CN102083989B

CN102083989B - 具有缩短的Raphanus片段(SRF)的新的芸苔属Ogura恢复系

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Publication number: CN102083989B
Application number: CN200980109801.9A
Authority: CN
Inventors: 张永平; 贾扬提拉勒·D·帕特尔; 洛马斯·塔尔斯尔曼
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2008-02-06
Filing date: 2009-02-05
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2029-02-05
Also published as: AU2009212420B2; US20090205065A1; US8466347B2; CA2714400C; US20140345005A1; US20130254946A1; AU2009212420A1; US8766040B2; WO2009100178A2; CN102083989A; CN104041403A; EP2247734A2; WO2009100178A3; EA201070928A1; CA2714400A1

Abstract

本发明提供了具有缩短的Raphanus片段的新的芸苔属Ogura育性恢复系。该新的系缺乏OPC2标记并能够在Ogura细胞质雄性不育(cms)植物中完全恢复能育性。改良的系使用新的育种方法培育。新的育种方法可以用于缩短任何植物中包含目的基因的外源插入物。

Description

具有缩短的Raphanus片段(SRF)的新的芸苔属Ogura恢复系

发明领域

本发明涉及具有缩短的Raphanus片段的新的芸苔属系，该缩短的Raphanus片段包括用于Ogura细胞质雄性不育的育性恢复基因。本发明还涉及缩短任何植物中包含目的基因的外源插入物的新的育种方法。

发明背景

来自芸苔属(Brassica)植物的含油种子是日益重要的作物。作为植物油的来源，其目前在商业市场容量中只位于大豆和棕榈科之后。油可以用于多种用途，例如沙拉油或烹调油。提取油时，粕可以用作饲料来源。

称为油菜籽的芸苔属种子，在其最初形式时，对人体是有害的，这是由于其油中相对高水平的芥酸和粕中相对高水平的硫代葡萄糖苷。芥酸在天然栽培品种中是普遍存在的，含量为总脂肪酸成分重量的30-50％。硫代葡萄糖苷在芸苔属种子中是不需要的，因为其在油的提取和消化过程中，通过酶的裂解可以导致抗营养物分解产物的产生。植物科研工作者鉴定出低芥酸菜籽油的种质来源，攻克了芥酸问题(Stefansson，“TheDevelopment of Improved Rapeseed Cultivars(改良油菜籽栽培品种的培育).”“High and Low Erucic Acid Rapeseed Oils(高芥酸和低芥酸菜籽油)”中(第6章)，由John K.G.Kramer，Frank D.Sauer和Wallace J.Pigden编辑.加拿大学术出版社(Academic Press Canada)，多伦多(1983))。最近，植物科研工作者致力于将总硫代葡萄糖苷在含水量8.5％的整粒种子中的含量降低至少于20μmol/g的水平。这可以通过核共振成像(NRI)或高效液相色谱(HPLC)来测定(国际标准化组织，参考号ISO 91671：1992)。

特别吸引植物科研工作者的是所谓的“双低(double-low)”品种：该品种油中的芥酸低并且在油提取后残留的固体粕中硫代葡萄糖苷低(即芥酸含量低于总脂肪酸成分重量的2％，并且硫代葡萄糖苷在无油粕中的含量低于30μmol/g)。在加拿大首次培育出的这些更高品质的油菜种类，称为加拿大油菜(canola)。

另外，植物科研工作者已经尝试改善菜籽油的脂肪酸特征(profile)(Robbelen，“Changes and Limitations of Breeding for Improved PolyenicFatty Acids Content in Rapeseed(油菜籽中改良的多烯脂肪酸含量的育种改变和局限性).”“Biotechnology for the Oils and Fats Industry(用于油类和脂肪产业的生物技术)”(第10章)，edited by Colin Ratledge，Peter Dawsonand James Rattray(Colin Ratledge、Peter Dawson和James Rattray编辑)，American Oil Chemists′Society(美国石油化学家学会)，(1984)；Ratledge，Colin，Dawson，Peter和Rattray，James，(1984)(用于油类和脂肪产业的生物技术).American Oil Chemists′Society(美国石油化学家学会)，Champaign；328pp；Robbelen and Nitsch.Genetical and PhysiologicalInvestigations on Mutants for Polyenic Fatty Acids in Rapeseed，Brassicanapus L.(甘蓝型油菜菜籽中多烯脂肪酸突变体的遗传学和生理学调查)Z.Planzenzuchta.，75：93-105，(1975)；Rako and McGregor.“Opportunities andProblems in Modification of Levels of Rapeseed C18 Unsaturated Fatty Acids(油菜籽C18不饱和脂肪酸的水平的改变的机遇和问题).”J.Am.Oil Chem.Soc.(1973)50(10)：400-403)。这些参考文献是该尝试的代表。

目前，自由授粉品种和芸苔属杂种都在栽培。在培育改良的芸苔属杂种中，育种者可以利用不同的授粉控制系统，例如自交不亲和(SI)、细胞质雄性不育(CMS)和核雄性不育(NMS)芸苔属植物作为母本。在杂种作物育种中，植物育种者探索从雄性系和雌性系的结合或杂交中能导致更高作物产量(谷类或生物质)的杂种优势(heterosis或hybrid vigor)现象。使用这些植物，育种者尝试改善种子生产的效率和F1杂种的品质以及降低育种成本。当在二元杂交中不使用SI、CMS或NMS植物进行杂交时，在子代(progeny，F1代)获得和分离所需要的性状更为困难，因为亲本能够经历异花授粉和自花授粉。如果亲本中的一个是不能产生花粉的SI、CMS或NMS植物，那么只会发生异花授粉。如果亲本是相同品质的并且育种者进行单交，那么通过在二元杂交中去除一个亲本品种的花粉，植物育种者可以保证获得相同品质的杂种种子。

在一个实例中，F1杂种的产生包括将CMS芸苔属母本和产生花粉的芸苔属父本进行杂交。但是为了有效繁殖，F1杂种的父本必须具有育性恢复基因(Rf基因)。Rf基因的存在意味着F1代不会完全地或部分地不育，以便可以发生自花授粉或异花授粉。F1代的自花授粉对于确保F1植物为种植者提供优异的产量来说是理想的。F1代的自花授粉对于确保所需要的性状是可遗传的和稳定的来说也是理想的。

一种细胞质雄性不育并用于育种的芸苔属植物是Ogura(OGU)细胞质雄性不育(Pellan-Delourme，et al.，(1987)Male fertility restoration inBrassica napus with radish cytoplasmic male sterility Proc.7th Int.RapeseedConf.，Poznan，Poland，199-203)。Ogura细胞质雄性不育植物的育性恢复系已经被位于法国雷恩市(Rennes)的法国国力农业科学院(InstitutNational de Recherche Agricole(INRA))从萝卜(Raphanus sativus(radish))转移到芸苔属(Pelletier and Primard，(1987)“Molecular，Phenotypic andGenetic Characterization of Mitochondrial Recombinants in Rapeseed(油菜籽内线粒体重组体的分子、表型和遗传特征).”Proc.7th Int RapeseedConf.，Poznau，Poland 113-118)。源自萝卜的恢复基因Rfl的描述见于WO92/05251和Delourme，et al.，(1991)“Radish Cytoplasmic Male Sterility inRapeseed：Breeding Restorer Lines with a Good Female Fertility(油菜籽中的萝卜细胞质雄性不育：具有良好雌性能育性的育种恢复系).”Proc 8thInt.Rapeseed Conf.，Saskatoon，Canada.1506-1510。

但是，当Ogura Raphanus恢复基因从萝卜转移到芸苔属时，大段Raphanus基因组也渗入到芸苔属中。这个大Raphanus基因组片段不但携带了恢复基因而且还携带了很多不希望的性状。例如，早期恢复系种质是不适当的，因为携带该大Raphanus片段的近交种和杂种恢复系的硫代葡萄糖苷水平升高并且该恢复系与结籽-每个长角果胚珠的数目的降低有关(Pellan-Delourme and Renard，(1988)“Cytoplasmic male sterility inrapeseed(Brassica napus L.)：Female fertility of restored rapeseed with“Ogura”and cybrids cytoplasms)”，Genome 30：234-238；Delourme，et al.，(1994)，“Identification of RAPD Markers Linked to a Fertility Restorer Genefor the Ogura Radish Cytoplasmic Male Sterility of Rapeseed(Brassicanapus L.)”，Theor.Appl.Gener.88：741-748)。在杂种的情况下，即使母本具的硫代葡萄糖苷含量降低时，硫代葡萄糖苷水平依然升高。所述水平通常大于无油粕的30μmol/g，超过世界上大部分监管机构所允许的种子注册的硫代葡萄糖苷水平。因此，早期恢复系种质可以用于研究用途，不能直接培育加拿大油菜品质的商业杂种品种。

对于Ogura细胞质不育，INRA列出了与获具有低硫代葡萄糖苷水平的恢复系有关的困难(Delourme，et al.，(1994)“Identification of RAPDMarkers Linked to a Fertility Restorer Gene for the Ogura RadishCytoplasmic Male Sterility of Rapeseed(Brassica napus L.)”，Theor.Appl.Gener.88：741-748；Delourme，et al.，(1995)“Breeding Double Low RestorerLines in Radish Cytoplasmic Male Sterility of Rapeseed(Brassica NapusL.(油菜籽(甘蓝型油菜)的萝卜细胞质雄性不育中双低恢复系的育种))”，Proc.9th Int.Rapeseed Conf.，Cambridge，England)。IRNA表明这些困难是由于在其育种材料中雄性育性恢复和硫代葡萄糖苷含量的关联造成的。IRNA建议更多的萝卜的遗传信息需要从其恢复系中去除。(Delourme，etal.，(1995)“Breeding Double Low Restorer Lines in Radish CytoplasmicMale Sterility of Rapeseed(Brassica Napus L.)(油菜籽(甘蓝型油菜)的萝卜细胞质雄性不育双低恢复系的育种)”，Proc.9th Int.Rapeseed Conf.，Cambridge，England)。尽管在前些年对恢复系进行了改良，但是对恢复系进行的同工酶研究表明，该大段萝卜遗传信息仍然保留在恢复基因周围(Delourme，et al.，(1994)“Identification of RAPD Markers Linked to aFertility Restorer Gene for the Ogura Radish Cytoplasmic Male Sterility ofRapeseed(Brassica napus L.)”，Theor.Appl.Gener.88：741-748)。

INRA尝试培育硫代葡萄糖苷水平降低的恢复系。其报道了具有15μmol/g的杂合恢复系(Delourme，et al.，(1995)“Breeding Double LowRestorer Lines in Radish Cytoplasmic Male Sterility of Rapeseed(BrassicaNapus L.)(油菜籽(甘蓝型油菜)的萝卜细胞质雄性不育双低恢复系的育种)”，Proc.9th Int.Rapeseed Conf.，Cambridge，England)。但是，(i)该恢复系对于恢复基因是杂合(Rfrf)的不是纯合(RfRf)的，(ii)该恢复系是单交植物(single hybrid plant)而不是近交系，(iii)只有单独的数据点表明该恢复系具有低硫代葡萄糖苷水平，而不是多数据点来支持低硫代葡萄糖苷水平，(iv)没有数据证明低硫代葡萄糖苷性状是否会传递给该恢复系的子代，并且(v)该恢复系是在单一环境中选择和评价的-即没有证明在田间试验时所述低硫代葡萄糖苷性状在连续代中是稳定的。因此，该最初的芸苔属Ogura恢复系不适于商业用途。出于本公开的目的，该材料称为“最初的(original)”芸苔属恢复系。

改良的恢复系由Charne，et al.，(1998)WO 98/27806“Oilseed BrassicaContaining an improved fertility restorer gene for Ogura cytoplastic malesterility(含有针对Ogura细胞质雄性不育的改良的育性恢复基因的含油种子芸苔属)”制造。所述改良的恢复系具有Ogura细胞质雄性不育的纯合的(固定的)恢复基因(RfRf)并且含油种子是低硫代葡萄糖苷的。因为该恢复系是纯合的(RfRf)，所以其可以用于培育恢复系近交种，或者作为雄性近交种，用于制造用于商业产品培育的单交种(single cross hybrid)组合。硫代葡萄糖苷水平低于不同国家在加拿大油菜标准中制定的硫代葡萄糖苷水平，并且育种者可以使用改良的恢复系来生产具有低硫代葡萄糖苷水平含油种子的芸苔属近交种和杂种。这对于农作业者是有益的，他们可以种植授粉后产生具有低硫代葡萄糖苷水平含油种子的芸苔属杂种。该育种成果去除了约三分之二的最初的Raphanus片段。这是基于14个RFLP、AFLP和SCAR标记中丢失了10个而估计的(WO98/56948Tulsieram，et al.，1998-12-17)。但是，该材料中的Raphanus片段仍然是不必要地大。为了本公开的目的，该材料称为“第一期重组(first phaserecombinant)”芸苔属恢复系或种质。

尽管在“第一期重组”恢复系种质中有所改良，但是仍然与不利的农艺学性能有关。这些不利的性状可以来自该Raphanus片段内与能育性无关的基因。实际上，只有Raphanus片段中的恢复基因是加拿大油菜CMS授粉系统所需要的。因此，恢复系中的Raphanus片段越短，该恢复系预期的表现就越好。

Ogura恢复基因已经被DNA LandMarks Inc./McGill University(美国专利申请公开第2003/0126646A1号，WO 03/006622A2)、三菱(Mitsubishi)(美国专利申请公开第2004/0117868A1号)和INRA(WO2004/039988A1)分离和克隆。该基因可以用于转化芸苔属植物。

其他人已尝试产生具有缩短的Raphanus片段的恢复系。例如，法国国力农业科学院(INRA)通过将具有Pgi-2等位基因缺失的恢复系“R211”杂交并与双低甘蓝型油菜(B.napus)系Drakkar杂交而培育了具有缩短的Raphanus片段的系。子代植物在减数分离前用γ射线照射以诱导重组。这产生了一种子代植物“R2000”，其中来自甘蓝(Brassica oleracea)的Pgi-2基因发生重组(WO 2005/002324和Theor.Appl.Genet(2005)111：736-746)。但是，R2000中的Raphanus片段大于本申请人培育的并在上文描述的第一期重组恢复系材料中的Raphanus片段。

另一个实例，即Syngenta的WO 05074671描述了在其BLR1重组事件中缩短的Raphanus片段。该BLR1重组事件只是通过杂交和选择来产生，然后用分子标记筛选；没有使用诱变。但是Raphanus片段可以进一步缩短。

发明概述

本发明一方面提供了包含用于Ogura细胞质雄性不育的育性基因的芸苔属植物，其中所述育性基因位于从萝卜基因渗入的Raphanus片段上，并且所述Raphanus片段缺乏选自以下的标记：RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、RMA10、RMC24、OPC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32和RMC33。所述芸苔属植物可以缺乏Raphanus片段中的OPC2标记。

本发明另一方面提供了包含用于Ogura细胞质雄性不育的育性基因的芸苔属植物，其中所述育性基因位于从萝卜基因渗入的Raphanus片段上，并且所述Raphanus片段(i)缺乏选自以下的标记：RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、RMA10、RMC24、OPC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32和RMC33，并且(ii)包含选自以下的分子标记：RMB01、E35M62、RMB02、RMB03、RMB04、RMB05、RMB06、RMB07、RMB08、RMB09、RMB10、OPF10、RMB11、RMB12、RMC01、RMC02、RMC03、E38M60、RMC04、RMC05、RMC06、RMC07、RMC08、RMC17、RMC18、RMC19、RMC20、RMC21、RMC22和RMC23。所述芸苔属植物可以称为R1439或其后代或通过将R1439与另一植物杂交产生的植物，R1439的代表性种子已经进行了保藏，NCIMB登录号为41510。该芸苔属植物的子代(progeny)或后代植物(descendent plant)可以包含缺乏选自以下的标记的Raphanus片段：RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、RMA10、RMC09、RMC10、RMC11、RMC12、RMC13、RMC14、RMC15、RMC16、RMC24、OPC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32和RMC33。

本发明的另一方面是提供包含针对Ogura细胞质雄性不育的育性基因的芸苔属植物，其中所述育性基因位于从萝卜基因渗入的Raphanus片段上，并且所述Raphanus片段(i)缺乏选自以下的标记：RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、RMA10、RMC24、OPC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32和RMC33，并且(ii)包含选自以下的分子标记：RMB01、E35M62、RMB02、RMB03、RMB04、RMB05、RMB06、RMB07、RMB08、RMB09、RMB10、OPF10、RMB11、RMB12、RMC01、RMC02、RMC03、E38M60、RMC04、RMC05、RMC06、RMC07、RMC08、RMC09、RMC10、RMC11、RMC12、RMC13、RMC14、RMC15、RMC16、RMC17、RMC18、RMC19、RMC20、RMC21、RMC22和RMC23。所述芸苔属植物可以称为R1815或其后代或通过将R1815与另一植物杂交产生的植物，R1815的代表性种子已经进行了保藏，NCIMB登录号为41511。子代或后代植物可以包含缺乏选自以下的标记的Raphanus片段：RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、RMA10、RMC24、OPC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32和RMC33。

本发明另一方面提供了包含用于Ogura细胞质雄性不育的育性基因的芸苔属植物，其中所述育性基因位于从萝卜基因渗入的Raphanus片段上，并且所述Raphanus片段(i)缺乏选自以下的标记：RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、RMA10、RMC24、OPC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32和RMC33，并且(ii)包含选自以下的分子标记：RMB01、E35M62、RMB02、RMB03、RMB04、RMB05、RMB06、RMB07、RMB08、RMB09、RMB10、OPF10、RMB11、RMB12、RMC01、RMC02、RMC03、E38M60、RMC04、RMC05、RMC06、RMC07、RMC08、RMC09、RMC10、RMC11、RMC12、RMC13、RMC14、RMC15和RMC16。所述芸苔属植物可以称为R1931或其后代或通过将R1931与另一植物杂交产生的植物，R1931的代表性种子已经进行了保藏，NCIMB登录号为41512。子代或后代植物可以包含缺乏选自以下的标记的Raphanus片段：RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、RMA10、RMC17、RMC18、RMC19、RMC20、RMC21、RMC22、RMC23、RMC24、OPC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32和RMC33。

任何上述芸苔属植物可以是甘蓝型油菜、芜菁(B.rapa)或芥菜(B.juncea)。所述植物可以是近交种或杂种。

本发明另一方面提供了来自任何上述芸苔属植物的芸苔属种子。另一方面提供了来自任何上述芸苔属植物的植物细胞或上述植物的部分，所述部分可以选自：核酸序列、组织、细胞、花粉、胚珠、根、叶、含油种子、小孢子、营养部分，无论是成熟的还是胚的。

本发明另一方面提供了任一上述芸苔属植物的压碎的芸苔属种子的集合(assemblage)。

本发明另一方面提供了任何上述芸苔属植物的种子在制备油和/或粕中的用途。

本发明另一方面提供了生产油的方法，其包括：(i)压碎称为R1439、R1815或R1931且NCIMB登录号分别为41510、41511和41512的植物系所产生的的种子，或者R1439、R1815或R1931的后代所产生的种子或者通过将R1439、R1815或R1931与另一植物杂交产生的植物所产生的种子；并且(ii)从所述种子中提取油。所述方法还可以包括(i)将所述油精炼、漂白和除臭的步骤。

本发明另一方面提供了任何上述植物在栽培农作物中的用途。

本发明另一方面提供了栽培芸苔属植物的方法，其包括(i)播种称为R1439、R1815或R1931且NCIMB登录号分别为41510、41511和41512的种子，或者来自R1439、R1815或R1931的后代的种子或者来自将R1439、R1815或R1931与另一植物杂交所产生的植物的种子；并且(ii)在芸苔属生长条件下，栽培所得到的植物。

本发明另一方面提供了任何上述植物在芸苔属系育种中的用途。所述育种可以选自常规育种、系谱育种、杂交、自花授粉、加倍单倍体、单粒传法、回交和通过遗传转化育种。

本发明另一方面提供了具有用于Ogura细胞质雄性不育的育性基因的芸苔属植物的育种方法，其中所述育性基因位于从萝卜基因渗入的Raphanus片段上，并且所述Raphanus片段缺乏选自以下的分子标记：RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、RMA10、RMC24、OPC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32和RMC33，所述育种方法包括(i)将任何上述植物与另一芸苔属植物杂交，产生第一代子代植物；(ii)筛选所述第一代子代植物的Ogura Raphanus恢复基因；以及(iii)任选地重复步骤(i)和(ii)。所述第一代子代植物可以是近交植物。所述第一代子代植物可以是杂种植物。还提供通过此方法所产生的子代植物。

本发明另一方面提供了与第一植物中的Raphanus片段相比，具有缩短的Raphanus片段的新系的育种方法，其中新系中缩短的Raphanus片段包括Ogura育性恢复基因，所述方法包括(i)诱变具有Raphanus片段的第一植物的第一种群，所述Raphanus片段具有用于细胞质雄性不育的Ogura育性恢复基因；(ii)筛选在所述Raphanus片段中缺失Ogura育性恢复基因的第一种群，从而鉴定在Raphanus片段中缺失Ogura育性恢复基因的第二植物；(iii)将在Raphanus片段中缺失Ogura恢复基因的第二植物与包含Raphanus片段的所述第一植物杂交，所述Raphanus片段具有用于细胞质雄性不育的Ogura育性恢复基因；(iv)鉴定与第一植物相比，具有缩短的Raphanus片段的第三植物，其中所述缩短的Raphanus片段包括所述恢复基因，以及(v)对第三植物进行育种以产生具有缩短的、包括Ogura育性恢复基因的Raphanus片段的新系。第一植物可以是R1439、R1815或R1931。第三植物可以缺乏选自以下的分子标记：RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、RMA10、RMC24、OPC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32和RMC33。还提供了通过此方法所产生的新系。

本发明另一方面提供了包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：158中列出的任何序列所示的序列的分离的核酸。

本发明另一方面了提供了包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：158中列出的任何序列所示的序列的分离的核酸在分子标记开发中的用途。

本发明另一方面提供了包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：158中列出的任何序列所示的序列的分离的核酸作为引物的用途。

本发明另一方面提供了包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：158中列出的任何序列所示的序列的分离的核酸作为探针的用途。

本发明另一方面提供了用一个或多个SEQ ID NOS：1至158的序列筛选植物以表征Raphanus片段的用途。

本发明另一方面提供了筛选植物来表征Raphanus片段的方法，其包括：(i)将至少一个选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：158的引物序列与植物基因组杂交；(ii)实施PCR检测；以及(iii)表征Raphanus片段。

本发明另一方面提供了在具有Raphanus片段的基因组中产生缺失突变体的方法，所述Raphanus片段具有Ogura育性恢复基因，所述方法包括：(i)提供细胞群，其中所述细胞对于Raphanus片段是杂合的并且所述细胞具有Ogura CMS细胞质；(ii)诱变所述细胞进行以产生诱变的细胞；(iii)由诱变的细胞产生植物；以及(iv)筛选所述植物的不育性以鉴定缺失突变体中缺失的Ogura育性恢复基因，其中所述诱变的Ogura基因不能恢复具有Ogura CMS细胞质的植物中的能育性。诱变细胞的步骤可以包括照射。还提供通过此方法所产生的缺失突变体。

本发明另一方面提供了使具有Ogura恢复基因的Raphanus片段重组的方法，其包括：(i)提供在核基因组中具有Raphanus片段的植物，该Raphanus片段具有Ogura恢复基因；(ii)将(i)的植物与核基因组中具有Raphanus片段的植物杂交，该Raphanus片段中的Ogura恢复基因已经缺失；以及(iii)鉴定Raphanus片段已经发生重组的子代。(i)的植物对于具有Ogura恢复基因的Raphanus片段可以是纯合的(RfRf)，(ii)的植物对于Ogura恢复基因缺失的Raphanus片段可以是纯合的(Rf^Rf^)，来自对于Raphanus片段是杂合的(Rf Rf^)第一子代种群的子代，以允许(a)具有Ogura恢复基因的Raphanus片段(Rf)和(b)Ogura恢复基因缺失的Raphanus片段(Rf^)以有效速率进行重组。该方法还可以包括，将(a)不含有Raphanus片段(rfrf)且具有Ogura CMS细胞质的植物用(b)来自对于核基因组中具有Ogura恢复基因的Raphanus片段和没有Ogura恢复基因的Raphanus片段都是杂合的(RfRf^)的上述子代植物的花粉进行授粉，以产生在Ogura CMS细胞质中对于Raphanus基因是杂合的第二子代种群，其中第二种群包含约50％具有rfRf基因型的植物，约50％具有rfRf^基因型的植物以及Raphanus片段发生重组的一些子代(rfRf*)，并且其中第二子代中Raphanus片段的分析得以促进，因为在分析Raphanus片段时没有干扰。分析前，可以筛选第二种群子代植物的能育性。该方法还可以包括鉴定包含纯合的重组Raphanus片段的植物的步骤。还提供了此方法所产生的具有重组Raphanus片段的子代植物。

本发明另一方面提供了用于缩短第一植物中外源插入物的方法，其中外源插入物包括目的基因，所述方法包括：(i)诱变具有包括目的基因的外源插入物的第一植物，以产生具有缺乏目的基因的、部分缺失的外源插入物的第二植物；(ii)将第二植物与第一植物杂交以产生第一种群，其中来自第一植物的外源插入物和来自第二植物的部分缺失的外源插入物都可以重组；(iii)将第一种群的植物与不具有外源插入物的植物杂交以产生第二植物种群；以及(iv)筛选第二植物种群以鉴定具有比第一植物中的外源插入物更短的外源插入物的第三植物，其中所述第三植物中更短的外源插入物包括目的基因。

本发明另一方面提供了具有比第一植物中的外源插入物短的外源插入物的新系的育种方法，其中外源插入物包括目的基因，所述方法包括：(i)诱变具有包括目的基因的外源插入物的第一植物，以产生具有缺乏目的基因的、部分缺失的外源插入物的第二植物；(ii)将第二植物与所述第一植物杂交以产生第一种群，其中来自第一植物的外源插入物和来自第二植物的部分缺失的外源插入物都可以重组；(iii)将第一种群的植物与不具有外源插入物的植物杂交以产生第二植物种群；以及(iv)筛选第二植物种群，以鉴定具有比第一植物中的外源插入物短的外源插入物的第三植物，其中第三植物中更短的外源插入物包括目的基因。

之前的两个方法还可以包括产生包围并包括外源插入物的基因组区的遗传信息的步骤。遗传信息的产生可以选自产生分子标记、序列信息和遗传图谱。第一植物经历步骤(i)中的诱变后对于目的基因可以是杂合的。第一植物在步骤(ii)中与第二植物杂交后对于目的基因可以是纯合的。第二植物在步骤(ii)中与第一植物杂交后对于缺乏目的基因的、部分缺失的外源插入物可以是纯合的。所述方法在步骤(ii)后还可以包括使用所述遗传信息鉴定具有来自第一植物的外源插入物和来自第二植物的部分缺失的外源插入物的植物的步骤。所述方法还可以包括增加步骤(ii)的种子的步骤。所述方法还可以包括对第三植物进行育种以产生商业系的步骤。外源插入物可以是Raphanus插入物，并且目的基因可以是Ogura育性恢复基因。外源插入物可以包括选自以下的目的基因：抗病性、抗虫性、耐旱性、耐热性、抗裂荚性和改善的谷物质量。还提供了以上两方法中任一方法所产生的第三植物。

本发明另一方面提供了选自SEQ ID NOS：159至237的分子标记。

本发明另一方面提供了一个或多个SEQ ID NOS：159至237的序列筛选植物以表征Raphanus片段的用途。

本发明另一方面提供了表征具有包含Ogura育性恢复基因的Raphanus片段的植物基因组的方法，其包括：(i)利用选自SEQ ID NO：159至SEQ ID NO：237的序列筛选所述植物基因组，以及(ii)表征Raphanus片段。

本发明另一方面提供了用于表征包含选自SEQ ID NOS：159至237的标记的Raphanus片段的标记/引物的组合。

本发明另一方面提供了用于表征包含选自SEQ ID NOS：1至158的引物的Raphanus片段的试剂盒。所述试剂盒还可以包含标记信息。

本发明另一方面提供了包含R1439、R1815或R1931重组事件的芸苔属植物。

附图简要说明

本发明将结合附图进行描述，其中：

图1说明在(i)最初的芸苔属Ogura恢复系(NW3002)、(ii)第一期重组芸苔属Ogura恢复系(NW1717)和(iii)具有缩短的Raphanus片段(SRF)的新的第二期重组芸苔属Ogura恢复系中所作的改良。

图2表示与NW1717中第一期重组Raphanus片段和最初的系NW3002相比，突变体系R1、R2和R5以及SRF系R1439、R1815和R1931中丢失的分子标记。

图3表示缩短的Raphanus片段(SRF)开发的杂交图。

图4表示描述用于缩短外源插入物的一般方法的连续图。

定义

CMS：表示细胞质雄性不育并且是一类可用于杂种种子生产的雄性不育。

重叠群：是通过组装染色体的重叠的测序片段而生成的DNA的连续序列。重叠群还是代表基因组的重叠区的一组克隆。术语重叠群还可以用于表示显示染色体重叠区位置的染色体图谱，连续的DNA节段在该位置处重叠。重叠群图谱很重要，因为其提供了通过检查一系列重叠克隆来研究基因组的完整并通常大的节段的能力，然后所述重叠克隆提供关于该区的完整连续的信息，例如物理尺度和方向。

保持系(也称为B-系)(Maintainer line(also known as B-line))：保持系是携带天然细胞质(即非CMS)并且携带与细胞质雄性不育(CMS)系相同的核遗传性的系。当与CMS系杂交时，其“保持”CMS系子代的不育性。因此，其与CMS系具有基本上相同的核遗传信息，但不是雄性不育。所述保持系是能育植物并且可以产生其自身的能育子代。

最初的恢复系(也称为最初的芸苔属Ogura恢复系)：这些系是最初的芸苔属Ogura恢复系，并且当恢复基因在纯合条件下存在时，携带高硫代葡萄糖苷性状。因此这些系不能商业化或用于商业种子生产。这些系的实例是图1所示的NW3002。

第一期重组恢复系或种质(也称为第一期重组芸苔属Ogura恢复系或种质)：基于标记测量，这些系含有小于最初的恢复系的Raphanus片段。当恢复基因在纯合条件下时，这些系不携带高硫代葡萄糖苷性状。因此，这些系可在商业上使用。这些系的实例公开于Charne，et al.，(1998)WO98/27806“Oilseed Brassica Containing an improved fertility restorer gene forOgura cytoplastic male sterility(含有针对Ogura细胞质雄性不育的改良的育性恢复基因的含油种子芸苔属)”中。另一实例是图1所示的NW1717。第一期重组恢复系与具有缩短的Raphanus片段的第二期重组恢复系的区别在于存在很多标记，例如(i)图1所示的OPC2标记和(ii)图2所示的标记RMC24至RMC33，包括RMC24和RMC33，以及RMA01至RMA10，包括RMA01和RMA10。

缺失突变体系(Rf^)：这些系含有突变的Raphanus片段，其中所述片段上的Raphanus恢复基因和其他Raphanus基因缺失。为本申请人的教导的目的，这些系称为Rf^。当突变的Raphanus片段(除去恢复基因)在纯合条件下时，突变体系称为Rf^Rf^，并且当其细胞质是Ogura CMS时，这些系是不育的。当突变的Raphanus片段在杂合条件下时，所述系称为Rf^Rf或Rf^rf，这对本领域技术人员是已知的。例如，Rf^Rf表示一个等位基因包含所述突变的Raphanus片段(除去恢复基因)，并且另一等位基因包含第一期重组Raphanus片段(具有恢复基因)。在Rf^Rf的情况下，当其细胞质是Ogura CMS时，所述系是能育的。Rf^rf表示一个等位基因包含突变的Raphanus片段(除去恢复基因)，并且另一等位基因根本不含有Raphanus片段。对于Rf^rf，当其细胞质是Ogura CMS时，所述系是不育的。这些突变体系用于产生具有缩短的Raphanus片段(SRF)的系，所述Raphanus片段包含恢复基因(参见下文)。

第二期重组恢复系或种质(也称为第二期重组芸苔属Ogura恢复系，具有缩短的Raphanus片段(SRF)的第二期重组芸苔属Ogura恢复系或Rf*)：这些系含有约一半的第一期重组恢复系中发现的Raphanus片段(通过丢失的标记的数目估计)，并且包括Raphanus恢复基因。这些系的实例包括图1所示的本发明的R1439、R1815和R1931。为本申请人教导的目的，这些系称为Rf*。当SRF在纯合条件下时，所述系称为Rf*Rf*。当SRF在杂合条件下时，所述系称为Rf*Rf或Rf*rf，其中Rf*Rf是指包含具有SRF的一个等位基因和具有来自第一期重组系的Raphanus片段的另一等位基因的系，Rf*rf指包含具有SRF的等位基因和根本不含有Raphanus片段的另一等位基因的系。无论Rf*Rf*、Rf*Rf或Rf*rf，当其细胞质是Ogura CMS时，所有这些SRF系都是能育的。

不同实施方案的描述

最初的芸苔属Ogura恢复系由INRA通过将Ogura恢复基因从萝卜转移到甘蓝型油菜而培育(Pelletier，et al.，(1987)“Molecular，Phenotypicand Genetic Characterization of Mitochondrial Recombinants in Rapeseed(油菜籽内线粒体重组体的分子、表型和遗传特征)”Proc.7th Int RapeseedConf.，Poznau，Poland 113-118)。这些系包括赋予高硫代葡萄糖苷性状的一个基因或多个基因。在图1中，这些最初的系以NW3002作为示例。

第一期重组芸苔属Ogura恢复系由不同研究所培育，本申请人是其中之一。第一期重组恢复系去除了赋予高硫代葡萄糖苷性状的一个基因或多个基因。在图1中，这些第一期重组恢复系以NW1717作为示例。但是，所述第一期重组恢复系仍然携带大量的Raphanus基因组(图1)。此外，某些系伴有不希望的农艺学特性。这些不希望的性状可以来自剩余的Raphanus片段中的基因或者来自芸苔属染色体上基因的去除/破坏。

本教导涉及具有缩短的Raphanus片段(SRF)的第二期重组芸苔属Ogura恢复系。第二期重组芸苔属Ogura恢复系通过以下步骤培育：(i)使用细菌人工染色体(BAC)重叠群为第一期重组恢复系中的Raphanus片段制备物理图谱(数据未显示)，(ii)用高密度标记在第一期重组恢复系中对Raphanus片段作图，(iii)产生第一期重组芸苔属Ogura恢复系的敲除突变种群，(iv)筛选敲除突变种群并鉴定具有第一期重组Raphanus片段包括Ogura恢复基因的不同缺失的突变体系，(v)将突变体系与第一期重组恢复系杂交以提供在Raphanus基因座重组的机会，并产生具有缩短的Raphanus片段(SRF)的第二期重组恢复系，(vi)在具有Ogura恢复基因和缩短的Raphanus片段(SRF)的系中鉴定新的重组，(vii)表征具有缩短的Raphanus片段(SRF)的第二期重组恢复系，(viii)测试具有SRF的第二期重组恢复系的更好的能育性、胚胎发生和农艺学，以及(ix)将新的第二期重组恢复系与另外的系杂交以产生商业系。

提供了以下实施例，作为本发明的具体示例。但是，应当理解，本发明不限于实施例中所示的具体细节。

实施例1.制备第一期重组芸苔属Ogura恢复系NW1717中Raphanus片段的高密度标记图。

图2显示了第一期重组芸苔属Ogura恢复系NW1717上的高密度标记。标记特异性用一组系谱系即6个恢复系和6个非恢复系进行了研究。只有那些对Ogura恢复系是特异的标记才用于筛选敲除突变种群和随后本发明的SRF材料(参见下文)。

标记进行编号并且其详细说明在表1a中列出。标记的序列信息在表1b中提供。

表1a含有关键的标记信息。第1、2、3、11和13栏分别列出了标记组、标记名称、PCR条带的大小、正向引物序列和反向引物序列。第4-10栏分别列出了在第一期重组恢复系NW1717、缺失突变体系R1、R2和R5、以及SRF系R1439、R1815和R1931中标记的存在或不存在(如下文实施例2-5所述)。除了第IV组，所有的标记都存在于第一期重组系中的Raphanus片段上。这些标记用于表征最初的缺失突变体和本发明的缩短的Raphanus片段系(SRF系)。

本发明的范围内包括对表征Raphanus片段有用的包含引物和/或标记的试剂盒。例如，试剂盒可以包括用于检测与Raphanus片段有关的标记基因座的适合的引物或探针和使用引物或探针检测标记基因座并使所述基因座与存在的Raphanus片段大小相互关联的操作说明。该试剂盒还可以包括用于包装探针、引物或操作说明的材料，对照，如包括用于扩增的探针、引物或核酸模板的扩增反应对照，分子大小标记等。该试剂盒还可以包括标记、标记序列信息、物理顺序次序信息和预期的PCR条带大小。

实施例2.产生第一期重组芸苔属Ogura恢复系00SNH09984的敲除突变体种群00SNH09984。

来自F₁系00SNH09984的种子在匈牙利KFKI原子能研究所(KFKIAtomic Energy Research Institute(AERI))中进照射，所述F₁系00SNH09984包含CMS细胞质并且对于Ogura恢复基因是杂合的(Rfrf)。选择杂种种子(即其中所述Ogura恢复基因是杂合状态)用于诱变(即照射处理)，因为杂种种子只有一个拷贝的恢复基因(即其对于恢复基因是杂合的)，因此恢复基因的突变产生表型突变体种群的概率，比具有两个相同拷贝的恢复基因的纯合种子更高。另外，筛选M0诱变的杂合种群比筛选诱变的纯合种群效率更高，因为在杂合条件下，敲除突变体可以在当代(M0)就被获得鉴定，而如果两个基因拷贝中只有一个拷贝被敲除，那么需要在M1或M2代鉴定纯合种子的突变体。3组500g的种子用以下剂量照射：30Gy、60Gy和90Gy。另一500g未处理的种子作为对照。所有处理按照以下标准流程实施：

种子诱变是在位于布达佩斯中子中心(Budapest Neutron Center(BNC))的布达佩斯研究反应堆(Budapest Research Reactor(BRR))的生物辐射装置(Biological Irradiation Facility(BIF))中进行，并且由KFKI原子能研究所(AERI)操作。总体来说，为用快速中子照射种子，使用了编号1A的滤片/吸收片布置。从核心开始向照射洞的滤片的顺序为：

●内部：143.6mm Al+18mm Pb+15mm Al

●外部在含硼水准直管内：在样品前没有外部滤片

●样品后的光束截捕器：30mm Fe+45mm Pb+8mmAl+20mmB4C

样品在壁厚2mm的Cd胶囊中进行照射。照射温度低于30℃，正常气压以及湿度小于60％。样品以16转/分钟旋转。样品通常重新包装以避免表面污染和最初的容器/袋的活化。在10.2MW下的中子剂量率(水比释动能～水中吸收的剂量)为6.93mGy/s。

照射期间，实时监测剂量，且当需要的剂量送递后，停止照射。

实施例3.筛选Raphanus片段中有缺失的敲除突变体种群

如表2所述，处理后的种子和未处理的对照于2001年5月种植在加拿大的一英亩许可的田间。“PNT”是指“具有新性状的植物(Plant withNovel Trait)”。此外，如表3所述的种植图所示，相应的保持系B系96DHS-60作为对照种植两次。

表2.田间试验中诱变的种子的细节

作物和受体系	甘蓝型油菜
		试验目的	筛选雄性不育突变体
容纳方法	200米隔离
		试验地点	加拿大安大略
PNT地的数量/地点	4000排，约一英亩
		植物的数量/地点	约250000颗种子
推荐的收获日期	2001年9月
		生长季中的处理	无

表3.诱变的种子田间试验的种植图

植物总数的估计通过样品计数计算。开花时，观察植物并视觉鉴定不育植物。如表4所总结的，在处理的种群中鉴定出1415株不育植物。对照中也观察到104株不育植物(可能是种子不纯导致的)，代表总对照植物的0.52％，这要低于处理的种子，在该处理种子中高达0.95％的植物是不育的。来自诱变的种群的不育植物可以表明在Raphanus片段上发生了突变，以致恢复基因发生缺失或突变。标记不育植物并且去除所有开的花。剩余的花蕾(bud)装进袋子以确保没有零散的花粉可以对其授粉。另外，破坏鉴定的不育突变体植物周围的所有能育植物。从所有不育植物上收集了嫩叶片和组织。将所述不育突变体用来自B系的花粉授粉。收获来自突变体植物的种子。

表4.种子诱变发生筛选结果

处理	30Gy	60Gy	90Gy	对照
					全部植物	64,307	61,713	45,029	19,989
不育植物	614	558	243	104
					不育/全部(％)	0.95	0.90	0.54	0.52

实施例4.鉴定在第一期重组Raphanus系的Raphanus片段中具有不同缺失的突变体。

冻干和磨碎来自在田地鉴定为突变体的不育植物的叶片样品。提取基因组DNA。DNA提取的方法对于本领域技术人员是已知的。

1415个突变体样品通过使用一组代表性的标记进行PCR来表征，并表征哪些标记得以保留以及哪些标记丢失。所述标记由6个PCR标记组成。一个标记(OPC2)对于本领域技术人员是已知的，而其他的5个标记(RMA07、RMB04、RMB12、RMC32和RME08)在此做了描述。6个标记中的每一个都代表来自第一期重组Raphanus系的基因组片段的不同区域。除了位于邻近Raphanus片段的napus基因组内的RME08，所有的标记都位于第一期重组Raphanus系的Raphanus片段内。保存那些保留至少一个Rf标记的样品，用于进一步分析，去除假的不育突变体(杂种种子中的A系污染)。基于PCR结果，1415个样品中有111个样品对于至少一个标记是阳性的。将这111株不育植物(与B系杂交)的M1(第二代突变体)种子种植在温室中，并且确认不育表型。收集叶片组织并用6个标记通过PCR分析。利用PCR结果和表型数据的联合，鉴定出7个恢复系突变体。使用另外的标记，对称为缺失突变体R1、缺失突变体R2和缺失突变体R5的三个突变体系进一步进行分析并继续进行。

图2显示了称为缺失突变体R1、缺失突变体R2和缺失突变体R5的初期突变体系与第一期重组恢复系NW1717相比的表征。图2列出了与NW1717上的标记相比突变体系上丢失的标记。正如所观察到的，初期的突变体系中发生了显著的缺失，包括包含恢复基因(Rf)的第II组的缺失。由于这些植物对于突变的Raphanus片段是杂合的，所以他们被称为Rf^rf。如实施例5所述，将这些突变体系(丢失恢复基因的)与第一期重组恢复系杂交，以提供用于产生新的重组体的不同材料。新的重组体用于培育具有SRF的第二期重组恢复系，所述SRF包括恢复基因。

实施例5.将突变体R1、突变体R2和突变体R5系与第一期重组恢复系杂交以增强突变的Raphanus片段重组的概率。

杂交程序在下文进行了详细描述，并且表5和图3总结了所有的系谱系。在名为代的栏里，“M”指突变体，“F”指后代或“子代(filialgeneration)”，“F1”指第一子代(杂合的)，“F2”指第二子代(分离的)，“BC”指回交，“DHS”指加倍单倍体种子，“S”指自花授粉种子。5个代表性标记中每一个都具有不同用途。RMA07、RMB12和OPC2分别代表第I、II和III标记组。Y5N是靶向非Rf基因组的专利标记。CMS标记也是专利的并且证实Ogura CMS细胞质的存在。

(i)2001年10月：如上文讨论，用保持系(rfrf)96DHS60给不育突变体(Rf^rf)授粉以产生在Ogura CMS细胞质中是Rf^rf或rfrf的种子。在表5中，这些被称为Rf^1rf、Rf^2rf和Rf^5rf以区别三个突变体R1、R2和R5中的每一个。此部分如表5中的M1F1代所示。

(ii)2002年：将来自三个鉴定的突变体系(突变体R1、突变体R2和突变体R5)的M1F1种子(Rf^rf/rfrf)播种在温室中。通过使用选择的标记(即RMA01-10用于R2和R5；RMC01-33用于R1和R2)进行筛选来鉴定Rf^rf植物，并且用第一期(野生型)重组恢复系(RfRf)给Rf^rf植物授粉以产生在CMS细胞质中具有Rf^Rf和rfRf基因型的种子。这样做有两个原因：(a)在进一步杂交后，获得具有正常细胞质的能育固定突变体基因型(参见下文)，和(b)稀释突变体剂量(每次杂交稀释50％)。一旦Rf^rf植物与野生型(第一期重组恢复系)杂交，所有子代(Rf^Rf和rfRf)就是能育的。这如表5中的M2F1代所示。使用rf特异性标记Y5N筛选能育子代以及去除具有rfRf基因型的植物。然后用Rf^Rf植物给B系96DHS60植物(rfrf)授粉。对于每一次杂交，使用两株雌性植物(在所述3个突变体中的每一个的情况下)和两株雄性植物(第一期重组恢复系NS4304MC)，并且按约200粒种子/堆，将其种子堆在一起。所有的杂交都是在加拿大油菜的正常生长室条件下完成：22℃下16小时光照和18℃下8小时无光。此部分如表5中的M3F1代所示。

在正常(非cms)细胞质中产生纯合的Rf^Rf^系

(iii)如上文所述，在2002年，通过使用rf特异性标记鉴定生长自Rf^Rf/rfRf种子的植物以去除rfRf植物。将Rf^Rf植物与保持系rfrf(作为雌性)杂交，从而将CMS细胞质转化为napus细胞质并且在能育(非CMS)背景中产生Rf^rf和Rfrf基因型。将背景从CMS转化为非CMS的目的是能够自花授粉并且培育固定的Rf^Rf^植物。此部分如表5中的M3F1代所示。

(iv)在2003年，生长自具有napus细胞质的Rf^rf种子的植物自花授粉以产生Rf^Rf^、Rf^rf和rfrf种子。授粉如上文所述实施。此部分参见表5的M3F2代。

将Rf^Rf^系与RfRf系杂交

这些杂交的目的是增强突变体Rf^系的缺失的Raphanus片段与Rf系的第一期重组Raphanus片段之间异常重组(也称为交叉变形(crossoverdistortion))的概率。

(v)在2003年，将生长自具有napus细胞质的Rf^Rf^种子的植物与第一期重组RfRf恢复系(作为雌性)NS4304MC杂交，以产生具有OguraCMS细胞质的100％能育的Rf^Rf种子。该二元杂交可以在细胞中排列Rf^和Rf染色体并且提供在Raphanus片段基因座发生异常染色体交换(也称为交换失真)和使Raphanus片段重组的可能性。具有含有恢复基因的缩短的Raphanus片段的子代可以使用Raphanus片段内的高密度标记来鉴定。此部分如表5中的M4F1代和图3所示。

(vi)在2004年，将来自步骤(v)的Rf^Rf系与雌性的CMS系(rfrf)NS2173FC杂交，以在CMS背景中产生Rf^rf和Rfrf的大种群。与F1自花授粉(F2种群)相比，该新的三元杂交(F1与无关的A系杂交)具有较大的优势，所述优势在于在Rf^Rf植物进行减数分裂时生成新的重组。不受任何特定理论的限制，该三元杂交去除了在鉴定具有新重组的Raphanus片段的子代中的Rf和Rf ^Raphanus染色体干扰，导致鉴定包含恢复基因的新的缩短的Raphanus片段的概率更大。我们的结果表明，通过使用本方法，重组率约为0.1％(1000个中的1个)。如表6所示，如果相同的重组率发生在F1自花授粉种群中，那么1,000,000个子代中有1个将对于新的Raphanus重组是纯合的，并且可以通过标记模式(markerprofiling)鉴定，前提条件是雄性和雌性配子具有相同的重组基因座。如果雄性和雌性配子具有不同的重组基因座，那么在F2种群中几乎不可能鉴定出任何缩短的Raphanus重组。如果将F3种群用于筛选，那么该种群对于分析来说过大，约几百万株植物。

三个大种群，每个都有约4000粒种子，这三个大种群产自三个突变体系即突变体R1、突变体R2和突变体R5中的每一个。理论上，只有Rfrf子代会是能育的。Rf^rf植物是不育的并会被舍弃。所有能育的植物，三个种群中的每一个都约2000株，用一组PCR标记筛选。如果发生交换或重组，那么少数能育植物会丢失一些标记但仍保留恢复基因。这些植物鉴定为具有缩短的Raphanus片段的Rf*rf。此部分如表5中的M5F1代和图3所示。

表6.新的三元杂交与自花授粉之间效率比较

(vii)在2004年，约6000株rfRf植物用多重PCR标记筛选。称为R1439、R1815和R1931的三个具有缩短的Raphanus片段的第二期重组恢复系被鉴定出，与第一期重组恢复系材料NW1717相比，高达50％的Raphanus片段的丢失(参见图2中具体标记描述)。R1815源自突变体R2杂交种群，R1439和R1931源自突变体R5杂交种群。这些植物包含新的重组事件，分别称为R1439、R1815和R1931。

(viii)在2005和2006年，三个系通过育种和加倍单倍体构建来固定，并称为R1439、R1815和R1931。此部分如表5中的M6F2和M6DHS1代所示。

(ix)在2005和2006年，讲三个SRF系还回交5次，产生BC0、BC1、BC2、BC3和BC4系。每次回交使用4株NS1822FC植物作为雌性和4株每种Rf*rf基因型(即R1439、R1815和R1931)作为雄性。种子堆在一起并立刻种植以产生Rf*rf和rfrf植物。不育的rfrf植物被舍弃，只有能育的Rf*rf继续进行下一代回交。除了回交，将BC2和BC4自花授粉，以产生BC2S1(F2)和BC4S1(F2)种子。然后将BC2S1和BC4S1植物自花授粉，以产生固定的BC2S2(F3)和BC4S2(F3)作为育种材料。此部分如表5中的M7BC0至BC4S2代所示，包括M7BC0和BC4S2代。

实施例6第二期重组SRF系的表征

表7比较了第二期重组恢复系的Raphanus片段中的缺失和第一期重组恢复系NW1717的Raphanus片段。据估计，第二期重组恢复系中的Raphanus片段比第一期重组恢复系NW1717中的Raphanus片段短约36％至49％。该估计是基于缺失的标记的数目。例如，在SRF系R1815中，丢失了59个标记中的21个。基于丢失的标记的数目(21/59)，约36％的Raphanus片段缺失(剩余64％的Raphanus片段)。就SRF系R1439来说，丢失了59个标记中的29个。基于丢失的标记的数目(29/59)，约49％的Raphanus片段缺失(剩余51％的Raphanus片段)。图2显示了在SRF系/重组事件R1439、R1815和R1931中缺失的标记和剩余的标记。SRF系的物理图谱(不按比例)见图2。

表7.SRF系中剩余的Raphanus片段

^*通过丢失的标记的数目估计

与缺失突变体R1、R2和R5相比，SRF系更相似于NW1717，因为SRF系包括Raphanus恢复基因。缺失突变体R1、R2和R5缺乏Ogura恢复系并且与NW1717差别很大。缺失突变体的主要功能是引起交叉变形和破坏NW1717中的Raphanus片段以生成SRF系。SRF系保留了更少的不希望的萝卜基因并且预期具有更好的农艺学性能。

表7的第三行总结每个系丢失的标记的数目。第一期重组恢复系NW1717上有59个标记。第二期重组系中丢失的标记数目的范围是21至29。SRF系含有恢复基因并且其通过测试证实恢复了Ogura CMS系的雄性能育性。

图1显示了Ogura恢复片段基因渗入的最初的甘蓝型油菜系(NW3002)、第一期重组商业系(NW1717)和具有缩短的Raphanus片段的第二期重组恢复系(SRF lines)之间的关系。正如所观察到的，Raphanus片段上发生了显著的缺失。最初的系(在此由NW3002代表)含有恢复基因座和高硫代葡萄糖苷基因座。商业上使用的第一期重组恢复系(在此由NW1717代表)含有比NW3002小得多的Raphanus片段。高硫代葡萄糖苷基因座在第一期重组恢复系中是缺失的。第二期重组恢复系含有比NW1717短得多的Raphanus片段，但仍保留恢复基因。第二期重组恢复系具有更好的农艺学性能，下文将要讨论的。OPC2和E38M60标记可以将第一期重组和第二期重组Raphanus片段清晰地区分开。E38M60标记见于NW1717和第二期重组恢复系。OPC2标记见于NW1717，但不在第二期重组恢复系中。如图2所示的其他标记可以用于区分3个SRF系和第一期重组系，以及将3个SRF系互相区分开。例如，一组标记，RMC09至RMC23，包括RMC09和RMC23，可以将3个SRF系互相区分开。R1439丢失了含有很多第III组的标记和所有第I组标记的DNA序列。其侧翼是RMB01和RMC23，但是缺少RMC09至RMC16，包括RMC09和RMC16。R1815丢失了含有RMC24至RMC33的标记和所有第I组标记的DNA序列。其侧翼是RMB01和RMC23。最后，R1931丢失了含有第I组标记和第III组的RMC17至RMC23的标记的DNA序列。其侧翼是RMB01和RMC16。

表8显示了本发明的第二期重组芸苔属Ogura恢复系与竞争者的系(INRA R2000、INRA R211和INRA R113)的比较。通过本文公开的新的育种方法所产生的新的重组恢复系具有比竞争者的系的Raphanus片段更短的Raphanus片段。本文公开的产生这些系的新的育种方法证明是非常成功的。

表8.选择的Ogura恢复系材料之间的关键的Rf标记谱

本文教导的新的育种方法可以用于除了缩减Raphanus片段大小以外的目的。当将包含一个或多个目的基因的外源插入物引入种质中，并且有人希望缩减所述外源插入物大小，但保留目的一个或多个基因的时候，可以使用该方法。此外，所述新的育种方法不限于芸苔属种类，而可以用于任何种类，包括小麦、玉米、大豆、苜蓿和其他植物。在很多情况下，育种者会发现使用本领域技术人员已知的技术将外源插入物引入优良种质是有用的。例如，外源插入物可以通过以下方法引入：杂交、人工染色体的转化、核注射、原生质体融合和其他本领域技术人员已知的方法。例如，抗虫性和抗病性基因通常通过与优良植物种质远缘杂交传递。另外，例如抗旱性、耐热性、落粒性和谷物质量(种子成分)的农艺学性状也可以通过种间杂交传递。

但是多数情况下，育种者会发现伴随一个或多个目的基因，引入了影响其他性状的“多余的”遗传材料。多余的遗传材料本质上有两个问题。第一，多余的遗传材料可以携带不希望的基因。例如，最初的Raphanus插入物包括赋予高硫代葡萄糖苷性状的基因。第二，所述多余的遗传材料可以导致减数分裂的问题，因为由于外源插入物染色体不能正确排列。这可以导致能育性问题以及更差的农艺学活力，正如在最初的Raphanus材料中所观察到的。因此，一旦育种者将外源插入物引入优良种质，他们往往会花费数年“削减(chipping away at)”外源插入物以缩减其大小，同时筛选一个或多个目的基因。习惯上，这是通过与优质系连续地杂交来进行，以期望外源插入物可以缩减。但是，问题是优良种质中没有同源序列可以与外源插入物重组，所以这既消耗时间又没有效率。

本文所述的新的育种方法通过产生包含优良种质和外源插入物的系(即缺失突变体)克服了这个问题，在所述外源插入物中，一个或多个目的基因已发生缺失。将缺失突变体与含有外源插入物的最初的种质杂交。因为缺失突变体仍然含有部分外源插入物，所以其可以与最初的插入物排列并诱导基因重组。本质上，该新的育种方法提供了可以与最初的外源插入物容易地重组的系。该新的育种方法在实施例中就缩减Raphanus片段进行了详细描述，但是正如上文所讨论的，本方法可以用于优良进入种质中的外源插入物的大小需要缩减的任何情况。该新的育种方法用以下步骤做了总结，并作为连续图显示在图4中。为了清晰，外源插入物以“E”表示，外源缺失以“E^”表示，重组的缩短的外源插入物以“E*”表示，所有无效(null)染色体(即不具有外源插入物)以“e”表示：

(i)理解外源插入物和外源插入物周围的区域是非常有用的。这可以通过包围和包括外源插入物的基因组区的遗传图谱、序列信息、分子标记图谱和/或本领域技术人员已知的其他方法来进行。高密度标记图谱会促进更短的重组外源插入物的鉴定。

(ii)下一步骤是在杂合系中优选地产生缺失突变体，其中所述系对于外源插入物是杂合的(Ee)→(E^e)。缺失突变体是一个或多个目的基因从基因组中缺失，但是某些外源插入物仍然存在的突变体。通过使用杂合系，可以比使用纯合系更容易地鉴定缺失突变体，因为缺失突变体的表型不会被同源基因座所掩盖。缺失突变体可以通过与无效系(null line，ee)杂交一次或多次来保持、稳定和重新确认。

(iii)下一步骤是将缺失突变体(E^e)与对于外源插入物(EE)是纯合的系杂交，以产生(E^E)和(eE)种子，随后鉴定出那些含有缺失(E^E)的系。(E^E)的鉴定可以通过使用步骤(i)中所鉴定的标记筛选基因组来进行。例如，标记可以对无效系(ee)是特异性的。可选地，可以将E^E和eE自花授粉，使用子代分离来鉴定E^E植物，其中，在E^E植物的子代中可以不存在ee基因型。任选地，首先将E^e缺失突变体自花授粉(假设除了能育性以外的性状)，选择E^E^植物，并将E^E^与EE杂交，这样所有的后代都是E^E。

(iv)任选地，增加(E^E)植物以获得用于授粉目的的足够数量。这可以通过以下进行：(a)将(E^E)自花授粉以产生(E^E^)、(E^E)和(EE)种子，随后(b)将(E^E^)和(EE)异花授粉以产生很多(E^E)植物。在本发明中，进行此步骤是为了将细胞质从CMS转变为正常的细胞质。如果不需要此步骤，可以直接进行步骤(v)，因为理论上只需要一株(E^E)植物。

(v)下一步骤是将(E^E)与无效系(ee)杂交以产生大的F1种群，高达数千粒种子。在减数分裂过程中，(E^E)系中的外源插入物经历重组，这样至少一些配子包含重组的、包括一个或多个目的基因的外源插入物，但是显著短于E。较短的重组外源插入物以E*表示。重组率取决于植物种类、外源插入物的大小、缺失突变体的大小和特征以及其他因素。Raphanus片段的重组率发现约为0.1％。子代(E^e)、(Ee)和(E*e)用分子标记筛选，以鉴定已经重组的外源插入物(E*e)。通过与无效系(ee)连续回交，表达了E*表型。所述表型可以通过依赖于目的基因或性状的测量来验证。尽管不受任何理论限制，但是外源插入物和缺失突变体之间的高度同源性可以导致更大的交换概率。

通过采用新的育种方法，技术人员可以减小外源插入物的大小，同时保持目的基因。如上文讨论，这可以用任何种类以及任何外源插入物来进行。

另外，本方法可以重复，直到外源插入物缺失到可接受的长度。例如，含有缩短的片段(E*E*)的系可以与缺失突变体(E^E^)杂交以产生E*E^系。然后这些系可以与无效系(ee)杂交以允许外源插入物重组。可以筛选子代(E*e、E^e和E**e)，用于进一步减小外源片段。E**表示保留了一个或多个目的基因的外源片段进一步减小。

实施例7.与保持系继续回交以产生BC2、BC3、BC4、BC2S2和BC4S2代，并且将SRF系转化为具有正常保持系和恢复系背景的育种材料。

所有的回交和自花授粉在温室里、在相同的上述条件下完成。种植了BC1种子并且BC1种子显示出正常的遗传分离。因为混合的基因型(Rf*rf/rfrf)，50％的BC1植物是能育的，其他50％的植物是不育的。选择四株能育的BC1植物(Rf*rf)作为雄性，与雌性系NS1822FC(雄性不育A系)杂交以产生BC2种子，所述NS1822FC与保持系具有相同的核，但是具有雄性不育细胞质。将大量的BC2种子利用相同方式发展(advanced)，以产生BC3和BC4种子。每一代回交显示出正常的育性分离，50％能育和50％不育(表10)。将选择的能育BC2和BC4植物Rf*rf自花授粉，分别生成BC2S1和BC4S1(F2)种子。种植BC2S1和BC4S1种子并且观察分离(表11)。鉴定纯合的BC2S1和BC4S1植物并且将其自花授粉以产生固定的BC2S2和BC4S2种子。表5列出了产生SRF系的系谱系的总结。此部分如表5中的M6F2至BC4S2代所示，包括M6F2和BC4S2代。育种的结果是培育出三个具有包含缩短的Raphanus片段的纯合基因座的新的系(Rf¹⁴³⁹Rf¹⁴³⁹、Rf¹⁸¹⁵Rf¹⁸¹⁵和Rf¹⁹³¹Rf¹⁹³¹)。表9是实现SRF恢复系培育的按时间发生顺序排列的事件的总结。

实施例8.与第一期重组系相比SRF系中提高的能育率的初步数据

来自温室栽培植物的初步结果表明，SRF系经历了正常的恢复性状的孟德尔式分离并且与第一期恢复系相比能够更好地使Ogura CMS植物恢复能育性。表10总结了除了BC2的所有回交代的回交数据，BC2的数据没有收集。将SRF系与CMS系回交。实验的细节见上文，特别是实施例7中。SRF系R1439、R1815和R1931的回交种群分别得到了47％、45％和52％的能育子代。该数据与50％的理论数值非常接近。表11总结了三个SRF系的BC4S1(F2)分离及NW1717来源的平行比较。R1439和R1815显示出正常的F2分离。也就是说，四分之一的F2子代rfrf是不育的。二分之一是杂合能育的rfRf*以及四分之一是纯合能育的Rf*Rf*。R1931是例外，其显示出比理论比率更高的杂合能育子代和更低的纯合能育子代。

表10.SRF系回交数据总结

表11.SRF系的BC4S1(F2)种群分离总结

实施例9.使用SRF系的胚胎发生的初步数据

用三个SRF系的F2种群作为供体植物，通过加倍单倍体(DH)产生来固定SRF系。小孢子胚胎发生中使用的加拿大春油菜DH方案详述于Swanson，Eric B.，第17章，第159页，其在Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)第6卷，Jeffrey W编辑的Plant Cell and TissueCulture(植物细胞和组织培养)中(Swanson，Eric B.，Chapter 17，p.159 inMethods in Molecular Biology，vol.6，Plant Cell and Tissue Culture，Ed.Jeffrey W.)。将三个F2种群即05SM194、05SM197和05SM198在正常的加拿大油菜生长条件下栽培在温室中，每个种群32株植物。开花时，随机选择10株能育植物作为DH供体植物。能育植物具有两个基因型：rfRf*和Rf*Rf*。10株供体植物没有用分子标记进行基因分型，但是平均起来应该是由3株Rf*Rf*植物(1/3)和7株rfRf*植物(2/3)组成。将来自10株供体植物的花蕾堆在一起并且作为用于DH产生的初始小孢子来源。将DH子代栽培在相同的温室条件下，直到开花。记录它们的表型(能育性)并总结在表12中。能育子代具有Rf*Rf*基因型，不育子代具有rfrf。在三个SRF系中观察到大量差别。R1439和R1931在DH产生中具有良好的胚胎发生，分别是47％和38％能育子代，而R1815具有差的胚胎发生，约1％能育子代。

表12.SRF系的DH固定总结

实施例10.SRF系的农艺学性状和质量性状的第一年数据

在2007年，来自三组七次杂交的F3子代种植在位于安大略贝尔泉(Belfountain，Ontario)的恢复系育种区(breeding nursery)中，其中每次杂交分别用R1439、R1815或R1931作为一个SRF亲本以及用不同的育种系或商业品种作为另一亲本。编号1、20、40、60等的排种植了46A65-为质量目的选择的商业加拿大油菜品种。将每个F3和46A65对照的大约100粒种子种植在3米长的排中，间隔50cm。在生理成熟期，每次杂交的F3系凭视觉选择优秀的活力、一致性、早熟性，并且稍后收获所选择的系，获得15g自由授粉的种子样品，用于质量分析。还收获每排质量对照，获得相同量的种子，用于质量比较。通过对每个SRF系与其两边最近的两排对照进行比较，实施对于油、蛋白质和总硫代葡萄糖苷的选择。在育种方案中，发展比最近的两个对照具有更高的油、更高的蛋白质和更低的总硫代葡萄糖苷的F3系。表13总结了质量分析结果。基于全部收获的来自七次杂交的系的全部平均值，SRF系比商业对照46A65具有更低的总硫代葡萄糖苷。

表13.收集自2007年育种区的种子样品的质量分析结果，育种区涉及来自三组杂交的F3系，每组杂交都涉及SRF来源

^*Pioneer培育的OP(自由授粉)加拿大油菜商业品种

^**完整的种子中蛋白质含量

选择3个SRF来源的每一个作为供体亲本，并且选择Pioneer专利的非商业育种系NS1822BC作为循环亲本以开始三个不同的回交系列。将BC2植物连续自花授粉两次以产生BC2S2。通过标记分析鉴定几个恢复基因的BC2S2纯合植物，并且每个系列内大批收获。三批BC2S2在三个涉及来自Pioneer的常见OGU CMS近交系的杂种中成为父本。产生这些杂种所用的三个雄性系预期具有87.5％的遗传相似性，因为它们都是BC2后代。

所述杂种在种植于加拿大西部7个地点的非重复、不完全区组设计实验(un-replicated incomplete block design experiment)中进行评价。由于恶劣天气失去了这些地点中的两个。从剩余的5个地点中收集数据。每一小块地按排长6米、排间隔17cm种植。记录了产量(q/ha)、农艺学性状例如到开花的天数(排里50％的植物具有至少一朵花)、到成熟的天数(从种植到总状花序(raceme)底部(1/3)上的豆荚内的种子颜色从绿色变为褐色或黑色的天数)、早期活力(1＝差，9＝极好)、植物高度(cm)、抗倒伏性(1＝差，9＝极好)和质量性状例如油含量百分比、蛋白质含量百分比、总硫代葡萄糖苷和总饱和脂肪酸(表14)。与基于NW1717来源的商业杂种45H26相比，基于SRF的恢复系产生对于所有性状都有竞争力的杂种。

表14.来自2007田间试验的基于SRF的杂种的农艺学性状和质量性状

^*Pioneer培育的基于NW1717的杂种加拿大油菜商业品种

^**粕中蛋白质含量

油含量百分比是用油的重量除以含水量为0％的种子的重量来计算。测定成熟完整干燥种子中油的典型重量百分比是通过基于“AOCSOfficial Method Am 2-92 Oil content in Oilseeds(美国石油化学家学会官方方法Am 2-92含油种子中的油含量)”的方法。用脉冲NMR“ISO10565：1993 Oilseeds Simultaneous determination of oil and water--PulsedNMR method(含油种子油和水同步测定--脉冲NMR方法)”或NIR(NearInfra Red spectroscopy，近红外光谱)(Williams，(1975)“Application of NearInfrared Reflectance Spectroscopy to Analysis of Cereal Grains and Oilseeds(谷类作物和含油种子分析中近红外反射光谱的应用)”，Cereal Chem.，52：561-576，在此通过引用并入)进行分析是可接受的方法，并且数据可以用于加拿大注册(Canadian registration)，只要所述仪器由加拿大谷类研究实验室(Grain Research Laboratory of Canada)校准和证明。也可以使用本领域技术人员已知的其他方法。

测定成熟完整干燥种子无油粕中蛋白的典型质重量百分比是通过基于“AOCS Official Method Ba 4e-93 Combustion Method for theDetermination of Crude Protein(美国石油化学家学会官方方法Ba 4e-93用于粗蛋白测定的燃烧法)”的方法。蛋白质可以使用NIR(Near Infra Redspectroscopy，近红外光谱)(Williams，(1975)“Application of Near InfraredReflectance Spectroscopy to Analysis of Cereal Grains and Oilseeds(谷类作物和含油种子分析中近红外反射光谱的应用)”，Cereal Chem.，52：561-576，在此通过引用并入)进行分析。数据可以用于加拿大注册，只要所述仪器由加拿大谷类研究实验室校准和证明。也可以使用本领域技术人员已知的其他方法。

硫代葡萄糖苷含量表示为含水量8.5％时的微摩尔每克的形式。含水量8.5％的种子的总硫代葡萄糖苷是使用基于“AOCS Official MethodAK-1-92(93)(Determination of glucosinolates content in rapeseed-colza byHPLC)”(“美国石油化学家学会官方方法AK-1-92(93)(通过HPLC油菜籽中硫代葡萄糖苷含量的测定)”的方法进行测量；在此通过引用并入。NIR数据可以用于加拿大注册，只要所述仪器由加拿大谷类研究实验室校准和证明。

总饱和脂肪酸百分比是每个单独的饱和脂肪酸相对于总油的百分比之和(例如％C12:0+％C14:0+％C16:0+％C18:0+％C20:0+％C22:0+％C24:0)。测定了成熟完整干燥种子的内源性形成的油中存在的脂肪酸的典型重量百分比。在该测定过程中，将种子压碎，与甲醇和甲醇钠反应后，种子以脂肪酸甲基酯的形式提取。然后，得到的酯通过气液色谱使用毛细管柱分析脂肪酸含量，所述毛细管柱允许基于不饱和度和脂肪酸链长度分离。该方法描述于Daun，et al.，(1983)J.Amer.Oil Chem.Soc.，60：1751-1754的工作中，在此通过引用将其并入。

R1439、R1815和R1931是含有第二代缩短的Raphanus片段的植物/重组事件的实例。这些植物可以用于产生新的恢复系、产生近交系和/或产生产生杂种系。另外，来自新系的任何植物部分，或新系的后代或子代，包括但不限于种子、细胞、花粉、胚珠、核酸序列、组织、根、叶、小孢子、营养部分，无论是成熟的还是胚的，都包括在本发明的范围内。植物细胞、原生质体和小孢子以及其他植物部分，可以通过本领域技术人员已知的细胞和组织培养方法来分离。包含称为R1439、R1815或R1931的新的重组事件的任何植物细胞，都包括在本发明的范围内。

进一步缩短Raphanus片段R1439、R1815和R1931是含有第二代缩短的Raphanus片段的植物的实例。这些植物可以用于通过将其与缺失突变体系R1、R2和R5(或其他缺失突变体系)杂交并且再次重复该过程来进一步缩短Raphanus片段。此过程可以重复实施，直到将Raphanus片段缩减小与任何不希望的基因或性状无关的长度。

产生新的恢复系本发明的第二期重组芸苔属Ogura恢复系可以用于通过与商业恢复系杂交并且选择缩短的Raphanus片段来产生新的恢复系。此外，遵循本发明的方法，可以重新产生新的恢复系。另外，加倍单倍体产生也可以用于产生固定的SRF恢复系。产生芸苔属中加倍单倍体的方法对与本领域技术人员是已知的。参见，例如Beversdorf，et al.，(1987)“The utilization of microspore culture and microspore-deriveddoubled-haploids in a rapeseeds(Brassica napus)breeding program(油菜籽(甘蓝型油菜)育种方案中小孢子培养和衍生于小孢子的加倍单倍体的利用)”-In Proc.7th Int.Rapeseeds Conf，(Organizing Committee，ed(组织委员会编辑))，pp.13.Poznan，Poland；Swanson，“Microspore Culture inBrassica”.Chapter 17，Methods in Molecular Biology，Vol.6，P 159-169，Plant Cell and Tissue Culture，Edited by Pollard and Walker by The HumanaPress(1990)(Swanson，“芸苔属的小孢子培养”，第17章，其在分子生物学中的方法，第6卷，第159-169页，由Pollard和Walker编辑，The HumanaPress(1990)出版的植物细胞和组织培养中)，在此通过引用将以上并入。

使用恢复系产生近交植物本发明的第二期重组芸苔属Ogura恢复系可以使用已知技术用于近交。芸苔属植物的纯合恢复基因可以通过芸苔属植物的重复回交引入芸苔属近交系。例如，得到的含油种子可以按照常规芸苔属栽培方法进行种植，自花授粉后，在其上形成了芸苔属含油种子。得到的含油种子可以再次种植，自花授粉后，在其上形成了下一代芸苔属含油种子。该系的初期培育(芸苔属含油种子的最初几代)优选在温室中进行，其中要仔细控制和监测授粉。这样，可以验证随后用于田间试验的芸苔属含油种子的硫代葡萄糖苷含量。在随后的代中，芸苔属含油种子的种植优选在田间试验中实施。收获作为在目前或随后的代中自花授粉的结果而形成的另外的芸苔属含油种子，并且使用本领域技术人员已知的的技术对所需要的性状进行分析。

使用新的第二期重组恢复系作为父本产生杂种植物-本发明使植物育种者能够将细胞质雄性不育的Ogura恢复系的所需性质合并入商业所需芸苔属杂种品种。使用已知的技术，芸苔属植物可以由本发明的Ogura恢复系再生。例如，得到的含油种子可以按照常规的芸苔属栽培方法进行种植，异花授粉后，在母本上形成芸苔属含油种子。芸苔属含油种子的种植可以在温室或田间试验中实施。收获作为在目前代中此类异花授粉的结果而形成的另外的芸苔属含油种子，并且对所需要的性状进行分析。甘蓝型油菜、芜菁和芥菜是可以使用已知技术用于本发明的芸苔属种类。

所述杂种可以是使用本发明的恢复系的单交种、双交种(double-crosshybrid)、三元杂交种(three-way cross hybrid)、组合杂种(composite hybrid)、混合杂种(blended hybrid)、完全恢复的杂种和本领域技术人员已知的任何其他杂种或合成的品种。

在产生杂种植物的过程中，关键的是，与Ogura恢复系(P2)杂交育种的母本(P1)所具有的硫代葡萄糖苷水平足够低，确保F1杂种的种子所具有的硫代葡萄糖苷水平处于调节水平内。从F1杂种收获的种子的硫代葡萄糖苷水平粗略地为母本(P1)和父本(P2)硫代葡萄糖苷水平的平均值。杂种谷物(F2)的硫代葡萄糖苷水平反映了F1杂种的基因型。例如，如果目的是获得硫代葡萄糖苷水平低于20μmol/g的杂种谷物(F2)并且父本(Ogura恢复系)的硫代葡萄糖苷水平为15μmol/g，那么母本的硫代葡萄糖苷水平必须低于25μmol/g。

由植物部分产生植物芸苔属植物可以使用已知技术从本发明的恢复系芸苔属植物的植物部分再生。例如，得到的含油种子可以按照常规的芸苔属栽培方法进行种植，自花授粉后，在其上形成芸苔属含油种子。可选地，可以提取加倍单倍体小植物立即形成纯合植物，这是本领域技术人员已知的。

蔬菜粕(vegetable meal)-按照本发明，芸苔属含油种子的可食用的内生蔬菜粕所含有的硫代葡萄糖苷水平，不高于种子的30μmol/g，极为必要。可以用于对芸苔属植物育种以产生含有用于硫代葡萄糖苷性状的所需遗传决定子(genetic determinant)的含油种子芸苔属种质的母本，是已知的并且是公众可获得的。例如，用于此性状的芸苔属种质在北美自从20世纪70年代中期就是可用的。

包括用于表达低硫代葡萄糖苷含量的遗传手段(genetic means)且在欧洲可商购获得的代表性冬油菜品种例如包括，EUROL

，(可从SemencesCargill获得)、TAPIDOR

、SAMOURAI

(可从Ringot获得)。更多的近期冬油菜品种包括46W10、46W14、46W09、46W31、45D01和45D03(可从Pioneer

获得)。包括用于表达低硫代葡萄糖苷含量的遗传手段且在加拿大可商购获得的代表性春油菜品种例如包括KRISTINA

(可从SvalofWeibull获得)。最近，46A76(可从Proven

获得)和46A65(可从Pioneer获得)是可用的。

第二期重组Ogura恢复系保藏于National Collections of Industrial，Marine and Food Bacteria NCIMB Ltd，Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen，AB21 9YA.Scotland，UK。所述保藏的种子包括恢复系R1439(登录号NCIMB 41510)、R1815(登录号NCIMB 41511)和下文讨论的R1931(登录号NCIMB 41512)

芸苔属含油种子的可食的内源性蔬菜油，含有脂肪酸和遗传手段所控制的其他性状(参见Pioneer Hi-Bred International，Inc.的美国专利申请，题目为“Improved Oilseeds Brassica Bearing An Endogenous Oil Whereinthe Levels of Oleic，Alpha-Linolenic and Saturated Fatty Acids AreSimultaneously Provided In An Atypical Highly Beneficial Distribution ViaGenetic Control(具有内生油的改良的含油种子芸苔属其中通过遗传控制油酸、α-亚麻酸和饱和脂肪酸在非典型高度有益分布中同时提供)”，W091/15578；和美国专利第5,387,758号，在此通过引用并入)。优选地，基于总脂肪酸含量，按重量计，所述芸苔属含油种子的芥酸是以不高于2％的低浓度包括在内，该低浓度受到遗传手段联合指定的其他所述组分的控制。表达此类芥酸性状的遗传手段可以来自具有良好农艺学特性的商购获得的加拿大油菜品种，例如46A05、46A65、BOUNTY、CYCLONE、DELTA

、EBONY

、GARRISON

、IMPACT

、LEGACY

、LEGEND

、PROFIT

和QUANTUM

。这些品种中的每一个都在加拿大注册并且在加拿大可商购买获得。

除草剂抗性-正如本领域技术人员所知，使用本发明培育是用于Ogura细胞质雄性不育的育性恢复系的、产生具有低硫代葡萄糖苷含量的含油种子的以及具有其他所需性状的芸苔属植物，是可能的。商业上所需的其他性状是，降低芸苔属作物生产成本或能够提高芸苔属作物质量的性状。例如除草剂抗性就是所需的性状。

本领域技术人员可以使用本发明的芸苔属植物来培育是这样的芸苔属植物，即其是用于Ogura细胞质雄性不育的育性恢复系的、产生具有低硫代葡萄糖苷含量的含油种子，以及抵抗一种或多种除草剂。除草剂抗性可以包括例如，除草剂草甘膦抗性，草甘膦由Monsanto^TM销售，商标为ROUNDUP^TM。草甘膦是极其普遍的除草剂，因为其只在植物的生长部分中积累并且具有很小的或不具有土壤残留。

在加拿大油菜中，有两个基因参与草甘膦抗性。一个是用于使该除草剂解毒的酶：该酶称为GOX，草甘膦氧化还原酶。另一个是突变体靶基因，EPSP合酶的突变体形式。本领域技术人员可以在加拿大油菜中使用带有启动子的GOX或CP4(来自农杆菌(Agrobacterium sp)CP4的5-烯醇-丙酮酸莽草酸-3-磷酸盐合酶(CP4 EPSPS))。基本上，将所述基因引入到植物细胞，例如携带用于Ogura细胞质雄性不育的恢复基因的本发明的植物细胞，然后使所述植物细胞生长为芸苔属植物。

作为另一个实例，本领域技术人员可以使用本发明的芸苔属植物来培育这样的芸苔属植物，即其是用于Ogura细胞质雄性不育的育性恢复系、产生具有低硫代葡萄糖苷含量的含油种子，以及抵抗咪唑啉酮除草剂家族，咪唑啉酮除草剂由BASF销售，商标为CLEARFIELD。咪唑啉酮类抗性由乙酰羟酸合成酶(AHAS)基因，也称为乙酰乳酸合成酶(ALS)赋予。本领域技术人员可以将存在于例如Pioneer^TM加拿大春油菜品种45A71等品种中的AHAS的突变体形式引入也携带缩短的Raphanus片段的芸苔属植物中，所述Raphanus片段含有用于Ogura细胞质的恢复基因。可选地，可以通过一些方法中的任何方法将带有合适启动子的AHAS基因的修饰形式引入加拿大油菜植物细胞。基本上，将所述基因引入植物细胞，例如携带用于Ogura细胞质雄性不育的恢复基因的本发明的植物细胞，然后使所述植物细胞生长为芸苔属植物。

如果需要，可以将除草剂耐性的遗传手段任选地并入本发明的油菜植物，当所除草剂能够以破坏缺乏所述遗传手段的油菜植物的速率使用时，如共同转让的美国专利第5,387,758号中所述，在此通过引用将其并入。草甘膦抗性可以由草甘膦N-乙酰转移酶(GAT)基因赋予，参见例如WO2002/36782或WO2005/012515；美国专利申请公开第2004/0082770号、第2005/0246798号、第2006/0200874号、第2006/0191033号、第2006/0218663号和第2007/0004912号；以及加拿大专利申请第2,521,284号和第2,425,956号，在此通过引用将以上并入。

育种技术已经发现，本文所述的所需性状的组合一旦建立，就可以通过涉及异花授粉和子代选择的常规植物育种技术，将其转移到相同的甘蓝型油菜、芜菁或芥菜种类内的其他植物中。

此外，所述需的性状一旦建立，就可以使用涉及花粉传递和选择的相同的常规植物育种技术，将其在napus、campestris或juncea种类之间转移。利用标准植物育种技术，芸苔属种类之间性状的转移，例如napus和campestris，在技术文献中记载(参见，例如Tsunada，et al.，“BrassicaCrops and Wild Alleles Biology and Breeding(芸苔属作物和野生等位基因生物学和育种).”Japan Scientifc Press，Tokyo(1980))。

作为本文所述的所需性状从napus到campestris转移的实例，可以选择可商购获得的campestris品种，例如REWARD

、GOLDRUSH

和KLONDIKE

，并且实施与例如下文讨论的(即R1439、R1815和R1931)来自napus育种系的合适的植物进行种间杂交。可选地，其他napus育种系可以使用已知技术可靠地且独立地培育。种间杂交后，将F1代的成员自花授粉以产生F2含油种子。然后对单独F2植物进行所需性状的选择，所述F2植物然后与campestris亲本进行回交，回交到获得表现出需要的性状组合的整倍体(n＝10)campestris系所需的代数。

为了避免伴随芜菁近交的近交衰退(例如活力和能育性的丢失)，可以有利地使表现出相似的所需性状同时在遗传控制下的选择的植物即BC1植物同胞交配。从这些杂交中得到的含油种子可以称为BC1SIB1含油种子。因此，所需等位基因的固定可以以与自花授粉相似的方式实现，同时使可能表现出对活力和能育性的负面影响的其他等位基因的固定最小化。

低硫代葡萄糖苷含量和低芥酸含量的代表性的芥菜品种是商业品种45J10，其中所需要的性状可以相似地转移到所述芥菜品种中。

植物群(stand of plants)本发明的含油种子芸苔属植物优选地以基本上一致的植物群提供。本发明的芸苔属含油种子优选地以基本上均质的含油种子的集合提供。

本发明改良的含油种子芸苔属植物能够在商业规模含油种子生产时通常所采用的常规含油种子芸苔属生长条件下在田间生产。因此，本发明包括栽培芸苔属植物的方法，其包括：播种称为R1439、R1815或R1931并且NCIMB登录号分别为41510、41511和41512的种子，其后代(例如有性子代或后代)、营养插枝(vegetable cutting)或无性繁殖体或者将R1439、R1815或R1931与另一植物杂交所产生的植物；在芸苔属生长条件下栽培所得到的植物。此类含油种子芸苔属表现令人满意的农艺学特征并且能够通过自花授粉形成在其中存在的粕中具有商业上可接受的硫代葡萄糖苷水平的含油种子。此外，本申请人的教导包括压碎的具有SRF的系芸苔属种子的集合、该系的后代及其子代和来自这些系的油和粕。油的生产可以通过：压碎称为R1439、R1815或R1931的植物系或其后代、亚系所产生的种子或者来自将R1439、R1815或R1931与另一植物杂交所产生的植物的种子；并且从所述种子中提取油。本方法还可以包括对油进行精炼、漂白和脱臭的步骤。

保藏

本发明的种子保藏于the National Collections of Industrial，Marine andFood Bacteria Ltd(NCIMB)，Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen，AB21 9YA Scotland，UK。

所有出版物、专利和专利申请在此以引用的方式整体并入，该引用的程度就如同每个单独的出版物、专利或专利申请特定地及单独地表明以引用的方式整体并入一样。

结合优选的具体实施方案，详细地描述了本发明；但是，应当理解到，对于本领域普通技术人员而言，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行改变。

Claims

1.产生包含用于Ogura细胞质雄性不育的育性基因的芸苔属(Brassica)植物的方法，包括向所述芸苔属植物基因中渗入Raphanus片段，其中所述育性基因位于从萝卜(Raphanus sativa)基因渗入的Raphanus片段上，并且所述Raphanus片段缺乏以下标记：RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、RMA10、RMC17、RMC18、RMC19、RMC20、RMC21、RMC22、RMC23、RMC24、OPC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32和RMC33。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述Raphanus片段包含选自以下的分子标记：RMB01、E35M62、RMB02、RMB03、RMB04、RMB05、RMB06、RMB07、RMB08、RMB09、RMB10、OPF10、RMB11、RMB12、RMC01、RMC02、RMC03、E38M60、RMC04、RMC05、RMC06、RMC07、RMC08、RMC09、RMC10、RMC11、RMC12、RMC13、RMC14、RMC15和RMC16。

3.产生植物的方法，包括从通过权利要求1或2所述的方法产生的芸苔属植物产生后代或通过将通过权利要求1或2所述的方法产生的芸苔属植物与另一植物杂交产生后代，所述通过权利要求1或2所述的方法产生的芸苔属植物的代表性种子已经进行了保藏，NCIMB登录号为41512。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述后代包含缺乏选自以下的标记的Raphanus片段：RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、RMA10、RMC17、RMC18、RMC19、RMC20、RMC21、RMC22、RMC23、RMC24、OPC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32和RMC33。

5.产生植物的方法，包括使用通过权利要求1所述的方法产生的植物产生近交芸苔属植物。

6.产生植物的方法，包括使用通过权利要求1所述的方法产生的植物产生杂种芸苔属植物。

7.产生植物种子的方法，包括从通过权利要求1所述的方法产生的芸苔属植物产生芸苔属种子。

8.产生植物细胞的方法，包括从通过权利要求1所述的方法产生的芸苔属植物产生植物细胞。

9.产生植物部分的方法，包括从通过权利要求1所述的方法产生的芸苔属植物产生植物部分。

10.产生压碎的芸苔属种子的集合的方法，包括将通过权利要求7所述的方法产生的芸苔属种子压碎。

11.生产油的方法，包括：

(i)压碎称为R1931且NCIMB登录号为41512的植物系所产生的种子，或者R1931的后代所产生的种子或者通过将R1931与另一芸苔属植物杂交产生的植物所产生的种子；并且

(ii)从所述种子中提取油。

12.通过权利要求1中所述的方法产生的植物在芸苔属系育种中的用途。

13.如权利要求12所述的用途，其中所述育种选自：常规育种、系谱育种、杂交、自花授粉、加倍单倍体、单粒传法、回交和通过遗传转化育种。

14.产生植物的方法，包括在芸苔属植物中产生重组事件R1931。