CN102050875A - 一种促甲状腺素受体的提取及纯化方法 - Google Patents

一种促甲状腺素受体的提取及纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促甲状腺素受体的提取及纯化方法，提取方法为：(1)将去除脂肪和结缔的猪甲状腺组织，加A缓冲液，用匀浆器研磨；(2)离心；(3)取上清液，离心，弃上清液，向沉淀中加入B缓冲液，摇匀后离心，弃去上清液；(4)向沉淀中加入C缓冲液，提取，然后摇匀，离心，弃去沉淀，得到促甲状腺素受体粗品溶液，冻存备用；本发明提取和纯化TRAb检测中最为关键的组分TSH受体，并对提取和纯化的技术工艺进行了较大的调整和改进，能很好地保持猪TSH受体的生物学活性。本提取及纯化方法产率高，克服了以往TSH受体只能粗提而不易获得纯品及活性较低的困难。

Description

一种促甲状腺素受体的提取及纯化方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种促甲状腺素受体(TSH Receptor，TSHR)的提取及纯化方法。
背景技术
促甲状腺激素受体自身抗体由甲状腺内的淋巴细胞所产生，是直接作用于甲状腺细胞膜上的TSH受体的抗体。根据其作用可分为以下三类：(1)甲状腺刺激性抗体(TSAb)，又称甲状腺刺激免疫球蛋白(TSI)，与甲状腺滤泡膜上的TSH受体结合，刺激甲状腺肿大，增强其功能活性，是导致Garves病(毒性弥漫性甲状腺肿)的主要病因。(2)甲状腺抑制性抗体(TBIAb)，又称甲状腺功能抑制性免疫球蛋白(TBII)，与促甲状腺素受体结合后，可抑制甲状腺功能，引起甲低。(3)甲状腺生长刺激免疫球蛋白(TGI)，可刺激甲状腺肿大，但不影响其功能。
已知TSAb等刺激性抗体是Graves病(毒性弥漫性甲状腺肿)发生、发展的主要原因；而TBIAb在甲状腺功能减退症的发病机理中起重要作用，导致甲状腺功能低下。TSAb作用于TSH受体，模仿TSH的作用，通过环磷腺苷的介导，使T3、T4合成、分泌增加；TBIAb影响TSH和TSAb对甲状腺的刺激效应，或直接阻断环磷腺苷的释放，从而抑制甲状腺的生长和功能，导致甲状腺功能减退。文献认为，以上多种不同效应的TRAb之间存在着相对平衡，一旦平衡被破坏，即由起主导作用的抗体决定临床症状。未经治疗的Graves病患者血清TRAb(促甲状腺素受体自身抗体)的阳性率可达70％以上。因此，测定血清TRAb对甲亢和Graves病的病因诊断及鉴别诊断均有重要意义。而获取高纯度、高特异性的TSH受体对TRAb检测方法的建立起着至关重要的作用。
TSH受体存在于甲状腺腺泡上皮细胞，是一种跨膜蛋白。它是含有750个氨基酸残基，分子量为85000。TSH与其受体结合后，通过G蛋白激活腺苷酸环化酶，使cAMP(环化腺苷酸)生成增多，进而促进甲状腺激素的释放与合成。由于膜蛋白水性强、难溶于水，抽提时既要削弱它与膜脂的硫水性结合，又要使它保持硫水基在外的天然状态，且TSH受体极不稳定，其活性很容易降低乃至丧失，分离纯化难度较大。因此以往只能对TSH受体进行粗提而无法获得纯品，且活性较低。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种促甲状腺素受体的提取方法。
本发明的第二个目的是提供一种促甲状腺素受体的纯化方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种促甲状腺素受体的提取方法，包括如下步骤：
(1)将去除脂肪和结缔的猪甲状腺组织100～200g，加300～600ml 2-8℃A缓冲液，用匀浆器研磨3～10min；
(2)1000～2000r/min离心20～40min；
(3)取上清液，在2～8℃下8000～18000r/min离心0.5～1.0小时，弃去上清液，向沉淀中加入100～200ml B缓冲液，摇匀后2～8℃下50,000～100,000g离心0.5～1.5小时，弃去上清液；
(4)向沉淀中加入100～200ml C缓冲液，2-8℃下提取1～2小时，然后摇匀，在2-8℃下50,000～100,000g离心0.5～1.5小时，弃去沉淀，得到促甲状腺素受体粗品溶液，冻存备用；
所述A缓冲液由下述组份组成：0.2～0.4M蔗糖；pH＝7.5的0.05～0.1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸；100～150mM氯化钠；1.0～2mM乙二胺四乙酸；0.5～1.0ug/ml亮抑酶肽；0.5～1.0ug/ml抑肽素；0.6～1.2ug/ml抑肽酶；0.1～0.2mM苯甲基磺酰氟；余量为水；
所述B缓冲液由下述组份组成：pH＝7.5的10～20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量浓度为1～2％的甘油；质量浓度为0.1～0.2％的烷基聚氧化乙烯或聚乙二醇辛基苯基醚；1.0～2mM乙二胺四乙酸；0.5～1.0ug/ml亮抑酶肽；0.5～1.0ug/ml抑肽素；0.6～1.2ug/ml抑肽酶；0.1～0.2mM苯甲基磺酰氟；余量为水；
所述C缓冲液由下述组份组成：pH＝7.5的10～20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量浓度为1～2％的甘油；质量浓度为0.5～1.5％的烷基聚氧化乙烯或聚乙二醇辛基苯基醚；质量浓度为0.5～1.5％的正-辛基-β-D-葡萄糖；1～2mM乙二胺四乙酸；0.5～1.0ug/ml亮抑酶肽；0.5～1.0ug/ml抑肽素；0.6～1.2ug/ml抑肽酶；0.1～0.2mM苯甲基磺酰氟，余量为水。
一种促甲状腺素受体的纯化方法，包括如下步骤：
(1)将去除脂肪和结缔的猪甲状腺组织100～200g，加300～600ml 2-8℃A缓冲液，用匀浆器研磨3～10min；
(2)1000～2000r/min离心20～40min；
(3)取上清液，在2～8℃下8000～18000r/min离心0.5～1.0小时，弃去上清液，向沉淀中加入100～200ml B缓冲液，摇匀后2～8℃下50,000～100,000g离心0.5～1.5小时，弃去上清液；
(4)向沉淀中加入100～200ml C缓冲液，2-8℃下提取1～2小时，然后摇匀，在2-8℃下50,000～100,000g离心0.5～1.5小时，弃去沉淀，得到促甲状腺素受体粗品溶液，冻存备用；
所述A缓冲液由下述组份组成：0.2～0.4M蔗糖；pH＝7.5的0.05～0.1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸；100～150mM氯化钠；1.0～2mM乙二胺四乙酸；0.5～1.0ug/ml亮抑酶肽；0.5～1.0ug/ml抑肽素；0.6～1.2ug/ml抑肽酶；0.1～0.2mM苯甲基磺酰氟；余量为水；
所述B缓冲液由下述组份组成：pH＝7.5的10～20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量浓度为1～2％的甘油；质量浓度为0.1～0.2％的烷基聚氧化乙烯或聚乙二醇辛基苯基醚；1.0～2mM乙二胺四乙酸；0.5～1.0ug/ml亮抑酶肽；0.5～1.0ug/ml抑肽素；0.6～1.2ug/ml抑肽酶；0.1～0.2mM苯甲基磺酰氟；余量为水；
所述C缓冲液由下述组份组成：pH＝7.5的10～20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量浓度为1～2％的甘油；质量浓度为0.5～1.5％的烷基聚氧化乙烯或聚乙二醇辛基苯基醚；质量浓度为0.5～1.5％的正-辛基-β-D-葡萄糖；1～2mM乙二胺四乙酸；0.5～1.0ug/ml亮抑酶肽；0.5～1.0ug/ml抑肽素；0.6～1.2ug/ml抑肽酶；0.1～0.2mM苯甲基磺酰氟，余量为水；
(5)脱盐处理：将促甲状腺素受体粗品溶液上PD-10柱，在10～20mM三乙醇胺缓冲液的洗脱下脱盐；
(6)浓缩处理：用高压层析系统对脱盐处理后的促甲状腺素受体溶液进行离子交换色谱，浓缩纯化，用0～0.6M的NaCl进行梯度洗脱；
(7)高压液相色谱纯化：将浓缩处理后的促甲状腺素受体溶液用高压液相色谱仪进行再次纯化，得到促甲状腺素受体，冷冻保存。
本发明利用独特的蛋白提纯技术提取和纯化TRAb检测中最为关键的组分TSH受体，并对提取和纯化的技术工艺进行了较大的调整和改进，能很好地保持猪TSH受体的生物学活性。本提取及纯化方法产率高，克服了以往TSH受体只能粗提而不易获得纯品及活性较低的困难。
附图说明
图1为TSH受体纯度鉴定结果
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
A缓冲液由下述组份组成：0.32M蔗糖；pH＝7.5的0.1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)；120mM氯化钠；1.0mM乙二胺四乙酸(EDTA)；0.5ug/ml亮抑酶肽(Leupeptin)；0.5～1.0ug/ml抑肽素(Pepstatin A)；0.6～1.2ug/ml抑肽酶(Aprotinin)；0.1～0.2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)；余量为水。
实施例2
A缓冲液由下述组份组成：0.2M蔗糖；pH＝7.5的0.05M三羟甲基氨基甲烷-盐酸；100M氯化钠；1.0mM乙二胺四乙酸；0.5ug/ml亮抑酶肽；0.5ug/ml抑肽素；0.6ug/ml抑肽酶；0.1mM苯甲基磺酰氟；余量为水。
实施例3
A缓冲液由下述组份组成：0.4M蔗糖；pH＝7.5的0.1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸；150mM氯化钠；2mM乙二胺四乙酸；1.0ug/ml亮抑酶肽；1.0ug/ml抑肽素；1.2ug/ml抑肽酶；0.2mM苯甲基磺酰氟；余量为水。
实施例4
B缓冲液由下述组份组成：pH＝7.5的20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量浓度为2％的甘油；质量浓度为0.1％的烷基聚氧化乙烯；1.0mM乙二胺四乙酸；0.5ug/ml亮抑酶肽；0.5ug/ml抑肽素；0.6ug/ml抑肽酶；0.1mM苯甲基磺酰氟；余量为水。
实施例5
B缓冲液由下述组份组成：pH＝7.5的10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量浓度为1％的甘油；质量浓度为0.2％的聚乙二醇辛基苯基醚；2mM乙二胺四乙酸；1.0ug/ml亮抑酶肽；1.0ug/ml抑肽素；1.2ug/ml抑肽酶；0.2mM苯甲基磺酰氟；余量为水。
实施例6
B缓冲液由下述组份组成：pH＝7.5的15mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量浓度为1.5％的甘油；质量浓度为0.15％的烷基聚氧化乙烯；1.5mM乙二胺四乙酸；1.0ug/ml亮抑酶肽；1.0ug/ml抑肽素；0.8ug/ml抑肽酶；0.15mM苯甲基磺酰氟；余量为水。
实施例7
C缓冲液由下述组份组成：pH＝7.5的20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量浓度为2％的甘油；质量浓度为1％的烷基聚氧化乙烯；质量浓度为0.5％的正-辛基-β-D-葡萄糖；1mM乙二胺四乙酸；0.5ug/ml亮抑酶肽；0.5ug/ml抑肽素；0.6ug/ml抑肽酶；0.1mM苯甲基磺酰氟，余量为水。
实施例8
C缓冲液由下述组份组成：pH＝7.5的10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量浓度为1％的甘油；质量浓度为1.5％的聚乙二醇辛基苯基醚；质量浓度为1.5％的正-辛基-β-D-葡萄糖；1mM乙二胺四乙酸；1.0ug/ml亮抑酶肽；1.0ug/ml抑肽素；1.2ug/ml抑肽酶；0.2mM苯甲基磺酰氟，余量为水。
实施例9
C缓冲液由下述组份组成：pH＝7.5的15mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量浓度为1％的甘油；质量浓度为0.5％的烷基聚氧化乙烯；质量浓度为1％的正-辛基-β-D-葡萄糖；2mM乙二胺四乙酸；0.8ug/ml亮抑酶肽；0.8ug/ml抑肽素；0.8ug/ml抑肽酶；0.15mM苯甲基磺酰氟，余量为水。
实施例10
一种促甲状腺素受体的提取方法，包括如下步骤：
(1)将猪甲状腺组织剃去脂肪和结缔，准确称取100g；加500ml2℃A缓冲液，用匀浆器研磨10min；
(2)2000r/min离心20min；
(3)取上清液，在4℃下18000r/min离心1.0小时，弃去上清液，向沉淀中加入200ml B缓冲液，摇匀后4℃下100,000g离心1小时，弃去上清液；
(4)向沉淀中加入100ml C缓冲液，4℃下提取2小时，然后摇匀，在4℃下100,000g离心1小时，弃去沉淀，得到促甲状腺素受体粗品溶液，冻存备用；
本实施例使用的A缓冲液由实施例1制备；B缓冲液由实施例4制备；C缓冲液由实施例7制备。
实施例11
一种促甲状腺素受体的提取方法，包括如下步骤：
(1)将猪甲状腺组织剃去脂肪和结缔，准确称取100g；加300ml8℃A缓冲液，用匀浆器研磨3min；
(2)1000r/min离心40min；
(3)取上清液，在2℃下15000r/min离心0.5小时，弃去上清液，向沉淀中加入100ml B缓冲液，摇匀后2℃下50,000g离心1.5小时，弃去上清液；
(4)向沉淀中加入200ml C缓冲液，8℃下提取1小时，然后摇匀，在8℃下50,000g离心0.5小时，弃去沉淀，得到促甲状腺素受体粗品溶液，冻存备用；
本实施例使用的A缓冲液由实施例2制备；B缓冲液由实施例5制备；C缓冲液由实施例8制备。
实施例12
一种促甲状腺素受体的提取方法，包括如下步骤：
(1)将猪甲状腺组织剃去脂肪和结缔，准确称取200g；加600ml5℃A缓冲液，用匀浆器研磨5min；
(2)1500r/min离心30min；
(3)取上清液，在8℃下15000r/min离心1.0小时，弃去上清液，向沉淀中加入200ml B缓冲液，摇匀后8℃下100,000g离心0.5小时，弃去上清液；
(4)向沉淀中加入100C缓冲液，2℃下提取2小时，然后摇匀，在2℃下100,000g离心1.5小时，弃去沉淀，得到促甲状腺素受体粗品溶液，冻存备用；
本实施例使用的A缓冲液由实施例3制备；B缓冲液由实施例6制备；C缓冲液由实施例9制备。
实施例13
一种促甲状腺素受体的纯化方法，包括如下步骤：
(1)-(4)同实施例10；
(5)脱盐处理：
①用20mM TEA(三乙醇胺)溶液洗脱PD柱10min左右，以平衡凝胶；
②凝胶平衡后，用滴管除去凝胶柱面的溶液，将促甲状腺素受体粗品溶液加入凝胶柱表面，打开柱下口，控制流速让蛋白样品溶液慢慢浸入凝胶内；并用20mM TEA(三乙醇胺)缓冲液洗脱，控制流速为0.5ml/min左右；
③收集洗脱液并检测蛋白峰；
(6)浓缩处理：
将对脱盐处理后的促甲状腺素受体溶液上样于用TEA(三乙醇胺)缓冲液平衡的SourceQ15柱上，用在TEA(三乙醇胺)缓冲液0～0.6M的NaCl进行梯度洗脱，控制流速为1.5ml/min左右，收集并检测蛋白峰。
(7)高压液相色谱纯化：将浓缩处理后的促甲状腺素受体溶液用高压液相色谱仪进行再次纯化，得到促甲状腺素受体，冷冻保存。
实施例14
一种促甲状腺素受体的纯化方法，包括如下步骤：
(1)-(4)同实施例10；
(5)脱盐处理：
①用20mM TEA(三乙醇胺)溶液洗脱PD柱10min左右，以平衡凝胶；
②凝胶平衡后，用滴管除去凝胶柱面的溶液，将促甲状腺素受体粗品溶液加入凝胶柱表面，打开柱下口，控制流速让蛋白样品溶液慢慢浸入凝胶内；并用10mM TEA(三乙醇胺)缓冲液洗脱，控制流速为0.5ml/min左右；
③收集洗脱液并检测蛋白峰；
(6)浓缩处理：用高压层析系统对脱盐处理后的促甲状腺素受体溶液进行离子交换色谱，浓缩纯化，用0～0.6M的NaCl进行梯度洗脱；
(7)高压液相色谱纯化：将浓缩处理后的促甲状腺素受体溶液用高压液相色谱仪进行再次纯化，得到促甲状腺素受体，冷冻保存。
实施例15
一种促甲状腺素受体的纯化方法，包括如下步骤：
(1)-(4)同实施例10；
(5)脱盐处理：
①用20mM TEA(三乙醇胺)溶液洗脱PD柱10min左右，以平衡凝胶；
②凝胶平衡后，用滴管除去凝胶柱面的溶液，将促甲状腺素受体粗品溶液加入凝胶柱表面，打开柱下口，控制流速让蛋白样品溶液慢慢浸入凝胶内；并用20mM TEA(三乙醇胺)缓冲液洗脱，控制流速为0.5ml/min左右；
③收集洗脱液并检测蛋白峰；
(6)浓缩处理：用高压层析系统对脱盐处理后的促甲状腺素受体溶液进行离子交换色谱，浓缩纯化，用0～0.6M的NaCl进行梯度洗脱；
(7)高压液相色谱纯化：将浓缩处理后的促甲状腺素受体溶液用高压液相色谱仪进行再次纯化，得到促甲状腺素受体，冷冻保存。
本发明的用途
用本发明提取及纯化的促甲状腺素受体，用于配制成受体工作液，作为促甲状腺素受体自身抗体(TRAb)放射免疫分析试剂盒的主要成分(亦可用于其它免疫分析方法，如酶联免疫分析方法及化学发光免疫分析方法等)，用于检测人血清中TRAb的含量，对Graves病病的诊断、治疗和预后评估都具有十分重要的意义，阳性率可达95％，是该病最重要的诊断指标，临床价值甚高。
受体工作液的配制
配制1.0升促甲状腺素受体工作液，具体配方如下：
◆去离子水1.0升；
◆Na2HPO4(磷酸氢二钠)1.014g；
◆NaH2PO4(磷酸二氢钠)0.27g；
◆NaCl(氯化钠)8.5g；
◆NaN3(叠氮钠)0.3g；
◆BSA(牛血清白蛋白)1.0g。
用磁力搅拌器搅拌使其充分溶解，至少3个小时，然后加入TSH受体浓缩液1瓶(0.2mL)，充分混匀。
受体工作液的分装及冷冻干燥
由于促甲状腺素受体在溶液状态下极不稳定，其活性会很快降低乃至丧失。因此配制好的TSH受体工作液应立即分装并冷冻干燥保存。主要方法如下：
①将TSH受体工作液分装于小玻璃瓶中，2.0mL/瓶。
②立即将分装后的受体放于-20℃冰柜中过夜，使液体冻结。
③将冻存于小瓶中的受体用冷冻干燥机进行干燥处理，然后于-20℃下密封保存。
冷干处理后的受体应现用现溶，即在使用时加入2.0mL去离子水，轻轻摇动使之充分溶解，然后使用。由于受体在溶解后活性及其容易丧失，因此剩余的受体溶液应当弃去，不可反复冻融。
促甲状腺素受体纯度的鉴定：
将实施例13提取提纯的促甲状腺素受体进行纯度鉴定分析，具体采用10％SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定，用凝胶成像仪拍照，结果见图1。
经10％SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定，
本发明实施例13提取的产物分子量为85000，与文献报道结果一致，且TSH(促甲状腺激素)受体纯度高。而单独使用Lubrol和n-ctyl-β-D-glucoside的提取产物则纯度低，且提取量少(见图1)。说明在整个TSH受体的提取过程中，表面活性剂烷基聚氧化乙烯(Lubrol)和正-辛基-β-D-葡萄糖(n-ctyl-β-D-glucoside)的浓度及配比是一个十分关键的因素。
图1中的1为本发明的方法提取纯化的产物；2为1.0％Lubrol提取的产物；3.为1.0％n-ctyl-β-D-glucoside提取的产物；4.为标准蛋白。
实施例14、15公开的提取提纯的方法经实验证明也具有相似的结果。

Claims (2)

1.一种促甲状腺素受体的提取方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将去除脂肪和结缔的猪甲状腺组织100～200g，加300～600ml 2-8℃A缓冲液，用匀浆器研磨3～10min；
(2)1000～2000r/min离心20～40min；
(3)取上清液，在2～8℃下8000～18000r/min离心0.5～1.0小时，弃去上清液，向沉淀中加入100～200ml B缓冲液，摇匀后2～8℃下50,000～100,000g离心0.5～1.5小时，弃去上清液；
(4)向沉淀中加入100～200ml C缓冲液，2-8℃下提取1～2小时，然后摇匀，在2-8℃下50,000～100,000g离心0.5～1.5小时，弃去沉淀，得到促甲状腺素受体粗品溶液，冻存备用；
所述A缓冲液由下述组份组成：0.2～0.4M蔗糖；pH＝7.5的0.05～0.1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸；100～150mM氯化钠；1.0～2mM乙二胺四乙酸；0.5～1.0ug/ml亮抑酶肽；0.5～1.0ug/ml抑肽素；0.6～1.2ug/ml抑肽酶；0.1～0.2mM苯甲基磺酰氟；余量为水；
所述B缓冲液由下述组份组成：pH＝7.5的10～20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量浓度为1～2％的甘油；质量浓度为0.1～0.2％的烷基聚氧化乙烯或聚乙二醇辛基苯基醚；1.0～2mM乙二胺四乙酸；0.5～1.0ug/ml亮抑酶肽；0.5～1.0ug/ml抑肽素；0.6～1.2ug/ml抑肽酶；0.1～0.2mM苯甲基磺酰氟；余量为水；
所述C缓冲液由下述组份组成：pH＝7.5的10～20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量浓度为1～2％的甘油；质量浓度为0.5～1.5％的烷基聚氧化乙烯或聚乙二醇辛基苯基醚；质量浓度为0.5～1.5％的正-辛基-β-D-葡萄糖；1～2mM乙二胺四乙酸；0.5～1.0ug/ml亮抑酶肽；0.5～1.0ug/ml抑肽素；0.6～1.2ug/ml抑肽酶；0.1～0.2mM苯甲基磺酰氟，余量为水。
2.一种促甲状腺素受体的纯化方法，其特征是包括如下步骤：
(1)脱盐处理：将权利要求1提取的促甲状腺素受体粗品溶液上PD-10柱，在10～20mM三乙醇胺缓冲液的洗脱下脱盐；
(2)浓缩处理：用高压层析系统对脱盐处理后的促甲状腺素受体溶液进行离子交换色谱，浓缩纯化，用0～0.6M的NaCl进行梯度洗脱；
(3)高压液相色谱纯化：将浓缩处理后的促甲状腺素受体溶液用高压液相色谱仪进行再次纯化，得到促甲状腺素受体，冷冻保存。
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