CN102053133A - 一种检测转基因水稻温室气体排放的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的检测转基因水稻温室气体排放的方法，利用¹³C稳定碳同位素标记结合静态箱采样方法，检测转基因水稻与亲本之间温室气体的排放。具体步骤包括：(1)制作密闭式¹³C稳定碳同位素标记箱；(2)¹³C稳定碳同位素标记；(3)静态箱法采集气体；(4)同位素比质谱测定。利用该方法可精确评价转基因水稻与对照之间的温室气体排放差异。为制定我国转基因水稻商品化释放标准提供有力的技术依据。

Description

一种检测转基因水稻温室气体排放的方法

技术领域

本发明涉及一种基于¹³C同位素标记，精确检测转基因水稻温室气体(CO₂和CH₄)排放的方法。

背景技术

全球气候变暖及其可能带来严重的生态环境和社会经济影响已被世界各国政府及科学家广泛关注。许多研究表明，人类活动对大气成分具有显著性的影响，温室效应是引起全球气候变暖的重要原因。中国政府在哥本哈根全球气候峰会上郑重承诺，延缓二氧化碳的排放，既到2020年中国单位国内生产总值(GDP)二氧化碳排放比2005年下降40％-45％。稻田生态系统是温室气体排放的重要来源，我国常规水稻种植面积约4.5亿亩，如何减少稻田温室气体的排放实施我国当年急需解决的问题。

目前关于水稻温室气体排放的检测主要是应用常规的静态箱采集方法，但由于稻田的田间异质性强，且稻田温室气体排放来源复杂，很难精确的测定稻田中水稻对温室气体排放的贡献。

发明内容

本发明的目的是基于¹³C稳定态同位素标记技术，提供一种能精确检测转基因水稻温室气体排放的方法，为转基因水稻环境安全评估标准提供有力的技术依据。

本发明的检测转基因水稻温室气体排放的方法，采用¹³C稳定碳同位素标记结合静态箱采样，检测转基因水稻与亲本之间温室气体的排放，具体步骤如下：

(1)制作¹³C稳定碳同位素标记箱：标记箱由透明桶状箱体和底座构成，底座是沿周边具有回形槽的矩形框，箱体的箱口与回形槽相吻合，箱体内顶部装有用于调节箱内气体均匀性的风扇和预检测CO₂浓度的传感器，箱体下部侧面设有标记药品进样管，箱体上部侧面设有用丁胶塞密封的气体采集口；

(2)¹³C稳定碳同位素标记：将标记箱的箱体口嵌入底座回形槽中，并在回形槽中注入足够的蒸馏水进行密封，标记箱罩住供试水稻并固定，标记箱内位于标记药品进样管的下方放置盛有乳酸的烧杯，标记时间为早上9点至12点之间，由传感器监控标记箱内CO₂气体浓度。当箱内CO₂浓度降为125ppm时，通过标记药品进样管注入浓度为1mol·L^-1Na₂ ¹³CO₃，标记时使室内¹³CO₂浓度维持在150-200ppm浓度；

(3)用注射器定时采集气体样品，测试结果取平均值；

(4)用气象色谱-同位素比质谱分别测定¹³C-甲烷和二氧化碳气体的同位素丰度比R_sample值，再根据公式(1)将数据转换成稳定态同位素相对比率δ¹³C，供后期评价转基因水稻温室气体排放的统计分析，

稳定态同位素比率按照以下公式计算：

$\mathrm{\δ}C_{13}=[\left(\frac{R_{\mathrm{sample}}}{R_{s\tan \mathrm{dard}}}\right)-1]\×1000---\left(1\right)$

δ¹³C是指稳定态同位素相对比率，R_sample和R_standard分别是样品同位素丰度比和标准的同位素丰度比，即某一元素的重同位素原子丰度与轻同位素原子丰度之比。R_standard按国际惯例使用美国南卡罗来那州白圣纪皮狄组拟箭石化石。

通过比较转基因与亲本对照及其秸秆的CH₄和CO₂中稳定态同位素相对比率δ¹³C，可精确有效评价转基因效应是否对水稻温室气体排放造成负面的影响。

本发明的有益效果如下：

(1)目前对转基因水稻环境风险特别对其温室气体排放的评价标准还未建立，本发明为转基因水稻温室气体排放标准的制定提供有力的技术支持。

(2)本发明基于¹³C同位素标记方法，可精确评价转基因水稻与对照之间的温室气体排放差异。

附图说明

图1是本发明的¹³C稳定碳同位素标记箱示意图。

具体实施方式

实施例

本实例以某转Bt基因水稻与亲本水稻及其秸秆为对象，将已经标记完成的转Bt基因水稻秸秆，还到种植水稻田中，分别在7天、15天、30天、55天、80天及110天对转Bt基因与亲本水稻进行¹³C-CH₄及¹³C-CO₂检测，评价转Bt基因对对水稻温室气体排放的影响。

检测转基因水稻温室气体排放的方法，具体步骤如下：

(1)制作¹³C稳定碳同位素标记箱(见图1)：标记箱由5mm厚的透明桶状箱体7和底座1构成，有机玻璃各个面之间用三氯甲烷粘接，箱体长宽高根据不同水稻品种以及植株不同的生长阶段进行调整，一般单株水稻长宽约20cm，多株长宽约50-100cm。本例，箱体长×宽×高为20cm×25cm×80cm。底座1是四周边具有回形槽的矩形框，箱体7的箱口与回形槽相吻合，箱体内顶部装有用于调节箱内气体均匀性的风扇2和预检测CO₂浓度的传感器3，箱体下部侧面设有标记药品进样管4，箱体上部侧面设有用丁胶塞密封的气体采集口6；

(2)¹³C稳定碳同位素标记：将标记箱的箱体口嵌入底座回形槽中，并在回形槽中注入足够的蒸馏水进行密封，标记箱罩住供试水稻并固定，标记箱内位于标记药品进样管4的下方放置盛有乳酸的烧杯5，标记时间为早上9点至12点之间，由传感器3监控标记箱内CO₂气体浓度。当箱内CO₂浓度降为125ppm时，通过标记药品进样管注入浓度为1mol·L^-1Na₂ ¹³CO₃，乳酸与Na₂ ¹³CO₃反应产生¹³CO₂，标记时使室内¹³CO₂浓度维持在150-200ppm浓度。

(3)用注射器采集密封初本底气体10mL注入真空瓶中，每隔一个小时用10mL真空瓶采集一次气体，并分别转入静态箱中，总共采集三次。测试结果取三箱平均值。

(4)用气象色谱-同位素比质谱分别测定¹³C-甲烷和二氧化碳气体的同位素丰度比R_sample值，再根据公式1将数据转换成稳定态同位素相对比率δ¹³C。

稳定态同位素比率按照以下公式计算：

$\mathrm{\δ}C_{13}=[\left(\frac{R_{\mathrm{sample}}}{R_{s\tan \mathrm{dard}}}\right)-1]\×1000---\left(1\right)$

δ¹³C是指稳定态同位素相对比率，R_sample和R_standard分别是样品同位素丰度比和标准的同位素丰度比，即某一元素的重同位素原子丰度与轻同位素原子丰度之比。R_standard按国际惯例使用美国南卡罗来那州白圣纪皮狄组拟箭石化石。

转Bt基因及其秸秆降解对CH₄和CO₂的影响如表1、2所示。随着时间的推移，在¹³C-CH₄和¹³C-CO₂浓度呈显著增加后减少的趋势，表明本次¹³C标记试验成功。

表1.转Bt基因及亲本水稻秸秆还土对CH₄排放δ¹³C的影响.

*：同列不同小写字母表示相同采样时期不同处理间显著性差异

Ckr+Cks：亲本水稻添加亲本水稻秸秆；Btr+Bts：转Bt基因水稻添加转Bt基因秸秆；Cks：亲本水稻秸秆；Bts：转Bt基因水稻秸秆

表2.转Bt基因及亲本水稻秸秆还土对根际、非根际CO₂排放δ¹³C的影响

*：同列不同小写字母表示相同采样时期不同处理间显著性差异Ckr+Cks：亲本水稻添加亲本水稻秸秆；Btr+Bts：转Bt基因水稻添加转Bt基因秸秆；Cks：亲本水稻秸秆；Bts：转Bt基因水稻秸秆

¹³C-CH₄排放通量的动态变化见表1所示，对比添加转Bt基因与亲本水稻秸秆后¹³C-CH₄浓度在前期随着时间的推移浓度显著上升，而后缓慢的下降。然而转Bt基因水稻秸秆与亲本水稻秸秆处理之间未发现有显著性的差异，结果表明转Bt基因本身对稻田CH₄排放影响并不显著。

转Bt基因与亲本¹³C-CO₂排放通量如表2所示，¹³C-CO₂的变化趋势呈现与¹³C-CH₄相似的变化趋势。但转Bt基因与亲本水稻之间并无显著性差异。

Claims (1)

1.一种检测转基因水稻温室气体排放的方法，具体步骤如下：

(1)制作¹³C稳定碳同位素标记箱：标记箱由透明桶状箱体(7)和底座(1)构成，底座(1)是沿周边具有回形槽的矩形框，箱体(7)的箱口与回形槽相吻合，箱体内顶部装有用于调节箱内气体均匀性的风扇(2)和预检测CO₂浓度的传感器(3)，箱体下部侧面设有标记药品进样管(4)，箱体上部侧面设有用丁胶塞密封的气体采集口(6)；

(2)¹³C稳定碳同位素标记：将标记箱的箱体口嵌入底座回形槽中，并在回形槽中注入足够的蒸馏水进行密封，标记箱罩住供试水稻并固定，标记箱内位于标记药品进样管(4)的下方放置盛有乳酸的烧杯(5)，标记时间为早上9点至12点之间，由传感器(3)监控标记箱内CO₂气体浓度。当箱内CO₂浓度降为125ppm时，通过标记药品进样管注入浓度为1mol·L^-1Na₂ ¹³CO₃，标记时使室内¹³CO₂浓度维持在150-200ppm浓度；

(3)用注射器定时采集气体样品，测试结果取平均值；

(4)用气象色谱-同位素比质谱分别测定¹³C-甲烷和二氧化碳气体的同位素丰度比R_sample值，再根据公式(1)将数据转换成稳定态同位素相对比率δ¹³C，供后期评价转基因水稻温室气体排放的统计分析，

稳定态同位素比率按照以下公式计算：

$\mathrm{\δ}C_{13}=[\left(\frac{R_{\mathrm{sample}}}{R_{s\tan \mathrm{dard}}}\right)-1]\×1000---\left(1\right)$

δ¹³C是指稳定态同位素相对比率，R_sample和R_standard分别是样品同位素丰度比和标准的同位素丰度比，即某一元素的重同位素原子丰度与轻同位素原子丰度之比。R_standard按国际惯例使用美国南卡罗来那州白圣纪皮狄组拟箭石化石。

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