR抗体(Catalog#07-457,Upstate)的Techmate500(DAKO,Copenhagen,Denmark)中进行染色,该抗体选择性地与一种由序列SEQ ID NO:4组成的肽相互作用。先前已经进行了ER和PR的IHC染色。符合目前的临床惯例,将在10%阳性核的一个截止值用于定义激素受体阳性。
为了统计分析,按照在以上实例部分3中的说明评价了细胞质强度(CI)水平根据临床组织病理诊断使用的标准主观地评价细胞质的染色强度的水平,并且将结果分类为:缺乏的=无免疫反应性,弱的=微弱的免疫反应性,中等的=中等的免疫反应性,或强的=显著而强烈的免疫反应性。基于对于所有不同层的生存趋势,构建了一种用于进一步统计分析的二分变数(dichotomizedvariable)。将两种分类定义为:“HMGCR高”对应于CI=微弱的、中等的和强的,并且“HMGCR低”对应于CI=缺乏的。这种样品的分类用于根据Kaplan-Meier估值器的RFS分析,并且用对数秩检验比较在不同层中的生存率。根据在瑞典的目前的临床指导方针将ER和PR阴性定义为<10%阳性染色细胞核。所有统计检验是双侧的,并且认为p值<0.05是显著的。所有计算是用统计软件包SPSS 17.0(SPSS Inc.Illinois,USA)作出的。
b)结果
在这个结果部分,“HMGCR”是指HMGCR蛋白。为了本研究,可以在423个肿瘤上进行HMGCR表达的免疫组织化学分析。剩余的芯不含浸润性癌或者已经在组化过程中损失。在分析的423个肿瘤中,324个是ER阳性的(即ERα+),被定义为>10%ER细胞核部分,这是符合临床建立的用于激素受体评估的截止值的。
基于在用它莫西芬治疗的患者以及未接受辅助内分泌疗法的患者的一个对照组中高或低HMGCR蛋白水平的无复发生存率(RFS)的分析分别呈现在图1a和图1b中。如图在1a中所见,这项分析揭示了HMGCR高的类别的RFS明显好于HMGCR低的类别(p=0.001)。
基于在用它莫西芬治疗的患者的ER阳性患者以及对照组中高或低HMGCR水平的RFS的分析分别呈现在图2a和图2b中。如在图2a中所见,这项分析揭示了它莫西芬治疗的受试者的HMGCR高的类别的显著较好的RFS。
根据在这个队列中HMGCR对它莫西芬应答的明显影响,分析了在具有不同的HMGCR蛋白表达状况与ER状况的组合的层中对RFS的影响。简要地,基于HMGCR状况以及ER状况将全部受试者分成四组,即HMGCR阳性并且ER阳性的受试者,HMGCR阳性并且ER阴性的受试者,HMGCR阴性并且ER阳性的受试者,以及HMGCR阴性并且ER阴性的受试者。该分析揭示了这些层与在它莫西芬治疗的队列中RFS的差异相关联(p=0.001)(图3a)。然而,观察到了在未治疗队列中的层之间的非常小的差异(图3b)。出人意料的是如在图3a中的说明,在该治疗的队列中,HMGCR阳性并且ER阴性的患者具有比HMGCR阴性并且ER阳性的患者更好的结果。
因此,已经证明了HMGCR表达对它莫西芬应答的一种有利效果。此外,鉴定了可能对它莫西芬应答的一组ER阴性患者。因此,HMGCR蛋白是一种内分泌治疗的标志物,它可以是对于ER的一种替代物或补充物。
其次,研究了在用它莫西芬治疗的淋巴结阳性患者中HMGCR表达与RFS之间的关系。这揭示了在接受它莫西芬的淋巴结阳性患者中HMGCR表达与一种改进的RFS(p=0.001)相关联(图4a)。当分析相同亚组的ER阳性受试者时获得了类似的结果(图5a)。还观察到了淋巴结阴性亚组的HMGCR阳性受试者的更好的生存趋势(图4b和图5b),但是这些亚组包含的患者太少而不能得出统计学显著的结果。分析了基于在它莫西芬治疗的受试者中具有不同HMGCR表达与ER状况的组合的层中淋巴结的状况对RFS的影响。与淋巴结阴性的它莫西芬治疗的患者相比,在淋巴结阳性的它莫西芬治疗的受试者中,HMGCR/ER状况对RFS具有高度显著的影响(p=0.000)(图6a)。关于淋巴结阳性的受试者,在该治疗的队列中,HMGCR阳性并且ER阴性的患者具有比HMGCR阴性并且ER阳性的患者更好的结果(图6a)。
在图7中可以更详细地看到它莫西芬治疗的受试者(HMGCR阳性并且ER阴性的受试者)对生存率的影响。在图7a中可以看到基于在ER阴性受试者中的HMGCR水平对于RFS的正面效果,并且在图7b中可以看到该效果在淋巴结阳性的患者中显得进一步增强了。
如果改变这些参数并且该RFS分析是基于HMGCR高或低的受试者的它莫西芬治疗(不论ER状况),这些结果揭示与患有HMGCR低的肿瘤的患者(其中它莫西芬治疗对生存率没有影响,图8b)相比,对于患有HMGCR高的肿瘤的患者(图8a)在用它莫西芬治疗上的生存率的一种显著改进。
在图9a中可以看到当分析HMGCR阳性并且ER阴性的受试者时还观察到在它莫西芬治疗上的生存率的一种改进。在图9b中可以看到在淋巴结阳性的患者中这种趋势显得进一步增强了。图8和图9的结果进一步支持HMGCR阳性受试者受益于它莫西芬治疗,并且这种益处还存在于ER阴性患者亚组中的HMGCR阳性受试者(以前认为对它莫西芬是无应答的)中。
当将这些乳癌受试者分别分为HMGCR阳性或ER阳性、以及HMGCR阴性并且ER阴性时,在前者组中观察到了一种它莫西芬治疗的显著的正面效果,而在后者组中没有观察到正面效果(分别地10a和10b)。
在文献中,已经建议在内分泌治疗预测中将PR作为对于ER的一种替代物或补充物。因此,已经研究了它对于HMGCR状况的关系。PR阳性并且HMGCR阳性的受试者显示了对于它莫西芬治疗的显著应答,而在PR阴性并且HMGCR阴性的受试者的组中没有观察到应答(分别地图11a和图11b)。在HMGCR阳性并且PR阴性的受试者的组中,可以观察到它莫西芬对于生存率的影响的趋势(图12)。可能由于在这个组中患者太少,该趋势不是统计学显著的。
是否一个乳癌患者可能受益于一种内分泌治疗的确定以及所述患者的治疗
5)一个非限制性实例
一个乳癌患者可以表现出症状或征象如一种可触及的肿块/肿瘤、来自乳头的分泌物或皮肤变形。通常没有症状的乳癌的比例通过乳房X线照相术扫描也可以检测出来。如果那些试验对于诊断不是结论性的,可以进行一种乳房活组织检查,即去除来自该可疑肿瘤的组织的选择的实体片。
在诊断乳癌后,常规地通过手术(例如通过乳房切除术或部分乳房切除术)将该肿瘤去除。
为了进行该治疗预测的方法,获得一种肿瘤组织样品。该肿瘤组织样品可以从来自肿瘤的早期手术去除或来自在该癌症的早期诊断期间进行的活组织检查的一种标本获得。
为了提供显示一种阴性HMGCR染色(阴性参考)的一个参比样品,从没有HMGCR表达的一种组织取得一种材料,例如包括缺乏可检出的HMGCR蛋白表达的组织的档案材料。该阴性参考可以显示一种缺乏的细胞质强度。
为了提供显示出一种阳性HMGCR染色(阳性参考)的一个参比样品,从具有高HMGCR表达的一种组织取得一种材料,例如具有预先建立的高HMGCR蛋白表达的乳癌组织。这种阳性参考可以显示一种强的细胞质强度。
为了获得薄切片(4μm),将这些材料(肿瘤组织样品和参比样品)在缓冲的福尔马林中固定并且经组化处理。可替代地,可以预先制备这些参比样品,例如已经固定在缓冲的福尔马林中或已经装在载玻片上(见下文)。
如在实例部分3中的说明进行免疫组织化学。将来自每一样品的一个或多个样品切片固定在载玻片上,在60℃下孵育45分钟,在二甲苯中脱石蜡(2x15分钟),并且在梯度醇中水合。为了抗原恢复,将这些载玻片浸在TRS(靶标恢复溶液中,pH 6.0,DakoCytomation)并且在一种Decloaking chamber(Biocare Medical)中在125℃下煮沸4分钟。然后,将这些载玻片放置在该Autostainer(DakoCytomation)中,并且开始用H2O2(DakoCytomation)封闭内源性过氧化物酶。安装多个样品切片的原因可能是为了增加结果的准确度。
将第一HMGCR特异性抗体(例如实例部分2或4的抗HMGCR抗体)添加到这些载玻片上,然后在室温中孵育30分钟,随后与标记的第二抗体(例如结合Envision的羊抗兔过氧化物酶)在室温中孵育30分钟为了检测该第二抗体,将二氨基联苯胺(DakoCytomation)用作色原体并且用Harris苏木精(Sigma-Aldrich)进行对比复染。在所有步骤之间,将载玻片在洗涤缓冲液(DakoCytomation)中漂洗。然后,用Pertex(Histolab)装上这些载玻片。
作为验证该染色步骤的一种工具,可以使用二种对照细胞系;例如一个载玻片具有表达HMGCR的细胞(阳性细胞系),并且一个载玻片具有无HMGCR表达的细胞(阴性细胞系)。技术人员了解如何提供这类细胞系,例如按照Rhodes等人披露的(2006)The biomedical scientist,p 515-520的指导。这些对照系载玻片可以与这些乳癌载玻片在同一步骤中同时染色,即与相同的第一和第二抗体孵育。
为了获得数字图象,可以使用一种ScanScope T2自动化载玻片扫描系统(Aperio Technologies)在20倍放大率下在一个光学显微镜中扫描乳癌肿瘤载玻片、参考载玻片、以及任选地具有对照细胞系的载玻片。然而,这个扫描步骤不是必需的,但是可以使得这个步骤更容易,例如如果在不同的位置或通过不同的人进行这些载玻片的制备和染色以及细胞质强度的评价(见下文)。
如果使用对照细胞系,检查这些以验证该染色步骤。如果这些细胞系显示可接受标准之外的染色结果,例如由技术人员识别的染色假象,则考虑这些载玻片的染色是无效的并且用新的载玻片重复该整个染色步骤。如果这些阳性和阴性细胞系分别显示强的染色强度和无染色强度,则考虑该染色被是有效的。
通过目测人工地评价来自该肿瘤样品的一个或多个染色样品载玻片,并且如在实例部分3中的说明将一个或多个乳癌载玻片的细胞质强度(CI)进行分级。
在该分级中,主观地将该细胞质强度(CI)分类为:缺乏的=无免疫反应性,弱的=微弱的免疫反应性,中等的=中等免疫反应性,或强的=显著而强烈的免疫反应性。
通过目测染色的阳性的和阴性的参考载玻片辅助执行该评价和分级的人员。
该参考值可以是一种缺乏的CI,并且在此情况下如果来源于该受试者的样品值是高于一种缺乏的CI,即如果这种样品值是一种微弱的、中等的、或强的CI,则推断所讨论的的患者可能受益于一种内分泌治疗。
以上结论可以引导一位医师应用一种内分泌治疗。然而,在一些情况下,此类决定可能取决于若干参数。无论如何,患者是HMGCR阳性的事实是支持用一种内分泌治疗(尤其是一种它莫西芬治疗)来治疗该患者的决定的。
将在本申请中涉及的所有引证材料(包括但不限于公开文件、DNA或蛋白数据录入、以及专利)通过引用结合在此。
经过对本发明如此说明,显而易见能够以很多方式对其进行修改。此类改变不得被视为是偏离了本发明的精神以及范围,并且对本领域的普通技术人员而言显而易见的所有此类变更都是旨在包含于以下权利要求的范围之内。
Claims (28)
1.一种试剂盒,该试剂盒包括:
a)能够与一种HMGCR蛋白选择性地相互作用的一种可以计量的亲和配体;以及
b)用于定量所述可以计量的亲和配体的量必需的试剂,并且进一步包括
a')能够与一种雌激素受体选择性地相互作用的一种可以计量的亲和配体;以及
b')用于定量a')的可以计量的亲和配体的量必需的试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其中所述能够与一种HMGCR蛋白选择性地相互作用的可以计量的亲和配体是选自下组,其组成为:抗体、它们的片段、以及它们的衍生物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其中所述能够与一种HMGCR蛋白选择性地相互作用的可以计量的亲和配体是通过一个方法能得到的,该方法包括用一种蛋白质免疫一种动物的一个步骤,该蛋白质的氨基酸序列包括序列SEQ ID NO:1。
4.根据权利要求2所述的试剂盒,其中所述能够与一种HMGCR蛋白选择性地相互作用的可以计量的亲和配体是通过一个方法能得到的,该方法包括用一种蛋白质免疫一种动物的一个步骤,该蛋白质的氨基酸序列由序列SEQ ID NO:1组成。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其中所述能够与一种HMGCR蛋白选择性地相互作用的可以计量的亲和配体是一种衍生于选自下组的一种支架的蛋白配体,该组的组成为:葡萄球菌蛋白A和其域、脂质运载蛋白、锚蛋白重复域、纤维素结合域、γ晶质类、绿色荧光蛋白、人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、蛋白酶抑制剂、PDZ域、肽适体、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纤连蛋白Ⅲ型域以及锌指结构。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其中所述能够与一种HMGCR蛋白选择性地相互作用的可以计量的亲和配体是一种寡核苷酸分子。
7.根据权利要求1至6的任一项所述的试剂盒,其中所述能够与一种HMGCR蛋白选择性地相互作用的可以计量的亲和配体能够与一种HMGCR蛋白选择性地相互作用,该HMGCR蛋白包括或其组成为选自以下的一个序列:
i)SEQ ID NO:1;以及
ii)一个与SEQ ID NO:1有至少85%相同的序列。
8.根据权利要求1至6的任一项所述的试剂盒,其中所述能够与一种HMGCR蛋白选择性地相互作用的可以计量的亲和配体能够与一种HMGCR蛋白选择性地相互作用,该HMGCR蛋白包括或其组成为选自以下的一个序列:
i)SEQ ID NO:2;以及
ii)一个与SEQ ID NO:2有至少85%相同的序列。
9.根据权利要求1至6的任一项所述的试剂盒,其中所述能够与一种HMGCR蛋白选择性地相互作用的可以计量的亲和配体包括一种选自下组的标记物,该组的组成为:荧光染料类和金属类、发色染料类、化学发光化合物类和生物发光蛋白类、酶类、放射性同位素类、颗粒以及量子点。
10.根据权利要求1至6的任一项所述的试剂盒,其中用于对所述能够与一种HMGCR蛋白选择性地相互作用的可以计量的亲和配体的所述量进行定量必需的所述试剂包括能够识别所述能够与一种HMGCR蛋白选择性地相互作用的可以计量的亲和配体的一种第二亲和配体。
11.根据权利要求10所述的试剂盒,其中所述第二亲和配体包括一种选自下组的标记物,该组的组成为:荧光染料类和金属类、发色染料类、化学发光化合物类和生物发光蛋白类、酶类、放射性同位素类、颗粒以及量子点。
12.根据权利要求1至6的任一项所述的试剂盒,进一步包括至少一种参比样品用于提供一个参考值。
13.根据权利要求12所述的试剂盒,其中至少一种参比样品是一种不含有可检出的HMGCR蛋白的组织样品。
14.根据权利要求12所述的试剂盒,其中至少一种参比样品包括对应于一种缺乏的细胞质强度的一个量的HMGCR蛋白。
15.根据权利要求12所述的试剂盒,其中至少一种参比样品包括对应于高于所述参考值的一个值的一个量的HMGCR蛋白。
16.根据权利要求15所述的试剂盒,其中至少一种参比样品包括对应于一种强的细胞质强度的一个量的HMGCR蛋白。
17.根据权利要求15或16所述的试剂盒,其中至少一种参比样品包括对应于75%或更高的细胞质部分的一个量的HMGCR蛋白。
18.根据权利要求12所述的试剂盒,该试剂盒包括:
一种第一参比样品,该参比样品包括对应于高于一个参考值的一个阳性参考值的一个量的HMGCR蛋白;并且
一种第二参比样品,该参比样品包括对应于低于或等于所述参考值的一个阴性参考值的一个量的HMGCR蛋白。
19.根据权利要求12所述的试剂盒,其中所述一种或多种参比样品是一种或多种组织样品。
20.根据权利要求1至6的任一项所述的试剂盒,进一步包括:
a")能够与一种孕酮受体选择性地相互作用的一种可以计量的亲和配体;以及
b")用于定量a")的可以计量的亲和配体的量必需的试剂。
21.根据权利要求12所述的试剂盒,进一步包括:
a")能够与一种孕酮受体选择性地相互作用的一种可以计量的亲和配体;以及
b")用于定量a")的可以计量的亲和配体的量必需的试剂。
22.一种HMGCR蛋白或其一种抗原活性片段用于对于患有一种乳癌的哺乳动物受试者的一种内分泌治疗指示剂的生产、选择或纯化的用途,其中该内分泌治疗是选自下组,其组成为:一种选择性雌激素受体调节剂(SERM)治疗、一种芳香酶抑制剂治疗、以及一种甾体雌激素受体拮抗剂治疗。
23.根据权利要求22所述的用途,其中所述内分泌治疗指示剂是一种能够与该HMGCR蛋白或其一种抗原活性片段选择性地相互作用的亲和配体。
24.根据权利要求23所述的用途,其中该亲和配体能够与一种由序列SEQ ID NO:1组成的蛋白质选择性地相互作用。
25.根据权利要求22至24的任一项所述的用途,其中HMGCR蛋白的氨基酸序列包括或其组成为选自以下的一个序列:
i)SEQ ID NO:1;以及
ii)一个与SEQ ID NO:1有至少85%相同的序列。
26.根据权利要求22至24的任一项所述的用途,其中HMGCR蛋白的氨基酸序列包括或其组成为选自以下的一个序列:
i)SEQ ID NO:2;以及
ii)一个与SEQ ID NO:2有至少85%相同的序列。
27.能够与一种HMGCR蛋白选择性地相互作用的亲和配体用于制备一种用于患有乳癌的哺乳动物受试者的内分泌治疗指示剂的用途。
28.根据权利要求27所述的用途,其中该哺乳动物受试者是一位绝经前的女性。
Applications Claiming Priority (3)
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