CN102066394B - 用作免疫佐剂的糖脂的类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供增加各种抗原引发的免疫应答的α-半乳糖基神经酰胺类似物。还提供利用这种化合物增加疫苗效力的方法。

Description

用作免疫佐剂的糖脂的类似物
发明领域
本发明涉及作为NKT细胞(天然杀伤T-细胞)配体的糖脂类似物、它们的制备方法和利用它们作为免疫佐剂来增加疫苗接种后的抗体滴度水平的方法。
发明背景
最近发现糖脂有许多不同的免疫学特性。其中，已证明当由CD1分子呈递时它们可用作抗原，以及当与疫苗组合给予时它们可改善免疫应答。
CD1分子是功能上类似于熟知的主要组织相容性复合体(MHC)分子的高度保守性抗原呈递蛋白质家族。MHC蛋白呈递肽，而CD1蛋白结合各种脂质和糖脂并将它们展示于T淋巴细胞。
在人中，各种CD1同种型根据序列相似性分类为组I(CD1a，b，c和e)和组II(CD1d)[Calabi，F.；Jarvis，J.M.；Martin，L.；Milstein，C，Two classes ofCD1genes(两类CD1基因)，Eur.J.Immunol.1989，19，(2)，285-92]。人CD1a[Zajonc，D.M.等，Nat.Immunol.(2003)，4，808-815]、hCD1b[Gadola，S.D.等，Nat.Immunol.(2002)，3，721-726]、hCD 1d[Koch，M.等，Nat Immunol(2005)，6，819-826]和小鼠CD1d(mCD1d)[Zeng，Z.-H.等，Science(1997)，277，339-345；Zajonc，D.M.等，J.Exp.Med.(2005)，202，1517-1526](其中一些与它们各自的配体形成复合物)的晶体结构揭示了它们各自的结合沟拓扑结构中有何不同从而使得它们具有(不同)配体特异性程度，但仍维持呈递各种抗原性脂质的能力。
具体地说，mCD1d显示总体折叠类似于I类MHC蛋白。α-链折叠成3个结构域(α1，α2和α3)并与β2m紧密结合。膜远端α1和α2结构域形成结合沟，其由8股反向平行β-片层构成，其间贯穿着两条反向平行的α-螺旋[Zeng，Z.-H.等Science(1997)，277，339-345]。mCD1d还显示能在位于结合沟中，称为A’和F’的两个疏水袋中容纳长脂质尾。此外，hCD1b和hCD1a的结构显示当加载了抗原性糖脂时，CD1在疏水性沟中结合脂质部分，而使亲水性糖部分可用于接触T-细胞受体。
哺乳动物和分枝杆菌脂质已知由人CD1a、CD1b、CD1c和CD1d呈递[Porcelli，S.A.和Modlin，R.L.(1999)Annu.Rev.Immunol.17，297-329]。α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)是在海洋海绵(Agelas mauritianus)中发现的脂质，其是迄今为止最广泛研究的CD1d配体。当α-GalCer结合CD1d时，其刺激小鼠中的Vα14z天然杀伤T细胞(Vα14z NKT细胞)和人同源Vα24zNKT细胞快速产生Th1和Th2细胞因子，现在将其视作模型抗原。然而，其在哺乳动物中的生理意义尚不清楚，因为不知道为何海洋生物的α-半乳糖神经酰胺是如此强效的激动剂。
α-GalCer：
天然杀伤(NK)细胞在正常外周血的单核的细胞中通常约占10-15％。历史上，NK细胞首先因它们无需事先免疫或活化即能裂解某些肿瘤细胞而得到鉴定。NK细胞还在细胞因子产生中起至关重要的作用，可能涉及控制癌症、感染，还可能涉及胚胎植入。
组合给予α-GalCer与免疫原性蛋白质通过与树突细胞相互作用导致针对可溶性抗原的CD4+和CD8+NKT细胞反应增强[Ian F.Hermans，I.F.等，J.Immunol.(2003)，171，5140-5147]。给予α-GalCer还增强B淋巴细胞反应，从而对加强免疫起反应而引发更高频率的记忆B细胞和更高的抗体水平[Galli G.等，PNAS，(2007)，104；3984-3989]。其已用于增强某些肽抗原的效力。WO 2005/000348。
发明概述
本发明涉及与α-GalCer类似的免疫原性化合物新类别和它们的新合成方法以及它们增强疫苗效力的应用，所述化合物对应于以下通用结构。与α-GalCer相比，这些化合物的药代动力学特性改善，在给予抗原或疫苗时其增加免疫应答的效力类似。
在一方面，本发明涉及式I所示化合物或其药学上可接受的盐以及含有这种化合物的组合物：
式中R2、R3、R4和R5各自独立表示H或保护基团；
X是可被取代的C4-C30烃基(hydrocarbyl group)；
Y是可被最多两个基团取代的C1-C6亚烷基或C2-C6亚烯基(alkenylene)接头；
Z是-OR1，其中R1是骨架内可含有杂原子并且可被任选取代的C4-C20烃基。
含有式I所示化合物的组合物可以是药物组合物，其常包含药学上可接受的运载体。在一些实施方式中，所述组合物还包含因能引发所需免疫应答而选择的至少一种抗原。本发明的某些实施方式包括与疫苗混合的式I所示化合物。
在另一方面，本发明涉及制备式I所示化合物的方法以及可用于制备式I所示化合物的新型中间体。
在另一方面，本发明涉及通过将式I所示化合物给予接触某抗原的对象，从而利用式I所示化合物增强针对该抗原的免疫应答的方法。在具体的实施方式中，该方法可用于增加给予人对象的疫苗的效力。
附图简述
图1通过由APC(THP1)呈递时小鼠T细胞淋巴瘤FF13的激活情况显示合成化合物的活性。通过ELISA试验测定培养48小时后释放入培养基的IL2作为检测T细胞激活的手段。y-轴显示IL2水平(以pg/ml计)。X-轴显示糖脂量(以μg/ml计)。
图2总结了在检测NKT淋巴瘤细胞释放IL-2的试验中检验的四种合成化合物的活性数据，所示淋巴瘤细胞与暴露于所述化合物或α-GalCer的APC相接触。
图3总结了在检测Balb/C小鼠中HI滴度的试验中检验的合成a-Gal GG和a-Gal LP的体内活性数据。显示了抗-H3N2HI滴度。
图4总结了在检测Balb/C小鼠中IgG滴度的试验中检验的合成a-Gal GG和a-Gal LP的体内活性数据。IgG滴度以EU/ml显示。对于图中的各三联柱，各柱从左到右表示B、H1N1和H3N2。
图5总结了在检测Balb/C小鼠中IgG2a/IgG1滴度的试验中检验的合成a-Gal GG和a-Gal LP的体内活性数据。IgG滴度以EU/ml显示。对于图中的各对柱，各柱从左到右表示IgG2a和IgG1。
某些实施方式的详述
本发明化合物
除非另有规定，本文所用的“烃残基”指只含有碳和氢的残基。该残基可以是脂族或芳族的、直链、环状、支链、饱和或不饱和的，或这些的任何组合。然而，如此规定时，烃残基可含有除烃基团本身的碳氢成员以外或用于替代烃基团本身的碳氢成员的杂原子。因此，当特别注明含有杂原子时，烃基团可在该烃残基的“骨架”内含有杂原子，当任选取代时，烃残基还可具有一个或多个羰基、氨基、羟基等以替代母体烃残基的一个或多个氢。
本文所用的“无机残基”指不含有碳的残基。例子包括但不限于卤素、羟基、NO2或NH2。
本文所用的术语“烷基”、“烯基”和“炔基”包括直链、支链和环状的单价烃基以及这些的组合，当其未取代时只含有C和H。例子包括甲基、乙基、异丁基、环己基、环戊基乙基、2-丙烯基、3-丁炔基等。本文有时描述了这种基团中各自的碳原子总数，例如，当该基团可含有最多10个碳原子时，其可表示成1-10C或C1-C10或C1-10。当如杂烷基那样，允许杂原子(通常是N、O和S)替代碳原子时，例如，虽然描述该基团的数值仍写作，例如C1-C6，但其表示该基团中碳原子数加上替代所述环或链中碳原予而包含的这种杂原子数的总数。
本发明的烷基、烯基和炔基取代基通常含有1-10C(烷基)或2-10C(烯基或炔基)。它们优选含有1-8C(烷基)或2-8C(烯基或炔基)。有时它们含有1-4C(烷基)或2-4C(烯基或炔基)。一个基团可包含一类以上的多键，或一个以上的多键；当它们含有至少一个碳-碳双键时，这种基团包括在术语“烯基”的定义中，当它们包含至少一个碳-碳三键时，它们包括在术语“炔基”的定义中。
烷基、烯基和炔基常有一定程度的取代，这种取代在化学上有意义。典型的取代基包括但不限于：卤素、＝O、＝N-CN、＝N-OR、＝NR、OR、NR2、SR、SO2R、SO2NR2、NRSO2R、NRCONR2、NRCOOR、NRCOR、CN、COOR、CONR2、OOCR、COR和NO2，其中各R独立为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C6-C10芳基、或C5-C10杂芳基，并且各R任选被以下基团取代：卤素、＝O、＝N-CN、＝N-OR′、＝NR’、OR′、NR′2、SR′、SO2R′、SO2NR′2、NR’SO2R′、NR′CONR′2、NR′COOR′、NR′COR′、CN、COOR′、CONR′2、OOCR′、COR′和NO2，其中各R′独立为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基。烷基、烯基和炔基还可被以下基团取代：C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基，各基团可以被适于具体基团的取代基取代。
″杂烷基″、″杂烯基″和″杂炔基″等与相应烃基(烷基、烯基和炔基)的定义类似，但’杂’术语指在骨架残基内含有1-3个O、S或N杂原子或其组合的基团；因此，相应烷基、烯基或炔基的至少一个碳原子被具体的杂原子之一替代从而形成杂烷基、杂烯基或杂炔基。烷基、烯基和炔基的杂形式的典型和优选的大小通常与相应烃基相同，杂形式上可能存在的取代基与上述烃基相同。出于化学稳定性的原因，还应知道除非另有规定，这种基团不包含多于两个的毗连杂原子，除非是在N或S上存在氧，例如硝基或磺酰基。
虽然本文所用的″烷基″包括环烷基和环烷基烷基，但术语″环烷基″可在本文用于描述通过环碳原子相连的非芳族碳环基团，″环烷基烷基″可用于描述通过烷基接头与该分子相连的非芳族碳环基团。类似地，″杂环基″可用于描述含有至少一个杂原子作为环成员并通过环原子与该分子相连的非芳族环状基团，所述环原子可以是C或N；″杂环基烷基″可用于描述通过接头连接于另一分子的这样一种基团。适于环烷基、环烷基烷基、杂环基和杂环基烷基的大小和取代基与上述烷基的那些相同。本文所用的这些术语还包括含有双键的环或双环，只要该环不是芳族的。
本文所用的″酰基″包括含有连接于羰基碳原子的两个可用化合价位置之一的烷基、烯基、炔基、芳基或芳基烷基的基团，杂酰基指其中除羰基碳以外的至少一个碳被选自N、O或S的杂原子取代的相应基团。因此，杂酰基包括，例如-C(＝O)OR和-C(＝O)NR2以及-C(-O)-杂芳基。
酰基和杂酰基结合于通过羰基碳的开放的化合价和它们相连的任何基团或分子。它们通常是包括甲酰基、乙酰基、新戊酰基和苯甲酰基在内的C 1-C8酰基，包括甲氧基乙酰基、乙氧基羰基和4-吡啶酰基(pyridinoyl)在内的C2-C8杂酰基。烃基、芳基和包含酰基或杂酰基的这种基团的杂形式可被本文所述取代基取代，例如对于酰基或杂酰基的各相应组分通常适合的取代基。
“芳族”部分或“芳基”部分指具有熟知芳香性质的单环或稠合的双环部分；例子包括苯基和萘基。类似地，“杂芳族”和“杂芳基”指含有选自O、S或N的一个或多个杂原子作为环成员的这种单环或稠合双环环系统。包含杂原子能使5-元环以及6-元环具有芳香性。典型的杂芳族系统包括单环C5-C6芳族基团，例如吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡唑基、噻唑基、噁唑基、和咪唑基，以及通过将这些单环基团之一与苯环或任何杂芳族单环基团稠合形成C8-C10双环基团的稠合双环部分，例如吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、异喹啉基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、吡唑并吡啶基(pyrazolopyridyl)、喹唑啉基、喹喔啉基、噌啉基等。该定义包括从电子在环系统中的分布来看具有芳香性质的任何单环或稠环双环系统。还包括其中至少直接连接于该分子其余部分的环具有芳香性质的双环基团。环系统通常含有5-12个环成员原子。单环杂芳基优选含有5-6个环成员，双环杂芳基优选含有8-10个环成员。
芳基和杂芳基部分可被各种取代基取代，包括C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-C12芳基、C1-C8酰基和这些基团的杂形式，这些取代基各自本身可作进一步取代；芳基和杂芳基部分的其它取代基包括卤素、OR、NR2、SR、SO2R、SO2NR2、NRSO2R、NRCONR2、NRCOOR、NRCOR、CN、COOR、CONR2、OOCR、COR和NO2，其中各R独立为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C7-C12芳基烷基或C6-C12杂芳基烷基，各R任选被上述烷基的取代基取代。芳基或杂芳基上的取代基当然可被本文所述适于各类这种取代基或取代基的各组分的基团进一步取代。因此，例如，芳基烷基取代基可以在芳基部分上用本文所述芳基的典型取代基取代，其还可在烷基部分上用本文所述烷基的典型或合适取代基取代。
类似地，″芳基烷基″和″杂芳基烷基″指通过连接基团，例如亚烷基结合于其连接点的芳族和杂芳族环系统，所述连接基团包括取代或未取代的、饱和或不饱和的、环状或非环状的接头。接头通常是C1-C8烷基或其杂形式。这些接头还可包含羰基，因此它们能提供取代基，例如酰基或杂酰基部分。芳基烷基或杂芳基烷基中的芳基或杂芳基环可以被上述芳基的取代基取代。芳基烷基优选包括用以上为芳基定义的基团任选取代，和用未取代或被1或2个C1-C4烷基或杂烷基取代的C1-C4亚烷基取代的苯环，其中所述烷基或杂烷基可任选环化形成环，例如环丙烷、二氧戊环或氧代环戊烷。类似地，杂芳基烷基优选包括用上述基团如芳基上的典型取代基任选取代，和用未取代或被1或2个C1-C4烷基或杂烷基取代的C1-C4亚烷基任选取代的C5-C6单环杂芳基，或者其包括任选取代的苯环或C5-C6单环杂芳基和未取代或被1或2个C1-C4烷基或杂烷基取代的C1-C4亚杂烷基(heteroalkylene)，其中所述烷基或杂烷基可任选环化从而形成环，例如环丙烷、二氧戊环或氧代环戊烷。
如果将芳基烷基或杂芳基烷基描述为任选取代的，则取代基可以在该基团的烷基或杂烷基部分上或在芳基或杂芳基部分上。任选位于烷基或杂烷基部分上的取代基通常与上述烷基的那些相同；任选位于芳基或杂芳基部分上的取代基通常与上述芳基的那些相同。
如果是未取代的，本文所用的″芳基烷基″是烃基，并根据环和亚烷基或类似接头中的碳原子总数描述。因此，苄基是C7-芳基烷基，苯乙基是C8-芳基烷基。
上述″杂芳基烷基″指包含通过连接基团相连的芳基的部分，其与″芳基烷基″的不同之处在于芳基部分的至少一个环原子或连接基团中的一个原子是选自N、O或S的杂原子。本文根据合并环和接头中的原子总数来描述杂芳基烷基，它们包括通过杂烷基接头相连的芳基；通过烃基接头，例如亚烷基相连的杂芳基和通过杂烷基接头相连的杂芳基。因此，例如C7-杂芳基烷基可包括吡啶基甲基、苯氧基和N-吡咯基甲氧基。
本文所用的″亚烷基″指二价烃基；由于是二价的，其能将两个其它基团连接在一起。其通常指-(CH2)n-，其中n是1-8，优选n是1-4，但如果具体说明，亚烷基还可被其它基团取代，可以是其它长度，并且打开的化合价无需位于链的相对端。因此，-CH(Me)-和-C(Me)2-还可称为亚烷基，例如可以是环状基团，例如环丙烷-1，1-二基。如果亚烷基是取代的，取代基包括本文所述通常位于烷基上的那些。
包含在取代基中的任何烷基、烯基、炔基、酰基、芳基或芳基烷基或这些基团之一的任何杂形式通常本身可被额外的取代基任选取代。如果取代基未另作描述，这些取代基的性质类似于初级取代基本身所述的那些。因此，当(例如)R7的一种实施方式是烷基时，该烷基可任选被R7的实施方式所列的其余取代基取代，只要这是有化学意义的并且不破坏该烷基本身的大小限制；例如烷基或烯基取代的烷基将简单地拓展这些实施方式的碳原子上限，并不包括在内。然而，芳基、氨基、烷氧基、＝O等取代的烷基包括在本发明范围内，这些取代基的原子不计算在用于描述所述烷基、烯基等基团的数值内。如果未规定取代基的数量，这种烷基、烯基、炔基、酰基或芳基各自可根据其可用的化合价被许多取代基取代；特别是，例如，任何这些基团可用氟原子在其任何或所有可用的化合价处取代。
本文所用的″杂形式″指基团，例如烷基、芳基或酰基的衍生物，其中指定碳环基团的至少一个碳原子被选自N、O或S的杂原子替代。因此，烷基、烯基、炔基、酰基、芳基和芳基烷基的杂形式分别是杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂酰基、杂芳基和杂芳基烷基。应该知道，除了氧代基团连接于N或S从而形成硝基或磺酰基外，通常没有2个以上的N、O或S原子顺序连接。除非另有规定，如果所述基团可在骨架或烷基链内含有任选的杂原子，例如，杂原子选自N、O或S。
本文所用的“任选取代的”表示所述的一个或多个具体基团可不具有非氢取代基，或者一个或多个可具有一个或多个非氢取代基。如果未作规定，可能存在的这种取代基的总数等于所述基团未取代形式上存在的H原子数。当任选的取代基通过双键连接时，例如羰基氧(＝O)，该基团占据两个可用的化合价，因此，可包含的取代基总数根据可用化合价的数量减少。
本文所用的″卤素″包括氟、氯、溴和碘。常优选氟和氯。
本文所用的″氨基″指NH2，但当氨基描述成″取代的″或″任选取代的″时，该术语包括NR′R″，其中R′和R″各自独立为H，或是烷基、烯基、炔基、酰基、芳基或芳基烷基，或这些基团之一的杂形式，而烷基、烯基、炔基、酰基、芳基或芳基烷基或这些基团之一的杂形式各自被本文所述适于相应基团的取代基任选取代。该术语还包括下述形式，其中R′和R″连接在一起从而形成饱和、不饱和或芳族的3-8元环，其含有1-3个独立选自N、O或S的杂原子作为环成员，并且任选被适于烷基的所述取代基取代，或者，如果NR′R″是芳族基团，其被所述杂芳基的典型取代基任选取代。
在一方面，本发明提供式I所示化合物或其药学上可接受的盐：
式中R2、R3、R4和R5各自独立表示H或保护基团；
X是可被取代的C4-C30烃基；
Y是可被最多两个基团取代的C1-C6亚烷基或C2-C6亚烯基接头；
和Z是-OR1，其中R1是可在其骨架内含有杂原子并且被任选取代的C4-C20烃基。
在式I中，R2、R3、R4和R5各自可以是H，或者这些基团的一个或多个可以是保护基团。在一些实施方式中，R2和R3；或R3和R4；或R4和R5可一起连接成环；例如，任何这些配对可表示丙酮化物(acetonide)保护基团。′保护基团′包括常规酰基、烷基、芳基烷基、甲硅烷基，和通常在有机合成期间用于保护羟基的其它基团。具体实例包括甲基、甲酰基、乙酰基、甲氧基乙酰基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、甲氧基甲基、2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基、苄基、二甲氧基苄基、烯丙基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、三氯乙氧基羰基、苄氧基羰基等。具体地说，R2、R3、R4和R5各自可以是任选取代的C1-C10酰基，例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰基、苯甲酰基、甲氧基羰基、苄氧基羰基或取代的苄氧基羰基、叔丁氧基羰基；或任选取代的芳基甲基，例如苄基、甲氧基苄基或二甲氧基苄基。尤其优选其中R2、R3、R4和R5中的一个或多个表示这些保护基团之一并且其余各自是H的化合物，因为它们能用作中间体从而通过本领域熟知的修饰，包括进一步脱保护而合成本发明其它化合物；还可将它们作为直接起作用或体内转化成其中R2、R3、R4和R5各自是H的化合物后起作用的免疫佐剂给予。
在式I中，X优选是具有4-30个碳的直链或支链烃，其优选含有10-30个碳。优选具有20-30个碳的直链烷基，有时优选25个碳的烷基。X常是烷基，但在一些实施方式中，其是烯基或炔基。X可以是未取代的，或者其可被一个或多个适合烷基的取代基取代。X的优选取代基包括卤素，特别是F；和烷氧基，特别是C1-C6烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、异丙氧基等。
Y可以是C1-C6亚烷基或C2-C6亚烯基，并且可以是未取代的，或者当Y是亚烷基时可以被选自下组的一个或多个基团取代：卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和羟基。当Y是亚烯基时，优选的取代基包括卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和C1-C6卤代烷基。当Y的一个碳或毗连的碳上存在两个取代基时，所述取代基可连接在一起形成5-6元环，该环任选具有最多2个选自N、O或S的杂原子作为环成员。在一些实施方式中，Y是CH2或CH2CH2或(CH2)3或(CH2)4，或这些基团之一的羟基取代形式。在其它实施方式中，Y是-CH(OH)-CH(OH)-CH2-。在某些实施方式中，-Y-Z如下式所示：
其中Z如上所述。
Z是基团-OR1，其中R1是可在其骨架中含有杂原子的C4-C20烃基，杂原子有时是O，有时是N或S，R1可以是未取代的或者可以是取代的。优选地，R1可以是未取代的C4-C20烷基，或者其可以是取代的，或者其是通式-(CH2)m-O-R1b所示基团，其中m是1-6，R1b是C1-C16烷基、环烷基或环烷基烷基，R1b可以是未取代的，或者其可以被通常存在于烷基上的基团取代，例如羟基、C1-C6烷氧基、卤素等。
在Z的一些实施方式中，R1是连接于环烷基或芳基或杂芳基环的C1-C6亚烷基链，例如式-(CH2)r-Rg所示基团，其中r是1-6的整数，Rg表示环，可以是3-8元脂环或杂环，或5-10元芳族或杂芳族基团；Rg可以是取代的。合适的例子包括-(CH2)2-4-Rg，其中Rg是3-8元单环基团，例如环丙基、环戊基、环己基、呋喃基、四氢呋喃基、吡喃基、四氢吡喃基、苯基、吡啶基、嘧啶基、噻吩基等。
本发明还涉及新型合成方法，包括在半乳糖和连接于半乳糖环异头碳的糖苷配基部分之间形成糖苷键，然后形成鞘氨醇的脂质部分。还提供用于制备本发明化合物的式(IIa)和(IIb)所示中间体。因此，在一方面，本发明提供利用通式IIa或IIb所示中间体制备上述式I所示化合物的方法：
式中Nx是受保护的氮基团，例如N3、NHC(O)X、NHC(O)J或酰亚胺，例如琥珀酰亚胺或邻苯二甲酰亚胺；其中J可以是任选取代的C1-C10烷基或任选取代的C1-C10烷氧基或任选取代的苄氧基；Y和R2、R3、R4和R5如式I所定义。
对于式IIa和IIb所示化合物，R2-R6各自优选是保护基团，而非H。优选的保护基团包括不难在还原或氢解条件下除去的基团，例如苄基、联苯基甲基、苄氧基甲基、苄氧基羰基等。
可采用本领域公知的方法，从该类的共同中间体，如化合物7和10所示获得本发明的某些化合物。化合物7和10所示例的中间体可从适当保护的α-D-吡喃半乳糖基-(1-5)-呋喃来苏糖二糖方便地获得，其中来苏糖部分是鞘氨醇类似物极性部分的前体，如下所示。可采用其它原料替代呋喃来苏糖以提供中间体，例如IIa和IIb，从而类似地制备本发明的其它化合物。这些化合物含有基团Nx，其可以是式I所示酰基胺-NHC(O)X，或者其可以是受保护的氮，例如可通过常规方法转化成游离胺(-NH2)或式I所示酰基胺-NHC(O)X的叠氮化物(-N3)或琥珀酰亚胺或酰化胺-NHC(O)J。在这些酰化胺中，J可以是任选取代的C1-C10烷基，例如三氟甲基或三氯甲基；或者其可以是任选取代的C1-C10烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、2，2，2-三氯乙氧基或叔丁氧基；或者其可以是任选取代的苄氧基，例如苄氧基、甲氧基苄氧基、二甲氧基苄氧基等。可通过本领域公知的方法将这些基团从氮上除去从而提供游离胺(NH2)，然后可采用常规酰化条件引入式I所示-C(O)X基团使得游离胺(NH2)酰化。可如本文实施例所示，类似地还原和酰化叠氮化物。Nx是酰亚胺时，可通过已知方法，例如用肼处理将其转化成游离胺。
在一个实施方式中，可采用各种其它方法将中间体7或10在游离羟基处烷化或以任何其它方式修饰以得到本发明的各种化合物，所述化合物含有各种线形或支化、饱和或不饱和的R1基团，还可含有脂族或芳族环，杂原子或各种其它官能团。这种方法的代表性例子包括在已知条件，例如用碱促进烷化反应的威廉森醚(Williamson ether)条件下及通常利用膦和偶氮二羧酸酯促进烷化反应的光延(Mitsunobu)条件下用烷化剂R1-LG1烷化式IIa所示醇化合物和用式IIb所示化合物烷化式R1-OH所示醇。
在一些实施方式中，用烷化剂LG1-R1对式IIa所示中间体进行O-烷化从而产生式I所示化合物。R1可以是上述式I中R1的任何基团。在其它实施方式中，制备具有离去基团LG2的式IIb所示中间体，例如可通过常规方法，如用磺酰氯或磺酸酐磺化，或采用已知条件，例如CBr4和三苯基膦转化成卤化物，从式IIa所示化合物制备式IIb所示中间体。然后利用式IIb所示化合物烷化式HO-R1所示醇，从而提供式I所示化合物。这些反应中的R1如上所述，如果其包含游离羟基或游离胺的话可以是受保护的形式。这些反应中的LG1和LG2代表常规离去基团，常选自C1、Br、I和任选取代的烷基或芳基磺酸酯，例如-OSO2-J′，其中J′是任选取代的C1-C10烷基或任选取代的芳基。LG1和/或LG2可代表的合适烷基或芳基磺酸酯包括，例如甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、苯磺酸酯、三氟甲基磺酸酯(三氟甲磺酸酯)等。
虽然利用半乳糖基团上的具体保护基团，通过流程和实例作了说明，但还可利用本领域熟知的和本文简要讨论的其它保护基团。合适的保护基团及加载和除去它们的方法描述于通过引用纳入本文的Wuts和Greene，ProtectiveGroups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基团)，第4版，威利出版社(Wiley Press)(2006)。
流程1说明中间体7的制备。试剂和条件是：a)三-(1-吡咯烷)-膦氧化物；b)i.tBuOK，DMSO，80℃；ii.I2，吡啶/H2O；c)NaBH4，EtOH；d)PivCl，吡啶，DCM，室温；e)氯甲磺酰氯，吡啶；f) NaN3，DMF，85℃；g)Bu4NOH(40％水性)，二噁烷。流程1如下所示：
普通技术人员应知道，在流程1的第一步中可利用其它醇替代受保护的来苏糖引入式I所示化合物的各种Y基团。具体地说，可利用其它受保护的糖引入相对或绝对立体化学性质与该流程所示来苏糖不同的各种Y。
通过烷化羟基，然后将叠氮化物还原成胺，从而不难从化合物7制备本发明的各种化合物，其中所述胺可以通过常规方法酰化，从而加载式I所示化合物的-C(O)-X部分。然后可通过氢解或通过其它方法，例如TMSI除去半乳糖基环上的苄基保护基团；可在温和的酸水溶液条件下除去丙酮化物基团，如下所示并且这是本领域已知的。这些脱保护步骤的顺序不限于所述的顺序。如果利用其它保护基团替代苄基，可通过本领域已知的常规方法除去它们。
流程2说明了中间体10的制备。试剂和条件是：a)Lindlar催化剂，H2，EtOH；b)二十六烷酸，EDC，HOBT，DIPEA；c)Bu4NOH(40％水溶液)，二噁烷。流程2如下所示：
类似地，化合物10或具有不同X基团的化合物10的类似物可用作合成其中基团Z不同的化合物的前体。可以通过各种已知方法引入Z，最著名的是在碱性条件下，利用常规烷化剂，例如烷基卤或烷基硫酸酯或烷基磺酸酯(例如，甲磺酸酯或甲苯磺酸酯等)直接烷化化合物10的伯羟基。一旦加载了所需的X和Z基团，可如上所述使得化合物脱保护。因此，可通过采用本文所述方法制备各种本发明化合物。
流程3说明了通过烷化羟基、引入脂肪酸(仅对11而言)和最终脱保护，利用两种共同中间体7和10得到α-GalCer的某些氧杂-类似物，以获得所选的式I所示化合物。
试剂和条件：a)KOH，18-冠-6，nBuOCH2CH2OMs，THF；b)NaH，nBuOCH2CH2OMs，DMF；c)i.Lindlar催化剂，H2，EtOH；ii.二十六烷酸，EDC，HOBT，DIPEA；c)i.二噁烷配制的4N HCl，DCM-MeOH 5∶1，ii.H2，Pd(OH)2/C，CHCl3-MeOH 1∶3。
对于步骤(b)，利用不同烷化剂类似地制备化合物14-16。利用本领域不难获得的原料，通过这些方法不难制备具有不同X、Y和Z基团的式I所示其它化合物。
在一些实施方式中，本发明化合物可溶于水和水性溶液中。例如，化合物15可溶于水。在一些实施方式中，本发明化合物在水性溶液中的溶解度至少约为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、7.5mg/mL、10mg/mL、12.5mg/mL、15mg/mL、17.5mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、75mg/mL、100mg/mL、150mg/mL或200mg/mL。在其它实施方式中，本发明化合物的水溶性高于其它相当的化合物。
本发明化合物的生物评估利用通过细胞融合而无限增殖化的小鼠Vα14i
NKT细胞得到杂交瘤FF13，而本发明化合物由APC(THP1)呈递。作为检测T细胞激活的手段，通过ELISA试验测定培养48小时后释放入培养基的IL2。
结果显示当由APC呈递给小鼠杂交瘤时，α-GalCer的合成糖脂氧杂-类似物能显著刺激IL释放。与α-GalCer比较显示它们有相似活性，而本发明的一些新型化合物更有效。氧原子替代α-GalCer的亚甲基不影响这些化合物加载到CD1d上以后的功能，并使得它们加载到CD1d上时活力更高并改善它们的药代动力学特性。因此，式I所示化合物可与至少一种抗原联用以增加该抗原所引发的免疫应答。因此，本发明化合物可与一种或多种用于疫苗接种的抗原联用以加强该抗原和疫苗的效力。
递送系统
本发明组合物可包含与药学上可接受的赋形剂混合的至少一种式I所示化合物。可利用疫苗给予这种组合物以接种对象，或者它们可在将疫苗给予待接种对象的同一天给予。所述化合物常与抗原或疫苗混合，二者通过注射或摄取或其它方式而作为一种制剂给予。所述化合物通常作为抗原递送系统的一部分给予，最常见的是与抗原或疫苗混合成一种组合物，可以是任何合适的疫苗组合物。合适的系统包括乳液、脂质体和微粒。因此，组合物可包含，例如加入了上述激动剂的水包油乳液，含有上述激动剂的脂质体或含有和/或展示上述激动剂的微粒。
乳液
已知水包油和油包水乳液可用于疫苗中。优选O/W乳液，这些乳液通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容的。乳液中的油滴直径通常小于5μm，甚至可具有亚微米直径，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳剂。优选小于220nm的液滴，因为它们可进行过滤除菌。
本发明可使用的油诸如动物油(如鱼油)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。坚果油中最常见的是花生油、大豆油、可可油和橄榄油。也可使用获自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可采用其它谷类如小麦、燕麦、裸麦、稻、画眉草(teff)、黑小麦(triticale)等的油。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯(不是种籽油中天然产生的)。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油是可代谢的，因此可用于实施本发明。由动物来源获得纯油的过程中必需的分离、纯化、皂化和其它步骤是本领域众所周知的。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油如鲸蜡代表了可用于本发明的几种鱼油的例子。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，它们总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为鲨烯的支链不饱和类萜，2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，本文特别优选此类萜。鲨烯的饱和类似物鲨烷也是优选的油。鱼油，包括鲨烯和鲨烷易于从商业来源购得，或可通过本领域已知方法获得。其它优选油是生育酚，包括α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚中任一种，但优选α-生育酚(例如，DL-α-生育酚)。可采用油的混合物。
可通过′HLB′(亲水/亲脂平衡)对表面活性剂分类。本发明的优选表面活性剂的HLB为至少10，优选至少15，更优选至少16。可用于本发明的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWF AX出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；乙氧基化的壬基酚，例如TergitolTMNP-40系列；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；以及去水山梨糖醇酯(总称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中包含的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。
可利用表面活性剂的混合物，例如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯山梨糖醇酐酯，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇，例如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的混合物也适用。另一有用的混合物包含月桂醇聚醚9加上聚氧乙烯山梨糖醇酐酯和/或辛苯聚醇。
表面活性剂的含量(重量％)优选为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1％，特别是约0.1％；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1％，特别是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，特别是0.1-1％或约0.5％。本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：
·角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。以体积计，所述乳液的组成可以是约5％角鲨烯，约0.5％聚山梨醇酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例可以是4.3％角鲨烯，约0.5％聚山梨醇酯80和0.48％司盘85。该佐剂称为“MF59”。MF59乳液优选包含柠檬酸离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲液。
·角鲨烯、生育酚和吐温80的乳液。该乳液可包含磷酸缓冲盐水。其还可包含司盘85(例如，1％)和/或卵磷脂。这些乳液可具有2-10％角鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，角鲨烯和生育酚的重量比优选≤1，因为这能提供更稳定的乳液。角鲨烯和吐温80的体积比可以约为5∶2。可将吐温80溶解于PBS中获得2％的溶液，然后将90ml该溶液与(5g DL-α-生育酚和5ml角鲨烯)的混合物混合，随后微流化该混合物来制备这样一种乳液。得到的乳液可具有亚微米油滴，例如平均直径在100-250nm之间，优选约180nm。
·含有聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)、曲通洗涤剂(例如，曲通X-100)和生育酚(例如，α-生育酚琥珀酸酯)的乳液。该乳液所包含的这三种组分的质量比约为75∶11∶10(例如，750μg/ml聚山梨醇酯80，110μg/ml曲通X-100和100μg/ml α-生育酚琥珀酸酯)，这些浓度应包括这些组分与抗原的任何比例。该乳液还可包含角鲨烯。该乳液还可包含3d-MPL。水相可含有磷酸缓冲液。
·角鲨烷、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆401(″PluronicTM L121″)的乳液。可以用磷酸缓冲盐水，pH 7.4配制该乳液。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已与用″SAF-I″佐剂(0.05-1％Thr-MDP、5％角鲨烯烷、2.5％Pluronic L121和0.2％聚山梨醇酯80)配制的苏氨酰-MDP联用。也可不与Thr-MDP联用，例如用″AF″佐剂(5％角鲨烷、1.25％Pluronic L121和0.2％聚山梨醇酯80)配制。优选微流体化。Hariharan等，Cancer Res.VoI 55，3486-89(1995)。
·角鲨烯、生育酚和曲通洗涤剂(例如，曲通X-100)的乳液。该乳液还可包含3d-MPL。该乳液可包含磷酸缓冲液。
·乳液可具有0.5-50％的油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子表面活性剂。如WO 95/11700所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴大小。
·不可代谢的油(例如，轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(例如，卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂偶联物(例如，GPI-0100，经葡糖醛酸的羧基将脂族胺加入脱酰基皂苷产生)、二甲基二(十八烷基)溴化铵和/或N，N-二(十八烷基)-N，N-二(2-羟乙基)丙二胺。
·其中皂苷(例如，QuilA或QS21)和固醇(例如，胆固醇)结合成螺旋状胶束的乳液。参见WO2005/097181。
·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液。参见WO2006/113373。
·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液。参见WO2006/113373。
包含角鲨烯，具有亚微米油滴直径的水包油乳液是理想的。
脂质体
脂质体是基于围绕水性隔室的脂双层的囊泡结构。本领域已知各种类型的脂质体。它们的物理化学特性可能极为不同，例如大小、脂质组成、表面电荷(阳离子、中性或阴离子)和磷脂双层的数量和流动性。例如，它们可只由磷脂(中性和/或带负电)和/或胆固醇构成。它们可以是单层或多层。它们作为佐剂的应用描述于，例如U.S.6,090,406；US 5,916,588；EP-A-0626169。
微粒
微粒作为佐剂的应用已有描述，例如，参见WO 98/33487和VaccineAdjuvants：Preparation Methods and Research Protocols(疫苗佐剂：制备方法和研究方案)，第42卷，Methods in Molecular Medicine(分子医药方法)，O′Hagan编。优选的微粒由生物可降解和无毒的聚合物制得。例如，它们可由选自下组的聚合物制成：聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚己内酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯。还可利用这些聚合物的共聚物，例如D，L-丙交酯和己内酯的共聚物。
优选的聚合物是聚(α-羟酸)，更优选选自下组的那些聚合物：聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)和聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)。最优选的聚合物是聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物，称为“PLG”。优选的聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)聚合物是丙交酯/乙交酯摩尔比范围在25∶75-75∶25，更优选40∶60-60∶40，例如约50∶50的那些聚合物。含有50％D，L-丙交酯和50％乙交酯的50∶50PLG聚合物可提供快速的吸附共聚物，而由于增加了丙交酯成分，75∶25PLG降解的比较慢，85∶15和90∶10降解得更慢。
这些聚合物可采用各种分子量，本领域技术人员不难确定对于给定抗原合适的分子量。对于聚丙交酯，例如合适分子量是约2000-5000的数量级。对于PLG，合适分子量通常是约10,000-约200,000，优选约15,000-约150,000，最优选约50,000-约100,000。有用的范围是30,000道尔顿-70,000道尔顿。
微粒的直径可以是约100nm到约150μm，更优选约200nm到约30μm，最优选约500nm到约10μm。它们通常基本上是球形的。
可采用各种方法制备微粒。例如，双重乳剂/溶剂蒸发技术是已知的，包括形成由聚合物溶液的液滴组成的初级乳剂，然后将其与含有颗粒稳定剂/表面活性剂的连续水相混合。更具体地，水包(油包水)(w/o/w)溶剂蒸发系统可用于形成微粒。在该技术中，特定的聚合物与有机溶剂结合，例如乙酸乙酯、二甲基氯(也称为亚甲基氯或二氯甲烷)、乙腈、丙酮、氯仿等。聚合物以有机溶剂中约2-15％，更优选4-10％，最优选6％的溶液提供。使用，例如匀浆器使聚合物溶液乳化。然后乳剂与较大体积的乳剂稳定剂的水溶液合并，例如聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮。乳剂稳定剂通常以约2-15％溶液提供，更常见是以约4-10％溶液提供。然后使混合物均匀化来生产稳定的w/o/w双重乳剂。然后蒸发有机溶剂。制剂参数应可操作来制备小(＜5μm)和大(＞30μm)的微粒。例如，降低搅拌速率得到较大的微粒，使得内相体积增加。颗粒大小可通过常规方法测定。
还可采用双乳剂技术、单乳剂技术。可采用喷雾干燥和凝聚，或通过空气悬浮包衣技术，例如锅包衣法和Wurster包衣法形成微粒。还可采用离子胶凝作用。
制备后，微粒可直接保存或冷冻干燥待用。
可任选处理微粒使之具有带负电表面(例如，用SDS)或带正电表面(例如，用阳离子去污剂，如CTAB)。表面特征的改变可按照待吸附的抗原而改变吸附特征。
其它免疫活性组分
除了本文所述的化合物，本发明组合物可包含其它免疫刺激性组分。例如，它们可包含以下一种或多种物质：铝盐；钙盐；细胞因子；CD40配体；皂苷；和/或免疫刺激复合物(ISCOM)。然而，在一些实施方式中，该组合物不含这种额外的免疫刺激性组分。
铝盐
本发明组合物中可含有或不含铝盐。合适的盐包括本领域已知的佐剂，例如氢氧化铝和磷酸铝。这些名称是常规名称，但仅为方便使用，因为它们都不是所代表的实际化合物的准确描述。本发明可采用通常用作佐剂的任何″氢氧化物″或″磷酸盐″佐剂。
称为″氢氧化铝″的佐剂一般是羟基氧化铝盐(通常至少部分为晶体)。羟基氧化铝以分子式AlO(OH)表示，其与其它铝化合物，例如氢氧化铝Al(OH)3的区别在于红外(IR)光谱，特别是在1070cm-1处存在吸收带和在3090-3100cm-1处存在强烈的肩峰。Vaccine Design(疫苗设计)，第9章。半峰高处衍射带的宽度(WHH)反映了氢氧化铝佐剂的结晶程度，结晶不佳的颗粒因晶体尺寸较小而显示更强的谱线增宽。表面积随WHH的增加而增加，WHH值较大的佐剂显示吸附抗原的能力较强。氢氧化铝佐剂呈典型的纤维形态(例如，电子透射显微照片所见的)。氢氧化铝佐剂的pI通常约11，即在生理pH下佐剂本身具有表面正电荷。
称为″磷酸铝″的佐剂一般是羟基磷酸铝，也常常含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。可通过沉淀获得这些佐剂，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代该盐中羟基的程度。羟基磷酸盐的PO4/Al摩尔比通常为0.3-1.2。羟基磷酸盐因存在羟基而有别于严格的AlPO4。例如，3164cm-1的IR光谱带(例如，当加热至200℃时)表明存在结构性羟基。VACCINEDESIGN：THE SUBUNIT AND ADJUVANT APPROACH(疫苗设计：亚基和佐剂方法)(Powell和Newman编)，第9章，普莱努出版社(Plenum Press)。
磷酸铝佐剂的PO4/Al3+摩尔比通常为0.3-1.2，优选为0.8-1.2，更优选为0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO4/Al摩尔比为0.84-0.92的无定形的羟基磷酸铝，包含0.6mg Al3+/ml。磷酸铝通常是颗粒(如在透射电子显微镜照片上观察到的板状形态)。抗原吸附后颗粒直径一般是0.5-20μm(如约5-10μm)。
磷酸铝的零点电荷(PZC)与磷酸对羟基的取代程度逆相关，这种取代程度可能取决于用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根＝更多酸性PZC)或加入缓冲剂如组氨酸缓冲剂(使PZC碱性更强)改变PZC。本发明所用的磷酸铝的PZC通常为4.0-7.0，更优选为5.0-6.5，例如约为5.7。
可能使用氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在这种情况下，磷酸铝比氢氧化铝多，例如重量比为至少2∶1，例如≥5∶1、≥6∶1、≥7∶1、≥8∶1、≥9∶1等。
给予患者的组合物中Al+++的浓度优选小于10mg/ml，例如≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选范围是0.3-1mg/ml。优选最高为0.85mg/剂量。
钙盐
本发明组合物中可含有或不含磷酸钙佐剂。各种合适的磷酸钙形式是已知的，例如以下详述的。
《疫苗设计》，第8章讨论了如何在抗原存在下，通过盐的原位沉淀，或通过吸附于预先形成的盐而使抗原吸附于磷酸钙。
其它已知的佐剂包括磷酸钙。据报道，该佐剂是式Ca10-x(HPO4)X(PO4)6-x(OH)2-x所示，表面电荷依赖于pH的非化学计量羟基磷灰石羟基磷酸盐，而不是严格的Ca3(PO4)2，其零点电荷(PZC)为5.5。该佐剂可形成维度约10nmx150nm的针状颗粒以及维度约20-30nm的不规则板状。合适的磷酸钙组合物描述于，例如美国专利号5,676,976；WO00/46147；WO 03/051394；美国专利号6,355,271；美国专利号5,851,670。
磷酸钙佐剂可具有不同的Ca与P摩尔比，例如1.35-1.83。现已发现佐剂的吸附特性根据沉淀期间所用的条件而有所不同，例如，缓慢搅拌得到的佐剂的吸附性能低于快速搅拌形成的佐剂。
以Ca++检测的磷酸钙含量可以为0.1mg/ml-10mg/ml，例如0.5-5mg/ml，优选0.75-3mg/ml、0.9-1.5mg/ml或约1mg/ml。
磷酸钙佐剂能吸附抗原。对于给定抗原，至少80重量％(例如，＞85％、＞90％、＞92.5％、＞95％、＞97.5％、＞97.5％、＞98％、＞99％、＞99.5％等)的抗原总量被吸附。由于磷酸钙佐剂不可溶，通常是颗粒状的，不难通过以下方法检测吸附程度，所述方法涉及离心，然后测定固体或可溶物质(或二者)中的抗原量。
抗原
本发明可利用各种不同抗原，包括细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、原生动物抗原、肿瘤相关抗原等。
细菌抗原可来自细菌，包括但不限于：奈瑟菌(Neisseria)(例如脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)、淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae))、链球菌(Streptococcus)(例如无乳链球菌(S agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(Spyogenes)、变形链球菌(S.mutans))、葡萄球菌(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(S.aureus))、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、梭菌(Clostridium)(例如艰难梭菌(C.difficle)、破伤风梭菌(C.tetani))、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、分枝杆菌(Mycobacterium)(例如结核分枝杆菌(Mtuberculosis))、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、衣原体(Chlamydia)(例如砂眼衣原体(Ctrachomatis)、肺炎衣原体(Cpneumoniae))、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)。
原生动物抗原可来自原生动物，包括但不限于：疟原虫(Plasmodium)(例如镰状疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malariae)、卵形疟原虫(P.ovale))。
病毒抗原可来自病毒，包括但不限于：甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、流感病毒、西尼罗病毒、SARS冠状病毒、人免疫缺陷病毒、呼吸道合胞体病毒、登革热病毒、黄热病病毒、日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、单纯疱疹病毒、E-B病毒、人巨细胞病毒、人乳头状瘤病毒。
抗原可采取各种形式，例如全细菌、全病毒颗粒、灭活的细菌、灭活的病毒颗粒、纯化的蛋白质、纯化的糖、糖偶联物等。然而，可能给予能通过体内翻译原位提供蛋白质的核酸，而非给予蛋白质。
如果利用糖抗原，优选偶联于运载体蛋白以增强免疫原性。可视需要利用任何合适的接头，采用任何合适的偶联反应。
在一些实施方式中，可将抗原偶联于免疫增强剂之一。
药物组合物
本发明药物组合物是药学上可接受的。它们可包含除式I所示免疫增强剂以外的组分。它们通常包含一种或多种药物运载体和/或赋形剂。这种组分的详细讨论见REMINGTION：THE SCIENCE AND PRACTICE OFPHARMACY(雷明顿：药学科学与实践)，第20版，(2000)。
组合物通常是水性形式，它们常是等渗的。为控制张力，优选包含生理盐，例如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其含量可以是1-20mg/ml。可包含的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸二钠脱水物(disodium phosphatedehydrate)、氯化镁、氯化钙等。
组合物的重量克分子渗透压浓度通常是200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选240-360mOsm/kg，更优选290-310mOsm/kg。
组合物可包含一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括：磷酸缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸缓冲剂；琥珀酸缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是含氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸缓冲剂。缓冲剂的含量通常是5-20mM。
组合物的pH通常是5.0-8.1，更常见是6.0-8.0，例如6.5和7.5，或7.0-7.8。
组合物优选无菌。组合物优选无热原，例如每剂量含有＜1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量＜0.1EU。组合物优选无谷蛋白。组合物可包含防腐剂。
可采用适于全身性给药的方式制备制剂。全身性制剂包括设计用于注射(例如，肌肉内、静脉内或皮下注射)的那些，或者可以制成用于透皮、经皮、经粘膜或口服给予的那些。注射方法包括静脉内、肌肉内、皮下和用于内部递送的其它方法。粘膜给药可以是任何合适的粘膜表面。全身性给药可包括相对非介入性方法，例如利用栓剂、透皮贴剂、经粘膜递送和鼻内给药。口服给予也是合适的。合适的形式包括本领域知道的糖浆、胶囊、片剂等。本领域普通技术人员不难为给定对象选择特定途径。例如，如果对象经历恶心和呕吐从而不能有效的口服递送，则利用栓剂的直肠递送常是合适的。透皮贴剂常能在几天内递送控释剂量，因此，对于适合的对象是合适的。
治疗方法
本发明组合物适合给予人患者，本发明提供提升患者中免疫应答的方法，包括将本发明组合物给予患者的步骤。该方法可包括(a)给予包含免疫增强剂和一种或多种抗原的组合物，或(b)共同给予无抗原的免疫增强剂组合物与含抗原的组合物。
本发明还提供用作药物的本发明组合物。
本发明还提供两种或更多种免疫增强剂(如上所述)的组合在制备提升患者免疫应答的药物中的应用。
本发明还提供(i)如上所述两种或更多种免疫增强剂的组合，和(ii)抗原，以便同时、分别或依次用于免疫。
本发明还提供如上所述的抗原和免疫增强剂以便用于(a)制备提升患者免疫应答的药物，或(b)提升患者对该抗原的免疫应答的方法。
这些方法和应用提升的免疫应答通常包括抗体(B细胞应答)反应和/或T细胞应答。
本发明可用于提升粘膜免疫应答，例如包括IgA应答，如分泌型IgA应答。此外，可提升IgG应答。
提供以下实施例是为了增加对本发明某些方面和实施方式的理解，但不应理解成限制本发明的范围。
试剂
所有购买的化学品是试剂级的，无需进一步纯化即可使用。所有溶剂用新鲜活化的4分子筛干燥。
通用信息
利用默克硅胶板60F254，通过分析型薄层层析(TLC)监测反应，并在UV(254)下观察，和/或用5％H2SO4的MeOH溶液、酸性钼酸铈铵或KMnO4染色来观察。用Macherey-Nagel 60硅胶进行快速柱层析。25℃，用300MHzNMR光谱仪记录NMR光谱。在氚化溶剂中测定化学位移(以ppm计)。用300(75MHz)光谱仪获得13C附连质子试验(APT)光谱，相对于氚化溶剂校正。
实施例1
合成共同中间体7
烯丙基2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基-(1→5)-2，3-O-异亚丙基-α-D-呋喃来苏糖苷(1).
向5g 2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基溴[Grayson，E.J.等，J.Org.Chem.(2005)，70，9740-9754](8.34mmol)和1.5g烯丙基2，3-O-异亚丙基-α-D-呋喃来苏糖苷(6.42mmol)的DCM溶液中加入4.4mL三-(1-吡咯烷)-膦氧化物(19.6mmol)[Mukaiyama，T.和Kobashi，Y.，Chem.Lett.(2004)，33，10-11]。室温下，搅拌该混合物24小时，然后用EtOAc稀释，硅藻土过滤。蒸发溶剂后，通过仔细的快速层析(甲苯/EtOAc 95/5)纯化粗品得到4.12g l(85％)。
1H(CDCl3)：δ7.50-7.19(m，20H)，5.92-5.77(m，1H)，5.33-5.13(m，2H)，5.01(br s，1H)，5.00-4.50(m，9H)，4.47(d，J＝I 1.8，1H)，4.41(d，J＝11.8，1H)，4.25(dt，J＝6.1，J＝-3.8，1H)，4.13-3.83(m，7H)，3.58-3.51(m，2H)；1.40(s，3H)，1.26(s，3H).13C(CDCl3)：δ139.01，138.70，138.00，128.44，128.40，128.33，117.51，112.57，105.00，98.00，85.15，79.83，79.03，78.41，75.07，74.87，73.44，73.17，73.08，67.87，26.17，25.04。分析计算值：C45H52O10(752.89)C，71.79；H，6.96。实测值：C，71.66；H，6.88。
2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基-(1→5)-2，3-O-异亚丙基-D-呋喃来苏糖(2).
氩气气氛下，向2,509g(3.33mmol)1的34mL无水DMSO溶液中加入0.56g(5mmol)tBuOK。80℃，搅拌该混合物1.5小时。冷却后，用EtOAc稀释混合物，用水(x1)和盐水(x3)洗涤有机溶液，硫酸钠干燥并蒸发。将残留物溶解在65mL THF中，向该溶液加入13mL水、1.1mL吡啶和1.69g(6.66mmol)碘。室温3小时后，用EtOAc稀释混合物，用5％硫代硫酸钠水溶液、1N HCl、碳酸氢钠的饱和溶液和水洗涤。用硫酸钠干燥该溶液，蒸发溶剂。快速层析(甲苯/AcOEt 90/10)得到2.16g 2(91％)。
1H(CDCl3)：δ7,49-7,20(m，20H)，5.35(brs，1H)，5.00-4.66(m，7H)，4.60-4.52(m，2H)，4.48-4.35(m，3H)，4.11-3.95(m，4H)，3.91-3.75(m，2H)53.55-3.44(br d，2H)，3.40(d，1＝6.1，1H)，3.28(br s，1H)，1.41(s，3H)，1.29(s，3H).13C(CDCl3)：139.O1，138.75，138.70，128.47，128.44，128.37，112.60，101.13，98.39，98.05，96.83，85.54，79.13，78.82，73.50，73.31，73.10，69.33，69.03，68.79，66.50，66.13，60.57，26.15，25.94，25.20，25.00，21.22，20.92，14.30。分析计算值：C42H48O10(712.82)C，70.77；H，6.79。实测值：C，70.92；H，6.61。
(2R，3S，4R)-3，4-O-异亚丙基-1-O-(2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基)-1，2，3，4，5-戊五醇(3).
向2.1g(2.85mmol)2的20mL EtOH溶液中加入140mg(3.56mmol)硼氢化钠。室温下，搅拌该混合物2小时。用EtOAc稀释该混合物，用1N
HCl、碳酸氢钠的饱和溶液和水洗涤。用硫酸钠干燥并蒸发溶剂。快速层析(DCM/MeOH 97∶3)获得1.65g 3(81％)。1H(CDCl3)：7,49-7,20(m，20H)，5.01-4.53(m，7H)，4.47(d，J＝11.8，1H)，4.38(d，J＝11.8，1H)，4.22-3.87(m，9H)，3.81-3.63(m，2H)，3.55-3.44(m，2H)，3.40(dd，J＝8.8，J＝6.1，1H)，2.99(br s，1H)，1.48(s，3H)，1.31(s，3H).13C(CDCl3)：138.72，138.55，138.43，128.53，128.37，128.35，108.42，104.53，98.62，79.11，76.17，74.96，73.80，73.65，73.18，70.03，67.74，61.28，27.17，25.18。分析计算值：C42H50O10(714.84)C，70.57；H，7.05。实测值：C，70.32；H，7.25。
(2R，3S，4R)-3，4-O-异亚丙基-5-O-新戊酰基-1-O-(2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基)-1，2，3，4，5-戊五醇(4).
0℃，在氩气气氛下，向1,265g(1.77mmol)3的28mL无水DCM溶液中加入0.65mL吡啶和0.66mL(5.3mmol)新戊酰氯。将该混合物升温至室温，搅拌过夜。26小时后，用EtOAc稀释该混合物，用1N HCl和盐水(3x)洗涤。硫酸钠干燥有机层并蒸发。快速层析(石油醚/EtOAc 75∶25)获得1.22g 4(86％)。1H(CDCl3)：δ7.52-7.20(m，20H，ArH)4.83(d，J＝3.7，1H)，4.92(d，J＝11.3Hz，，1H)，4.81(d，J＝11.9Hz，1H)，4.80(d，J＝11.3Hz51H)，4.72(d，J＝11.3Hz，1H)，4.65(d，J＝11.9Hz，1H)，4.55(d，J＝11.3Hz，1H)，4.47(d，J＝11.7Hz，，1H)，4.39(d，J＝11.7Hz，1H)，4.26-4.32(m，3H)，4.20(m，1H)，4.03(dd，J＝3.7，9.8Hz，1H)，3.99(t，J＝6.5Hz，1H)，3.95-3.88(m，2H)，3.87(br m，1H)，3.73(dd，J＝6.4Hz，J＝10.4Hz，1H)，3.55(dd，J＝5.8Hz，J＝10.4Hz，1H)，)；3.51-3.41(m，2H)，2.70(d，J＝7.3Hz，1H)1.47(s，3H)，1.31(s，3H)，1.19(s，9H)。13C(CDCl3)；δ：178.28，138.84，138.70，138.61，138.22，128.55，128.40，128.21，128.03，127.84，108.86，98.57，79.16，76.57，76.44，75.27，75.08，74.89，73.65，73.60，73.21，70.73，69.92，69.18，67.91，63.74，38.87，27.33，27.23，25.19。
分析计算值：C47H58O11(798.96)C，70.65；H，7.32。实测值：C，70.64；H，7.44。
(2S，3S，4R)-2-叠氮基-3，4-O-异亚丙基-5-O-新戊酰基-1-O-(2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基)-1，3，4，5-戊四醇(6).
氩气气氛下，向冷却到0℃的1,21g(1.52mmol)4的30mL干燥吡啶溶液中加入1.6mL(1.77mmol)氯甲磺酰氯。将反应升温至室温，搅拌5小时。用EtOAc稀释该混合物。用1N HCl、碳酸氢钠和盐水洗涤有机层，硫酸钠干燥并蒸发。粗品经硅胶垫过滤，无需进一步纯化即可用于下一步骤。
氩气气氛中，将粗品溶解于干燥DMF(12mL)。加入叠氮钠(0.45g)，将混合物加热至85℃保持。2.5小时后，用DCM稀释混合物，用水(3x)洗涤，用硫酸钠干燥有机层并蒸发。快速层析(石油醚/EtOAc 85∶15)得到0.85g 4(72％，两步)。
1H(CDCl3)：δ7.48-7.20(m，20H)，4.98-4.39(m，9H)，4.38-4.27(m，2H)，4.24-4.16(m，2H)，4.14-4.03(m，2H)，4.01-3.91(m，3H)，3.74(dd，J＝10.7Hz，J＝5.8Hz，1H).3.55-3.43(m，3H)，1.40(s，3H)51.27(s，3H)，1.19(s，9H).13C(CDCl3)；δ：178.3，138.9，138.7，138.1，128.4，128.3，127.9，127.7，109.1，98.9，78.7，76.6，75.3，74.9，74.3，73.5，73.3，73.0，70.0，69.2，69.1，62.5，59.2，38.9，27.8，27.3，25.5。分析计算值：C47H57N3O10(823.97)C，68.51；H，6.97；N，5.10。实测值：C，68.83；H，6.71；N，4.96。
(2S，3S，4R)-2-叠氮基-3，4-O-异亚丙基-1-O-(2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基)-1，3，4，5-戊四醇(7).
向0.5g(0.6mmol)6的二噁烷(20mL)溶液中加入1.7mL四丁铵氢氧化物的溶液。搅拌该混合物72小时，然后用EtOAc稀释。用1N HCl、盐水洗涤有机层，用硫酸钠干燥并蒸发。粗品经快速层析(石油醚/EtOAc70∶30)得到0.35g(78％)7。
1H(CDCl3)：δ7.56-7.26(m，20H)，4.96-4.52(m，7H)，4,47，(d，J＝11.8，1H)，4,39，(d，J＝11.8，1H)，4.25-4.20(m，2H).4.19-3.90(m，5H)，3.81(dd，，＝10.1，J＝2.4，1H)，3.74-3.64(m，2H)，3.55-3.43(m，2H)，1.40(s，3H)，1.29(s，3H)。13C(CDCl3)；δ：138.91，138.38，138.32，137.56，128.44，128.34，127.67，109.01，98.92，78.74，76.63，76.52，75.29，74.82，74.71，73.54，73.43，72.92，72.17，69.92，69.5，61.14，59.68，27.52，25.73。分析计算值：C42H49N3O9(739.85)C，68.18；H，6.68；N，5.68。实测值：C，68.42；H，6.41；N，5.86。
实施例2
合成共同中间体10
(2S，3S，4R)-2-(N-二十六烷酰基(esacosanoyl)氨基)-3，4-O-异亚丙基-5-O-新戊酰基-1-O-(2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基)-1，3，4，5-戊四醇(9).
氢气气氛下，向0.5g(0.6mmol)6的EtOH(40mL)溶液中加入催化量的Lindlar催化剂，搅拌该混合物4.5小时。0,107g二(15)0,07)。用DCM稀释该混合物，经硅藻土过滤得到0.5g粗制胺8，其直接用于下一步骤。
0℃，氩气气氛中，向20mL无水DCM-DMF的3∶1混合物配制的化合物8溶液中加入296mg(0.75mmol)二十六烷酸。向该悬浮液中加入EDC(145mg，0.75mmol)、HOBT(102mg，0.75mmol)，最终加入DIPEA(0.26ml，1.5mmol)的DCM溶液。20小时后，用EtOAc稀释混合物，用1N HCl、碳酸氢钠的饱和溶液和盐水洗涤，硫酸钠干燥并蒸发溶剂。快速层析(石油醚/AcOEt 80∶20)得到534mg 9(72％，两步)。1H(CDCl3)：δ7.56-7.26(m，20H)，6.43(d，J＝9.2Hz，1H)，4.96-4.55(m，6H)，4.85(d，J＝3.9Hz，1H)4,48，(d，J＝11.8，1H)，4,36，(d，J＝11.8，1H)，4.28-3.80(m，10H)，3.62-3.50(m，2H)；3.35(dd，J＝9.8Hz，J＝5.5Hz，1H)，2.03(t，J＝7.3Hz，2H)，1.6-1.5(m，2H)，1.42(s，3H)，1.28(s，3H)，1.25-1.22(m，46H)，1.18(s，9H)，0.87(t，J＝6.7Hz).13C(CDCl3)；δ：178.15，172.95，138.65，138.39，138.33，137.51，128.55，128.50，128.39，128.18，128.02，127.91，127.72，127.60，108.86，99.94，79.01，76.85，75.44，74.73，74.68，74.28，73.73，73.06，70.64，70.17，69.68，62.83，48.47，38.78，36.74，32.01，29.80，29.68，29.54，29.46，27.84，27.27，25.82，25.55，22.78，14.22。分析计算值：C73H109NO11(1176.65)C，74.52；H，9.34；N，1.19。实测值：C，74.81；H，9.47；N，1.06。
(2S，3S，4R)-2-(N-二十六烷酰基(esacosanoyl)氨基)-3，4-O-异亚丙基-1-O-(2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基)-1，3，4，5-戊四醇(10).
如以上制备化合物7所述从500mg 9获得化合物10。通过快速层析(石油醚/EtOAc 50∶50)纯化产物获得345mg(76％)化合物10。1H(CDCl3)：δ7.54-7.26(m，20H)，6.63(m，1H)，4.95-4.54(m，7H)，4,46，(d，J＝11.6，1H)，4,35，(d，J＝11.6，1H)，4.21-4.09(m，2H)，4.09-3.80(m，7H)，3.60-3.40(m，3H)，3.35(dd，J＝9.5Hz，J＝5.2，Hz，1H)，2.44(br s，1H)，2.03(m，1H)，1.6-1.5(m，2H)，1.39(s，3H)，1.29(s，3H)，1.25-1.22(m，46H)，0.86(t，J＝6.7Hz)。13C(CDCl3)；δ：173.47，138.52，138.33，138.28，137.73，128.61，128.52，128.40，128.21，128.03，127.92，127.73，127.61，108.35，100.21，78.96，77.97，74.98，74.80，74.60，73.80，73.01，70.63，69.98，69.63，61.04，47.99，36.68，32.11，29.81，29.74，29.62，29.49，28.34，25.76，25.36，22.98，14.24。分析计算值：C68H101NO10(1092.53)C，74.76；H，9.32；N，1.28。实测值：C，74.45；H，9.21；N，1.16。
实施例3
合成α-GalCer的氧杂类似物
(2S，3S，4R)-2-叠氮基-(2-丁氧基乙基)-3，4-O-异亚丙基-1-O-(2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基)-1，3，4，5-戊四醇(11).
氩气气氛下，向100mg(0.135mmol)7的无水DMF(3mL)溶液中加入60％NaH(11mg，0.27mmol)和2-丁氧基乙基甲磺酸酯(75mg，0.4mmol)。100℃，搅拌该混合物2小时。再加入2当量的NaH和2-丁氧基乙基甲磺酸酯。再2小时后，用EtOAc稀释的氯化铵(饱和溶液)终止该混合物，用水(4x)洗涤，用硫酸钠干燥并蒸发。快速层析(石油醚/AcOEt 80∶20)得到74mg(65％)11。
1H(CDCl3)：δ7.51-7.18(m，20H)，4.94(m，1H)，4.86-4.50(m，6H)，4.47(d，J＝I 1.8Hz，1H)，4,36(d，J＝I 1.8Hz，1H)；4,33(m，1H)，4.15-3.94(m，6H)，3.80(dd，J＝10.4，J＝4.3，1H)，3.72-3.44(m，8H)，1,56(m，2H)，1,40(s，3H)，1.36(m，2H)，1.27(s，3H)，0,90(t，J＝7.2Hz，3H).13C(CDCl3)：δ138.97，138.45，138.37，137.60，128.36，128.31，127.66，109.00，98.91，78.75，76.67，75.34，74.81，74.68，73.53，73.38，72.81，71.27，70.96，70.09，69.64，69.20，69.06，59.61，32.00，28.01，26.00，25.54，14.89。分析计算值：C48H61N3O10(840.01)C，68.63；H，7.32；N，5.00。实测值：C，68.81；H，7.16；N，4.83。
(2S，3S，4R)-5-O-(2-丁氧基乙基)-2-(N-二十六烷酰基(exacosanoyl)氨基)-3，4-O-异亚丙基-1-O-(2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基)-1，3，4，5-戊四醇(12).
从10开始：向100mg(92mmol)10的溶液中加入10mg KOH和20mg(0.1mmol)2-丁氧基乙基磺酸酯。40℃，搅拌该混合物20小时，然后用EtOAc稀释。用盐水洗涤有机层，硫酸钠干燥，并蒸发。快速层析(甲苯/EtOAc 80∶20)得到75mg(68％)12。
从11开始：按照以上从6制备9相同的方法获得化合物12，产率为69％。
1H(CDCl3)：δ7.52-7.25(m，20H)，6.42(d，J＝8.8Hz，1H)，4.94-4.87(d，J＝3.8，1H)，4.82-4.55(m，6H)，4.44(d，J＝11.8Hz，1H)，4.38(d，J＝11.8Hz，1H)，4.21(m，IH)，4.14-3.88(m，6H)，3.63-3.28(m，9H)，2,03(m，2H)，1.81-1.48(m，4H)，1,43(s，3H)，1.32(s，1H)，1.27-1.10(m，46H)，0.92-0.80(m，6H)。13C(CDCl3)：δ172.84，138.45，138.37，137.59，128.49，128.47，128.05，108.72，99.62，79.03，76.70，73.68，73.56，73.03，71.05，70.92，65.34，48.02，36.79，32.03，31.77，29.57，29.46，28.05，25.89，22.80，19.35，14.03。分析计算值：C74H113NO11(1192.69)C，74.52；H，9.55；N，1.17。实测值：C，74.31；H，9.67；N，1.09。
(2S，3S，4R)-5-O-(2-丁氧基乙基)-2-(N-二十六烷酰基(exacosanoyl)氨基)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-1，3，4，5-戊四醇(13).
0℃，向70mg(0.06mmol)12的4mL二噁烷溶液中加入0.08mL二噁烷配制的4N HCl。将该混合物升温至室温，并搅拌4小时。
蒸发溶剂，粗产物可直接用于下一步骤。
将该粗产物溶解于2mL CHCl3/MeOH混合物中。加入30mg 10％Pd(OH)2/C，氢气气氛下搅拌该混合物3小时。该混合物经硅藻土过滤，蒸发溶剂。快速层析(DCM/MeOH 90∶10)得到29mg(62％，两步)13。
1H(CDCl3/CD3OD 1∶1)：δ4.87(d，J＝2.9Hz，1H)，4.21(m，1H)，4.00-3.50(m，14H)，3.46(t，J＝6.7Hz，2H)，3.30(m，2H)，2.18(br t，J＝7.3，2H)，1.61-1.44(m，4H)，1.40-1.21(m，46H)，0.95-0.80(m，6H).13C(CDCl3/CD3OD 1∶1)：δ174.72，99.82，72.57，72.00，71，20，70.94，70.42，70.38，70.16，69.84，69.74，68.90，66.92，61.66，50.06，36.32，31.87，31.46，29.61，29.49，29.29，25.85，22.59，19.08，13.71，13.51。分析计算值：C43H85NO11(792.14)C，65.20；H，10.82；N，1.77。实测值：C，64.91；H，11.03；N，1.61。
化合物14和15可以类似方式获得。
实施例4
鼠NKT细胞系通过糖脂识别而分泌IL-2
糖脂：如上所述合成所有α-GalCer类似物。按照文献方法合成α-GalCer[Figueroa-Perez，S.和Schmidt，R.R.(2000)Carbohydr.Res，328，95-102]。
过度表达CD1d受体的THP1(人急性单核细胞性白血病细胞系)用作APC(抗原呈递细胞)并在RPMI培养基(谷氨酰胺2mM，丙酮酸钠1mM，非必需氨基酸1％，卡那霉素100μl/ml，FBS 10％，β-巯基乙醇0.01mM)中培养。
对激活起反应而分泌IL-2的CD1d反应性小鼠T细胞杂交瘤FF13用于评估化合物。FF13细胞培养在RPMI 1640培养基中(谷氨酰胺2mM，丙酮酸钠1mM，非必需氨基酸1％，卡那霉素100μl/ml，FBS 10％，β-巯基乙醇0.01mM)。
THP1hCD1d(人CD1D转染的人THP-1细胞)和小鼠NKT-细胞杂交瘤FF 13由巴塞尔大学医院(University Hospital Basel)提供。
制备化合物的DMSO储备溶液(1mg/mL)，稀释至不同浓度：10μg/ml；1,1μg/ml；0.37μg/ml；0.12μg/ml；0.04μg/ml；0.01μg/ml。
FF13刺激
在96多孔(板)中，给90μl无血清培养基中的THP1(APC)(5x104个细胞)加载10μl化合物溶液并温育2小时。
加入100μl完全培养基配制的FF 13(每孔10x104)，48小时后，该试验评估IL2产量。
利用第一单克隆抗-小鼠IL-2抗体(研发系统公司(R&D System))并利用SIGMA FAST OPD作为显色剂，通过ELISA评估IL2浓度，所述抗体是生物素化的抗-小鼠IL-2抗体(研发系统公司)。利用重组小鼠IL2(研发系统公司)作为标准品，一式三份进行所有试验。
图2描述了在NKT细胞杂交瘤试验中，与α-GalCer本身的作用相比，用化合物13-16处理的细胞释放的IL2水平。将α-GalCer特异性NKT杂交瘤细胞加入接触各种剂量测试化合物(约0.1-10μg/mL)的CD1d-转染THP-1细胞中，48小时后测定培养基中的IL-2水平。化合物13和16在10微摩尔时与α-GalCer等效，其它化合物效力略低。因此，将氧插入神经酰胺化合物的烷基未对活性产生破坏作用，并且可对烷基作出显著改变而活性改变较小。
实施例5
合成α-Gal GG和αGal LP的体内比较
比较两类不同来源的合成α-GalCer。在有流感抗原存在下，在成年Balb/C小鼠体内比较合成的“α-Gal GG”和“α-Gal LP”的作用。最初提供的两种α-GalCer溶解于H2O和0.5％吐温20。单独或与MF59水包角鲨烯乳液组合给予该吐温20溶解的物质。将α-GalCer加入MF59(非-配制的)或掺入MF59(配制的)。
8只成年小鼠(7周)的组经历2次免疫，间隔3周。此外，一组小鼠不给予任何疫苗组合物，用作对照。免疫组合物包含流感抗原“Flu”，对于每次免疫，各小鼠接受0.1μg A/Solomon H1N1、0.1μg A/Wisconsin H3N2或0.1μg B/Malaysia流感抗原。对于用α-GalCer处理的小鼠，各小鼠每次免疫接受0.1μgα-GalCer。通过在腿部肌肉内注射50μL组合物给予免疫。首次免疫后三周，给予第二次免疫，其中在另一条腿中给予额外50μL疫苗。以下组合物各给予一组小鼠：
Flu；
Flu和MF59；
Flu和a-Gal GG
Flu和MF59和a-Gal GG
Flu和MF59和a-Gal GG，配制的；
Flu和a-Gal LP
Flu和MF59和a-Gal LP
Flu和MF59和a-Gal LP(配制的)。
给予第二次免疫后两周评估对疫苗接种组合物的免疫应答。记录HI(血凝抑制反应)滴度和IgG滴度的检测值并用作免疫应答的指标。采用HI试验检测HI滴度，通过ELISA检测IgG滴度。结果总结于图3、4和5，分别显示了对H3N2(A/Wisconsin)起反应的HI滴度，对B(B/Malaysia)、H1N1(A/Solomon)和H3N2(A/Wisconsin)起反应的IgG滴度；以及IgG滴度亚类。
实施例6
合成α-Gal LP及其衍生物的体内比较
用流感抗原在成年Balb/C小鼠体内比较化合物a-Gal LP、13、14、15和16的作用。化合物13-16如说明书所述合成。
8只成年小鼠(7周)的组经历2次免疫，间隔3周。此外，4只小鼠未给予任何疫苗组合物，用作对照组。免疫组合物包含流感抗原“Flu”，其包含2008/09毒株，即A/Brisbane/59/2007-样、A/Brisbane/10/2007-样和B/Florida/4/2006-样中任一种的0.1μg血凝素。对于用a-GalCer处理的小鼠，各小鼠每次免疫接受0.1μg a-GalCer。通过在腿部肌肉内注射50μL组合物给予免疫。首次免疫后三周，给予第二次免疫，其中在另一条腿中给予额外50μL疫苗。以下组合物各给予一组小鼠：
Flu；
Flu和MF59佐剂；
Flu和a-Gal LP
Flu和化合物13(H2O/吐温200.5％)、14(H2O/吐温200.5％)、15(H2O)或16(H2O/吐温200.5％)；
Flu和MF59/a-Gal LP；和
Flu和MF59/化合物13、14、15或16
给予第二次免疫后两周评估对疫苗接种组合物的免疫应答。记录HI(血凝抑制反应)滴度、IgG和IgG亚类滴度的检测值并用作免疫应答的指标。采用HI试验检测HI滴度，通过ELISA检测IgG滴度。

Claims (10)

1.式I所示化合物或其药学上可接受的盐：
式中R2、R3、R4和R5各自独立表示H或保护基团，所述保护基团选自甲基、甲酰基、乙酰基、甲氧基乙酰基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、甲氧基甲基、2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基、苄基、烯丙基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、三氯乙氧基羰基、苄氧基羰基、丙酰基、新戊酰基、苯甲酰基、叔丁氧基羰基苄基、甲氧基苄基或二甲氧基苄基；
X是C4-C30烃基；
Y是-CH(OH)-CH(OH)-CH2-；和
Z是-OR1，其中R1是：(i)(CH2)m-O-R1b，其中m是1-6，R1b是C1-C16烷基；(ii)C4-C20烷基；(iii)连接于环烷基的C1-C6亚烷基链；或(iv)连接于芳基的C1-C6亚烷基链。
2.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，X是具有10-30个碳的未取代烷基。
3.如权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，-Y-Z是
4.如权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，Z是-O-R1，而R1是(CH2)m-O-R1b，其中m是1-6，R1b是C1-C16烷基。
5.如权利要求1-4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，R2、R3、R4和R5各自是H。
6.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自以下的化合物13、14、15和16或其药学上可接受的盐：
7.一种免疫原性组合物，其包含如权利要求1-6中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐和抗原。
8.式I所示化合物或其药学上可接受的盐在制备提高接受抗原的对象中该抗原引发的免疫应答的药物中的用途：
式中R2、R3、R4和R5各自独立表示H或保护基团，所述保护基团选自甲基、甲酰基、乙酰基、甲氧基乙酰基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、甲氧基甲基、2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基、苄基、烯丙基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、三氯乙氧基羰基、苄氧基羰基、丙酰基、新戊酰基、苯甲酰基、叔丁氧基羰基苄基、甲氧基苄基或二甲氧基苄基；
X是C4-C30烃基；
Y是-CH(OH)-CH(OH)-CH2-；和
Z是-OR1，其中R1是：(i)(CH2)m-O-R1b，其中m是1-6，R1b是C1-C16烷基；(ii)C4-C20烷基；(iii)连接于环烷基的C1-C6亚烷基链；或(iv)连接于芳基的C1-C6亚烷基链。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述抗原和式I所示化合物或其药学上可接受的盐同时或在同一天给予。
10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述抗原选自：细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、原生动物抗原和肿瘤相关抗原。
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