CN102057046A - 固定的产物耐受的微生物 - Google Patents

Abstract

提供了用于适应或选择具有提高的产物耐受性的微生物的方法。另外，公开了能够以填充床或流化床操作的生物反应器，以及使用该生物反应器培养被适应或选择增加的产物耐受性的微生物的方法。

Description

固定的产物耐受的微生物

交叉引用

本申请要求享有2008年4月9日提交的美国临时专利申请第61/043,710号的权益，通过引用将其整体并入本文。

发明背景

在石油化学工业兴起之前，工业规模的发酵在历史上是为溶剂和酸的生产而进行的。对污染、气候变化和产生的环境退化的关注已更新了兴趣，特别是在低成本或低污染的生物物质(biomatter)可作为原料利用的领域。在经济上制约更为普及的采用的一个问题是从通常见于发酵培养液的低浓度回收发酵产物所需的高能耗。由于这些化合物对培养的微生物的毒性，提高发酵培养液中产物浓度的努力取得了有限的成功。制约基于生物产物的发酵的经济可行性的另一个问题是发酵过程的生产率。生产率的提高导致设备资本的改良利用。

本发明详述了出人意料的发现，即产生产物的微生物的菌株、环境分离株、或突变体可以就其同时存在的在固体支持体上生长和耐受高浓度产物的能力而适应或选择，并且如果产生产物的微生物的这些菌株、环境分离株或突变体被固定在固体支持体上而不是作为悬浮培养物培养，那么它们在培养物中保留较高的产物耐受性。改进整体培养物生产率并降低能量利用的较高产物浓度现在是可能的。增加的产物耐受可能依赖于已知抑制剂的抑制作用降低，所述抑制剂例如HMF、糠醛(fufural)、乙酰丙酸(levulenic acid)、葡糖醛酸或乙酸，它们可能是由生物体产生的或者存在于最初的进料中。

发明概述

本发明的一个方面包括一种方法，该方法包括在生产溶剂的发酵工艺中培养固定在固体支持体上的微生物的步骤，其中所述微生物是突变体并且表现出相比于相应的非突变微生物的溶剂耐受性至少125％的对溶剂的耐受性。

在该方法的一些实施方案中，突变微生物表现出至少150％的对溶剂的耐受性。在该方法的一些实施方案中，突变微生物表现出至少200％的对溶剂的耐受性。在该方法的一些实施方案中，突变微生物表现出至少250％的对溶剂的耐受性。在该方法的一些实施方案中，突变微生物表现出至少500％的对溶剂的耐受性。在该方法的一些实施方案中，突变微生物表现出至少1,000％的对溶剂的耐受性。

在该方法的一些实施方案中，培养微生物的步骤是在包含容器、固体支持体和生长培养基的生物反应器中进行的。在该方法的一些实施方案中，微生物包括细菌或真菌。在该方法的一些实施方案中，微生物包括单个物种。在该方法的一些实施方案中，微生物包括来自同一物种的菌株的混合培养物。在该方法的一些实施方案中，微生物包括不同物种的混合培养物。在该方法的一些实施方案中，微生物包括环境分离株。

在该方法的一些实施方案中，微生物包括以下属：梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、乳杆菌属(Lactobacillus)、或芽孢杆菌属(Bacilus)。在该方法的一些实施方案中，微生物包括丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、紫色梭菌(Clostridium puniceum)、糖丁酸梭菌(Clostridium saccharobutylicum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)、金黄丁酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)、假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)或热解糖梭菌(Clostridium thermosaccharolyticum)。

在该方法的一些实施方案中，突变微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌，并且表现出对至少2％丁醇的耐受性。在该方法的一些实施方案中，突变微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌，并且表现出对至少2.5％丁醇的耐受性。在该方法的一些实施方案中，突变微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。在该方法的一些实施方案中，突变微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌，并且表现出对至少5％丁醇的耐受性。在该方法的一些实施方案中，突变微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。在该方法的一些实施方案中，突变微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌，并且表现出对至少10％丁醇的耐受性。在该方法的一些实施方案中，突变微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌，并且表现出对至少12％丁醇的耐受性。在该方法的一些实施方案中，突变微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌，并且表现出对至少15％丁醇的耐受性。

在一些实施方案中，本方法包括通过使包含突变细胞的发酵培养基循环经过生物反应器来将突变微生物固定在固体支持体上的步骤。在该方法的一些实施方案中，微生物处于对数生长状态。

在该方法的一些实施方案中，根据在第一固体支持体上的溶剂耐受性对微生物进行选择，然后将微生物培养在固定的第二固体支持体上。在该方法的一些实施方案中，第一固体支持体包括琼脂。

在该方法的一些实施方案中，在第一固体支持体上选择之前将微生物培养在包含诱变剂的液体培养基中。在该方法的一些实施方案中，固体支持体包括多孔材料。在该方法的一些实施方案中，固体支持体包括选自由以下组成的组的材料：骨炭、合成聚合物、天然聚合物、无机材料或有机材料。在该方法的一些实施方案中，固体支持体包括所述组中的两种或多种材料的复合材料。在该方法的一些实施方案中，固体支持体包含有机材料，包括原料。在该方法的一些实施方案中，原料包括玉米淀粉或纤维素生物质。在该方法的一些实施方案中，固体支持体包括细胞生物质或细胞生物质的团聚物。在该方法的一些实施方案中，固体支持体包括在梅拉德反应过程中形成的有机分子。在一些实施方案中，固体支持体包括在培养基中形成的有机沉淀。

在该方法的一些实施方案中，发酵工艺包括使用串联或平行排列的至少两个生物反应器。在一些实施方案中，本方法包括在至少两个生物反应器的至少一个中使用悬浮培养。在该方法的一些实施方案中，至少两个生物反应器的至少一个的发酵工艺是连续培养。在该方法的一些实施方案中，至少一种连续培养物接收来自另一种培养物的发酵流出液。在该方法的一些实施方案中，至少一种连续培养物具有比产生发酵流出液的培养物高的溶剂耐受性。在该方法的一些实施方案中，发酵工艺包括分批培养、补料-分批培养或连续培养。在该方法的一些实施方案中，发酵工艺包括提取发酵，其中溶剂产物被连续提取。在该方法的一些实施方案中，发酵工艺是需氧的、厌氧的或微需氧的。

在该方法的一些实施方案中，连续培养包括连续加入新鲜培养基，并从培养物中连续移除发酵流出液。在该方法的一些实施方案中，连续培养包括使突变微生物保持在对数生长状态中。在该方法的一些实施方案中，固定的突变微生物包括对至少2％丁醇耐受的梭菌。

在该方法的一些实施方案中，溶剂选自由醛、酮或醇组成的组。在该方法的一些实施方案中，溶剂包括选自以下醛：乙醛、丁醛或丙醛。在该方法的一些实施方案中，溶剂包括选自以下酮：丙酮或丁酮。在该方法的一些实施方案中，溶剂包括选自以下醇：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、1，3-丙二醇、2，3-丙二醇、2，3-丁二醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-苯基乙醇和丙三醇。

本发明的一个方面包括包含生物反应器的系统，所述生物反应器包含与固体支持体接触的生长培养基和固定在该固体支持体上的微生物，其中所述微生物是突变微生物，它们表现出与相应的非突变微生物的溶剂耐受性相比至少125％的对溶剂的耐受性。

在该系统的一些实施方案中，突变微生物表现出至少150％的对溶剂的耐受性。在该系统的一些实施方案中，突变微生物表现出至少200％的对溶剂的耐受性。在该系统的一些实施方案中，突变微生物表现出至少250％的对溶剂的耐受性。在该方法的一些实施方案中，突变的微生物表现出至少500％的对溶剂的耐受性。在该方法的一些实施方案中，突变的微生物表现出至少1,000％的对溶剂的耐受性。

在该系统的一些实施方案中，生物反应器还包括厌氧的或微需氧的环境。在一些实施方案中，该系统包括至少一个其他的生物反应器，其中这些生物反应器被串联或平行排列。在一些实施方案中，该系统包括至少两个生物反应器，所述生物反应器包含来自不同物种的微生物或来自同一物种的不同菌株。在一些实施方案中，该系统包括包含悬浮的微生物的至少一个生物反应器和包含固定的微生物的至少一个生物反应器。在一些实施方案中，该系统包含串联排列的两个生物反应器，其中来自串联的第一生物反应器的流出液构成第二生物反应器的原料流。

在一些实施方案中，该系统适合于分批培养、补料-分批培养或连续培养。在一些实施方案中，该系统适合于提取发酵，其中溶剂产物被连续提取。在一些实施方案中，该系统包括用于将微生物保持在连续培养物中的装置。在该系统的一些实施方案中，发酵工艺是连续培养，还包括在溶剂纯化过程中回收的发酵培养液的养分和矿物质的再循环和再利用。

在该系统的一些实施方案中，根据在第一固体支持体上的溶剂耐受性对微生物进行选择，然后将微生物培养在固定的第二固体支持体上。在该系统的一些实施方案中，第一固体支持体包括琼脂。在该系统的一些实施方案中，在第一固体支持体上选择之前将微生物培养在包含诱变剂的液体培养基中。

在该系统的一些实施方案中，固体支持体包括多孔材料。在该系统的一些实施方案中，固体支持体包括选自由以下组成的组的材料：骨炭、合成聚合物、天然聚合物、无机材料或有机材料。在该系统的一些实施方案中，固体支持体包含有机材料，包括原料。在该系统的一些实施方案中，固体支持体包含原料，原料包括玉米淀粉或纤维素生物质。在该系统的一些实施方案中，固体支持体包括所述组中的两种或多种材料的复合材料。

在该系统的一些实施方案中，微生物包括细菌和/或真菌。在该系统的一些实施方案中，微生物包括单个物种。在该系统的一些实施方案中，微生物包括来自同一物种的菌株的混合培养物。在该系统的一些实施方案中，微生物包括不同物种的混合培养物。在该系统的一些实施方案中，由微生物的一个物种或混合培养物种产生的发酵培养物被转移至包含不同物种或混合培养物种的另一发酵培养物中。

在该系统的一些实施方案中，微生物包括以下属：梭菌属、肠球菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属或芽孢杆菌属。在该系统的一些实施方案中，微生物包括丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、紫色梭菌、糖丁酸梭菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、金黄丁酸梭菌、假破伤风梭菌或热解糖梭菌。

在该系统的一些实施方案中，突变的微生物是丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌。在该系统的一些实施方案中，突变的微生物是丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，并且表现出对至少2％丁醇的耐受性。在该系统的一些实施方案中，突变的微生物是丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，并且表现出对至少2.5％丁醇的耐受性。在该系统的一些实施方案中，突变的微生物是丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，并且表现出对至少5％丁醇的耐受性。在该系统的一些实施方案中，突变的微生物是丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，并且表现出对至少10％丁醇的耐受性。在该系统的一些实施方案中，突变的微生物是丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，并且表现出对至少12％丁醇的耐受性。在该系统的一些实施方案中，突变的微生物是丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，并且表现出对至少15％丁醇的耐受性。

在本发明的一个方面，提供了用于在生物反应器中制备产物的方法，该方法包括：i)培养微生物，所述微生物被适应或诱变使得表现出与相应非适应的或非诱变的微生物的产物耐受性相比对产物至少150％的产物耐受性；和ii)收获所述产物。在一些实施方案中，适应的微生物或突变的微生物表现出对产物至少200％的耐受性、对产物至少500％的耐受性或对产物至少1000％的耐受性。

在本发明的一些实施方案中，微生物包括细菌或真菌。在一些实施方案中，微生物包括单个物种，而在其他实施方案中微生物包括来自同一物种或不同物种的菌株的混合培养物。在一些实施方案中，微生物处于对数生长状态。

在一些实施方案中，微生物包括以下属：梭菌属、肠球菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属或芽孢杆菌属。在其他实施方案中，微生物包括丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、紫色梭菌、糖丁酸梭菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、金黄丁酸梭菌、假破伤风梭菌或热解糖梭菌。在一些实施方案中，这些梭菌属物种产生丁醇。在其他实施方案中，丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌表现出对至少2％丁醇、至少2.5％丁醇、至少5％丁醇、至少10％丁醇、至少12％丁醇或至少15％丁醇的耐受性。

在一些实施方案中，微生物被固定在固体支持体上。在其他实施方案中，通过使包含适应的细胞或突变的细胞的发酵培养基循环经过生物反应器来完成固定。在一些实施方案中，循环的发酵培养基包含固定在固体支持体上的适应的微生物或突变的微生物。

在一些实施方案中，根据在第一固体支持体上的产物耐受性对微生物进行选择，然后将微生物培养在固定的第二固体支持体上。在一些实施方案中，第一固体支持体包括琼脂。在一些实施方案中，与在液体培养基中表现出的产物耐受性相比，微生物在固体支持体上表现出增强的产物耐受性。在其他实施方案中，固体支持体是半固体或固体。在其他实施方案中，固体支持体包括多孔材料。仍在其他实施方案中，固体支持体包括选自由以下组成的组的材料：骨炭、合成聚合物、天然聚合物、无机材料或有机材料。在一些实施方案中，固体支持体包括所述组中的两种或多种材料的复合材料。在其他实施方案中，固体支持体包含有机材料，包括原料。在其他实施方案中，原料包括玉米淀粉或纤维素生物质。在其他实施方案中，有机物包括细胞生物质或细胞生物质的团聚物。在另一实施方案中，有机物包括在原料准备过程中和/或在发酵过程中形成的沉淀。仍在其他实施方案中，固体支持体包括在梅拉德反应过程中形成的有机分子。

在一些实施方案中，培养步骤包括使用串联或平行排列的至少两个生物反应器。在一些实施方案中，在所述至少两个生物反应器中包括至少一个悬浮培养。在其他实施方案中，在至少两个生物反应器的至少两个中使用固定的培养物。在其他实施方案中，至少两个生物反应器中的至少一个是连续培养。在其他实施方案中，至少一种连续培养物接收来自另一种培养物的发酵流出液。仍在其他实施方案中，至少一种连续培养物具有比产生发酵流出液的培养物更高的产物耐受性。

在一些实施方案中，培养步骤包括以分批培养、补料-分批培养或连续培养而培养微生物。在其他实施方案中，培养步骤是在填充床生物反应器或流化床生物反应器中进行的。仍在其他实施方案中，流化床生物反应器是一种膨胀床生物反应器。在一些实施方案中，培养步骤是在适合于以填充床或流化床模式操纵的生物反应器中进行的。

在一些实施方案中，生物反应器包括：a)填充床区，所述填充床区适合于容纳固体支持体；b)床膨胀区，所述床膨胀区与所述填充床区接合，当以膨胀床模式操纵所述生物反应器时，所述床膨胀区适合于容纳所述固体支持体；和c)颗粒脱离区(particle disengagement zone)，所述颗粒脱离区与所述床膨胀区接合，所述颗粒脱离区适合于防止所述固体支持体从所述生物反应器中出去。

在一些实施方案中，生物反应器还包括与填充床区接合的入口分配区。在其他实施方案中，柱还包括柱膨胀区。在其他实施方案中，生物反应器在入口分配区具有的压力降不超过跨生物反应器整个长度总压力降的30％。在其他实施方案中，颗粒脱离区的直径比填充床区或膨胀床区的直径大。在一些实施方案中，连续培养包括连续加入新鲜培养基并从培养物中连续移除发酵流出液。在其他实施方案中，连续培养包括将适应的微生物或突变的微生物保持在对数生长状态。

在一些实施方案中，微生物包括对至少2％丁醇耐受的梭菌属物种。在其他实施方案中，培养步骤是在厌氧、微需氧或需氧条件下进行的。在一些实施方案中，产物选自由有机酸、醛、酮或醇组成的组。在其他实施方案中，有机酸选自甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、己二酸或氨基酸。仍在其他实施方案中，醛选自乙醛、丁醛或丙醛。在其他实施方案中，酮选自丙酮或丁酮。仍在其他实施方案中，醇选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、1，3-丙二醇、2，3-丙二醇、2，3-丁二醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-苯基乙醇和丙三醇。在其他实施方案中，产物是选自由以下组成的组的抑制性产物：5-羟甲基糠醛、糠醛、乙酸、葡糖醛酸(glucouronic acid)以及乙酰丙酸。

在一些实施方案中，收获步骤包括连续从培养物中提取产物。在其他实施方案中，连续提取是使用汽提气、溶剂、吸收材料、全蒸发膜或蒸馏进行的。

在一些实施方案中，培养步骤包括在提供至少6g/L/小时、至少8g/L/小时或至少10g/L/小时的丁醇生产率的条件下培养丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。在一些实施方案中，培养步骤包括在提供至少10g/L/小时或至少13g/L的总溶剂生产率的条件下培养丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。在一些实施方案中，每天生产至少1000升的丁醇或者每天产生至少1500升的总溶剂。

在一些实施方案中，培养步骤包括培养至少7天或至少30天。

在一些实施方案中，微生物包含异源基因。在其他实施方案中，异源基因编码在产物生物合成途径中的酶。仍在其他实施方案中，酶选自由以下组成的组：磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、NAD依赖性β羟丁酰辅酶A脱氢酶、丁酰辅酶A脱氢酶、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶、乙酰辅酶A乙酰转移酶、丁酸激酶、磷酸丁酰转移酶、NADH依赖性丁醇脱氢酶B、NADH依赖性丁醇脱氢酶A、醛-醇脱氢酶、乙酰辅酶A乙酰转移酶、醛脱氢酶、丁酸乙酰乙酸辅酶A转移酶A亚基、丁酸乙酰乙酸辅酶A转移酶B亚基和乙酰乙酸脱羧酶。

一方面，提供了用于制备产物的系统，所述系统包括生物反应器，所述生物反应器包含：a)与固体支持体接触的生长培养基；b)固定在所述固体支持体上的微生物，其中微生物被适应或诱变以表现出与相应的非适应的或非诱变微生物的产物耐受性相比对产物至少150％的产物耐受性。在一些实施方案中，适应的微生物或突变的微生物表现出对产物至少200％的耐受性、至少500％的耐受性或至少1000％的耐受性。在一些实施方案中，微生物包括以下属：梭菌属、肠球菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属或芽孢杆菌属。在其他实施方案中，微生物包括丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、紫色梭菌、糖丁酸梭菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、金黄丁酸梭菌、假破伤风梭菌或热解糖梭菌。仍在其他实施方案中，适应的微生物或突变的微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。在一些实施方案中，产物是丁醇。在其他实施方案中，微生物是对至少2％丁醇、对至少2.5％丁醇、对至少5％丁醇或对至少10％丁醇表现出耐受性的丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。

在一些实施方案中，微生物包含异源基因。在其他实施方案中，异源基因编码在产物生物合成途径中的酶。仍在其他实施方案中，酶选自由以下组成的组：磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、NAD依赖性β羟丁酰辅酶A脱氢酶、丁酰辅酶A脱氢酶、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶、乙酰辅酶A乙酰转移酶、丁酸激酶、磷酸丁酰转移酶、NADH依赖性丁醇脱氢酶B、NADH依赖性丁醇脱氢酶A、醛-醇脱氢酶、乙酰辅酶A、乙酰转移酶、醛脱氢酶、丁酸乙酰乙酸辅酶A转移酶A亚基、丁酸乙酰乙酸辅酶A转移酶B亚基和乙酰乙酸脱羧酶。

在一些实施方案中，该系统包括用于将微生物保持在连续培养物中的装置。在一些实施方案中，发酵工艺是连续培养，还包括在产物纯化过程中回收的发酵培养液的养分和矿物质的再循环和再利用。在其他实施方案中，与在液体支持体中表现出的产物耐受性相比，微生物在固体支持体上表现出增强的产物耐受性。在一些实施方案中，固体支持体包括多孔材料。在其他实施方案中，固体支持体包括选自由以下组成的组的材料：骨炭、合成聚合物、天然聚合物、无机材料或有机材料。在其他实施方案中，固体支持体包含有机材料，包括原料。

在一些实施方案中，产物选自由有机酸、醛、酮或醇组成的组。在其他实施方案中，有机酸选自甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、己二酸或氨基酸。在其他实施方案中，醛选自乙醛、丁醛或丙醛。仍在其他实施方案中，酮选自丙酮或丁酮。在一些实施方案中，醇选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、1，3-丙二醇、2，3-丙二醇、2，3-丁二醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-苯基乙醇和丙三醇。

在该系统的一些实施方案中，在提供至少6g/L/小时、至少8g/L/小时或至少10g/L/小时的丁醇生产率的条件下培养丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。在一些实施方案中，在提供至少10g/L或至少13g/L的总溶剂滴度的条件下培养丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。在一些实施方案中，该系统每天生产至少1000升的丁醇或者每天产生至少1500升的总溶剂。

一方面，提供了生物反应器，所述生物反应器包括：a)填充床区，所述填充床区适合于容纳固体支持体；b)床膨胀区，所述床膨胀区与所述填充床区接合，当以膨胀床模式操纵所述生物反应器时，所述床膨胀区适合于容纳所述固体支持体；和c)颗粒脱离区，所述颗粒脱离区与所述床膨胀区接合，所述颗粒脱离区适合于防止所述固体支持体从所述生物反应器中出去。在一些实施方案中，所述填充床区和所述床膨胀区的结合高度(combined height)(H)与填充床区的高度(H_p)之比大于1.01、1.05、1.10、1.15或1.20。

在一些实施方案中，生物反应器还包括适合于安放在床膨胀区和颗粒脱离区之间的柱膨胀区，其中柱膨胀区的上游端与床膨胀区接合，并且柱膨胀区的下游端与颗粒脱离区接合。在一些实施方案中，柱膨胀区包括距水平线向上倾斜至少10°或至少30°的倾斜角度。在一些实施方案中，生物反应器还包括与颗粒脱离区接合的气体-液体分离区。在一些实施方案中，生物反应器被设置成以填充床模式或以膨胀床模式操纵。在其他实施方案中，生物反应器还被设置成在填充床模式和膨胀床模式的操作之间交替。在一些实施方案中，生物反应器能够连续发酵至少100小时、至少500小时或至少1000小时。

在一些实施方案中，固体支持体是半固体或固体。在其他实施方案中，固体支持体包括多孔材料。在其他实施方案中，固体支持体包括至少50m²/g的表面积。仍在其他实施方案中，固体支持体包括至少0.3g/cm³的堆密度。在其他实施方案中，固体支持体包括至少60的球盘硬度数。在其他实施方案中，固体支持体包括至少20MaP的屈服强度。

在一些实施方案中，固体支持体包括选自由以下组成的组的材料：骨炭、合成聚合物、天然聚合物、无机材料或有机材料。在其他实施方案中，固体支持体包括所述组中的两种或多种材料的复合材料。在其他实施方案中，固体支持体包含有机材料，包括原料。仍在其他实施方案中，原料包括玉米淀粉、纤维素生物质、细胞生物质、细胞生物质的团聚物、在原料准备过程中和/或在发酵过程中形成的沉淀、或者在梅拉德反应过程中形成的有机分子。

一方面，提供了用于在固体支持体上发酵生物学产物的生物反应器，所述生物反应器包括：a)填充床区，包括其中的固体支持体，所述固体支持体包括其上用于发酵所述生物学产物的微生物；b)床膨胀区，所述床膨胀区与所述填充床区接合，当以膨胀床模式操纵所述生物反应器时，所述床膨胀区适合于容纳所述固体支持体；和c)颗粒脱离区，所述颗粒脱离区与所述床膨胀区接合，所述颗粒脱离区适合于防止所述固体支持体从所述生物反应器中出去。在一些实施方案中，所述填充床区和所述床膨胀区的结合高度(H)与填充床区的高度(H_p)之比大于1.01、1.05、1.10、1.15或1.20。

在一些实施方案中，生物反应器还包括适合于安放在床膨胀区和颗粒脱离区之间的柱膨胀区，其中柱膨胀区的上游端与床膨胀区接合，并且柱膨胀区的下游端与颗粒脱离区接合。

在一些实施方案中，柱膨胀区包括距水平线向上倾斜至少10°或至少30°的倾斜角度。在一些实施方案中，生物反应器还包括与颗粒脱离区接合的气体-液体分离区。在一些实施方案中，生物反应器被设置成以填充床模式或以膨胀床模式操纵。在一些实施方案中，生物反应器还被设置成在填充床模式和膨胀床模式的操作之间交替。在一些实施方案中，生物反应器能够连续发酵至少100小时、至少500小时或至少1000小时。

在一些实施方案中，微生物包括以下属：梭菌属、肠球菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属或芽孢杆菌属。在其他实施方案中，微生物包括丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、紫色梭菌、糖丁酸梭菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、金黄丁酸梭菌、假破伤风梭菌或热解糖梭菌。

在一些实施方案中，微生物生产丁醇。在其他实施方案中，丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌表现出对至少2％丁醇、至少2.5％丁醇、至少5％丁醇或至少10％丁醇的耐受性。

在一些实施方案中，通过使包含微生物的发酵培养基循环经过生物反应器来将微生物固定在固体支持体上。在其他实施方案中，循环的发酵培养基包含固定在颗粒上的微生物。在一些实施方案中，微生物处于对数生长状态。

在一些实施方案中，固体支持体是半固体或固体。在另外的实施方案中，固体支持体包括多孔材料。仍在另外的实施方案中，固体支持体包括选自由以下组成的组的材料：骨炭、合成聚合物、天然聚合物、无机材料或有机材料。在一些实施方案中，固体支持体包括所述组中的两种或多种材料的复合材料。在其他实施方案中，固体支持体包含有机材料(包括原料)、细胞生物质、细胞生物质的团聚物，有机物，包括在原料准备过程中和/或在发酵过程中形成的沉淀，或在梅拉德反应过程中形成的有机分子。在另外的实施方案中，原料包括玉米淀粉或纤维素生物质。

在本发明的一个方面，提供了用于制备生物学产物的方法，所述方法包括：a)将微生物培养在生物反应器中，所述生物反应器包括：i)填充床区，包括其中的固体支持体，所述固体支持体包括其上用于发酵所述生物学产物的微生物；ii)床膨胀区，所述床膨胀区与所述填充床区接合，当以膨胀床模式操纵所述生物反应器时，所述床膨胀区适合于容纳所述固体支持体；和iii)颗粒脱离区，所述颗粒脱离区与所述床膨胀区接合，所述颗粒脱离区适合于防止所述固体支持体从所述生物反应器中出去；以及b)收获产物。

附图简述

图1是显示双盘诱变测定(double disc mutagenesis assay)的配置的图片。

图2A显示在各个时间点和丁醇浓度的OD₆₀₀测量结果。

图2B显示按1∶20接种的起始培养物的OD₆₀₀测量结果。

图3是显示在每种丁醇浓度(0％-1.6％丁醇)的液体培养基中Co-5673随时间生长的图。

图4是显示在每种丁醇浓度(0％-1.6％丁醇)的液体培养基中Co-0124随时间生长的图。

图5是显示在每种丁醇浓度(0％-1.6％丁醇)的液体培养基中Co-7449随时间生长的图。

图6A是显示分析三种菌株Co-5673、Co-7449和Co-0124在固体培养基(P2+4％木糖)上在24小时的丁醇耐受的表。观察到的生长表明了丁醇耐受性。

图6B是在24小时的时间点，在液体培养基中和在固体培养基上生长的三种菌株的丁醇耐受性的比较。

图7A是显示分析三种菌株Co-5673、Co-7449和Co-0124在固体培养基(P2+4％木糖)上在96小时的丁醇耐受性的表。观察到的生长表明了丁醇耐受。

图7B是在96小时的时间点，在液体培养基中和在固体培养基上生长的三种菌株的丁醇耐受性的比较。

图8用图说明包括串联排列的具有悬浮的细胞的生物反应器和具有固定的细胞生物反应器的系统。将培养基引入到悬浮的细胞的生物反应器中，将发酵流出液移出并连同另外的培养基一起引入到固定细胞生物反应器中。固定细胞生物反应器包含具有丁醇耐受性、表现出提高的产物耐受性的分离的、适应的菌株或突变体，它们能够利用培养基中的残余基质，产生高浓度的产物。然后将发酵流出液移出并送往分离和回收。

图9A是包括具有不同大小的目、沉降速度(cm/s)以及等效直径(μm)的骨炭颗粒的三个实例的表。

图9B是使用终端沉降速度，5×8型骨炭在4％葡萄糖溶液中的等效直径的图示。

图10A是显示以5×8型骨炭在4％葡萄糖溶液中的不同等效直径，经一定范围的空隙率计算出的最小流化速度(U_mf)的表。

图10B是显示对5×8型骨炭的不同等效直径，经一定范围的空隙率计算出的最小流化速度(U_mf)的图示。

图11A是显示以10×28型骨炭在4％葡萄糖溶液中的不同等效直径，经一定范围的空隙率计算出的最小流化速度(U_mf)的表。

图11B是显示对10×28型骨炭的不同等效直径，经一定范围的空隙率计算出的最小流化速度(U_mf)的图示。

图12A是显示以20×60型骨炭在4％葡萄糖溶液中的不同等效直径，经一定范围的空隙率计算出的最小流化速度(U_mf)的表。

图12B是显示对20×60型骨炭的不同等效直径，经一定范围的空隙率计算出的最小流化速度(U_mf)的图示。

图13A显示了用于计算5×8型骨炭的床膨胀水平的参数。结果是膨胀床高度比填充床高度的比率形式(H/H_填充)。

图13B是5×8型骨炭的床膨胀的图示。

图14A显示了用于计算10×28型骨炭的床膨胀水平的参数。结果是膨胀床高度比填充床高度的比率形式(H/H_填充)。

图14B是10×28型骨炭的床膨胀的图示。

图15A用图说明了用于计算20×60型骨炭的床膨胀水平的参数。结果是膨胀床高度比填充床高度的比率形式(H/H_填充)。

图15B是20×60型骨炭的床膨胀的图示。

图16用图说明了确定填充区的高度、床膨胀区的高度和实现5×8型骨炭流化的液体流动速率的设计计算。

图17用图说明了确定填充区的高度、床膨胀区的高度和实现10×28型骨炭流化的液体流动速率的设计计算。

图18用图说明了确定填充区的高度、床膨胀区的高度和实现20×60型骨炭流化的液体流动速率的设计计算。

图19用图说明了样品反应器概念。

图20是显示被收集以支持生物反应器的设计和建模的实验数据的表。

图21是固定细胞生物反应器的配置和控制的方案。

图22显示Co-7449在100mL固定细胞生物反应器中连续发酵的过程中所获得的数据的实验踪迹。

图23显示Co-7449在1000mL固定细胞生物反应器中连续发酵的过程中所获得的数据的实验踪迹。

图24显示Co-5673在1000mL固定细胞生物反应器中连续发酵的过程中所获得的数据的实验踪迹。

图25显示Co-7449在1000mL固定细胞生物反应器中连续发酵的过程中所获得的数据的实验踪迹。

图26显示Co-5673在1000mL固定细胞生物反应器中连续发酵的过程中所获得的数据的实验踪迹。

图27是概括在固定细胞生物反应器中连续产生丁醇的过程中获得的实验数据的图表。

图28是小试规模固定细胞的填充床生物反应器工艺设计/控制的方案(具有生物反应器温度指示器控制)。

图29是小型规模(mini-pilot)工艺流-上游加工的方案(没有收获罐的固定细胞的填充床生物反应器)。MF代表微量过滤，例如切向流过滤。

发明详述

本发明提供了用于提高从微生物的培养物中生产产物的总产率的方法和材料。所述方法是通过在半固体或固体支持体上适应或选择微生物实现的，所述微生物显示出对产物的高耐受性，所述产物包括有机酸，像乙酸和丁酸，以及溶剂，例如醇、醛和酮。然后在产生产物的条件下将微生物培养在生物反应器中的半固体或固体支持体上，在其中所选择的微生物出人意料地保持其对产物的耐受性，并且表现出与起始的一种或多种微生物母体原料相比至少大125％的对具体产物的耐受性。本发明的微生物包括细菌和真菌。本发明的微生物可以来源于最近从环境分离的微生物、来源于已知培养物、突变体或来源于被遗传修饰的培养物。在一些实施方案中，使用来自同一物种的不同菌株的混合培养物或不同物种的混合培养物。

本发明考虑使用这些方法来生产沿着生物化学途径、代谢途径、合成途径或发酵途径所产生的产物。本发明适用于任何生产产物的途径，不论是天然存在的、部分遗传工程的或完全遗传工程的途径。本发明还包括微生物，其中在将中间产物从生产产物的途径中占用的竞争途径中一种或多种基因的表达被敲除或工程化以具有减少的表达。天然存在的生产有机酸的发酵途径的一个实例是乳杆菌属物种的同型乳酸发酵途径。天然存在生产溶剂的发酵途径的实例是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的乙醇途径。溶剂途径的另一实例是丙酮丁醇梭菌的丁醇途径。部分遗传工程发酵途径的实例是工程化到大肠杆菌中的乙醇途径。部分遗传工程合成途径的实例是工程化到大肠杆菌中的四碳醇途径。

酸

本发明的方法可用于生产有机酸。这些有机酸包括，例如：甲酸、乙酸、乳酸、丙酸、丁酸、琥珀酸和其他二羧酸、己二酸以及氨基酸。通过微生物生产可用作食品或药品添加剂、或工业化学品的有机酸是特别令人感兴趣的。

溶剂

本发明的方法可用于生产工业溶剂。这些工业溶剂包括，例如：醇(乙醇、丁醇、丙醇、异丙醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、2，3-丙二醇、1，2-丁二醇、2，3-丁二醇、1，2，4-丁三醇、1，2-戊二醇、1，2-己二醇、丙三醇、正戊醇及其异构体、正己醇及其异构体、正庚醇及其异构体、正辛醇及其异构体)，醛(乙醛、丁醛)以及酮(丙酮、丁酮)。通过微生物生产可用作燃料和工业化学品的溶剂是特别令人感兴趣的。在一些实施方案中，本发明的方法可用于通过丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、紫色梭菌或糖丁酸梭菌增加高价值的生物燃料丁醇的生产。

其他适应或选择的耐受性

本文的方法也可以用于分离适应的微生物或选择的微生物，所述微生物具有对发酵途径、代谢途径、呼吸途径或合成途径中生产的中间物质的提高的耐受性。另外，提高的产物耐受性可以是间接的并且可以依赖抑制剂的降低的抑制作用，所述抑制剂包括但不限于：HMF、糠醛、乙酰丙酸、葡糖醛酸、自溶素或乙酸。抑制剂可以由生物体产生，或者可以存在于最初的进料中。抑制剂或抑制性物质可以沿着发酵途径、代谢途径、呼吸途径或合成途径形成。对抑制剂提高的耐受性可以提高期望产物例如乙醇、丁醇等等的生产率。在一个实施方案中，与未适应的微生物或未诱变的微生物以及选择的微生物相比实现对抑制剂提高的耐受性，所述抑制剂选自由HMF、糠醛、乙酰丙酸、葡糖醛酸和乙酸组成的组。

发酵途径

发酵途径是厌氧进行的代谢途径，其中有机分子而非氧作为末端电子接受体起作用，如在需氧条件下氧化磷酸化所发生的那样。糖酵解是在细菌(丙酮丁醇梭菌和大肠杆菌)和酵母中的广泛的发酵途径的实例。在糖酵解过程中，细胞将单糖例如葡萄糖转化成丙酮酸，同时净产生ATP和NADH。在再生NAD⁺的短途径中消耗至少95％丙酮酸，NAD⁺是用于持续的糖酵解和ATP生产的专性需求物。这些NAD⁺再生系统的废物或终产物被称为发酵产物。取决于生物和培养条件，丙酮酸最终被转化成诸如有机酸(甲酸、乙酸、乳酸、丙酮酸、丁酸、琥珀酸和其他二羧酸)和中性溶剂(乙醇、丁醇、丙酮、1，3-丙二醇、2，3-丙二醇、乙醛、丁醛、2，3-丁二醇)等终产物。

基于以下发酵终产物，TIGR的综合微生物资源(CMR)在其图册集列出九种类型发酵途径：同型乳酸(乳酸)；异型乳酸(乳酸)、乙醇(ethanolic)、丙酸、混合酸(甲酸和乙酸)、丁二醇、丁酸、氨基酸和产甲烷作用。本发明的方法可以用在任何发酵途径中，其中在所述途径的任何阶段产生酸或溶剂。本发明中描述的发酵途径可以是天然存在的、通过化学诱变改变的、半遗传工程化或完全遗传工程化的发酵途径。

生产溶剂的发酵途径

天然的

通过公知的糖酵解途径，酵母将一个己糖分子转化成两个乙醇分子和两个二氧化碳分子。许多梭菌属物种通过发酵生产溶剂。在丙酮丁醇梭菌中，以按重量大致3∶6∶1的比率产生溶剂丙酮、丁醇和乙醇(ABE)。

其他作为中间产物产生的溶剂包括乙醛和丁醛。

遗传工程化大肠杆菌

乙醇

细菌大肠杆菌当厌氧生长时由于其缺乏酶丙酮酸脱羧酶而产生最少水平的乙醇。通过表达从运动发酵单胞菌(Z.mobilis)中克隆的醇脱氢酶II(adhB)和丙酮酸脱羧酶(pdc)可以在大肠杆菌中产生半遗传工程发酵的乙醇途径(Conway等人.(1987a)J.Bacterid 169：2591-2597；Neale等人.(1987)Nucleic Acids Res.15：1752-1761；Ingram和Conway[1988]Appl.Environ.Microbiol.54：397-404；Ingram等人.(1987)Appl.Environ.Microbiol.53：2420-2425)。乙醇生产率直接与运动发酵单胞菌产乙醇基因的表达水平相对应。该方法的通用性后来在两种其他肠道细菌菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)和植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)中证明。(Tolan和Finn.Appl.Environ.Microbiol.53：2033-2038，2039-2044，1987；Beall等人.，1993；Ingram和Conway，1988；Wood和Ingram，1992.)

4碳醇和高级醇

通过利用细菌的氨基酸生物合成途径，可以将包括异丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和2-苯基乙醇在内的高级醇表达在大肠杆菌中。通过将见于艾利希途径最后两步中的两种异源酶2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的表达遗传工程化，可以将该途径中产生的2-酮酸中间产物转换成醇产品。(Shota A.，等人.Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels(用于合成作为生物燃料的支链高级醇的非发酵途径).Nature，第451/3卷2008年1月.)

微生物

本发明提供了与对应的非突变微生物的产物耐受性相比具有提高的产物耐受性的菌株、环境分离株和突变微生物的适应或选择。所公开的方法学适用于广泛范围的微生物，包括细菌和真菌。本文的方法也可以用于适应或选择微生物的粘附或生长于且附于所选择的固体支持体的能力。微生物被接种或放置在具有基质的固体支持体上并且被培养。使培养物经历一个或多个循环，在循环中漂洗固体支持体以除去未粘附或粘附弱的微生物，接着加入更多培养基以允许剩余微生物增加其数目。那些表现出在固体支持体上增强或快速生长的微生物被选择并储存供后面使用。可以通过对于提高产物耐受性进行的适应或诱变和选择来进一步改良挑出的分离株。还可以转化挑出的分离株以表达赋予提高的产物耐受性或提高产物生产的异源基因。在一些实施方案中，微生物是真菌并且真菌是酵母。酵母的实例包括但不限于酿酒酵母、贝酵母(S.bayanus)、卡氏酵母(S.carlsbergensis)、摩纳酵母(S.Monacensis)、巴氏酵母(S.Pastorianus)、葡萄汁酵母(S.uvarum)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)物种。厌氧或耐氧真菌的其他实例包括但不限于属Neocallimastix、Caecomyces、Piromyces和其他瘤胃来源的厌氧真菌。

在一些实施方案中，微生物是细菌。本发明涵盖的细菌包括革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌。革兰氏阳性细菌的非限制性实例包括见于以下属的细菌：葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)和丙酸杆菌属(Propionibacterium)。具体的种的实例包括屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)。

革兰氏阴性细菌的非限制实例包括见于以下属的细菌：假单胞菌属(Pseudomonas)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、螺旋体属(Spirochaeta)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、泛菌属(Pantoea)、醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)和欧文菌属(Erwinia)。

在一些实施方案中，细菌是严格的厌氧菌或专性的厌氧菌诸如丙酮丁醇梭菌。考虑用于本发明的丙酮丁醇梭菌的菌株包括来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的野生型菌株诸如ATCC 43084和ATCC 824，以及来自德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Germany)的DSM 792和DSM 1731。考虑用于本发明的丁醇高产菌株丙酮丁醇梭菌包括来自ATCC的菌株诸如ATCC 55025和ATCC 39058。另一种考虑用于本发明的高产菌株是B643。(Contag，P.R.，等人，Cloning of a lactate dehydrogenase gene from Clostridium acetobutylicum B643 and expression in Escherichia coli(从丙酮丁醇梭菌B643克隆乳酸脱氢酶基因和在大肠杆菌中表达).Appl.Environ.Microbiol.56：3760-3765，1990.)尽管最初被鉴定为丙酮丁醇梭菌，B643现在被分类为糖丁酸梭菌。考虑用于本发明的另一高产菌株是来源于B643的B18(Rogers，P.和Palorsaari，N.Clostridium acetobutylicum mutants that produce butyraldehyde and altered quantities of solvents(产生丁醛和改变的量的溶剂的丙酮丁醇梭菌突变体).Appl.Environ.Microbiol.53：2761-2766，1987)。

考虑用于本发明的梭菌属的其他实例包括拜氏梭菌(例如ATCC25752、ATCC51743和BA101、ATCC PTA 1550(U.S 6,358,717和美国申请第10/945,551号))、紫色梭菌(例如ATCC 43978)或糖丁酸梭菌(例如ATCC BAA-117或Co-7449)。

考虑用于本发明的梭菌属物种的其他实例可以选自金黄丁酸梭菌(C.aurantibutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、解纤维梭菌(C.cellulolyticum)、土壤栖梭菌(C.phytofermentans)、解糖梭菌(C.saccharolyticum)、糖乙酸多丁醇梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)、假破伤风梭菌(C.tetanomorphum)、热丁酸梭菌(C.thermobutyricum)、热纤梭菌(C.thermocellum)、糖乙酸多丁醇梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)或热解糖梭菌(C.thermosaccharolyticum)。

考虑用于本发明的其他细菌包括：棒状杆菌属(Corynebacteria)，诸如白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)；肺炎球菌(Pneumococci)，诸如肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)；链球菌属(Streptococci)，诸如酿脓链球菌(S.pyogenes)和唾液链球菌(S.salivarus)；葡萄球菌属(Staphylococci)，诸如金黄色葡萄球菌(S.aureus)和白色葡萄球菌(S.albus)；肌病毒科(Myoviridae)；长尾噬菌体科(Siphoviridae)；需氧的芽孢形成杆菌，芽孢杆菌属(Bacilli)，诸如炭疽芽胞杆菌(B.anthracis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)；溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)；厌氧的芽孢形成杆菌，分枝杆菌(Mycobacteria)，诸如人结核分枝杆菌(M.tuberculosis hominis)、牛分支杆菌(M.bovis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)；放线菌(Actinomycetes)(真菌样细菌)，诸如衣氏放线菌(A.israelii)、牛型放线菌(A.bovis)、内氏放线菌(A.naeslundii)、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、巴西诺卡氏菌(Nocardia brasiliensis)；螺旋体(Spirochetes)，苍白密螺旋体(Treponema pallidium)、极细密螺旋体(Treponema pertenue)、斑点病密螺旋体(Treponema carateum)、回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)、出血黄疸钩端螺旋体(Leptospira icterohemorrhagiae)、犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、小螺菌(Spirillum minus)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)；锥虫属(Trypanosomas)；支原体属(Mycoplasmas)，肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)；单核增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)；猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)；念珠状链杆菌(Streptobacillus monilformis)；肉芽多诺万氏菌(Donvania granulomatis)；杆状巴尔通氏体(Bartonella bacilliformis)；立克次氏体属(Rickettsiae)，普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、穆氏立克次氏体(Rickettsia mooseri)、立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsiae)和康氏立克次氏体(Rickettsia conori)。使用的其他细菌包括大肠杆菌、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、菊欧文氏菌和植生克雷伯氏菌。

在本发明的一些实施方案中，微生物是专性厌氧微生物。专性厌氧微生物的非限制实例包括溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrosolvens)和梭菌属物种诸如巴氏梭菌(C.pasterianum)。在本发明的其他实施方案中，微生物是微需氧耐受的(microaerotolerant)，并且能够在小浓度氧的存在下存活。在一些实施方案中，微需氧条件包括但不限于通过用以下量气体充入液体培养基所产生的发酵条件：至少0.01％到至少5％或更多O2(例如0.01％、0.05％、0.10％、0.50％、0.60％、0.70％、0.80％、1.00％、1.20％、1.50％、1.75％、2.0％、3％、4％、5％或更多O2)。另一方面，微需氧条件包括但不限于具有至少约0.05ppm溶氧或更多溶氧(例如0.05ppm、0.075ppm、0.1ppm、0.15ppm、0.2ppm、0.3ppm、0.4ppm、0.5ppm、0.6ppm、0.8ppm、1.0ppm、2.0ppm、3.0ppm、4.0ppm、5.0ppm、8.0ppm、10.0ppm或更多)的培养条件。

用于开发更高产物耐受性突变体的细菌和真菌的亲本菌株来源包括已建立的培养物保藏中心和大学中的研究者、政府机构或公司。可选地，亲本菌株可以从环境样品中分离，诸如来自废水处理设施的废水污泥，所述废水处理设施包括市政设施和那些在化工厂或石油化工厂的设施。当能够预期分离的微生物经许多代的过程在高产物浓度的存在下进化并由此已达到可以被进一步改善的期望的产物耐受性水平时，后一种来源特别具有吸引力。个别物种和多个物种的混合群可以从环境样品中分离。

当期望具体种或属的混合群时，可以使用不期望物种或属的选择性生长抑制剂来阻止或抑制这些不期望微生物的生长。

在一些实施方案中，利用了共培养物。通常，一种微生物将酶分泌到培养基中，所述酶将原料降解成可以被另一种微生物利用的组成化合物。使用微生物的共培养物生产溶剂的实例包括用哈茨木霉(Trichoderma harzianum)与肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的共培养物生产丁二醇(Yu等人.，Applied and Environmental Microbiology(应用及环境微生物学)(1985)50(4)：924-929)和从热纤维梭菌与热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)的共培养物生产乙醇(Eng等人.，Applied and Environmental Microbiology(应用及环境微生物学)(1981)41(6)：1337-1343)。

在其他实施方案中，使用环境分离株和/或微生物聚生体来产生具有提高的产物耐受性的微生物聚生体。可以从众多的环境小生境中收集包括微生物聚生体在内的分离株，包括土壤、河流、湖泊、沉积物、河口、沼泽、工业设施等等。在一些实施方案中，微生物聚生体是严格厌氧微生物。在其他实施方案中，微生物聚生体是专性厌氧微生物。在一些实施方案中，微生物聚生体是兼性厌氧微生物。仍在其他实施方案中，微生物聚生体不包括肠球菌属或乳杆菌属的物种。

在一些实施方案中，微生物包含一个或多个异源基因，异源基因的表达提高微生物的产物耐受性。在一些实施方案中，在固体支持体上适应或选择产物耐受性之前将所述一个或多个异源基因引入微生物中，而在其他实施方案中，在适应或选择产物耐受性之后将所述一个或多个异源基因引入微生物中。

在一些实施方案中，微生物被工程化以过表达提高微生物产物耐受性的内源基因。在一些实施方案中，微生物包含提高对产物的耐受性的另外拷贝数的内源基因。在某些实施方案中，产物耐受的微生物不是大肠杆菌，并且异源基因或过表达基因不是yfdE、yhhL、yhhM和csrC。在其他实施方案中，微生物不是具有热激蛋白的提高表达的重组微生物。仍在其他实施方案中，微生物不是包含如下异源基因的重组微生物：所述异源基因编码将丁醇输出到微生物外的多肽。

适应过程

可以适应或选择微生物以在存在微生物正常产生的产物的情况下生长并附于固体支持体，或者适应和选择二者兼有。在一些实施方案中，通常，微生物群被接种或以其他方式被分散在包含可用养分的固体支持体上。养分可以自由利用，诸如在固体支持体是包含营养介质的琼脂的情况下。可选地，在其他实施方案中，固体支持体可以是微生物能够聚居形成生物膜的表面，诸如骨炭，但是在骨炭中养分是由灌注固体支持体的液体培养基提供。可以挑出并培养在期望的固体支持体上快速生长的微生物的菌落，或者将其储存供后面应用。

在另一实施方案中，固体支持体可以包含通过酶分解释放可利用的养分的原料，如发生在包含淀粉或纤维素的原料被分解成能够被微生物同化的葡萄糖和其他更简单组分时。可以从固体支持体中挑出并培养快速生长的微生物的菌落，或将其储存供后面应用。

仍在另一实施方案中，可以将已知在选择的固体支持体上生长良好的微生物暴露于不同浓度的其正常情况下产生的产物中，以便选择能够在更高浓度下生长的微生物。暴露可以是连续的，诸如用产物的低浓度开始。然后挑出具有良好生长特性的菌落，并将其转移或接种在相同固体表面，其中微生物被暴露于更高浓度的产物。挑出具有良好生长特性的菌落并且该过程根据所需继续用较高浓度按顺序进行以产生用于预期用途的适应的微生物。

使微生物适应于产物浓度的替代方式是将连续的培养物保持在固体基质上的微生物上。可以将产物的浓度保持在相同浓度或者它可以随时间改变，通常是以浓度递增的方式。随着细胞生长，过量细胞一般被移除，并且经过多代，产生了适应于产物浓度的更多产物耐受微生物。

对于产生丁醇的梭菌，包括但不限于丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，用于适应的有用的乙酸或丁酸浓度包括约0.2％到约10％。在一些实施方案中，可以使丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌适应以表现出对至少0.2％、0.40％、0.60％、0.80％、1.00％、1.20％、1.40％、1.60％、1.80％、2.00％、2.20.0％、2.40％、2.60％、2.80％、3.00％、3.5％、4.00％、5.00％、6.00％、7.00％或8.00％的乙酸或丁酸的耐受性。

对于产生丁醇的梭菌，例如但不限于丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，用于适应的有用的丁醇浓度包括约1.0％w/v到约25％w/v、1.5％w/v到约22.5％w/v、2.0％w/v到约20.0％w/v、2％到约18％w/v、2.0％w/v到约16.0％w/v、2％到约15％w/v、2.0％w/v到约12.0％w/v、2％到约10％w/v、2.0％w/v到约9.0％w/v、2％到约8％w/v、2.0％w/v到约7.0％w/v、2％到约6％w/v、2.0％w/v到约5.0％w/v、2％到约4％w/v、2.0％w/v到约3.0％w/v和2％到约2.5％w/v。其他有用的丁醇浓度包括至少1.0％、1.5％、1.8％、2.0％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3.0％、3.2％、3.4％、3.6％、4.0％、5.0％、7.0％、10％、12％或15％。丁醇适应浓度包括那些唯一由1-丁醇组成的浓度和那些由丁醇异构体的混合物构成的浓度。还可以使丙酮丁醇梭菌适应于包含ABE溶剂混合物的溶液。有用的ABE总溶剂浓度范围包括以下浓度：约1.0％w/v到约25％w/v、1.5％w/v到约22.5％w/v、2.0％w/v到约20.0％w/v、2％到约18％w/v、2.0％w/v到约16.0％w/v、2％到约15％w/v、2.0％w/v到约12.0％w/v、2％到约10％w/v、2.0％w/v到约9.0％w/v、2％到约8％w/v、2.0％w/v到约7.0％w/v、2％到约6％w/v、2.0％w/v到约5.0％w/v、2％到约4％w/v、2.0％w/v到约3.0％w/v和2％到约2.5％w/v。其他有用的总ABE浓度包括至少1.0％、1.5％、1.8％、2.0％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3.0％、3.2％、3.4％、3.6％、4.0％、5.0％、7.0％、10％、12％或15％。

在一些实施方案中，可以在固体支持体上使微生物适应，以耐受比对应的非适应亲本微生物可耐受的水平大至少125％的有机酸水平。在其他实施方案中，适应的微生物相比于对应的非适应亲本微生物的酸耐受性表现出至少150％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1,000％、2,000％、3,000％、4,000％、5,000％、6,000％、7,000％、8,000％、9,000％、10,000％、11,000％、12,000％、13,000％、14,000％或15,000％的酸耐受性。如果亲本微生物是不能利用的，那么可以使用标准种或标准菌株进行比较。例如，对于丙酮丁醇梭菌，标准菌株是ATCC 824。

在一些实施方案中，酸耐受性是通过测量适应的微生物在包含指定浓度酸的半固体或固体支持体上的生长能力而确定的绝对值。例如，使用本发明的方法产生的糖丁酸梭菌的适应菌株可能具有对至少5％的乙酸或丁酸的绝对耐受性。在一些实施方案中，梭菌属的适应菌株表现出对至少2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％、10.0％、12.5％、15.0％、20％或25％的乙酸或丁酸的耐受性。

选择过程

许多方法已知在本领域中用于诱发突变到微生物中并用于选择期望的表型。通常，将微生物悬浮在包含特定浓度诱变剂的液体培养基中。在孵育给定量的时间后，将悬浮液离心并且将得到的液体滗出，留下微生物沉淀。将沉淀重悬在培养基中。如果必要的话可以重复该洗涤步骤。除去诱变剂后，通常将微生物培养在液体培养基中以便在稀释之前从诱变步骤中恢复，然后将其展开在固体营养培养基(像琼脂)上，所述固体培养基包含对接种的微生物施加选择压的剂。

如果具有提高的产物耐受性的突变体是期望的，那么使用标出产物浓度范围的平板的集合。在适当的培养期后，可以从固体营养培养基中选择产物耐受微生物的菌落。通过改变诱变时间和诱变剂浓度，可以修改微生物的突变率和死亡率以找到有利条件。

在美国专利第4,757,010号中描述了用于正丁醇耐受的丙酮丁醇梭菌的替代的诱变和选择过程。在该过程中，在固体培养基上一步进行诱变。获得了处于生长状态的丙酮丁醇梭菌的液体培养物。将该液体培养物以不同稀释度接种在固体营养培养基的平板上，每个平板包含特定浓度的正丁醇，平板的集合标出正丁醇浓度的范围。另外，每个平板具有诱变剂的浓度梯度。通常，诱变剂被安放在一点，例如，在每个皿的中心，从中心诱变剂扩散产生浓度梯度。在培养适量时间后分离耐正丁醇的菌落。

另一诱变和选择的方法是使用双纸片扩散法(double disc method)，其中在培养物被接种到包含半固体或固体支持体的一个或多个容器上后，两个纸片或纸条被放在每个容器中支持体的顶部。用诱变剂的溶液浸渍一个纸片或纸条。另一个纸片或纸条包含施加选择性压力的剂。通常，纸条被彼此垂直地使用和放置以产生诱变剂和选择性剂的重叠梯度。参见图1。在两个纸条附近存在一个没有细胞能够生长的空白区域。通常，远离纸条处，在较低重叠浓度，可以发现和分离突变体的菌落。

在本发明中有用的诱变剂包括烷化剂，诸如甲基磺酸乙酯(EMS)、N-甲基N′-硝基N-亚硝基胍(MNNG或NG)、ICR 191、亚硝酸、硝基喹啉-N-氧化物、N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)和三乙烯三聚氰胺。其他有用的化学诱变剂包括羟胺、核苷碱类似物(例如BrdU)、DNA嵌入剂(例如溴化乙锭)和DNA交联剂(顺铂)。有用的物理诱变剂包括电离辐射(例如，x射线、α粒子和β粒子)和非电离辐射(例如，紫外线辐射)。

对于产生丁醇的梭菌，例如但不限于丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌，用于选择的有用的丁醇浓度包括约1.0％w/v到约25％w/v、1.5％w/v到约22.5％w/v、2.0％w/v到约20.0％w/v、2％到约18％w/v、2.0％w/v到约16.0％w/v、2％到约15％w/v、2.0％w/v到约12.0％w/v、2％到约10％w/v、2.0％w/v到约9.0％w/v、2％到约8％w/v、2.0％w/v到约7.0％w/v、2％到约6％w/v、2.0％w/v到约5.0％w/v、2％到约4％w/v、2.0％w/v到约3.0％w/v和2％到约2.5％w/v。其他有用的丁醇浓度包括至少1.0％、1.5％、1.8％、2.0％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3.0％、3.2％、3.4％、3.6％、4.0％、5.0％、7.0％、10％、12％或15％。丁醇选择浓度包括那些唯一由1-丁醇组成的浓度和那些由丁醇异构体的混合物构成的浓度。产溶剂的梭菌诸如但不限于丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌也可以用包含ABE溶剂混合物的溶液来选择。有用的ABE总溶剂浓度范围包括以下浓度：约1.0％w/v到约25％w/v、1.5％w/v到约22.5％w/v、2.0％w/v到约20.0％w/v、2％到约18％w/v、2.0％w/v到约16.0％w/v、2％到约15％w/v、2.0％w/v到约12.0％w/v、2％到约10％w/v、2.0％w/v到约9.0％w/v、2％到约8％w/v、2.0％w/v到约7.0％w/v、2％到约6％w/v、2.0％w/v到约5.0％w/v、2％到约4％w/v、2.0％w/v到约3.0％w/v和2％到约2.5％w/v。其他有用的ABE总溶剂浓度包括至少1.0％、1.5％、1.8％、2.0％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3.0％、3.2％、3.4％、3.6％、4.0％、5.0％、7.0％、10％、12％或15％。

在一些实施方案中，可以对最初选择的微生物使用多轮的选择或诱变和选择。每轮可以是逐步增高的产物浓度。可选地，诱变剂和/或产物可以在多轮选择之间改变。

酸耐受性

在一些实施方案中，对酸耐受的微生物在固体支持体上的提高的酸耐受性进行诱变和选择。在一些实施方案中，酸耐受的突变体可以用于溶剂或有机酸的生产。例如，可以将产溶剂的梭菌(诸如但不限于丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌)的酸耐受突变体培养在有助于乙酸和丁酸产生的条件下，或者可选地，培养在有助于丁醇产生的条件下。在本发明的一些实施方案中，酸耐受性是通过比较突变的微生物在半固体或固体支持体上的生长能力与非突变的亲本微生物在相同半固体或固体支持体上的生长能力而测量的相对值。通常，半固体或固体支持体包含生长培养基和通常基于体积比体积(w/v)测量的指定浓度的酸。一般而言，多个容器(通常是培养皿)被填充标出酸浓度范围的半固体或固体支持体。例如，用于测试丙酮丁醇梭菌的丁醇耐受性的有用支持体是包含强化梭菌培养基(RCM)的琼脂，并且有用的乙酸或丁酸浓度范围是从0.2％到5.0％。仍有菌落形成的最高浓度代表微生物的酸耐受性。替代的酸耐受性测试方法是用包含指定浓度的酸的溶液覆盖非酸支持体。

通过将突变微生物能够生长的最高酸浓度除以所记录的非突变微生物生长的最高酸浓度，可以计算出突变微生物的相对的酸耐受性。

例如，如果使用本发明的方法分离展现至少4％的乙酸耐受性的丙酮丁醇梭菌菌株的突变体，而亲本菌株具有2％的乙酸耐受性，则突变体的相对的酸耐受性将是非突变亲本菌株的200％。

在一些实施方案中，本发明的突变微生物的相对的酸耐受性包括与对应的非突变微生物的酸耐受性相比具有至少125％耐受性的微生物。在其他实施方案中，所选择的突变微生物相比于对应的非突变微生物的酸耐受性表现出至少150％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1,000％、2,000％、3,000％、4,000％、5,000％、6,000％、7,000％、8,000％、9,000％、10,000％、11,000％、12,000％、13,000％、14,000％或15,000％的酸耐受性。如果亲本微生物是不能利用的，那么可以使用标准种或标准菌株进行比较。例如，对于丙酮丁醇梭菌，标准菌株是ATCC 824。

在一些实施方案中，酸耐受性是通过测量突变的微生物在包含指定浓度酸的半固体或固体支持体上的生长能力而确定的绝对值。例如，使用本发明的方法产生的糖丁酸梭菌的突变体可能具有对至少0.8％的乙酸或丁酸的绝对耐受性，而亲本微生物不能在0.40％以上的乙酸或丁酸浓度生长。在一些实施方案中，丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌的突变体表现出对至少0.2％、0.40％、0.60％、0.80％、1.00％、1.20％、1.40％、1.60％、1.80％、2.00％、2.20.0％、2.40％、2.60％、2.80％、3.00％、3.5％、4.00％、5.00％、6.00％、7.00％或8.00％的乙酸或丁酸的耐受性。

溶剂耐受性

在一些实施方案中，对溶剂耐受的微生物在固体支持体上的提高的溶剂耐受性进行诱变和选择。在一些实施方案中，溶剂耐受的突变体可以用于溶剂或有机酸的生产。例如，可以将丙酮丁醇梭菌的溶剂耐受突变体培养在有利于乙酸和丁酸产生的条件下，或可选地，培养在有利于丁醇产生的条件下。在本发明的一些实施方案中，溶剂耐受性是通过比较突变的微生物在半固体或固体支持体上的生长能力与非突变的亲本微生物在相同半固体或固体支持体上的生长能力而测量的相对值。通常，半固体或固体支持体包含生长培养基和通常基于体积比体积(v/v)测量的指定浓度的溶剂。一般而言，多个容器(通常是培养皿)被填充标出溶剂浓度范围的半固体或固体支持体。例如，用于测试丙酮丁醇梭菌的丁醇耐受性的有用支持体是包含强化梭菌培养基(RCM)的琼脂，并且有用的丁醇浓度范围是从0.8％到5.0％。仍有菌落形成的最高浓度代表微生物的溶剂耐受性。替代的溶剂耐受性测试方法是用包含指定浓度的溶剂的溶液覆盖非溶剂支持体。另一替代的溶剂耐受性测试方法是确定在暴露于丁醇后的存活率。

通过将突变微生物能够生长的最高溶剂浓度除以所记录的非突变微生物生长的最高溶剂浓度，可以计算出突变微生物的相对的溶剂耐受性。

作为相对的溶剂耐受性计算的实例，使用本发明的方法分离展现至少5％的丁醇耐受性的糖丁酸梭菌菌株Co-7449的突变体。另一方面，菌株Co-7449具有近似2.1％的丁醇耐受性。因此，突变体的相对的溶剂耐受性是非突变亲本菌株的至少225％。

在一些实施方案中，本发明的突变微生物的相对的溶剂耐受性包括与对应的非突变微生物的溶剂耐受性相比具有至少125％耐受性的微生物。在其他实施方案中，所选择的突变微生物相比于对应的非突变微生物的溶剂耐受性表现出至少150％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1,000％、2,000％、3,000％、4,000％、5,000％、6,000％、7,000％、8,000％、9,000％、10,000％、11,000％、12,000％、13,000％、14,000％或15,000％的溶剂耐受性。如果亲本微生物是不能利用的，那么可以使用标准种或标准菌株进行比较。例如，对于丙酮丁醇梭菌，标准菌株是ATCC824。

在一些实施方案中，溶剂耐受性是通过测量突变的微生物在包含指定浓度溶剂的半固体或固体支持体上的生长能力而确定的绝对值。例如，使用本发明的方法产生的糖丁酸梭菌菌株Co-7449的突变体具有对至少5％的丁醇的绝对耐受性，而亲本微生物不能在2.1％以上的丁醇浓度生长。在一些实施方案中，丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌的突变体表现出至少2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％、10.0％、12.5％、15.0％、20％或25％的丁醇耐受性。在其他实施方案中，丙酮丁醇梭菌或糖丁酸梭菌的突变体表现出对至少2.0％、2.2％、2.4％、2.5％、2.6％、2.8％、3.0％、3.2％、3.4％、3.6％、4.0％、5.0％、7.0％、10％、12％或15％的总ABE溶剂浓度的耐受性。

发酵培养基

用于产生产物的发酵培养基必须包含适合的以碳为基础的底物。这些底物被酶促转化成通过生物化学途径、代谢途径、合成途径和发酵途径产生产物所用的中间化合物。如本文所用，术语“以碳为基础的底物”是指可以被酶促转化成中间产物(随后转化为期望的碳靶标)的包含至少一个碳原子的材料。示例性的以碳为基础的底物包括但不限于生物质、淀粉、糊精、糖或这些物质的水解产物。

如本文所用，“生物量”是指包含纤维素和/或淀粉的原料，包括但不限于木片、谷物秸杆、水稻、草、饲料、佩里草(perrie-grass)、马铃薯、块茎、根、全碾碎谷物、葡萄渣、穗轴(cob)、谷粒、小麦、大麦、黑麦、高粱、麸、谷类、含糖原料(例如糖蜜、果料、甘蔗或甜菜)、木材和植物残体。

如本文所用，“淀粉”是指任何含淀粉的材料。具体而言，该术语是指各种基于植物的材料，包括但不限于小麦、大麦、马铃薯、甜马铃薯、木薯、谷物、玉蜀黍、木薯、高粱、黑麦和麸。总体上，该术语是指包括植物的复杂多糖碳水化合物、包括直链淀粉和支链淀粉的具有式(C₆H₁₀O₅)_x的任何材料，其中“x”可以是任何数字。

如本文所用，“纤维素”是指任何含纤维素的材料。具体而言，该术语是指具有式(C₆H₁₀O₅)_x的葡萄糖聚合物(或“纤维二糖”)，其中“x”可以是任何数字。纤维素是植物细胞壁的主要组分，并且是在自然界最丰富的有机物质。尽管在纤维素中存在β-葡糖苷键，在淀粉中存在α-葡糖苷键。纤维素与木质素一起形成“木质纤维素”。

如本文所用，“半纤维素”是指任何含半纤维素的材料。具体而言，该术语是指具有木糖基残基、葡糖基残基、半乳糖基残基、阿拉伯糖基残基或甘露糖基残基的杂聚物(hetropolymer)。

适合的底物包括但不限于包含可以被转化成糖的组分的已加工的材料(例如，纤维素生物质、糖原、淀粉及其各种形式，诸如玉米淀粉、小麦淀粉、玉米固形物和小麦固形物)。其他适合的底物包括但不限于单糖和二糖、糖(粗制的或加工过的)、糖蜜、糖浆和来自农业材料的汁液(诸如甜高粱汁)、汁液浓缩物、玉米糖浆以及类似底物。各种淀粉是可商购获得的。

可发酵的糖可以由各种各样来源获得，包括木质纤维素材料。木质纤维素材料可以由木质纤维素的废产物(例如，植物残体和废纸)获得。适合的植物残体的实例包括但不限于任何植物材料，诸如茎、叶、谷壳、苞叶、穗轴等，以及玉米秸秆、甘蔗渣、木材、木片、木浆和锯屑。废纸的实例包括但不限于丢弃的任何类型的纸(例如，光感复印纸、计算机打印纸、笔记本纸、便签纸、打字纸等等)，以及报纸、杂志、纸板和以纸为基础的包装材料。

如本领域中已知的，除了适当的碳源，发酵培养基必须包括适合的一种或多种氮源、矿物盐、辅因子、缓冲剂和适合于培养物的生长和促进产生期望的靶标(例如丁醇)所必需的酶促途径的其他成分。在一些实施方案中，盐和/或维生素B12或其前体可用于本发明。

氮源可以是任何适合的氮源，包括但不限于铵盐或酵母提取物。磷可以以磷酸盐形式存在于培养基中，诸如磷酸钠和磷酸钾。硫可以以硫酸盐形式存在于培养基中，诸如硫酸钠和硫酸铵。其他的盐包括但不限于硫酸镁、硫酸锰、硫酸铁、氯化镁、氯化钙、氯化锰、氯化铁、氯化亚铁、氯化锌、氯化铜、氯化钴和钼酸钠。生长培养基还可以包含维生素，诸如盐酸硫胺素、生物素和对氨基苯甲酸(PABA)。

培养条件

多种工业上重要的微生物的最适培养条件是本领域已知的。视需要，培养条件可以是厌氧的、微需氧耐受的或需氧条件。如容易被本领域技术人员理解的那样，厌氧条件是基本上无氧的条件，需氧条件是包含溶解在培养基中的氧以使得需氧培养物将不能区分在具有另外的溶解氧的氧传递中的差别的条件，并且微需氧耐受的条件是如下的条件：其中一些溶解氧以低于空气中发现的水平且往往低于标准溶解氧探头的检出限(例如，小于1ppm)的水平存在的条件。可以搅动培养物或使之维持原状。通常，培养基的pH随时间而变化，因为微生物在数目上增长，消耗原料并分泌有机酸。通过向生物反应器内的起始发酵培养基中加入缓冲化合物或者通过向生长中的培养物中有效加入酸或碱以保持pH在期望的范围内，可以调节培养基的pH。

通过测量光密度(通常在600nm波长)，可以监测培养物的生长。

对于使用酿酒酵母将糖转化为乙醇，一般来说，温度在约25℃至约35℃之间。提供转化培养基的有用pH范围在4.0和6.0之间、在4.5和6.0之间以及在5.5和5.8之间。使培养物生长在没有搅拌的厌氧条件下。

由丙酮丁醇梭菌进行的ABE发酵通常是在厌氧条件下于约25℃至40℃的范围内的温度下进行。历史上，悬浮培养物不使用搅拌器，但是依赖于放出的气体或充入的气体来混合生物反应器的内容物。然而，可以搅拌培养物以确保反应器内容物更均匀的混合。对于固定的培养物，生物反应器将没有搅拌地以固定床(活塞流)模式或流化(充分混合)模式运转。嗜温细菌的发酵可以达到约50℃至80℃范围内的温度。在一些实施方案中，温度范围是约55℃至70℃。在一些实施方案中，温度范围是约60℃至65℃。例如，梭菌属物种诸如热纤梭菌或热硫化氢梭菌可以生长在约60℃至65℃。

半固体和固体支持体

对于发酵的、代谢的、呼吸的或合成的产物的产生，使本发明的微生物生长固定于半固体或固体支持体。可以使用多种类型的半固体和/或固体支持体材料。有用的支持体材料具有高的表面积与体积比，这样使得大量活性、生产性细胞能够在生物反应器中积累。

非限制性实例包括固体琼脂、多孔材料(诸如骨炭)、合成聚合物、天然聚合物、无机材料或有机材料。天然聚合物包括有机材料，诸如纤维素、木质纤维素、半纤维素和淀粉。有机材料包括原料，诸如植物残体和纸。应理解也可以使用两种或更多种材料的复合材料，诸如合成聚合物与天然植物聚合物的混合物。

半固体培养基的实例包括藻酸盐、κ-角叉菜聚糖和壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺-酰肼、琼脂糖、聚丙烯、聚乙二醇、丙烯酸二甲酯、聚苯乙烯二乙烯苯、聚乙烯苯、聚乙烯醇、环氧支持体、纤维素、乙酸纤维素、可光致交联的树脂、预聚合物、氨基甲酸乙酯和明胶。

固体支持体的实例包括软木、粘土、树脂、砂、多孔氧化铝珠、多孔砖、多孔硅石、硅藻土、木片或活性炭。

适合的无机固体支持体材料是具有可用表面的羟基或氧化物基团的一般无机材料。这些材料可以按化学组成被分类为硅质或非硅质金属氧化物。硅质支持体除了其他之外还包括玻璃、胶态硅石、硅灰石、堇青石、干硅胶、膨润土以及类似物。代表性非硅质金属氧化物包括矾土、羟基磷灰石和氧化镍。

在固体支持体上固定的方法

可以通过任何已知手段从孢子或营养细胞固定微生物。一般而言，可以通过三种不同的机制将微生物固定到半固体或固体支持体上。第一种，通过聚合或凝固含有孢子或营养细胞的溶液实现在支持体中的截留或包含。有用的可聚合或可凝固的溶液包括藻酸盐、κ-角叉菜聚糖、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺-酰肼、琼脂糖、聚丙烯、聚乙二醇、丙烯酸二甲酯、聚苯乙烯二乙烯苯、聚乙烯苯、聚乙烯醇、环氧支持体、纤维素、乙酸纤维素、可光致交联的树脂、预聚合物、氨基甲酸乙酯和明胶。

第二种固定方法是通过吸附到支持体上。有用的支持体包括例如骨炭、软木、粘土、树脂、砂、多孔氧化铝珠、多孔砖、多孔硅石、硅藻土或木片。微生物聚居在底物上并形成生物膜。第三种该方法是通过使用化学剂将微生物共价偶联至支持体，所述化学剂如戊二醛、邻联茴香胺(美国专利第3,983,000号)、聚异氰酸酯(美国专利第4,071,409号)、硅烷(美国专利第3,519,538和3,652,761号)、丙烯酸羟乙酯、过渡金属激活的支持体、氰尿酰氯、高碘酸钠、甲苯以及类似物。还参见美国专利第3,930,951和3,933,589号。

在一种实施方案中，固定的孢子诸如丙酮丁醇梭菌的孢子通过热激被激活，然后在适当条件下被培养在生长培养基中，从而营养生长接着发生。这些细胞仍附入固体支持体中或附于固体支持体上。在微生物达到适合的密度和生理状态后，可以改变培养条件以用于酸和/或溶剂的产生。如果固定的细胞减少溶剂产生，通过首先使细胞在重复热激和培养顺序之前形成孢子，将它们再活化。

营养细胞可以在其生长的不同阶段被固定。对于展现双相性培养物的微生物，诸如具有产酸相和产溶剂相的丙酮丁醇梭菌，可以在细胞进入期望的培养相后固定它们以便使期望的产物的产生最大化，其中在丙酮丁醇梭菌的情况下，在产酸相中有机酸是乙酸和丁酸，在产溶剂相中溶剂是丙酮、丁醇和乙醇。可选地，可以将双相性细胞在产酸相中固定，然后使其适应于溶剂生产。

在一些实施方案中，通过细胞悬液的方式引入要固定在生物反应器中的微生物。一般而言，这些微生物作为单细胞或细胞的小聚集体分散在培养基中。在其他实施方案中，通过使用被微生物聚居的悬浮颗粒来将微生物引入生物反应器中。这些悬浮颗粒可以被吸附到固体支持体上，并且常常具有足够小的尺寸以致它们能够进入构成填充床的固体支持体的孔结构中并变得固定在其中。通常，不考虑悬浮颗粒的尺寸，可以通过与构成填充床的固体支持体接触通过接触转移微生物。在引入的颗粒上的生物膜能够转移至这些新表面并聚居在这些新表面上。在一些实施方案中，微生物的期望特性只能通过在固体支持体上培养而保持，由此使得用于接种生物反应器的固体支持体的小的聚居颗粒悬浮液的使用成为必需。

生物反应器

在本发明中可以使用一个或多个生物反应器。当使用多个生物反应器时，它们可以被串联和/或平行排列。多个生物反应器胜过一个大生物反应器的优点包括建造成本和安装成本更低、容易放大生产规模以及生产灵活性更大。例如，单个生物反应器可以采用离线式以供保养、洗涤、杀菌等等，而没有明显影响生产计划。

应理解平行或串联排列的生物反应器可以包括一种或多种发酵工艺类型。例如，在串联排列中，第一个生物反应器可以包括分批发酵，而第二个生物反应器可以包括连续发酵。

在另一实施方案中，在串联排列中每个生物反应器相比于串联的其他生物反应器可以具有微生物的不同的种、菌株、或者微生物的种或菌株的混合。类似地，在本发明另一实施方案中，如在图8中所图示的那样，在串联排列中第一个生物反应装置有悬浮培养物而第二个生物反应装置有固定的细胞。在这种排列中，培养基被引入到悬浮培养生物反应器中，并且发酵流出液被移出并连同另外的培养基一起被进料到第二个生物反应器内的固定细胞。固定的细胞是表现出提高的产物耐受性的突变体，并且能够进一步利用培养基中的底物，产生较高浓度的产物。然后将发酵流出液移出并送往分离和回收。

在本发明的另一实施方案中，发酵罐可以被串联排列以使得来自发酵罐的流出液被立即引入到多个平行发酵罐中。在一些实施方案中，流出液可以在收获酸和/或溶剂后被再循环并用来制造用于将来发酵的初始发酵培养基或原料流，由此使未同化的和回收的养分和矿物质得到最大利用。在一些实施方案中，从流出液中分离产物，然后将产物减少的流出液用作下一个串联发酵罐的原料。可以使用各种类型的提取技术，包括气提、吸附、全蒸发、渗透萃取(perstraction)和蒸馏。

可以调整串联生物反应器的次序以防止或移除由于过度生物质生长所致的阻塞。例如，当第一个串联发酵罐达到高水平生物质时，可以代之将其放置在串联第二位，以现在接收具有高产物浓度或减少的养分水平的流出液，所述高产物浓度或减少的养分水平可能抑制生物质的进一步生产。如果是填充床生物反应器或流化床生物反应器，发酵罐的次序的适时移位可能防止生物质过度生长和发酵罐的阻塞。

在连续过程中，因为细胞浓度和流出液的流速可以不受彼此约束而改变，所以有可能获得比分批工艺或补料-分批工艺中更高的生产率。在连续发酵中，体积产率是通过产物浓度(本文可互换称为“滴度”)乘以养分稀释率(即生物反应器的体积转换率或生物反应器停留时间的倒数)而计算出的。最大可达到的稀释率是通过能够在生物反应器中稳定保持的生物质的浓度而确定的。以恒定稀释率(即养分消耗率)，随着提高可以保持的发酵滴度，生产率按比例提高。固定细胞生物反应器允许较高浓度的生产生物量积累，并因此，生物反应器能够以高稀释率运转，导致体积产率相对于悬浮细胞的培养物显著改善。用于丙酮丁醇梭菌的连续发酵的生物反应器也是本领域已知的(美国专利第4,424,275号和美国专利第4,568,643号)。因为高密度、稳态的培养物能够通过连续的培养而保持，随之而来移出包含产物的发酵培养液，因此可以使用更小容量的生物反应器。

用于培养产生靶产物的微生物的常规生物反应器和方法是已知的并且考虑用于本发明的方法和组合物。例如，在丙酮丁醇梭菌的分批发酵中使用的发酵罐是本领域公知的(Beesch，S.C.Acetone-butanol fermentation of sugars(糖的丙酮-丁醇发酵).Eng.Proc.Dev.44：1677-1682，1952；Beesch，S.C.Acetone-butanol fermentation of starches(淀粉的丙酮-丁醇发酵).Appl.Microbiol.1：85-96，1953；Killeffer，D.H.Butanol and acetone from corn.A description of the fermentation process(来自玉米的丁醇和丙酮。对发酵工艺的描述).Ind.Eng.Chem.19：46-50，1927；MuCutchan W.N.，和Hickey，R.J.The butanol-acetone fermentations(丁醇-丙酮发酵).Ind.Ferment.1：347-388，1954.)。历史上，用于丁醇生产的发酵罐具有50,000加仑到200,000加仑的容量，并且常常没有机械搅拌系统。考虑用于本发明的发酵罐容量包括具有至少100L、1000L、10,000L、50,000L、100,000L、250,000L或500,000L容量的发酵罐。

发酵罐内容物的混合可以通过充入无菌气体例如二氧化碳或N2实现，所述无菌气体也可以通过在发酵罐内保持正压用来防止培养物的污染。也可以在气举型反应器中利用从发酵中排出的气体(CO2、H2)来保持厌氧、加压、充分混合的条件。混合培养物内容物的其他技术包括搅拌器的使用或发酵培养液尤其是在移出发酵产物后返回到发酵罐中的培养液的再循环。在一些实施方案中，发酵罐中的内容物不混合，但是可能依赖于排出的气体的产生和移动来混合内容物。

固定细胞生物反应器

在本发明的一些实施方案中，固定的微生物被培养在填充床生物反应器中，也称为活塞流生物反应器。在其他实施方案中，微生物被培养在膨胀(流化)床生物反应器中。仍在其他实施方案中，将微生物培养在被设计以双重模式操作的生物反应器中，即所述生物反应器能够以填充床或膨胀(流化)床模式操作。参见图19A和19B。固定细胞生物反应器使用相对小尺寸的固体支持体，该固体支持体提供相对于颗粒体积的大表面积，允许固定在颗粒上的微生物处理大体积的流体。在填充床生物反应器中，细胞被固定在半固体或固体颗粒之上或之中，因为粒度，机械约束和/或低流体流速不引起或允许支撑材料的明显轴向移动。填充床反应器容易构建和操作，但是能够遭受阻塞、养分转移差、以及pH控制差。

相比之下，膨胀(流化)床反应器使用基本上不受机械约束的半固体或固体支持体，以使得对于足够的流体流，通常为向上流动的流，颗粒变得在该流中悬浮或“流化”，即表现得好像它们是流体流的一部分。在颗粒上的流体阻力是主要的悬浮机制，但是浮力也能有助于颗粒的悬浮。通常，生物反应器使用垂直流体运动来悬浮颗粒，但是其他流体运动是可能的，包括在垂直于生物反应器纵轴的方向的流体流。流体速度应该足以悬浮颗粒，但是不够大以至于不能将颗粒从容器中载出。床的膨胀允许固体颗粒围绕生物反应器移动，使生物反应器内的流体彻底混合。混合幅度取决于在生物反应器中达到的颗粒流化程度。由于流体的体积必须被循环以保持颗粒悬浮，所以膨胀床生物反应器与填充床相比需要相对大量的能量来操作。

本发明的双重模式、填充床-膨胀床生物反应器允许整个发酵运转的过程以任一种模式进行发酵的选择。可选地，发酵可以在单次发酵过程中在两个模式之间交替。双重模式生物反应器与常规的膨胀(流化)床生物反应器相比具有减少的能量使用，因为具有必需的增加能量需求的流化作用只需要在以下情况下进行：例如，在相对高的细胞密度，高产物浓度，或当可通过提高生物反应器的内容物混合而校正的pH或养分不均形成时。

以下阐述了用垂直流体流操作的双重模式生物反应器的一个实施方案。生物反应器的固体支持体在填充床模式下用微生物接种，然后将在没有流体流动的分批模式下将其保持一段时间。随着微生物开始聚居到半固体或固体支持体上并在密度上有所提高，启动低流体流速以提供其他营养和/或控制pH。然后视需要提高流速以适应增加的细胞密度。在某一点，提高的流体流将使填充柱开始膨胀或“流化”到名为“膨胀床区”的生物反应器区域中。参见图19B。床膨胀所需的最小流体速度U_mf取决于许多考虑因素，包括生物反应器的构造及其伴随的流体动力学、半固体或固体支持体的具体粒度分布、以及填充床的空隙容积，如在使用具体实施方案阐述一般的工程学概念的实施例部分中进一步解释的那样。随着流体速度的进一步提高，填充床将继续膨胀。正如可以理解的那样，能量的使用最初非常低并且将随着流体流动开始而斜升，并且随后提高以适应培养物的生物需要。流化以及此后的最大能量消耗只需要在双重模式的生物反应器中发生在如下时间点：在该时间点细胞密度需要这种混合进一步提高生产率、降低pH或底物不均性、或者以另外方式纠正或处理由增加的细胞密度带来的其他培养条件。

对操作垂直流体流双重模式生物反应器的实施方案的另外的说明如下。在填充床模式过程中通过用被微生物聚居的较小的半固体或固体颗粒连续灌注填充床，而用微生物接种生物反应器的固体支持体。较小的颗粒能够进入支持体材料的孔结构并寄居在那儿，或通过较小颗粒与固体支持体之间的碰撞，微生物可以转移至支持体材料。在24小时后，停止用具有附着的微生物的较小颗粒灌注支持体，并开始用养分溶液灌注。使用低流速，低流速视需要随时间而提高以提供足够的养分，但在运转到达到U_mf的点的发酵过程中永远不提高低流速。

许多发酵罐接种方法是可能的，包括从发酵罐的顶部反向冲洗以便从顶部装载床。其他方式包括通过位于沿着反应器壁的口添加液体培养物或浸渍的固体支持体。还可以使用反应器流出液来接种其他反应器，并且在这种情况下，任何残余的可发酵材料可以在第二个反应器中被转化，提高产率/回收率。

以相似方式，可以通过底部装载、顶部装载或侧面装载将支持体材料添加到柱/反应器以补充从生物反应器中降解或损失的支持体材料。

为了保持生物反应器中包含的流化的支持体材料，将颗粒脱离区安放在床膨胀区上方。脱离区具有将流化的颗粒从流体中分离的装置，并由此将颗粒保留在生物反应器内。在一些实施方案中，用于将颗粒从流体中分离的装置包括用于减慢流体速度的装置。通常，这是通过增加生物反应器的横截面积而实现的。随着流体速度减慢，颗粒开始从流体中沉降出来。颗粒脱离区的顶部截面不含颗粒。出口可以位于这个顶部以移出流出液。保留颗粒的其他装置包括位于生物反应器之内的过滤器或筛。通过使用沉清槽、离心机、水力旋流器、所有类型的过滤机(例如转鼓)、助滤器、干燥器或蒸馏设备，支持体材料可以被移除并且从流出液流中回收。

如之前的实例所说明的，本发明的双重模式生物反应器包括与填充床区接合的入口，所述填充床区与床膨胀区接合，所述床膨胀区与具有出口的颗粒脱离区接合。参见图19B。在一些实施方案中，具有该设计的生物反应器能够连续发酵至少100、250、500、750、1,000、1250、1,500、2,000、2,250、2,500、3,000小时、4,000、5,000或6,000小时。双重模式填充床-膨胀床生物反应器还可以包括柱膨胀区。参见图19B。该区域与床膨胀区的下游端接合，并且它与颗粒脱离区的上游端接合。柱膨胀区包括使脱离流体流的颗粒返回膨胀床区的倾斜的表面。倾斜的角度当从水平测量时是至少15°、20°、30°、40°、45°、50°、55°、60°、70°或80°。柱膨胀区还作为颗粒脱离区起作用，因为该区的顶部具有较宽的横截面直径，并因而将具有较慢的垂直流速。柱膨胀区任选地作为可使用的颗粒脱离区，其包括用于将支持体材料返回到膨胀床区的倾斜角。

双重模式填充床-流化床生物反应器还可以包括气体-液体分离区。参见图19B。该区域与颗粒脱离区的下游端接合。气体-液体区允许排出的气体或引入的气体从发酵培养液中分离，并且可能为积极产生气体(诸如CO₂、H₂或甲烷)的培养物所需，或者当培养物被充气时可能需要气体-液体区。气体-液体区的替代物是在生物反应器出口的下游安放容纳槽(holding tank)。流出液通常将进入该槽并从槽中的低点离开槽，而提供顶部空间以捕集任何可能溶解于流出液中或作为气泡或泡沫从生物反应器中载出的气体。通常，经常与冷凝器(condensor)、过滤器和/或涤气器接合以控制气味的通气口被安放在槽内的高点以允许累积的气体离开系统。取决于多种因素，像流速、原料和不可溶的碎片的产生，容纳槽可以包含沉降区，其中微粒物质能够沉降出来并且被定期移除。具有用本发明达到的预期高产物滴度，某些产物像丁醇可以达到一个浓度点，其中产物将从发酵流出液中相分离。容纳槽还可以设计成包括如下区域：通过相分离促进产物从流出液中分离并且还通过倾析法或抽出密度比流出液小的积累的产物来收获产物的区域。

上面指出的容纳槽还可以用作原位产物提取场所，在其中任何方式的产物回收技术-包括但不限于：气提、全蒸发、真空回收或液-液萃取，可以用来辅助产物从该过程中回收。

双重模式生物反应器还可以包括入口分配区。参见图19B。入口分配区与填充床区的上游端接合。入口分配区分配流体均匀穿过膨胀床以防止在原料分配中的不均匀性或在床内产生pH梯度。一般而言，生物反应器跨入口分配区的压力降被限制在不超过跨生物反应器长度的总压力降的30％。在一些实施方案中，压力降小于总系统压力的30％、25％、20％、15％、10％或5％。

通常，柱膨胀区、颗粒脱离区或气体-液体分离区中至少一个具有比填充床区直径大的直径。

本发明的生物反应器还可以替代地以与通常流体流相反的方向从生物反应器的顶部向下灌注通过填充床。交替的进料方向可以防止或减少流动限制的形成，由此延长填充床的寿命，并因而允许延长连续的发酵运转。

支持体材料一般在不同的粒度分类中是可用的。例如，处于5×8、10×28和20×60目大小的骨炭是可用的。在每种颗粒分类中存在粒度范围。例如，对于5×8骨炭，颗粒大小范围是3000-5000μm。对于任何具体的粒度范围，具有在该粒度范围内发现的最大颗粒的流化所需的最小流体速度U_mf。双重模式生物反应器通常被设计成具有足够的总体高度以便能够在生物反应器内保留当以U_mf操作时在分布范围内发现的最小尺寸的颗粒。一般而言，最小的足够的生物反应器高度是通过确定膨胀床的总高度(H)与填充床的高度(H_p)的比率来计算的，其中H等于H_p的高度加上床膨胀区。双重模式生物反应器应该具有至少1.0的H∶H_p比率，并且优选地具有至少1.05、1.10、1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.70、1.80、1.90或2.00的比率。

实验部分详述了用于获取具有给定粒度分布范围的特定半固体或固体支持体材料的H∶H_p比率的适用于骨炭的一般方法。

可以将膨胀床高度计算为发酵运转过程中在任意点的填充床的高度，所述任意点包括至少四分之一、一半或四分之三通过运转的时间点或在运转结束。这种计算考虑可以随外部生物膜的生长而发生的个体颗粒大小随时间增加。由于不可溶的碎片的积累，填充床还能够增加大小。

本发明的双重模式生物反应器还可以包括用于控制pH、控制氧化还原、引入消泡剂的装置，以及用于使生物反应器的内容物可见和用于引入检测或测量包括一种或多种发酵产物在内的发酵培养液的各种组分的探头的孔道。另外，可以通过孔道引入温度探头、压力探头和溶氧探头或其他的溶解气体探头。可选地，可以通过将探头放在离开生物反应器的流出液流的管线内而完成这些测量。还可以存在采样口以供自动或人工获得物理样品。另外，排出或引入的气体可以从气体-液体分离区的口或废气处理系统的管线内采样。生物反应器可以被包壳以用于温度控制和就地消毒。任选地，生物反应器可以具有允许大规模进入生物反应器内部或允许填充床区、膨胀床区、柱膨胀区、颗粒脱离区或气体-液体分离区中的一个或多个的高度改变的模块化设计。

本发明的双重模式生物反应器可以主要以定期提高流体速度的填充床模式运转，定期提高流体速度实现将柱膨胀到柱膨胀区或使填充床流动。这能够以计划的间隔预防性地进行以防止压力增大和流体流的限制或堵塞。在一些实施方案中，生物反应器主要以填充床模式运转，但以下述频率被切换到膨胀床模式：每小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、18小时、24小时、2天、4天、6天、8天、10天、20天或它们的组合。也可以在流体压力超出预定的工作点时进行切换。

在转到较低流体速度后，颗粒将以更松散的构型(a loser configuration)沉降，该构型允许与流速提高之前相比相同或更大的流体流速，但具有减少的压力降。在膨胀床模式下每次定期流速提高后，在填充床模式下的流速可以被设定成随时间渐进上升，例如，具有100ml/min的起始流速，在第一次提高后流速可以被设定为105ml/min，在提高后接下来流速为110ml/min等等。这种渐进增加可以防止生物反应器内部的堵塞或不可接受的压力增加。通过增加的流体速度定期对床重新充填的能力以及随后固体支持体和不可溶颗粒在流体速度降低后的沉降可能提供一种方法，该方法防止填充床的堵塞或积垢并引导连续的发酵运转超过100、250、500、750、1,000、1250、1,500、2,000、2,250、2,500、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000或8,000小时。取决于驻留在填充床中的不可溶颗粒的大小和密度，转换成膨胀床模式可能使得有冲洗来自系统的这些不可溶颗粒的机会。使用与生物反应器成一排的容纳槽，不可溶颗粒可能从发酵罐流出液中沉降出来。可选地，不可溶颗粒可以被滤出、通过离心或通过其他适合的手段移除。

通过从填充床运转模式转换到膨胀床运转模式定期对床重新充填的能力还可以防止或减轻在床基质中的沟流(channeling)。沟流能够导致进料分布和pH控制的不均性，因为在沟(channel)附近的固体支持体上的细胞与位于远离沟的固体支持体上的细胞相比被暴露于更大体积的原料流。

在一些实施方案中，在移种生物反应器之前或移种生物反应器后随即将流速增加以开始调整支持体材料的颗粒间间距，由此提高总体生产率或改变其他参数，诸如跨整个床的压力降。在一些实施方案中，流速的定期提高或降低周期性地膨胀和再沉降支持体材料和有机体材料。在这样做时，可以调整支持体材料之间的空隙间距。

任选地，可以将无氧气体添加到液体培养基以增强混合、提供另外的养分或维持生物反应器内部的正压。流化床的特点和表现依赖于固体和液体两者的特性。在产物对微生物有毒性或抑制性效应时，可以使用气提来降低柱流体中的产物浓度，并由此降低或防止产物的抑制或毒性。

在本发明中使用所需的粒度将依赖于应用、生物反应器构型和操作参数而变化。在一些实施方案中，通过筛分对固体支持体分大小。在一些实施方案中，通过颗粒能够穿过的筛孔的筛号将颗粒分类。在一些实施方案中，用具有以下美国筛号(U.S.Sieve Number)的筛目筛分颗粒：3 1/2、4、5、6、7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60或70。在一些实施方案中，颗粒被筛分至少两次，第一次使用具有较大开口的筛目，接着使用具有较小开口的筛目，以产生在限定的粒度分布范围内的颗粒。在一些实施方案中，颗粒直径为至少100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm、1,100μm、1,200μm、1,300μm、1,400μm、1,500μm、1,600μm、1,700μm、1,800μm、1,900μm、2,000μm。在一些实施方案中，颗粒直径为小于100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm、1,100μm、1,200μm、1,300μm、1,400μm、1,500μm、1,600μm、1,700μm、1,800μm、1,900μm、2,000μm。在其他实施方案中，至少80％、85％、90％、95％或100％的颗粒具有在以下范围内的直径：100-400μm、100-600μm、100-800μm、200-500μm、200-800μm、200-1000μm、400-800μm、400-1000μm、500-1000μm、600-1,200μm、800-1,400μm、1,000-1,500μm或1,000-2000μm。在一些实施方案中，颗粒直径是等效直径，即考虑到个体颗粒的不规则形状的直径。

理想地，半固体或固体支持体材料应该具有高表面积。这可以通过使用小尺寸颗粒、具有高孔隙率的颗粒或其组合来实现。在一些实施方案中，颗粒的表面积为至少10m²/g、25m²/g、50m²/g、75m²/g、100m²/g、125m²/g、150m²/g、175m²/g、200m²/g、225m²/g、250m²/g、275m²/g、300m²/g、325m²/g、350m²/g、375m²/g、400m²/g、425m²/g、450m²/g、500m²/g、600m²/g、700m²/g、800m²/g、900m²/g、1000m²/g或2000m²/g。另外，堆密度应该足够高以使得最小的颗粒从柱膨胀区和/或颗粒脱离区中的流体流中沉降出来，并由此保留在生物反应器中。在一些实施方案中，支持体的堆密度为至少0.3g/cm³、0.4g/cm³、0.5g/cm³、0.6g/cm³、0.7g/cm³、0.8g/cm³、0.9g/cm³、1.0g/cm³、1.1g/cm³、1.2g/cm³或1.3g/cm³。支持体材料应该具有足够的硬度以抵抗磨耗并由此在支持体材料彼此接触和碰撞时明显地避免粉尘形成。在一些实施方案中，支持体具有至少20、40、60、80、100、120、140、160或200的球盘硬度数。支持体材料还应该具有足够的拉伸强度以抵抗由于内部应力所致的碎裂，内部应力是由支持体材料孔内部的生物膜的生长引起的。在一些实施方案中，支持体具有至少20MaP、40MaP、60MaP、80MaP、100MaP、120MaP、140MaP、160MaP、180MaP、200MaP、300MaP或400MaP的屈服强度。

用于收获产物的装置

许多手段可用于从发酵培养液分离产物，包括蒸馏、用溶剂连续提取(美国专利第4,424,275号和美国专利第4,568,643号)、碳氟化合物的使用(美国专利第4,777,135号)、吸收材料的使用(美国专利第4,520,104号)、全蒸发膜的使用(美国专利第5,755,967号)以及汽提气的使用(美国专利申请第10/945,551号)。

本发明的一个实施方案使用蒸汽压缩蒸馏系统。(美国专利第4,671,856、4,769,113、4,869,067、4,902,197、4,919,592、4,978,429、5,597,453和5,968,321号。)另一实施方案利用机械的蒸汽再压缩系统来浓缩溶剂并利用塔顶流的焓来蒸发进料混合物。在这个实施方案中，发酵培养液被直接送至MVR塔以用于溶剂浓缩。来自MVR系统的塔顶流被压缩。热交换器用于从具有进料混合物的压缩的塔顶传递热。包含溶剂的混合物被传到后面的蒸馏柱用于分离。MVR柱的底部包含生物质和其他较重的化合物。生物质通过任何过滤方式被过滤并且可以被干燥以回收另外的水。过滤流包含大部分水和发酵培养基组分。处理该流以移除不期望的组分并且可以将其作为工业用水回收。以交替构型，对于丙酮丁醇梭菌的分批发酵，包含在消耗的发酵培养基中的产物的收获首先需要通过离心澄清，交叉流过滤或替代的过滤方式。然后将澄清的发酵培养液送至蒸馏系统中，其中澄清的培养液进入热交换器并且通过来自输出的蒸馏产物和废液的热传递而被预热。将预热的培养液除气并加至板式蒸发器/冷凝器中，所述板式蒸发器/冷凝器有在叠加的金属板之间交替形成的由垫圈分隔的对流蒸发室和冷凝室。培养基进入蒸发室，在其中培养基沸腾。离开蒸发室的加热的蒸汽通过除雾的筛孔，然后被低压压气机加压。加压的蒸汽被递送至冷凝室，在其中蒸汽部分地或全部地冷凝成蒸馏的产物，把热传给沸腾室中的培养液，并然后被从系统中排出。包含溶解固体的未蒸发的培养液可以被再循环并且用来补充新发酵运转的进料混合物，或者它可以被从系统中排出。

在一些实施方案中，对于丙酮丁醇梭菌的连续培养物，使抽出的发酵培养液离开发酵罐并离心以浓缩细胞和颗粒物质。可选地，可以通过例如切向流过滤来过滤发酵培养液。可以将浓缩的细胞和颗粒物质回填至发酵罐(若期望的话)以增加细胞密度或用于进一步发酵部分发酵的底物。可选地，如果澄清的或过滤的发酵培养液包含可溶的可发酵底物，可以将澄清的或过滤的发酵培养液回填至发酵罐。当期望从培养基中收获产物时，许多策略是可用的，包括储存澄清的或过滤的发酵培养液直至存在合理的数量来开始产物分离运转，诸如蒸馏，或者可选地，澄清的或过滤的发酵培养液的连续进料可以被送至分离系统。在一些实施方案中，发酵培养液可以被直接加工而不经离心或过滤。

由某些包含丁醇的溶剂混合物组成的发酵培养液可以经历基于比重的自发的相分离。浮标液位指示器的使用可用于从剩余的含水部分中辅助分离包含丁醇的溶剂层。

还可以通过气提或液体萃取回收发酵产物。在气提的情况下，期望的产物或抑制性化合物期望从发酵培养液中移出。在气提方法中，通过闪蒸槽、真空提取或冷凝法回收移出的产物。在抑制性化合物的情况下，对产物进一步纯化或处置。生物质以及所形成的其他固体材料和沉淀必须在某点从系统中移出或清洗。这可以通过间断的或连续的清洗流实现。生物质移出可以通过之前概括的几种手段实现。在液体萃取的情况下，生物质可以存在于萃取流或清洗流二者中。液体萃取流被传至另外的回收和纯化操作。

实施例

实施例1：包含2.2-2.6％(v/v/)丁醇的P2+4％木糖琼脂板的制备

为了制备1L的P2培养基，将以下成分称量到1-L瓶中：Bacto酵母提取物(1.0g)、乙酸铵(2.2g)、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)(0.5g)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)(0.5g)。将蒸馏水(800mL)加至混合物中，伴随搅拌棒搅拌。通过在搅拌盘(stir plate)上混合来溶解这些成分。用5N NaOH将溶液的pH调整到7.2。称量琼脂(16克)并加至瓶中。添加适当量的蒸馏水将体积提增到915ml。将瓶盖上，高压灭菌30分钟，并然后放在搅拌盘上。当触摸培养基刚冷却时，添加以下物质将培养基的终体积提增至1L∶P2微量元素(200×)(5ml)和50％(w/v)木糖(对于4％(w/v)的终浓度80ml)。

通过在1-L瓶中称量以下成分来制备1-L的200×P2微量元素：硫酸镁七水合物(MgSO₄.7H₂O)(40.0g)、硫酸锰一水合物(MnSO₄.H₂O)(2g)、硫酸亚铁七水合物(FeSO₄.7H₂O)(2g)、对氨基苯甲酸(0.2g)、盐酸硫胺素(0.2g)、柠檬酸(20g)、NaCl(2g)、D-生物素(0.002g)。用蒸馏水使终体积增加到1-L。使用0.2微米过滤器将溶液过滤除菌，用铝箔包裹，并储存在4℃。

通过在搅拌盘上将200ml蒸馏水加热到50℃来制备50％(w/v)木糖。将255g的D-木糖缓慢添加至热水中并搅拌直至所有木糖溶解。通过添加蒸馏水使体积增加至500ml。通过0.2微米过滤器对溶液过滤除菌。

用以0.2ml递增的4.4-5.2ml丁醇分别添加到五个无菌200ml量筒的一个中，制备具有以0.1％递增的2.2-2.6％(v/v)丁醇的平板。用按照描述制备的P2+木糖琼脂培养基将每个量筒中的体积增加到200ml，用石蜡膜密封，并且将量筒颠倒以均匀地混合丁醇与P2+木糖琼脂培养基。

将琼脂培养基放在热平板上以避免培养基在倾注过程中凝固。使用燃烧器/喷灯来保持无菌环境，由每个量筒倾注平板(每个平板大约25-30ml)以得到在以0.1％递增的平板2.2-2.6％(v/v)中适当的丁醇浓度。在培养基凝固后平板被移至厌氧罩并且被单独地用石蜡膜封口以防止丁醇损失。在厌氧罩中24小时后，平板是随时可用的。

实施例2：用于分离具有增加的丁醇耐受性的突变体的双盘诱变测定

在第一天，开始待诱变的菌株的种子训练(seed train)。第二天，剪下适当数目的0.75×6cm滤纸。将半数滤纸放到包含6mg/ml MNNG的50ml管中。将另一半滤纸放到包含丁醇的50ml管中。在平板上使用之前将管移至厌氧罩中至少4小时。

测量种子训练管的OD₆₀₀以确定哪个管最接近1的OD₆₀₀，并且如果需要，等待直到具体培养物达到1的OD₆₀₀。如果三种培养物都已经长到高于OD₆₀₀1，使用YEM做适当稀释以获得OD₆₀₀₀.5的培养物。OD₆₀₀0.5的培养物在0.5小时至1小时内达到OD₆₀₀1。

将200μl上述OD₆₀₀1的培养物铺板在每个RCM平板上。将MNNG浸泡的滤纸放在平板一边的水平处(参见图1)。孵育平板1小时。将丁醇浸泡的滤纸放在与MNNG滤纸垂直(正交)处(参见图8)。制备三个对照平板：没有丁醇和MNNG的平板，没有丁醇的平板，以及没有MNNG的平板。

将平板孵育1至3天。评估了在丁醇滤纸附近(即图1中的画圆圈区域)的分离的菌落的生长。评定这些菌落以确定它们与亲本菌株相比耐受丁醇的能力。

将图1的画圆圈区域中分离的细菌再暴露于MNNG和丁醇的这种双梯度以获得多种突变。这可能提高细菌耐受丁醇的能力。在暴露于双梯度两次后，从画圆圈区域中分离菌落。

实施例3：在固体培养基上分离具有提高的丁醇耐受性的突变体

使糖丁酸梭菌Co-7449菌株生长在酵母提取物培养基(YEM)中至大约3的OD₆₀₀，并用终浓度为50μg/ml的N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)处理15分钟。将细胞用无葡萄糖的YEM洗涤两次并以10^-3和10^-4稀释度铺板在强化梭菌培养基(RCM)上以回收3000-4000个菌落。将菌落在包含5％丁醇的RCM平板上重复铺板。总计20个菌落在丁醇平板中被分离并在包含5％丁醇的RCM平板上被重新划线。突变体当生长在固体支持体上时与亲本Co-7449菌株相比展示出至少高两倍的对丁醇的耐受性，所述Co-7449亲本菌株在固体支持体上具有大约2.1％的丁醇耐受性。

通过从第二组5％丁醇RCM平板中取出菌落并使用突变体来接种包含有或没有1.2％丁醇的YEM培养基的烧瓶，测试所选择突变体在悬浮培养中的丁醇耐受性。菌落在没有丁醇的YEM中生长，但是在具有添加到培养液中的1.2％丁醇的YEM中不生长，说明突变的微生物在固体支持体上比它们被悬浮在液体培养基中更加耐受溶剂。

将从没有1.2％丁醇的YEM培养基中取出的样品铺板在5％丁醇平板上，但是没有生长。高丁醇耐受菌株的保持可能需要在具有溶剂的连续选择压力的固体支持体上传代以保留高耐受性。

实施例4：丁醇耐受性测定方案-固体培养基相对液体培养基

研究了对于丁醇耐受性未被适应或选择的梭菌属的菌株，看它们当培养在固体支持体上时与悬浮培养相比是否具有更大的溶剂耐受性。在第一天，在厌氧罩内的P2+4％木糖的5ml培养物中开始对待研究的菌株的种子训练。制备1-L体积的包含4％木糖和琼脂的无菌P2培养基，并将其放在热平板上。在无菌环境中，将4.4、4.6、4.8、5.0和5.2ml丁醇放在250ml无菌量筒中并用P2+4％木糖琼脂培养基补足到200ml，使丁醇终浓度分别为2.2、2.3、2.4、2.5和2.6％(v/v)。将溶液充分混合，并在无菌环境中倾注平板。在平板凝固后，将其转移至厌氧罩并且在过夜储存前即刻用石蜡膜封口。

第二天，测量种子训练管的OD₆₀₀。挑出OD₆₀₀在0.6-1.0之间的管，并将其用于以1∶20的稀释度接种到10ml包含0、0.5、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5和1.6％(v/v)丁醇的P2+4％木糖管中。还制备了没有接种物的对照管。将管在厌氧罩中孵育。另外，将200μl的培养物铺板在0、2.2、2.3、2.4、2.5和2.6％(v/v)丁醇平板上。

在1天和3-4天后，测量液体培养物的OD₆₀₀。检验平板生长。对于每种菌株和在每个时间点的液体培养物，将每个丁醇浓度的OD₆₀₀相对于0％(v/v)丁醇的0D₆₀₀作图为((在x％的OD₆₀₀)/(在0％的0D₆₀₀))×100。图2A显示在不同时间点(0小时、24小时、96小时)对于使用的三种梭菌属菌株的包含不同丁醇浓度的不同液体培养物取得的OD₆₀₀测量结果。起点(0小时)的OD₆₀₀是基于起始培养物的1∶20接种。图2B显示按1∶20接种取得的起始液体培养物的OD₆₀₀测量结果。图3是来自图2A的数据的图示并显示Co-5673随时间在每种丁醇浓度(0％-1.6％v/v)的液体培养基中的生长。对于Co-5673，0D₆₀₀在24小时和96小时的时间点增加最多到1.4％(v/v)丁醇。图4是显示在每种丁醇浓度(0％-1.6％丁醇)的液体培养基中Co-0124随时间生长的图。对于Co-0124，OD₆₀₀在24小时和96小时的时间点增加最多到1.6％(v/v)丁醇。图5是显示在每种丁醇浓度(0％-1.6％丁醇)的液体培养基中Co-7449随时间生长的图。对于Co-7449，OD₆₀₀在24小时和96小时的时间点增加最多到1.4％(v/v)丁醇。

图6A是显示分析三种菌株Co-5673、Co-7449和Co-0124在固体培养基平板(P2+4％木糖)上在24小时时间点的丁醇耐受性的表。在液体培养基中的丁醇耐受性是基于相比于起始OD₆₀₀在OD₆₀₀上的增加。观察到的在固体培养基平板上的生长表明丁醇耐受性。Co-5673显示在包含0％和2.2％的丁醇的平板上生长。Co-0124显示在包含0％和2.2％的丁醇的平板上生长。Co-7449显示只在包含0％丁醇的平板上生长。图6B是在24小时的时间点三种菌株在液体培养基中和在固体培养基上的丁醇耐受性的比较。在固体培养基上Co-7449在24小时的丁醇耐受性结果(2.1％)是在与另外两种菌株分开的实验中确定的。所有三种菌株当生长在固体培养基上时在24小时表现出更高丁醇耐受性。

图7A是显示分析三种菌株Co-5673、Co-7449和Co-0124在固体培养基平板(P2+4％木糖)上在96小时时间点的丁醇耐受性的表。在液体培养基中的丁醇耐受性是基于相比于起始OD₆₀₀在OD₆₀₀上的增加。观察到的在固体培养基平板上的生长表明丁醇耐受性。Co-5673显示在包含0％和2.2％的丁醇的平板上生长。Co-0124显示在包含0％、2.2％和2.3％的丁醇的平板上生长。Co-7449显示只在包含0％和2.2％的丁醇的平板上生长。图7B是三种菌株在液体培养基中和在固体培养基上在96小时的时间点的丁醇耐受性的比较。所有三种菌株当生长在固体培养基上时在96小时表现出与液体培养基相比更高丁醇耐受性。当丙酮丁醇梭菌的不同菌株被培养在固体支持体上时发现的这些微生物的较高丁醇耐受性是出人意料的结果，如果该结果对包括丙酮丁醇梭菌的其他菌株和梭菌属的其他种在内的其他微生物也适用，则它具有提高生物燃料体积生产率的潜力以及由于减少的能量需求还具有减少分离成本的潜力。

实施例5：使来自环境样品的丁醇耐受的微生物适应

获得了环境样品(分离株)。将该分离株铺板在一组包含营养琼脂的相同平板上。平板具有范围在1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％和2.0％的提高的丁醇浓度。具有1.0％、1.2％和1.4％丁醇的平板过度生长，而具有1.6％丁醇的平板具有几个菌落。在具有1.8％或2.0％丁醇的平板上没有观察到生长。从1.6％平板中挑出菌落，并将其在包含每种提高浓度的丁醇的固体支持体上连续传代。在20次传代后，获得适应于在2.5％丁醇中生长的菌株。

实施例6：固定化连续培养的配置和操作

使用具有0.665空隙率的0.15L柱并使具有3％葡萄糖的P2培养基以0.36L/h的速率流过该柱，建立了具有在10×28目骨炭上的固定的Co-7449细胞的填充柱的连续发酵工艺。首先将Co-7449的细胞固定到柱上，这是通过将柱安装于中级生长的Co-7449的分批发酵并使来自该分批发酵的培养基循环经过该柱而实现的，然后回到发酵罐持续约24小时的时间。

在将细胞固定到填充柱上以后，然后将柱的出口流从分批发酵罐断开，并附加至另一个收获池。从发酵罐到柱的流速被设定为0.36L/h。培养基也从100L无菌培养基袋连续添加至发酵罐以保持在发酵罐中的相同培养基体积。通过使来自发酵罐的出口流在流经柱之前穿过加热培养基的热交换器，填充柱的温度被保持在允许细菌生长的温度。通过将供应给柱的发酵培养基充入氮来保持系统无氧。使用这些条件，具有固定的Co-7449的填充柱产生具有0.24g丁醇/g葡萄糖的产率和以3.6h-1稀释率的4.9g丁醇/(L*h)生产率的1.36g/L丁醇滴度。

实施例7：固定化连续培养的配置和操作

通过固定具有5.0％丁醇耐受性的Co-7449的丁醇耐受突变体的细胞，建立了固定的连续培养物。如以上实施例6中所述使用以10×28目骨炭填充的柱。在细胞被固定到填充柱上后，将来自种子分批发酵罐的入口流和返回到种子分批发酵罐的出口流断开。将来自100L无菌培养基袋的进料线与柱相连并将来自该柱的出口线送回到培养基袋。培养基至柱的流速被设定为0.36L/h。通过使来自培养基袋的出口流在进入柱之前穿过热交换器，填充柱的温度被保持在允许细菌生长的温度。使排出的发酵气体通过发酵锁逸出。使用这些条件，具有固定的Co-7449突变体的填充柱产生了超过10g/L的丁醇滴度。

实施例8：发酵

使用发酵工艺诸如分批发酵、补料-分批发酵或连续发酵产生了主发酵培养液，其中微生物在悬浮培养中生长或固定在固体支持体上。主发酵培养液包含一些酸和/或溶剂滴度以及残余的未同化原料。用于提高的生产率和滴度的残余原料的进一步利用是通过放置与第一个生物反应器串联的包含固定的产物耐受性突变微生物的第二个生物反应器实现的，如图8所示。附加进料可以按需添加以进一步提高生产率和滴度并由此降低分离和回收的能量需求。在发酵过程结束时，发酵培养液被传送以用于分离和回收发酵产物。

如将被理解的那样，多个生物反应器的构型是可能的。两个或多个生物反应器可以用作具有悬浮细胞或固定细胞的主生物反应器。可以将两个或多个生物反应器串联安放，且每个相继的生物反应器包含具有对产物的更高耐受性的突变微生物。另外，对于串联的生物反应器，对于每个生物反应器的具体工艺参数可以被优化，诸如稀释率和进料率、培养基组分以及温度。在串联的各个生物反应器包含不同的微生物菌株或物种或微生物的聚生体时这一特征可能是特别重要的。

不考虑生物反应器的构型，通过再循环来自分离和回收阶段的加工过的发酵流出液获得原料和水利用上的进一步节约，其中加工过的发酵流出液可以充当生物反应器中的起始发酵培养基的基础或进料流。以这种方式，利用未同化的和/或回收的养分和矿物质(例如铁)。

对于选择的固体支持体材料，填充床区、膨胀床区和H∶Hp的示例 性确定

实施例9-13举例说明用来计算双重模式生物反应器的具体设计参数的方法。在这些实施例中，选择骨炭作为固体支持体材料，使用该相同方法或相似方法也可以产生其他固体支持体和半固体支持体的设计参数。

实施例9：骨炭颗粒等效直径的计算

骨炭颗粒具有不规则形状，然而，可以由终端沉降速度计算等效直径，由此给出相同密度的“等效”球体的颗粒-液体相互作用的估计。由于在骨炭形状和大小上的差别，获得对于平均沉降速度和对于平均沉降速度的+/-一个标准差(+/-σ)的等效直径。

骨炭颗粒信息

图9A显示包括具有不同大小的目、沉降速度(cm/s)以及等效直径(μm)的骨炭颗粒的三个非限制性实例的表。图9B是使用终端沉降速度，在4％葡萄糖溶液中5×8型骨炭的等效直径的图示。

实施例10：骨炭颗粒的最小流化速度

使用压力降的Ergon方程完成使骨炭颗粒流化所需的最小液体速度的估计。基于颗粒密度和实施例9中公开的等量球面直径(equivalent spherical diameter)计算三种类型骨炭颗粒的这种最小流化速度(U_mf)。采取的液体性质是4％葡萄糖水溶液在35℃的性质。

对于每种颗粒类型，3种尺寸用于等效直径，对应于报道的平均沉降速度和各自平均值的+/-一个标准差(+/-σ)(参见实施例9)。

最小流化速度取决于流化之前的填充密度(空隙率，ε_mf)。因为这是未知的仍是未知的，因而对一定范围的空隙率计算结果。对于球形颗粒，ε_mf的常见值是在0.35-0.45范围内。对于具有奇怪形状和混合大小的颗粒，空隙率可能是显著不同的。

三种类型骨炭的结果呈现在图10、11和12所示的表和图中。图10A、11A、12A是显示以5×8、10×28和20×60型骨炭在4％葡萄糖溶液中的不同等效直径，经一定范围的空隙率分别计算出的最小流化速度(U_mf)的表。图10B、11B、12B是对不同等效直径，经一定范围的空隙率计算出的最小流化速度(U_mf)的图示。

为了能够流化每种类型骨炭中的较大颗粒(+1σ大小)，采取的最小流化速度不低于对应于在0.45的ε_mf的每种类型中较大直径的那些最小流化速度，如以下列出的：

骨炭类型  最小流化速度(cm/s)

5×8          1.394

10×28        0.371

20×60        0.144

由于奇怪形状的颗粒、每种类型的大小是一定范围和未知的填充密度，这些最小流化速度是具有某种程度不确定性的估计值。采用以上所列出的值作为设备能力的最小值。以填充床模式的操作将在较低速度发生，并且以流化膨胀床模式的操作将在略高的速度发生。另外，所述计算结果是对于清洁颗粒的；当生物膜在颗粒上生长时，预期在有效直径上和在速度需求上将存在改变。对于这些不确定性，建立了安全系数，即超过这些速度的某种能力。

实施例11：流化的骨炭颗粒的床膨胀

当固体颗粒被向上流动的液体流化时，对于比最小流化速度大的液体速度，床膨胀超过初始膨胀床的水平。使用Richardson&Zaki的模型(Richardson，J.F.和Zaki，W.N.1954.Sedimentation and fluidization：Part I(沉积和流化：第I部分).Trans.Inst.Chem.Eng.32：35-53)和Richardson&Khan的相关性(Khan，A.R.和Richardson，J.F.1989.Fluid-particle interactions and flow characteristics of fluidized beds and settling suspensions of spherical particles(液体-颗粒相互作用和流化床的流动特点以及球状颗粒的沉降悬浮).Chem.Eng.Comm.78：111-130)，编写程序来估计三种类型骨炭颗粒(5×8、10×28和20×60)的床膨胀水平。对于单尺寸颗粒形成了最初的相关性，并因此包含某种程度的不确定性，因为每种类型骨炭具有一定范围的颗粒大小。对于这种分析，应用该模型如同床包含直径等于等效“平均”直径的单尺寸颗粒。为了获得对可能的变化的一些估计，按照沉降速度对单尺寸颗粒重复计算等于+1σ“较大值”和-1σ“较小值”的直径：

等效直径(μm)

骨炭类型    较大值     平均值     较小值

5×8        988        763        550

10×28      451        341        239

20×60      277        215        156

床膨胀不仅取决于颗粒大小和液体速度，而且取决于床直径(D_床)和最小流化的空隙度(ε_mf)。对于这个实施例，分析使用了D_床＝10cm的床直径和ε_mf＝0.5的空隙率。

结果呈现在图13、图14和图15所示的表和图中，并且是以膨胀床的总高度与填充床高度之比(H/H_填充)的形式。图13A、14A、15A显示用于计算床膨胀水平的参数。图13B、14B、15B分别是骨炭类型5×8、10×28和20×60的床膨胀的图示。在每种类型骨炭中的较大和较小颗粒之间以这一比率扩展对于5×8型(图13)是最大的，而对于20×60型是最小的(图15)。这暗示对于5×8骨炭在生物反应器的膨胀区中保留较小颗粒更为困难，对于10×28骨炭更容易，并且对于20×60骨炭最容易。

对于能够在膨胀床和流化床两种模式下运转的生物反应器而言，期望在床膨胀区中保留较小颗粒(图19和图20)，而仍然实现较大颗粒的流化。因此，对于每种类型的骨炭，处在液体表观速度的较小颗粒的膨胀床总高度与填充床高度之比(H/H_填充)只略大于较大颗粒的最小流化速度。从计算的表和图，这种状况对于每种类型骨炭见于如下：

            表观速度      膨胀床的总高度与填充床

            (U_mf cm/s)    高度之比H/H_填充

骨炭类型    对于较大颗    粒对于较小颗粒

5×8        1.88          1.38

10×28      0.55          1.32

20×60      0.22          1.21

因此，虽然生物反应器设计用于所有三种类型的骨炭，应该选择膨胀床总高度与填充床高度的最大比率(即约1.4的H/H_填充)用于生物反应器设计。

实施例12：双重模式填充床-流化床生物反应器的设计要求

对双重模式填充床-流化床生物反应器的设计要求是基于在实施例9、10和11中描述的相关性和计算。设计是基于以下前提：

1.反应器必须用骨炭颗粒上的固定细胞操作。

2.反应器容积(填充床的)是要选择的参数。

3.反应器应该能够以填充床或流化床模式操作。

4.最大液流应该能够使所选级别的骨炭中存在的最大颗粒流化。

5.对于流化床的膨胀应该允许足够高度，甚至是对于所选级别骨炭中的最小颗粒。

编写电子表格程序(spreadsheet program)来计算具有以上要求的填充床-流化床生物反应器所需的设计参数。这些计算运用了在实施例9、10和11中描述的用于确定等效颗粒直径、最小流化速度和床膨胀高度的软件。

对于给定的一组规格(反应器体积、床直径、骨炭类型、液体特性)，为以下确定设计计算：

1.填充区的高度。

2.床膨胀区的高度。

3.实现流化的液体流速。

使床直径作为变量，因为最终的设计选择取决于组分利用率。在填充床模式中利用的流速，跨整个床的压力降和上面的脱离容器的设计不包括在计算中。

三种类型骨炭颗粒5×8、10×28和20×60的结果分别呈现在图16、图17和图18中。对于以下情况具体计算这些结果：

·反应器容积(V_R)＝1升。

·在最小流化的空隙度(ε_mf)＝0.5。

·床直径(D_b)变量在6-14cm范围。

下表比较了对于D_b＝8cm的情况，三种骨炭类型的设计要求。

                需要的流动          需要的膨胀高度

骨炭类型        V _f (升/分)           H _e (cm)

5×8            5.67                7.79

10×28          1.65                6.52

20×60          0.66                4.08

对于不同的床直径的类似结果可以从图16、图17和图18中的图中读出。如果对于反应器容积选择不同的规格或者如果发现在最小流化的空隙率不是0.5，那么可以重做计算。

注意到以下观察结果：

需要的液体流速对于5×8型最高，对于20×60型骨炭最小。

床膨胀的高度要求对于5×8型最大，对于20×60型骨炭最小。

因此，达到双重模式的能力对于20×60型骨炭而言最容易，而对于5×8型骨炭而言最难。

相反，为20×60型骨炭设计的反应器不太可能在另外两种类型的骨炭颗粒的流化模式下操作。

图19A和图19B图示了双重模式生物反应器概念。在图16、图17、图18和图19中使用的术语如下：

V_R＝在填充床区的反应器的容积

D_b＝反应器床容器的直径

D_d＝脱离容器的直径

D_p＝骨炭颗粒的直径

H_p＝填充床的高度

H_e＝在流化操作中膨胀区的高度

H＝膨胀床的总高度＝H_p+H_e

U_b＝在床容器中的表观液体速度

U_d＝在脱离容器中的表观液体速度

V _p＝液体通过填充模式反应器的体积流速

V _f＝液体通过流化模式反应器的体积流速

双重模式生物反应器通常具有被配置为包括几个分离区的柱形。参见图19B。它们通常以下列相继次序以垂直位置排列：

a)填充床区，包括其中的颗粒，所述颗粒包括其上用于发酵所述生物学产物的微生物；

b)床膨胀区，所述床膨胀区与所述填充床区接合，用于在流化床模式下膨胀颗粒；和

c)颗粒脱离区，所述颗粒脱离区与所述床膨胀区接合，当颗粒处在流化床模式时，所述颗粒脱离区使得颗粒沉降。

双重模式生物反应器的入口通常位于垂直安放的生物反应器的底部，在生物反应器中流体以垂直方式流动并且其中上述各区域按填充床区到颗粒脱离区的上升次序排列。当流速低于流化最大支持体颗粒所需速率时，填充床区包含固体支持体。床膨胀区被设计成允许床在提高的液体入口流速膨胀，以使得更均匀的轴向混合成为可能并打散由生物膜的生长所形成的聚集颗粒。后一种特性可用于填充床的间歇式膨胀(流化)以防止堵塞，允许更长的发酵时间以及由此频率较低的生物反应器周转。颗粒脱离区是较低的流体速度的区域，它允许悬浮颗粒从发酵培养液中分离，由此允许发酵培养液被不含悬浮颗粒地抽离生物反应器。在诸如丁醇的产物达到自发地相分离成为产物相和水相的浓度时，颗粒脱离区还可以充当相分离区，使得富集产物的有机相被直接从生物反应器中取出。

生物反应器可以任选地以柱膨胀区、入口分配区和/或气体-液体分离区为特征。参见图19B。入口分配区在固体支持体材料的整个填充床均匀地分配进来的流体。跨整个入口分配区的压力降一般被设计成不超过跨生物反应器整个长度的总压力降的30％、25％、20％、15％、10％或5％。气体-液体分离允许排出的气体或引入的气体从液体中分离，并由此防止流出液中的气体夹带和气体中的液体夹带。通常，柱膨胀区、颗粒脱离区和气体-液体分离区中至少一个具有比填充床区直径大的直径。

实施例13：图20B的结果的分析

实施例9-12呈现了基于从技术文献判断的最适合的模型和相关性的骨炭颗粒流化特点的计算结果。图20A和图20B显示对于1.6cm的移液床(pipet bed)直径与2cm²的床面积所收集的两组数据。图20B显示了对于测量实际骨炭颗粒的两个关键特点(最小流化和床膨胀)所收集的数据。该数据可以与模型一起使用来精选双重模式生物反应器的设计特征。基于实验数据和模型预测，对于双重模式填充床-流化床生物反应器的设计规格作出以下结论和建议。

最小流化

骨炭颗粒的最小流化速度(U_mf)取决于颗粒大小、密度、形状和填充空隙率(ε)。在这时对于不规则形状颗粒来说空隙率是未知的，因此在实施例10中对于U_mf的估计是基于ε＝0.45的值。

测量的U_mf被获得并且略大于模型的预测值，暗示实际空隙率大于0.45。基于U_mf的实验值，使用模型并计算出空隙率的新值(对应于实验的U_mf)：

骨炭类型        实验的U _mf     对应的ε

5×8            1.88         0.50

10×28          0.86         0.56

20×60          0.33         0.55

ε的新值范围是从0.50到0.56，这是合理的，因为骨炭颗粒的不规则形状。这些空隙率将用来做流化计算。

对于设计，将使用U_mf的实验值，因为它们比原来的估计值略大。使用较大值确保了使颗粒流化的能力。

床膨胀

需要双重模式生物反应器的足够高度以使得颗粒能够在床流化时被保留在生物反应器中。实施例11给出了对膨胀床高度与填充床高度比率(H/H_填充)的“可靠”估计，并且将这些与图20B中显示的测量的值相比：

骨炭类型        模型H/H _填充      H/H _填充 实验值

5×8            1.38            1.02

10×28          1.32            1.06

20×60          1.21            1.04

模型估计的高度是可靠估计值，然而，为了降低反应器容积和成本，基于这些新的实验观察结果，总膨胀床高度与填充床高度之比(H/H_填充)为1.2对于三种骨炭类型是足够的。在一些实施方案中，在双重模式、填充床-膨胀(流化)床生物反应器中使用不小于1.01、1.10、1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45的H/H_填充。在其他实施方案中，在双重模式、填充床-膨胀(流化)床生物反应器中使用不多于1.01、1.10、1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45的H/H_填充。

实施例14：来自连续发酵的固定细胞的填充床生物反应器数据

根据图21所示的示意图建立固定细胞的填充床生物反应器。这里，MFC是质量流控制器，P是压力，T是温度，ORP是氧化还原电位。使用未适应或选择的糖丁酸梭菌和拜氏梭菌菌株。接种生物反应器并在分批模式下启动，并然后切换到连续发酵模式。一些生物反应器在分批模式和连续模式下运转超过1000小时的总时间。五次运转的OD₆₀₀读数、进料速率、在培养基中的原料百分比、丁醇水平和丁醇生产率以示意图形式呈现在图22-26中。EFT是经过的发酵时间(小时)。在图27中提供了发酵运转的概述，包括稀释率、丁醇滴度、丁醇产量和丁醇生产率。

图22显示由监测Co-7449在100mL包含骨炭作为支持体的固定细胞生物反应器中的连续发酵运转所产生的数据的图(运转编号2008065)。底物是4％葡萄糖并且稀释率是0.73/h。

图23显示由监测Co-7449在1000mL包含骨炭作为支持体的固定细胞生物反应器中在31℃的连续发酵运转所产生的数据的图(运转编号2008137)。底物是4％蔗糖并且稀释率是0.51/h。

图24显示由监测Co-5673在1000mL包含骨炭作为支持体的固定细胞生物反应器中在33℃的连续发酵运转所产生的数据的图(运转编号2009012)。底物是5％蔗糖并且稀释率是0.73/h。贯穿丁醇生产率轨迹的水平的黑色实直线是使用梯形法则，在由水平黑线指示的时间段的丁醇生产率数据的积分平均数。

图25显示由监测Co-7449在1000mL包含骨炭作为支持体的固定细胞生物反应器中在31℃的连续发酵运转所产生的数据的图(运转编号2009021)。底物是4％木糖并且稀释率是0.76/h。贯穿丁醇生产率轨迹的水平的黑色实直线是使用梯形法则，在由水平黑线指示的时间段的丁醇生产率数据的积分平均数。

图26显示由监测Co-7449在1000mL包含骨炭作为支持体的固定细胞生物反应器中在33℃的连续发酵运转所产生的数据的图(运转编号2009023)。底物是4％木糖并且稀释率是0.76/h。贯穿丁醇生产率轨迹的水平的黑色实直线是使用梯形法则，在由水平黑线指示的时间段的丁醇生产率数据的积分平均数。

图27是显示图22-26中的每个连续发酵运转的稀释率、丁醇滴度(g/L)、丁醇产量(g丁醇/g底物)和丁醇生产率(g/L/h)的表。带有星号(*)的数字是使用梯形法则对由相应图上的水平黑线示出的时间段的积分平均数而计算的(图24-26)。这些时间段代表稳态系统。计算结果显示用在这些实验中使用的固定细胞的填充床生物反应器获得的结果是可成比例放大的。当以稳态运转，使用蔗糖作为原料时，具有正常的、未适应的或选择的糖丁酸梭菌和拜氏梭菌菌株的成比例放大的单级的填充床生物反应器预期至少8-10g/L丁醇的滴度。具有正常菌株的这种系统的总溶剂的滴度预期是至少12g/L。当以稳态运转，具有糖丁酸梭菌和拜氏梭菌正常菌株，使用木糖溶液、糖蜜、甘蔗、甜菜或甜高粱汁、水果材料、浓缩汁、玉米糖浆或类似原料时，成比例放大的单级填充床生物反应器预期8-10g/L的滴度。

对于至少2.5％丁醇耐受性被适应或选择的糖丁酸梭菌和拜氏梭菌的菌株的成比例放大系统的丁醇滴度预期为至少15-20g/L。

实施例15：下一代固定细胞的生物反应器的设计和控制

图28显示具有生物反应器温度指示器控制(TIC)的小试规模固定细胞的生物反应器工艺设计/控制。这里，NCG是不凝性气体，MFC是质量流控制器，PI是压力指示器，FIC是流量指示器控制。这种设计和控制方案适合于填充床、膨胀床和双重模式生物反应器。

图29是上游加工的小型规模工艺流(没有收获池的固定细胞生物反应器)。这里，MF代表微量过滤，例如切向流过滤。这种工艺流方案适合于填充床、膨胀床和双重模式生物反应器。

实施例16：使用双重模式生物反应器用于连续发酵固定的细胞

将具有1.2的H∶Hp的双重模式生物反应器用20×60大小的骨炭填充，测试压力并用蒸汽就地灭菌。冷却后，将生物反应器与具有吸附到骨炭固体支持体上的产丁醇梭菌属菌株的填充床生物反应器相连。再循环回路在这两个生物反应器之间运行，其中来自填充床生物反应器的流出液运转通过双重模式生物反应器的入口，并且双重模式生物反应器的流出液通过填充床生物反应器的入口被返回到该生物反应器。再循环回路运转24小时。来自填充床生物反应器的脱落细胞和小固体支持体上的细胞聚居于双重模式生物反应器中的新鲜支持体。

在接种期后，再循环回路被断开并且在它的位置安装进料线。读取的跨整个填充床的压力降比期望值高。流体流以超过固体支持体的最大颗粒的U_mf的递增方式被提高40％。在保持该流体速率10分钟后，将流体流速逐步降低回到初始进料速率。在支持体材料本身再装配后，系统中的反压下降到可接受的压力读数。

培养在填充床模式下运行240小时而没有事故，但是作为预防性措施，再次将流体流提高为40％递增以前那样并保持10分钟。然后将流速逐步降低回到初始进料速率。

在填充床模式下连续发酵另外92小时后，反压建立，所以流体流被逐渐提高到初始速率的40％，保持10分钟，并然后被逐渐降低到初始操作流速。压力增加仅被部分缓解。然后流体流速被逐渐增加到最小颗粒被携带至膨胀床区顶部的水平。将该流体流速保持30分钟，然后逐步回降到初始速率加20％。判断灌注速率是足够的并且接下来238小时以这种速率保持流速。处于顶端流体流速的生物反应器操作将最小颗粒保持在膨胀床区中，然而不溶颗粒被从柱吹出并在流出液容纳槽中沉降出来。发酵运转在594小时后终止。

Claims (86)

1.一种用于在生物反应器中制备产物的方法，所述方法包括：

i)培养微生物，其中所述微生物被适应或诱变以表现出与对应的非适应或非诱变的微生物的产物耐受性相比对所述产物至少150％的产物耐受性；和

ii)收获所述产物。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述适应的微生物或突变的微生物表现出对所述产物至少200％的耐受性。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述微生物包括单个物种。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述微生物包括丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、紫色梭菌(Clostridium puniceum)、糖丁酸梭菌(Clostridium saccharobutylicum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)、金黄丁酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)、假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)或热解糖梭菌(Clostridium thermosaccharolyticum)。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述适应的微生物或突变的微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述产物是丁醇。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌表现出对至少2％丁醇的耐受性。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述微生物被固定在固体支持体上。

9.如权利要求8所述的方法，所述方法还包括以下步骤：通过使包含适应的细胞或突变的细胞的发酵培养基循环经过所述生物反应器来将所述适应的微生物或突变的微生物固定在所述固体支持体上。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述微生物表现出与在液体培养基中表现出的产物耐受性相比在固体支持体上增强的产物耐受性。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述固体支持体是半固体或固体。

12.如权利要求8所述的方法，其中所述固体支持体包括多孔材料。

13.如权利要求8所述的方法，其中所述固体支持体包括选自由以下组成的组的材料：骨炭、合成聚合物、天然聚合物、无机材料或有机材料。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述培养步骤包括使用串联或平行排列的至少两个生物反应器。

15.如权利要求14所述的方法，所述方法还包括在所述至少两个生物反应器的至少一个中使用悬浮培养。

16.如权利要求14所述的方法，所述方法还包括在所述至少两个生物反应器的至少两个中使用固定的培养物。

17.如权利要求14所述的方法，其中所述至少两个生物反应器的至少一个是连续培养。

18.如权利要求1所述的方法，其中所述培养步骤包括以分批培养、补料-分批培养或连续培养来培养所述微生物。

19.如权利要求1所述的方法，其中所述培养步骤是在填充床生物反应器或流化床生物反应器中进行。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述流化床生物反应器是膨胀床生物反应器。

21.如权利要求19所述的方法，其中所述培养步骤是在适合于以填充床或流化床模式操作的生物反应器中进行。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述生物反应器包括：

a)填充床区，所述填充床区适合于容纳固体支持体；

b)床膨胀区，所述床膨胀区与所述填充床区接合，当以膨胀床模式操作所述生物反应器时，所述床膨胀区适合于容纳所述固体支持体；和

c)颗粒脱离区，所述颗粒脱离区与所述床膨胀区接合，所述颗粒脱离区适合于防止所述固体支持体从所述生物反应器中出去。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述生物反应器还包括与所述填充床区接合的入口分配区。

24.如权利要求22所述的方法，其中柱还包括柱膨胀区。

25.如权利要求22所述的方法，其中所述生物反应器在入口分配区中具有的压力降不超过跨生物反应器整个长度总压力降的30％。

26.如权利要求22所述方法，其中所述颗粒脱离区的直径比所述填充床区或所述膨胀床区的直径大。

27.如权利要求1所述的方法，其中所述收获步骤包括从所述培养物中连续提取所述产物。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述连续提取是使用汽提气、溶剂、吸收材料、全蒸发膜或蒸馏进行的。

29.如权利要求7所述的方法，其中所述培养步骤包括在提供至少6

g/L/小时的丁醇生产率的条件下培养所述丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。

30.如权利要求7所述的方法，其中每天生产至少1000升的丁醇。

31.如权利要求7所述的方法，其中每天生产至少1500升的总溶剂。

32.如权利要求1所述的方法，其中所述培养步骤包括培养至少7天。

33.如权利要求1所述的方法，其中所述微生物包含异源基因。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述异源基因编码产物生物合成途径中的酶。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述酶选自由以下组成的组：磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、NAD依赖性β-羟丁酰辅酶A脱氢酶、丁酰辅酶A脱氢酶、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶、乙酰辅酶A乙酰转移酶、丁酸激酶、磷酸丁酰转移酶、NADH依赖性丁醇脱氢酶B、NADH依赖性丁醇脱氢酶A、醛-醇脱氢酶、乙酰辅酶A乙酰转移酶、醛脱氢酶、丁酸乙酰乙酸辅酶A转移酶A亚基、丁酸乙酰乙酸辅酶A转移酶B亚基和乙酰乙酸脱羧酶。

36.一种用于制备产物的系统，所述系统包括生物反应器，所述生物反应器包括：

a)与固体支持体接触的生长培养基；

b)固定在所述固体支持体上的微生物，其中所述微生物被适应或诱变以表现出与对应的非适应或非诱变微生物的产物耐受性相比对所述产物至少150％的产物耐受性。

37.如权利要求36所述的系统，其中所述适应的微生物或突变的微生物表现出对所述产物至少200％的耐受性。

38.如权利要求36所述的系统，其中所述微生物包括以下属：梭菌属、肠球菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属或芽孢杆菌属。

39.如权利要求36所述的系统，其中所述适应的微生物或突变的微生物是丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌。

40.如权利要求36所述的系统，其中所述产物是丁醇。

41.如权利要求39所述的系统，其中所述丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌表现出对至少2％丁醇的耐受性。

42.如权利要求36所述的系统，其中所述微生物包含异源基因。

43.如权利要求42所述的系统，其中所述异源基因编码产物生物合成途径中的酶。

44.如权利要求43所述的系统，其中所述酶选自由以下组成的组：磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、NAD依赖性β-羟丁酰辅酶A脱氢酶、丁酰辅酶A脱氢酶、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶、乙酰辅酶A乙酰转移酶、丁酸激酶、磷酸丁酰转移酶、NADH依赖性丁醇脱氢酶B、NADH依赖性丁醇脱氢酶A、醛-醇脱氢酶、乙酰辅酶A乙酰转移酶、醛脱氢酶、丁酸乙酰乙酸辅酶A转移酶A亚基、丁酸乙酰乙酸辅酶A转移酶B亚基和乙酰乙酸脱羧酶。

45.如权利要求36所述的系统，所述系统包括用于将所述微生物保持在连续培养中的装置。

46.如权利要求45所述的系统，其中发酵工艺是连续培养，还包括在产物纯化过程中回收的发酵培养液的养分和矿物质的再循环和再利用。

47.如权利要求36所述的系统，其中所述微生物表现出与在液体培养基中表现出的产物耐受性相比在固体支持体上增强的产物耐受性。

48.如权利要求36所述的系统，其中所述固体支持体包括多孔材料。

49.如权利要求36所述的系统，其中所述固体支持体包括选自由以下组成的组的材料：骨炭、合成聚合物、天然聚合物、无机材料或有机材料。

50.如权利要求39所述的系统，其中所述丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌被培养在提供至少6g/L/小时的丁醇生产率的条件下。

51.如权利要求39所述的系统，其中所述丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌被培养在提供至少10g/L/小时的总溶剂生产率的条件下。

52.如权利要求40所述的系统，其中每天生产至少1000升的丁醇。

53.如权利要求40所述的系统，其中每天生产至少1500升的总溶剂。

54.一种生物反应器，所述生物反应器包括：

a)填充床区，所述填充床区适合于容纳固体支持体；

b)床膨胀区，所述床膨胀区与所述填充床区接合，当以膨胀床模式操作所述生物反应器时，所述床膨胀区适合于容纳所述固体支持体；和

c)颗粒脱离区，所述颗粒脱离区与所述床膨胀区接合，所述颗粒脱离区适合于防止所述固体支持体从所述生物反应器中出去。

55.如权利要求54所述的生物反应器，其中所述填充床区与所述床膨胀区的结合高度(H)与所述填充床区的高度(H_p)之比大于1.01。

56.如权利要求54所述的生物反应器，所述生物反应器还包括适合于安放在所述床膨胀区和所述颗粒脱离区之间的柱膨胀区，其中所述柱膨胀区的上游端与所述床膨胀区接合，并且所述柱膨胀区的下游端与所述颗粒脱离区接合。

57.如权利要求56所述的生物反应器，其中所述柱膨胀区包括距水平线向上倾斜至少10°的倾斜角度。

58.如权利要求54所述的生物反应器，所述生物反应器还包括与所述颗粒脱离区接合的气体-液体分离区。

59.如权利要求54所述的生物反应器，所述生物反应器被设置成以填充床模式或以膨胀床模式操作。

60.如权利要求54所述的生物反应器，所述生物反应器还被设置成在填充床模式和膨胀床模式的操作之间交替。

61.如权利要求54所述的生物反应器，所述生物反应器能够连续发酵至少100小时。

62.如权利要求54所述的生物反应器，其中所述固体支持体是半固体或固体。

63.如权利要求54所述的生物反应器，其中所述固体支持体包括多孔材料。

64.如权利要求54所述的生物反应器，其中所述固体支持体包括至少50m²/g的表面积。

65.如权利要求54所述的生物反应器，其中所述固体支持体包括至少0.3g/cm³的堆密度。

66.如权利要求54所述的生物反应器，其中所述固体支持体包括至少60的球盘硬度数。

67.如权利要求54所述的生物反应器，其中所述固体支持体包括至少20MaP的屈服强度。

68.如权利要求54所述的生物反应器，其中所述固体支持体包括选自由以下组成的组的材料：骨炭、合成聚合物、天然聚合物、无机材料或有机材料。

69.一种用于在固体支持体上发酵生物学产物的生物反应器，所述生物反应器包括：

a)填充床区，包括其中的固体支持体，所述固体支持体包含其上用于发酵所述生物学产物的微生物；

b)床膨胀区，所述床膨胀区与所述填充床区接合，当以膨胀床模式操作所述生物反应器时，所述床膨胀区适合于包含所述固体支持体；和

c)颗粒脱离区，所述颗粒脱离区与所述床膨胀区接合，所述颗粒脱离区适合于防止所述固体支持体从所述生物反应器中出去。

70.如权利要求69所述的生物反应器，其中所述填充床区与所述床膨胀区的结合高度(H)与所述填充床区的高度(H_p)之比大于1.01。

71.如权利要求69所述的生物反应器，所述生物反应器还包括适合于安放在所述床膨胀区和所述颗粒脱离区之间的柱膨胀区，其中所述柱膨胀区的上游端与所述床膨胀区接合，并且所述柱膨胀区的下游端与所述颗粒脱离区接合。

72.如权利要求71所述的生物反应器，其中所述柱膨胀区包括距水平线向上倾斜至少10°的倾斜角度。

73.如权利要求69所述的生物反应器，所述生物反应器还包括与所述颗粒脱离区接合的气体-液体分离区。

74.如权利要求69所述的生物反应器，所述生物反应器被设置成以填充床模式或以膨胀床模式操作。

75.如权利要求69所述的生物反应器，所述生物反应器还被设置成在填充床模式和膨胀床模式的操作之间交替。

76.如权利要求69所述的生物反应器，所述生物反应器能够连续发酵至少100小时。

77.如权利要求69所述的生物反应器，其中所述微生物包括以下属：梭菌属、肠球菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属或芽孢杆菌属。

78.如权利要求69所述的生物反应器，其中所述微生物包括丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌或糖丁酸梭菌。

79.如权利要求78所述的生物反应器，其中所述产物是丁醇。

80.如权利要求78所述的生物反应器，其中所述丙酮丁醇梭菌、糖丁酸梭菌或拜氏梭菌表现出对至少2％丁醇的耐受性。

81.如权利要求69所述的生物反应器，所述生物反应器还包括以下步骤：通过使包含所述微生物的发酵培养基循环经过所述生物反应器来将所述微生物固定在所述固体支持体上。

82.如权利要求81所述的生物反应器，其中所述循环的发酵培养基包含固定在颗粒上的微生物。

83.如权利要求69所述的生物反应器，其中所述固体支持体是半固体或固体。

84.如权利要求69所述的生物反应器，其中所述固体支持体包括多孔材料。

85.如权利要求69所述的生物反应器，其中所述固体支持体包括选自由以下组成的组的材料：骨炭、合成聚合物、天然聚合物、无机材料或有机材料。

86.一种用于制备生物学产物的方法，所述方法包括：

a)将微生物培养在生物反应器中，所述生物反应器包括：

i)填充床区，包括其中的固体支持体，所述固体支持体包括其上用于发酵所述生物学产物的微生物；

ii)床膨胀区，所述床膨胀区与所述填充床区接合，当以膨胀床模式操纵所述生物反应器时，所述床膨胀区适合于包含所述固体支持体；知

iii)颗粒脱离区，所述颗粒脱离区与所述床膨胀区接合，所述颗粒脱离区适合于防止所述固体支持体从所述生物反应器中出去；以及

b)收获所述产物。

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