CN102066400A

CN102066400A - 通过结晶选择性分离肽和蛋白质的方法

Info

Publication number: CN102066400A
Application number: CN200980123800XA
Authority: CN
Inventors: J.考林; D.哈夫科斯特; H-J.亨兹勒
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2008-06-23
Filing date: 2009-06-16
Publication date: 2011-05-18
Also published as: US20110130542A1; WO2009156073A1; EP2291389A1; DE102008029401A1

Abstract

本发明涉及用于借助于受控结晶从溶液中沉积和/或选择性分离肽和蛋白质的方法。

Description

通过结晶选择性分离肽和蛋白质的方法

本发明涉及用于结晶肽和蛋白质的方法。

用于沉积(Abscheidung)和分离肽或蛋白质的方法在例如从细菌细胞培养或动物细胞培养的身体组织中分离肽和蛋白质中具有重要的作用。在蛋白质的临床使用领域中，仅有几种工业方法（例如用于溶菌酶、胰岛素、Trasylol^®），其中作为分批法进行沉积并通过离心或过滤进行随后蛋白质的分离。

对于许多应用能够显示出在其中在单个搅拌反应器中进行沉淀剂的添加和/或温度的改变以沉积肽/蛋白质以及其本身的沉积和颗粒生长的常规间歇式反应器对于沉积肽和蛋白质不是优选的。原因是由于混合不充分而导致的不均匀性。由于混合不充分导致溶液的过饱和导致产品品质的降低。另一方面，对强化混合有限制，因为混合太剧烈能够导致在沉积的蛋白质/肽上的机械应力过高。可能破坏蛋白质/肽。

用均匀的粒度和纯颗粒提高了可分离性和产率。具有均匀粒度分布的小颗粒特别对于制备药物是必需的。

出于上述原因，在间歇式反应器中，通过使仅一种蛋白质/肽选择性分离而将各种蛋白质/肽彼此分离也是困难的。

因此，目的是提供用于沉积和/或分离肽和蛋白质的方法，其能够对多种应用设定受控条件以得到高产率、高纯度和具有尽可能窄分布的特定粒度。

令人惊奇地发现能通过受控结晶而沉积蛋白质/肽实现了该目的，其中该肽/蛋白质溶液与结晶剂的混合和/或在通过冷却/温热进行结晶时任选地冷却/温热和实际结晶在空间上彼此分隔开。

因此，本发明提供了用于从溶液中沉积和/或选择性分离肽/蛋白质的方法，其至少包括以下步骤：

a）将蛋白质/肽溶液与结晶剂混合，

b）任选地冷却或温热，

c）使蛋白质/肽结晶，

其中a）～c）在空间上彼此分隔开地进行。

下面，术语“肽”也将用于同义地表示蛋白质。该术语“肽”将进一步理解为表示取代和未取代的肽和/或蛋白质，其中可能的取代基能够是例如糖苷、核酸、烷基、芳基及其混合物。该取代基能够出现在该肽的主链上或该侧基上。

“混合”理解为表示用于使得待混合相的局部存在的组分之间的浓度或温度梯度平衡化的工艺。目的是实现新材料的非常高均匀性。当来自该混合物的随机样本以特定精度反映出初始材料（待混合材料）之比时实现了该目的。“混合”在宏观水平上通过对流发生且在分子水平上作为扩散的结果发生。该混合工艺以三个子步骤发生，其连续并同时进行。在宏观混合的第一子步骤中，通过对流传送在整个混合机中分布由其浓度表征的子体积。在此情况下，局部浓度波动和该子体积的广度基本上保持不变。仅发生由于粘滞摩擦造成的形变。在宏观混合的第二子步骤中，根据该流体的粘度通过分子或湍流动量交换降低该子体积的尺寸。由均匀浓度表征的子体积的尺寸降低到阈值。该值表征从宏观混合到微观混合的转变。

在该阈值尺寸之下，该体积单元不再能被紊流波动所驱散。进一步的浓度平衡是仅由分子扩散造成的。宏观混合程序和微观混合程序各自分配时间常数。从文献中能够得到关于微观混合和宏观混合的更特别细节，例如K. Kling, Visualisieren des Mikro- und Makromischens mit Hilfe zweier fluoreszierender und chemisch reagierender Farbstoffe（借助于两种荧光和化学活性染料的微观混合和宏观混合的可视化）、2004年为了获得由汉诺威大学的机械工程专业授予的工学博士学位的学位论文。

术语“在空间上分隔开”表示步骤a）～c）是在不同容器（其通过例如管彼此连接）中进行的。然而，术语“在空间上分隔开”也应当理解为表示步骤a）～c）是在容器的不同区域/区段中（例如在管状反应器的不同部分中）进行的。

术语“结晶剂”应当理解为表示造成或促进肽以晶体的形式从溶液中（例如从水溶液中）的沉积出来的任何化合物或化合物的混合物。在本发明的优选实施方案中，该结晶剂包括选自以下组的至少一种化合物：肽、蛋白质、醇、盐溶液、酸、pH缓冲液、酚、非离子聚合物、离子聚电解质。

“结晶”与沉淀(Fällung)不同。结晶理解为表示其中肽在受控条件下成核（即形成以受控方式形成晶体）的工艺。结晶的结果是具有特定形态的晶体。进一步地，结晶肽显示出比沉淀肽更窄的粒度分布。结晶通常是比沉淀更慢的工艺。

沉淀(Fällung)理解为表示其中通过添加沉淀剂和/或作为温度改变的结果从溶液中以快速工艺沉淀肽的工艺。沉淀的结果是下面称作沉淀物的沉积物。沉淀物的特点在于宽的粒度分布。颗粒的大部分是无定形的和/或多晶型的（不均匀晶体）。该沉淀物包含引入溶剂和沉淀剂，并因此与结晶的结果相比更不纯。该沉淀物任选的是凝胶状的且难于过滤。尽管通过添加过量的沉淀剂实现沉淀是简单的，但结晶需要其中晶体能够形成并生长的受控条件。结晶在技术上比沉淀更复杂。结晶和沉淀在下文中包括在术语沉积之下。

依照本发明的方法的步骤a）是在混合元件中进行的。在依照本发明的方法的优选实施方案中，步骤a）是在具有至少两个入口的喷射混合器中进行的，其中一个入口用于引入该肽溶液，第二入口用于引入沉淀剂。出口位于该混合元件的末端。混合腔和孔板在入口和出口之间。这种结构能够非常好地混合该料流，甚至在非常小的通过量比q₂/q₁的情况下也行，其中q₁和q₂表示通过入口1和2的料流。

在依照本发明的方法的优选实施方案中，步骤a）中的宏观混合时间t_Ms为1ms≤t_Ms≤1000ms；在特别优选的实施方案中，步骤a）中的混合时间为10ms≤t_Ms≤100 ms。

在依照本发明的方法的优选实施方案中，步骤a）中的平均混合速度v（在该混合腔中的平均混合速度）为0.05m/s≤v≤5 m/s。结果，步骤a）的时间保持尽可能短。在优选实施方案中，步骤a）中的混合速度为0.2m/s≤v≤1.5 m/s，尤其优选0.3m/s≤v≤1m/s。

在依照本发明的方法的优选实施方案中，该步骤a）中跨混合元件的压降∆p为0.05巴≤∆p≤20巴。该压降优选为0.1巴≤∆p≤2.5巴，尤其优选为0.2巴≤∆p≤1巴。

d₁（用于肽溶液的入口1的直径）与D_s（该混合腔的宽度）之比优选为0.1≤d₁/D_s≤0.4，尤其优选为0.2≤d₁/D_s≤0.3。d₂（用于沉淀剂的入口2的直径）与D_s（该混合腔的宽度）之比优选为0.05≤d₂/D_s≤0.3，尤其优选为0.08≤ d₂/D_s≤0.13。

该混合腔的尺寸（D_s）经选择使得占主导地位的是湍流状态。根据流速q₁/q₂优选如此选择直径比d₁/d₂：使得该碰撞料流的动量几乎相同。

在其中通过冷却或温热诱导或辅助结晶的依照本发明的方法的优选实施方案中，在步骤b）中使用在线热交换器(Inline-Wärmetauscher)以冷却或温热。优选地，使用螺旋管式热交换器，因为其提供非常好的传热性且易于清洗。

在依照本发明的方法的优选实施方案中，在步骤c）期间连续搅拌该混合物。其优选使用至少一个叶轮用于搅拌，其仅对颗粒造成小的机械应力。优选使用具有大直径的叶轮，其中该叶片优选径向设置使得主要得到径向流。优选使用叶片叶轮，其中将该叶片固定到共用轴上，具有各种径向定位，且表现出没有或者仅低的垂直倾斜度。该叶片的数量z优选为3≤z≤9，尤其优选为4≤z≤6。该搅拌速度优选接近形成的晶体正好悬浮的值。

在依照本发明的方法的优选实施方案中，该搅拌容器装备有折流板，例如具有四个宽度为0.1D的折流板，其中D是在其中进行步骤c）的容器或容器区段的直径。也可以将该搅拌器偏心设置，在这种情况中偏心率e/D优选为0≤e/D≤0.15，其中e是搅拌器外边缘与其中进行步骤c）的容器或容器区段的壁之间的间距。对于多种应用，该搅拌器的混合质量有利地受到该实施方案的影响。使用偏心搅拌器尤其提高了该结晶容器的可清洁性。

在依照本发明的方法的优选实施方案中，该搅拌叶片直径d与在其中进行步骤c）的该容器或容器区段的直径D之比为0.4≤d/D≤0.7。因此实现了小颗粒应力。该比值优选在0.45≤d/D≤0.65的范围，尤其优选在0.5≤d/D≤0.6的范围。

该搅拌叶片高度h与搅拌叶片直径d之比在0.15≤h/d≤1.3的范围。

在使用具有多个叶轮的叶轮系统时，所有叶轮的h/d比在0.25≤h/d≤0.25的范围。尤其优选所有叶轮具有相同的尺寸。

在依照本发明的方法的优选实施方案中，在其中进行步骤a）的容器或容器区段的容积与在其中进行步骤c）的容器或容器区段的容积之比大于或等于0.01且小于或等于0.1。令人惊奇地发现对于多种应用，使用与结晶容积相比小的混合容积能够是有利的，因为通过这种方式步骤a）中的沉淀剂能够以较大的过量存在而不会发生不受控制的沉积。

在依照本发明的方法的优选实施方案中，在其中进行步骤a）的容器或容器区段的容积与在其中进行步骤b）的容器或容器区段的容积之比大于或等于0.02且小于或等于0.08。

由于步骤a）和b），步骤c）以受控方式进行。通过进行步骤a）和b），步骤c）优选是自动进行的，即优选不需要外部激励以引发结晶。优选仅搅拌以维持均匀状态，等待用于能使晶体形成和生长的时间。

依照本发明通过结晶进行肽从溶液中的沉积和/或分离。在依照本发明的方法的优选实施方案中，通过沿该肽的溶解度曲线逐步添加结晶剂进行肽从溶液中的沉积和/或分离。结晶剂总是逐步以使得该溶液对该待沉积的肽过饱和且因此该肽结晶出来的量添加的。优选地，在各步骤中仅添加略微过量的结晶剂，以防止肽不受控制地沉淀。依照本发明，肽溶液和结晶剂的混合在空间上与实际结晶是分隔开的。

在依照本发明的方法的另一实施方案中，通过逐步温热或冷却（即通过逐步升高或降低温度，取决于是温热还是冷却对该结晶起到促进/诱发作用）进行肽从溶液中的沉积和/或分离。该温度改变是沿该肽的溶解度曲线进行的：该温度逐步改变到使得该溶液对待去除的肽过饱和因此该肽结晶出来的程度。优选地，以小的步长改变温度以防止该肽不受控制地沉淀。依照本发明，该温度改变在空间上与实际结晶是分隔开的。

图2、3和7中给出了溶解度曲线的实例。肽的溶解度曲线能够是经验确定地（例如参见实施例1）。通过例如蒸发特定量的溶液并称重剩余的肽以重量分析、光谱分析、或通过本领域技术人员已知的其它常用的用于测定浓度的方法进行溶解肽的浓缩。

在优选实施方案中，因此，依照本发明的方法在步骤a）和c）或a）、b）和c）之后包括额外的步骤d）：

d）在通过冷却结晶或温热结晶时，将来自步骤c）的结晶悬浮液的一部分溶液添加到步骤a）的混合物中或步骤b）的混合物中。

步骤d）能够连续或不连续地进行。通过步骤d）的另外引入，该结晶能够连续或不连续地进行，并对于一系列应用，提高了该结晶状态，导致产物质量的提高。

步骤d）优选是在其中将各种混合物/溶液汇聚到一起的混合腔中进行的。

在优选实施方案中，依照本发明的方法在步骤a）和c）或a）、b）和c）之后包括步骤a₁）和a₂）：

a₁）混合额外的结晶剂，

a₂）任选地重复步骤a₁）和a₂）。

步骤a₁）优选是在其中将各种混合物/溶液汇聚到一起的混合腔中进行的。

下面通过示例性的方式借助于附图对本发明进行详细阐述，然而并不将本发明限定于这些附图。

图1显示了在优选实施方案中用于进行依照本发明的方法的装置的示意图。该装置包括用作结晶剂的储存器的容器10、用作肽溶液的储存器的容器20、混合元件30、热交换器40和用于结晶的容器50。该容器10和20具有搅拌器。容器10通过第一泵15与该混合元件30连接。容器20也通过第二泵25与该混合元件30连接。依照本发明的方法的步骤a）是在混合元件30中进行的。在通过冷却结晶或加热结晶时，通过热交换器40改变该混合物的温度，并将该混合物引入用于结晶的容器50中。在优选实施方案中，通过其将该混合物引入该容器50中的管具有漏斗状设计，如图1中图示。该漏斗的开度角α在2°≤α≤8°的范围。叶片式搅拌器偏心设置在该容器50中。

图2示意性地显示了肽的溶解度曲线和两种沉积变型方案的实施方式（即反馈模式B和批次模式A）。

在该图中，将肽在溶液中的浓度c*相对于已经添加到溶液中的结晶剂的量aK绘制。随着结晶剂的量aK的提高，溶解的肽的浓度c*降低，因为肽的一部分量已经由该结晶剂造成结晶并因此从溶液中沉积出来。在该图中，描绘了两种可能的沉积工艺。在工艺A的情况中，一次添加大量的结晶剂。结晶剂的添加量在图2的图中的溶解度曲线的右边，因此肽应当沉淀出来。通过突然添加结晶剂，该肽溶液对肽过饱和。该肽快速沉积。

通过工艺B，受控结晶是可行的。在工艺B的情况中，添加与工艺A的情况相同量的结晶剂，但以多个更少的剂量添加，它们在时间上间隔开先后添加。优选沿该溶解度曲线c*移动，即总是添加仅略微过量的结晶剂。在结晶剂的首次添加中，该肽溶液仅变得略微过饱和。肽沉积且溶解肽的浓度降低（Δc）直到再次位于溶解度曲线处的浓度。再次添加结晶剂，该溶液对肽过饱和，肽沉积（Δc）。该溶液的肽浓度下降直到位于该溶解度曲线处的浓度，依此类推。通过以多个小剂量逐步添加结晶剂，产生受控结晶的状态。在各步骤中仅进行溶液的少量过饱和Δc/c*。该肽具有结晶和晶体生长的时间。该沉积的肽具有特定的形式和组成且由具有窄粒度分布的晶体构成。该结晶过程优选是由搅拌和/或温度控制辅助的。代替添加结晶剂，还能够通过受控温热或冷却进行该肽沉积。在这种情况中，该x轴将不再表示结晶剂的添加量aK而是表示温度T的升高或降低。反馈模式B是依照本发明的方法的优选实施方案，其中肽溶液/悬浮液与结晶剂的混合以及其结晶本身依照本发明是在分开的容器或容器区段中发生的。

其中逐步进行该溶液的仅略微过饱和Δc/c*的受控工艺B与工艺A相比在多种应用中具有以下优点：

- 防止不受控制地成核，

- 通过比值Δc/c*的变化，能够影响颗粒生长与成核速率之比并由此改善结晶结果，

- 产生具有窄粒度分布的较大晶体，

- 肽能够选择性地从肽混合物中结晶（例如参见图3），

- 水的引入更少且在沉积产物中杂质夹杂更少，

- 更低的形成多晶型沉积物的趋势，

- 避免沉淀物，

- 更纯的产物，因为可避免共沉淀，

- 提高再现性。

图3在一副图中显示了两种肽P1和P2的溶解度曲线。在该图中，将肽P1和P2在溶液中的浓度c*相对于已经添加的结晶剂的量aK绘制。图3示意性地显示了通过受控添加结晶剂和受控结晶肽P1能够选择性地从该溶液中沉积，而肽P2完全保持在溶液中。如果将图3中逐步添加的结晶剂的量一次性添加到溶液中，那么将会将肽P1和P2一起沉积出，分离将会不可能。代替添加结晶剂，通过受控温热或冷却也能够选择性沉积肽。在这种情况中，该x轴将不再表示结晶剂的添加量aK而是表示温度T的升高或降低。

在至少一种另外的肽存在下肽的所述逐步选择性沉积是依照本发明的方法的优选实施方案，其中肽溶液/悬浮液与结晶剂的混合以及其结晶本身依照本发明是在分开的容器或容器区段中发生的。

在图4中，图示了依照本发明的方法的步骤a）的优选混合元件。该图显示了喷射混合器100的横截面。该混合器包括两个用于肽溶液（料流q₁）和结晶剂（料流q₂）的入口110、120。该入口的直径为d₁和d₂。该喷射混合器优选设计为具有直径D_s的管式。该d₁/D_s比优选在0.1≤d₁/D_s≤0.4的范围，尤其优选在0.2≤d₁/D_s≤0.3的范围。该d₂/D_s比优选在0.05≤d₂/D_s≤0.3的范围，尤其优选在0.08≤d₂/D_s≤0.13的范围。

混合腔150在该喷射混合器内，用孔板(Blende)160将其分隔成混合区130和出口区140。该混合区的容积优选约为该混合腔容积的³/₄，因此该出口区的容积为该混合腔容积的¹/₄。如图中箭头130所示，在该混合区中占主导地位的是具有由碰撞料流q₁和q₂造成的高湍流度的宏观对流。与此相比，在出口区中的流动为从远更小的湍流度到根本没有湍流度。将肽溶液和结晶剂的混合物通过喷射混合器的出口添加到热交换器和/或用于结晶的容器/容器区段中（料流q）。

图5显示了用于实施依照本发明的方法的装置的优选实施方案。该装置包括用于接收结晶剂的容器10、用于接收肽溶液的容器20、通过泵15与容器10连接且通过泵25与容器20连接的混合元件30、与该混合元件30连接的用于结晶的容器50。在优选实施方案中，容器50与容器20和混合元件30之间的连接通过连接件70连接。该连接70能够具有例如管状设计，允许（连续）从该容器50中取出结晶悬浮液并将该悬浮液添加到依照本发明的方法的步骤a）中，其是在该混合元件30中进行的。

连接件70使得此处称作反馈方式1的操作形式为可行的：在第一次将来自容器10的结晶剂与来自容器20的肽溶液在该混合元件30中混合之后，将容器50中的混合物保持特定的时间间隔用于该第一晶体的熟化。在第二和任选的另外步骤中，将结晶剂与来自容器50的悬浮液或上清溶液混合，将其通过管线70与结晶剂一起添加到该混合元件中。作为结果，可以有针对性地逐步并以特定的间隔计量添加结晶剂。因此该结晶剂的量并不一次性添加，而是逐步添加。在该混合元件中，进行来自容器50的悬浮液或上清溶液与来自容器10的结晶剂的剧烈混合。依照反馈方式1的所述方法是依照本发明的方法的优选实施方案。

在用于实施依照本发明的方法的装置的另一实施方案中，将热交换器40和容器50之间的连接另外通过连接件80与容器20相连接。该连接件80能够具有管式设计，允许将来自该混合元件的混合物（连续）取出到该容器20中。

连接件80使得此处称作反馈方式2的操作形式为可行的：在第一步骤中，将来自容器10的结晶剂与来自容器20的肽溶液在该混合元件30中剧烈混合，然后将该混合物料添加到结晶容器50中。在第二步骤中，将来自容器50的悬浮液或上清溶液通过管线70与来自容器10的结晶剂一起添加到该混合元件30中。在剧烈混合和任选地温热或冷却之后，将该混合物通过该连接件80引入该空容器20中。在第三步骤中，进行该容器20中的内容物与额外的结晶剂的混合和将该混合物引入容器50中。该第二和第三步骤任选地重复一次或多次。该操作方式具有均匀并同时将结晶剂添加到溶液中的优点。

该容器50的容积大于混合元件和该混合元件与容器50之间的连接件的容积总和。在将反馈方式1中来自容器50的悬浮液或上清溶液通过该连接件70和该混合元件30返回供给到该容器50中时，将其在容器50中混合，更特别地在具有尚未返回的悬浮液的容器50中的入口位置。由此，反馈方式1中的反馈任选地导致容器50中的浓度波动。这些波动能够不利地影响该产物品质。在反馈方式2中避免了这种浓度波动。

在反馈方式2中，依照本发明的用于沉积和/或分离肽的方法能够比反馈方式1中更窄地(enger)沿该溶解度曲线进行。依照反馈方式2的所述方法是依照本发明的方法的尤其优选的实施方案。

图6显示了用于执行依照本发明的方法的图5中所示装置的变型方案。除了已经在图5中呈现的元件之外，还呈现了热交换器40和连接件90。在仅通过冷却或温热进行结晶时（在这种情况下仅通过冷却或温热该肽溶液实现结晶），能够省去混合元件。在这种情况中，将反馈方式1中来自容器50的肽溶液/悬浮液再次通过连接件70、连接件90和热交换器40返回供给到容器50。在该热交换器中，进行该肽溶液/悬浮液的逐步冷却或温热以实现受控结晶。如图5中的描述已经解释的那样，该容器50的体积大于该连接件70、90和热交换器的容积总和，因此任选地经冷却或温热的溶液/悬浮液返回供给到该容器50中，并在此遇到尚未返回的具有不同温度的悬浮液。在该情况中，这能够导致温度波动，其负面影响产品品质。此处，反馈方式2设法解决了这一问题，其中将来自容器50的悬浮液/溶液通过连接件70供给到该热交换器中以调节另外的温度，且将其从该热交换器中通过连接件80供给到该空容器20中。从该容器20中，然后将该溶液通过管线90供给到该热交换器中以再次调节到另外的温度并然后返回到容器50中。根据需要，该工艺能够重复一次或多次。此处描述的方法是依照本发明的方法的优选实施方案。

图7示意性地显示了溶菌酶水溶液的溶解度行为。将溶菌酶的浓度相对结晶剂NaCl的浓度绘制。在4.5的pH值和20℃的温度，溶菌酶溶液显示出在曲线CZ和PZ之间的过饱和范围。如果在上述条件下，设定位于曲线CZ和PZ之间的NaCl浓度，那么该溶菌酶缓慢结晶。如果NaCl的浓度提高并到达曲线PZ右边的区域，那么该溶菌酶以沉淀物的形式快速沉淀出来。

图8显示了用于实施依照本发明的方法的装置的另一实施方案。

该装置包括用于接收结晶剂的第一容器10’、用于接收肽溶液的第二容器20’、借助于双叶片式搅拌器60’搅拌的用于结晶的第三容器50’。该容器20’和10’通过低剪切泵15’、优选具有喷射混合器设计的混合元件30’和螺旋管式反应器40a、40b和40c与该容器50’连接。这种装置允许使肽沿该溶解度曲线逐步结晶。在第一步骤中，将来自容器20’和10’的肽溶液和一部分结晶剂在该容器20’和容器10’之间的混合元件30’中混合。将该混合物进入该反应器40a。在该管式反应器40a中，在非常均匀的条件下形成第一肽附聚物。在反应器40a和40b之间的混合元件30’中，将来自反应器40a的悬浮液与来自容器10’的额外的结晶剂混合。该混合物进入该反应器40b中。在该管式反应器40b中，在非常均匀的条件下形成额外的肽附聚物和/或生长现有的附聚物。在反应器40b和40c之间的混合元件30’中，将来自反应器40b的悬浮液与来自容器10’的另外的结晶剂混合。该混合物进入该反应器40c。在该管式反应器40c中，在非常均匀的条件下形成额外的肽附聚物和/或生长现有的附聚物。来自反应器40c的悬浮液进入该容器50’，其中在受控条件下使结晶结束。

该管式反应器40a、40b和40c也能够起热交换器作用，且例如吸收结晶热或者向溶液/悬浮液中供给热量。所述方法是依照本发明的方法的优选实施方案。

依照本发明的方法并不限定于此处所述的方法。由例如此处所述方法的组合产生的其它变型方案也是可行的。

通过依照本发明的方法，在多种应用中可实现一种或多种优点：

- 降低浓度波动以及在颗粒上的机械应力，

- 可以有针对性设定饱和状态并避免过饱和，

- 选择性结晶且因此更好地分离包括多于一种肽的溶液中的各种肽，

- 具有特定性质的均匀产物且避免多晶型化合物，

- 可以得到具有窄粒度分布的细小晶体，

- 降低受损肽的部分，

- 缩短工艺时间，

- 更高的产率和更大量的沉积颗粒，

- 规模放大简单。

实施例

实施例 1

该实施例描述了溶菌酶的结晶。该结晶是在依照图5中的装置中进行的。将具有4.7mol/L的浓度的NaCl水溶液作为结晶剂预先置入容器10中。溶菌酶同样以20g/L的浓度存在于水溶液中（容器20）。

将50升容器（50）用于该结晶。将低剪切泵（例如蠕动泵：Watson Marlow）用于输送该溶液和悬浮液。使用依照图4的喷射混合器，含具有直径d₁＝2.5mm和d₂＝6mm的两个入口。该管式混合腔具有24mm的直径。该喷射混合器以在Re＝1500的区域中的雷诺数湍流操作。其混合时间为65ms。该混合物的pH值为4.5，混合温度为20℃。

该结晶容器的直径为D＝406mm，并装备有叶片式搅拌器，其中叶片具有h/d＝0.5的高度与直径比。总计，该搅拌器携带6个叶片，具有d/D＝0.55的叶片直径与该结晶容器直径之比。搅拌器和容器之间的相对距离为e/D＝0.025。

通过几乎引到该容器底部的喷枪进行结晶剂和肽溶液的混合物到容器50的供给。该喷枪具有约5°的锥形（漏斗形状）角。引入该容器的喷射的功率输出小于30W/m³。

在图7中，显示了两种操作方式的结果。曲线PZ显示了作为添加大量（过量）NaCl溶液的结果的溶菌酶在该溶液中的浓度进展。曲线PZ上的圆显示了实际测定的值。逐步从溶液中作为沉淀物沉淀出来的该溶菌酶是多晶型的且难以过滤。

曲线CZ显示了在添加多个较少量NaCl溶液的进展。该曲线CZ上的圆显示了依照根据反馈方式2（参见图5的描述）的方法得到的实际测定值。以晶体形式逐步沉积的溶菌酶比该沉淀物具有更高的纯度，显示出更窄的粒度分布，且更容易过滤。而且，在结晶时纯溶菌酶的产率比在沉淀时的更高。

参考符号

10，10’	结晶剂的接收器皿/容器
		15，15’	泵
20，20’	肽溶液的接收器皿/容器
		25，25’	泵
30，30’	在其中实施依照本发明的方法的步骤a）的混合元件
		40	热交换器
40’	管式反应器
		50，50’	在其中实施依照本发明的方法的步骤c）的器皿/容器
60，60’	搅拌器
		70，80，90	连接件
100	混合元件，喷射混合器
		110，120	入口
130	混合区
		140	出口区
150	混合腔
		160	孔板

另外，该附图显示：

M＝搅拌驱动

T1＝温度1

T2＝温度2

FIC＝体积流量调节

TIC＝温度调节

Claims

1. 用于从溶液中沉积和/或选择性分离肽/蛋白质的方法，至少包括以下步骤：

a）将蛋白质/肽溶液与结晶剂混合，

b）任选地冷却或温热，

c）使蛋白质/肽结晶，

其中步骤a）～c）在空间上彼此分隔开地进行。

2. 权利要求1的方法，其特征在于步骤a）是在包括至少两个入口和至少一个孔板的喷射混合器中进行的，混合区在所述入口和孔板之间。

3. 权利要求1或2的方法，其特征在于步骤a）中的平均混合速度在0.05m/s≤v≤5 m/s的范围。

4. 权利要求1～3中任一项的方法，其特征在于步骤a）中的压降在0.05巴≤∆p≤20巴的范围。

5. 权利要求1～4中任一项的方法，其特征在于步骤a）中的宏观混合时间在1ms≤t_Ms≤1000ms的范围。

6. 权利要求1～5中任一项的方法，其特征在于步骤a）中的宏观混合时间在8ms≤t_Ms≤120ms的范围。

7. 权利要求1～6中任一项的方法，其特征在于步骤c）是用叶片式搅拌器在连续搅拌情况下进行的。

8. 权利要求7的方法，其特征在于该搅拌速度接近于该晶体正好悬浮的值。

9. 权利要求7或8的方法，其特征在于该搅拌器以在0≤e/D≤0.035范围的相对偏心率设置。

10. 权利要求7～9中任一项的方法，其特征在于该叶片式搅拌器的直径d与在其中进行步骤c）的该容器或容器区段的直径D之比在0.4≤d/D≤0.7的范围。

11. 权利要求1～10中任一项的方法，其特征在于在其中进行步骤a）的容器或容器区段的容积与在其中进行步骤c）的容器或容器区段的容积之比大于或等于0.02且小于或等于0.08。

12. 权利要求1～11中任一项的方法，其特征在于在步骤a）和c）之间或a）、b）和c）之间进行以下步骤d）：

d）将来自步骤c）的结晶悬浮液的一部分溶液添加到步骤a）的混合物中或步骤b）的混合物中。

13. 权利要求1～12中任一项的方法，其特征在于在步骤a）和c）之后或a）、b）和c）之后实施以下步骤a₁）和a₂）：

a₁）混入额外的结晶剂，

a₂）任选地重复步骤a₁）和a₂）。